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VERGLEICH ZWEIER METHODEN ZUR IN VIVO UND IN VITRO ISOLATION VON BOVINEN EUTEREPITHELZELLEN AUS DER MILCH

Bachelorarbeit
von Nicole Berner

durchgefhrt am Zentralinstitut fr Ernhrung- und Lebensmittelforschung (ZIEL), Abteilung Physiologie, TU Mnchen Freising-Weihenstephan

Betreuer:

Prof. Dr. Dr. Heinrich H.D. Meyer Dipl.-Ing. agr. Tanja Sigl

Bearbeitungszeitraum:

12. April 2010 20. Juni 2010

Vergleich zweier Methoden zur in vivo und in vitro Isolation von bovinen Euterepithelzellen aus der Milch

2010

Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis Abkrzungsverzeichnis 1. Einleitung 2. Literatur 2.1. Euterepithelzellen-MEC 2.2. Bestandteile der Milch 2.3. Milchproteine 2.4. Regulation der Milchproteinexpression 2.5. Methoden zur Gewinnung der MEC 2.6. Photometrische Bestimmung der Konzentration einer Lsung 2.7. qPCR 2.8. Untersuchte Gene 2.8.1. Cytokeratin 8 2.8.2. Glut-1 2.8.3. Glucocorticoidrezeptor 2.8.4. Housekeepergene - Histon und Ubiquitin 2.8.5. -Kasein 2.8.6. RunX2 2.8.7. Stat5a 3. Zielsetzung 4. Material und Methoden 4.1. Versuchsaufbau und Probennahme 4.2. In vivo Isolation von Euterepithelzellen aus der Milch 4.3. In vitro Isolation von Euterepithelzellen aus der Milch 4.4. Extraktion der RNA aus in vivo gewonnener Euterepithelzellen 4.5. Extraktion der RNA aus in vitro gewonnener Euterepithelzellen 4.6. Umschreiben der RNA in cDNA mittels Reverser Transkriptase 4.7. qPCR 4.8. Primer 4.9. Statistische Auswertung 4.10. Berechnung der Anzahl gewonnener Euterepithelzellen

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5. Ergebnisse 5.1. Vergleich der gemessenen RNA-Konzentration 5.1.1. Vergleich der RNA-Konzentration der beiden Methoden 5.1.2. Vergleich der RNA-Konzentrationen an den Probenahmetagen 5.2. Vergleich der Anzahl isolierter Euterepithelzellen 5.3. Vergleich der A260/280- bzw. A260/230-Werte 5.4. Cp-Werte 5.5. Vergleich der Cp-Werte 6. Diskussion 6.1. Vergleich der gemessenen RNA-Konzentration 6.2. Vergleich der Anzahl isolierter Euterepithelzellen 6.3. Vergleich der A260/280- bzw. A260/230-Werte 6.4. Vergleich der Cp-Werte 6.5. Vergleich der Cp-Werte 7. Zusammenfassung Literaturverzeichnis

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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Abbildung 2 Abbildung 3 Abbildung 4 Abbildung 5 Abbildung 6 Abbildung 7 Abbildung 8 Abbildung 9 Abbildung 10 Abbildung 11 Abbildung 12 Abbildung 13 Abbildung 14 Abbildung 15 Abbildung 16 Abbildung 17 Abbildung 18 Abbildung 19 Abbildung 20 Abbildung 21 Abbildung 22 Abbildung 23 Abbildung 24 Abbildung 25 Abbildung 26 Abbildung 27 Abbildung 28 Abbildung 29 Abbildung 30 Abbildung 31 Aufbau des Kuheuters Bestandteile der Milch in Prozent Zelltypen in der Milch Funktionsweise der Dynabeads Zusammensetztung der RT-Reaktion Reaktionsverlauf der RT-Reaktion Primer der qPCR Aufbau der Neubauerzhlkammer RNA-Konzentrationen Vergleich der RNA-Konzentrationen Anzahl isolierter Euterepithelzellen Individuelle Variation der Anzahl an Euterepithelzellen Vergleich der A260/280-Werte Vergleich der A260/230-Werte Amplifikationstemperaturen der Primer Cp-Werte von Histon Cp-Werte von Ubiquitin Cp-Werte von Cytokeratin 8 Cp-Werte von Glut-1 Cp-Werte von GR Cp-Werte von -Kasein Cp-Werte von RunX2 Cp-Werte von Stat5a Differenzen der Cp-Werte Ergebnisse des Chi-Quadrat-Tests und statistischer Unterschied Cp-Werte von Cytokeratin 8 Cp-Werte von Glut-1 Cp-Werte von GR Cp-Werte von -Kasein Cp-Werte von RunX2 Cp-Werte von Stat5a

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Abkrzungsverzeichnis
CaPO4 Cp-Wert d DIM DNA E FKS for GR H2O HBSS ITS KCl KH2PO4 MEC MgCl2 MGF MPBF min l ml NaOH NaCl Na2HPO4 x 2 H2O NF1 ng nm Oct-1 PBS PenStrep ppm PRL
5

Calciumphosphat Crosspoint-Wert Schichtdicke der Kvette days in milk Desoxyribonukleinacid Extinktion Extinktionskoeffizient fetales Klberserum forward Glucocorticoid Receptor Wasser Hank's balanced salt solution Liquid Medio Supplement Kaliumchlorid Kaliumhydrogenphosohat mammary epithelia cells Magnesiumchlorid mammary gland specific transkription factor milk protein binding factor Minuten Mikroliter Milliliter Natriumhydroxid Natriumchlorid

Natriumhydrogenphosphat Nuklear factor 1 Nanogramm Nanometer Octamer transkription factor 1 phosphate buffered saline Penicillin-Streptomycin-Lsung parts per million Prolactin

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qPCR rev RNA RunX2 Stat5a WAP

quantitative polymerase chain reaction reversed Ribonukleinacid runt-related transcription factor 2 signal transducer and activator of transcription whey acid protein

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1. Einleitung
Kuhmilch ist ein Grundnahrungsmittel, das man berall kaufen kann. Die Hauptbestandteile der Milch sind neben der Molke, Fett, Protein und Lactose. Der Milchpreis richtet sich nicht nach der produzierten Milchmenge, sondern nach dem Proteinanteil. Deshalb wird immer mehr an der Regulation der Expression von Milchproteinen geforscht, denn wenn man die Regulation der Milchproteine besser versteht kann man den Proteinanteil der Milch erhhen. Da die Milch von den Epithelzellen der Milchdrsen sekretiert wird, ist es notwendig diese Zellen zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden Euterepithelzellen zu isolieren. Invasive Methoden sind Euterbiopsien oder die Entnahme des Eutergewebes nach der Schlachtung des Tieres. Da Euterbiopsien zu Entzndungen fhren knnen, ist diese Methode nicht empfehlenswert. Denn bei jeder Entzndung werden Antibiotika gegeben und die Kuh wird geschwcht. Die Schlachtung der Kuh zur Gewinnung von Euterepithelzellen ist nicht konomisch und deshalb nicht empfehlenswert und auch nur einmal durchfhrbar wohingegen bei der Isolation der Epithelzellen aus der Milch die Milch als unendlicher Rohstoff. Bei der Isolation von Euterepithelzellen sollte man mglichst eine nicht invasive Methoden whlen. Die Isolation der Euterepithelzellen aus der Milch durch Kultivieren der Zellen in Zellkultur ist eine solche nicht invasive Methode. Diese in vitro Methode hat G.C. Buehring (1989) erstmals beschrieben. Dabei werden die Epithelzellen aus der Milch isoliert. Eine zweite nicht invasive Methode ist die Isolation der Epithelzellen mit Hilfe von magnetischen Kugeln, die mit Hilfe von Antigen-Antikrperkomplexen spezifisch an die Epithelzellen gebunden werden und anschlieend knnen die Epithelzellen mittels eines Magneten von den anderen Zellen der Milch getrennt werden. Da bei dieser Methode die Zellen aus der frischen Milch isoliert werden, bezeichnet man sie als in vivo Methode, diese Methode haben Boutinaud et al. (2008) zum ersten Mal publiziert. Da die Zellen jedoch durch die magnetischen Kugeln isoliert werden, verbleiben diese in der Zelllsung auch bei der RNA-Extraktion. Epithelzellen sind adhrente Zellen, diese Eigenschaft wird bei der in vitro Methode ausgenutzt. Die Zellen adhrieren an die Zellkulturflaschen und wachsen bis die Zellkulturflasche konfluent ist. Dann werden sie gelst und die RNA extrahiert. Bei der in vitro Methode verbleiben die Zellen bis zu 4 Wochen in Nhrmedium. Dadurch knnen sich die Zellen verndern, da das Nhrmedium eine andere Umgebung darstellt als die frische Milch. Es besteht bei beiden Methoden das Risiko, dass die Zellen durch die Isolationsmethode in ihren Eigenschaften verndert werden. Durch den Vergleich der gewonnenen RNA und der Ratio A260/280 bzw. Ratio A260/230 knnen Unterschiede der Isolationsmethoden bestimmt werden.

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Zum Vergleich der beiden Methoden werden Milchproben von Khen am Tag 15, 57, 113 und am Tag der Schlachtung (ca. 150 Tag) entnommen, die Epithelzellen werden isoliert und anschlieend die RNA extrahiert. Mit Hilfe der qPCR knnen Unterschiede in der Genexpression whrend der Laktationszeit erfasst werden.

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2. Literatur
2.1. Euterepithelzellen-MEC

Abbildung 1: Aufbau des Kuheuters (1)

Die Milch wird in den Drsenzellen der Alveolen produziert. Die Milchdrse betsteht aus Bindegewebszellen und Drsenzellen. Die Anzahl der Drsenzellen begrenzt die

Milchproduktionskapazitt des Euters (1). Die Milchdrse ist eine exokrine Drse, die whrend der Laktation unter komplexer Hormonkontrolle die Milch sekretiert (2; 3). Die Bestandteile der Milch, Fett, Proteine, Mineralien, Wasser, werden auf parazellulren oder transzellulren Weg durch die MEC abgegeben. Es gibt 4 transzellulre und einen parazellulren Weg. Transzellulr werden Wasser, Harnstoff, Glucose, Ionen, Hauptmilchproteine, Lactose, Milchfett und Immunoglobuline in die Milchgnge abgegeben. Auf dem parazellulren Weg, das heit ohne die Zellmembranen zu durchschreiten gelangt interstitielle Flssigkeit in die Milch. Es gibt zwei morphologisch verschiedene Typen von Euterepithelzellen. 52% sind kleine Zellen mit wenig Cytoplasma, die eine Verdopplungszeit von 76,6 Stunden haben. Die restlichen 48% sind lange Zellen mit viel Cytoplasma, die sich nicht teilen (4).

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2.2 Bestandteile der Milch


Zusammensetzung der Milch Anteil in % Trockenmasse 12,7 Fett 4,0 Protein 3,3 Lactose 4,7 Schmutz 0,7

Abbildung 2: Bestandteile der Milch in Prozent

Neben den Milchproteinen, der Molke, der Lactose und dem Fett beinhaltet die Milch auch Zellen. Die Zellpopulation der Milch besteht aus Immunzellen, den Lymphozyten, Neutrophilen und Makrophagen, und den Epithelzellen (5).
Zelltypen SCCCytoplasmatische der somatic Partikel bovinen cell count Milch 6 Anzahl der 0,075 *10 Keine Zellen in % Zellen/ml bzw. Zellen/ml Abbildung 3: Zelltypen in der Milch Epithelzellen Neutrophile PMN % Lymphozyten % Macrophagen %

Sehr wenige

5-20

20-30

61

2.3. Milchproteine
Es gibt 7 Hauptmilchproteine, die 95 % des Proteinanteils der Milch ausmachen (6). Die Hauptmilchproteine sind unterteilt in die vier Kaseine, zu denen die drei Ca2+-abhngigen Kaseine s1-Kasein, s2-Kasein, -Kasein und das Ca2+ unabhngige -Kasein, gehren. Die Ca2+-abhngigen Kaseine haben ein konserviertes Strukturmotiv, was darauf hindeutet, dass sie aus einem Gen entstanden sind. Alle Kaseine haben in der promotroregion Bindungsstellen fr MGF (mammary gland specific transkription factor). Die Aktivitt von MGF ist durch das Saugen des Kindes, hormonelle Signale etc. reguliert (2). -Casein bestimmt den Gehalt des CaPO4 in den Micellen, Casein bestimmt die Oberflchenstruktur der Micellen und -Casein dient zur Stabilisierung der Micellen (6). Die Kaseine sind in einem Multigenkomplex auf Chromosom 6 lokalisiert. Die andere Klasse der Milchproteine bilden die drei Molkeproteine -Lactalbumin, -Lactoglobulin und WAP, whey acid protein (2; 7). Die Molkeproteine haben auch einkonserviertes Strukturmotiv, an das MPBF binden kann. MGF und MPBF haben eine palindromische Sequenz und bilden Dimere. Die Milchproteine werden whrend der Lactation von den Euterepithelzellen unter komplexer Hormonkontrolle exprimiert. Whrend der Lactation kommt es zum Anstieg der Prolactin, den Glococorticoid und Estradiol17 Produktion und zur Abnahme des Schwangerschaftschutzhormons Progesteron. Durch das Zusammenwirken vieler Hormone und Faktoren kann man die Initiierung der lactation durch einen einzelnen Faktor ausschlieen. -Lactalbumin beeinflusst die Lactosesynthese. -Lactoglobulin und -Lactalbumin binden kleine hydrophobe Liganden und Retinol. Retinol ist wichtig fr das Wachstum des Suglings (2).
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Zustzlich zur Regulaton durch die Hormeone muss es zu einer Interaktion mit der extrazellulren Matrix kommen. Die extrazellulre Matrix induziert Zellmorphologische nderungen und produziert Laminin, ein Signal das zusammen mit den Laktationshormonen die Genexpression der Milchproteine induziert (7). Die Aufgabe der Milchproteine ist es das Kalb nach der Geburt mit Aminosuren und Mineralien zu versorgen. Die Ca2+ abhngigen Kaseine bilden Micellen, die von -Kasein stabilisiert werden. Die Micellen dienen zur Speicherung und Transport von Calcium und Phosphat (6).

2.4. Regulation der Milchproteinexpression


Man untersucht die Regulation der Expression der Milchproteine, um die Leistungen in der Milchproduktion einer Kuh effizienter zu machen, fr die Expression von pharmazeutischen

Proteinen in der Milch und um die gewebespezifische Regelung der Genexpression durch Hormone zu verstehen (2). Die Hauptmilchproteine werden durch Peptid- und Steroidhormone und die Interaktion der Epithelzellen mit der extrazellulren Matrix reguliert (7). An der Expression der Milchproteine sind verschiedene Faktoren beteiligt. Die Gewebespezifischen Faktoren MPBF und die ubiquitr vorkommenden Transkriptionsfaktoren NF1 und Oct-1 (2). Whrend der Laktation kommt es zu einem Anstieg von Prolactin, Glucocorticoiden und Estradiol 17 und zu einer Abnahme von Progesteron. Somit wird die Initiation der Lactation nicht von einem Faktor ausgelst, sondern durch ein Zusammenwirken vieler verschiedener Faktoren (2).

2.5. Methoden zur Gewinnung der MEC


Die MEC kann man auf verschiedenen Wegen gewinnen. Zum einen knnen Euterbiopsien durchgefhrt werden, dabei wird eine Gewebeprobe des Euters entnommen. Da dieses eine invasive Methode ist, kann sie nur bei gesunden Tieren durchgefhrt werden, da Komplikationen, wie z.B. Entzndungen, auftreten knnen. Durch die Schlachtung des Tieres und entnahme des Euters knnen ebenfalls MEC gewonnen werden. Diese Methode ist jedoch nicht sehr konomisch und deshalb bentigt man nicht invasive Methoden zur Gewinnung von MEC. Eine nicht invasive Methode ist die Isolation von Euterepithelzellen aus der Milch und anschlieende Kultivierung in der Zellkultur. Diese Methode ist erstmalsvon Buhring et all 1989 beschrieben worden. Die in meiner Bachelorarbeit durchgefhrte in vitro Methode lehnt sich an das Protokoll von Buhring an (4). Eine weitere Methode ist die Gewinnung von MEC aus der frischen Milch mit Hilfe von magnetischen Kugeln, die ber einen Antigen-Antikrper-Komplex spezifisch an die MEC gebunden werden. Diese Methode, die in vivo Methode, ist ebenfalls eine nicht invasive Methode.
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2.6. Photometrische Bestimmung der Konzentration einer Lsung


Bei der photometrischen Bestimmung der Konzentration wird die Extinktion gemessen. Die Extiktion ist ein Ma fr die Abschwchung der Intensitt eines Lichtstrahls beim passieren der Lsung. Die Abschwchung kommt durch Absorption, Streuung und Reflektion zustande. Durch das LambertBeersche Gesetzt kann man mit Hilfe der Schichtdicke der Kvette d, der gemessenen Extinktion E, des Extinktionskoeffizienten die Konzentration der Lsung bestimmen (8). Im Biophotometer bzw. NanoDrop wird ein Spektrum aufgenommen, d.h. es wird die Extinktion einer Lsung in einem Intervall von Wellenlngen gemessen. Im Biophotometer wird im Bereich 230-320 nm alle 5 nm und von 562-595 nm alle 7 nm gemessen (9). Proteine, bzw. die Reste der aromatischen AS, haben ein charaktristisches Absorptionsmaximum bei 280 nm. Nukleinsuren haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm. Um die Reinheit einer zu messenden Nukleinsure-Lsung gewhrleisten zu knnen, kann der Ratio260/280 ermittelt werden. Ist der Wert > 2,0 so kann man davon ausgehen, dass die Lsung nicht mit Proteinen kontaminiert ist. Ist der Wert < 2,0 hat man zustzlich Proteine in seiner Lsung und muss diese gegebenenfalls aufreinigen (10). Kontaminationen durch Kohlenhydrate, Salze, Phenol mssen bei der Konzentrationsbestimmung einer Nukleinsurelsung auch vermieden werden. Um diese ausschlieen zu knnen wird der Ratio260/230 bestimmt. Ist der Wert > 2,0 so kann man von einer reinen Lsung ausgehen. Ist der Wert < 2,0 so ist die Lsung kontaminiert.

2.7. qPCR
Bei der qPCR bindet ein Farbstoff an die doppelstrngige DNA. In den Experimenten wurde der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green eingesetzt. Liegt der Farbstoff ungebunden in Lsung vor, so kann er kaum detektiert werden. Erst wenn er an die dsDNA bindet kann die Emission bei 530 nm detektiert werden. Somit ist das Emissionssignal des Farbstoffes direkt proportional zum Amplificationsprodukt der DNA. Um berprfen zu knnen, ob das richtige Produkt entstanden ist und um eine Dimerisierung der Primer auszuschleien, wird eine Schmelzkurve aufgenommen, dabei wird das Produkt langsam auf 95 C aufgeheizt. Dabei wird die dsDNA wieder einzelstrngig und der Fluoreszenzfarbstoff kann nicht mehr binden, was eine als Abnahme der Emission detektiert wird. Die Abnahme entspricht dem Schmelzpunktpeak Tm in der Schmelzkurve. Aus den Amplifikationskurven kann man die Crosspoints, Cp-Werte, bestimmen. Die Cp-Werte entsprechen der Anzahl an PCR-Zyklen die ntig sind um ein konstant definiertes Fluoreszenzniveau
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zu erreichen (11). Die Cp-Werte knnen auf ein nicht reguliertes Gen, Housekeeper, bezogen werden, Cp-Werte, diesen Vorgang nennt man Normalisierung. Um eine Aussage darber machen zu knnen, ob das betrachtete Gen hoch oder herunter reguliert wird, whrend einer Behandlung im Vergleich zum Housekeepergen, kann der Cp-Wert berechnet werden.

2.8. Untersuchte Gene


2.8.1. Cytokeratin 8 Cytokeratin 8 ist ein Oberflchenprotein auf den MEC, es dient, wie CD45 ebenfalls, als Marker fr die Erkennung der MEC (5). Es ist spezifisch fr MEC, d.h. es kommt nicht auf Lymphozyten oden Fibroblasten vor und somit kann man mit Hilfe des Cytokeratin 8 die Zellen isolieren (4). 2.8.2. Glut-1 Glut-1 ist ein Glucosetransporter, durch den die D-Glucose in die MEC gelangt und an der basolateralen Seite der Epithelzellen lokalisiert ist. D-Glucose wird zur Synthese von Lactose bentigt. Die Lactosesynthese steigt rasch mit dem Anfang der Laktation an und fllt mit dem Ende der Lactation ab, deshalb muss whrend der Laktation vermehrt D-Glucose aufgenommen werden (12). 2.8.3. GR Glucocorticoidrezeptor Glucocorticoide sind Steroidhormone, die zusammen mit Stat5a einen stabilen Aktivierungskomplex bilden knnen dabei wird Stat5a vor der Dephosphorylierung geschtzt und kann lnger an der DNA binden und die Transkription aktivierne (7). 2.8.4. Housekeepergen - Histon und Ubiquitin Houskeepergene sind Gene von denen man wei, dass die whrend einer Behandlung nicht hoch bzw. herunter reguliert werden (11). 2.8.5. -Kasein Ist ein Hauptmilchprotein und gehrt zu den Kaseinen. Es verhindert das Ausfallen der anderen Kaseine in Abwesenheit von Ca2+, indem es Micellen mit den Ca2+-abhngigen Kaseinen bildet (2). Die Struktur und vor allem die Promotorregion von -Kasein ist in verschiedenen Tieren konserviert und enthlt ein leader peptid (2). Es hat ein primordial Gen mit der -Kette des Fibrinogens gemeinsam. (6) 2.8.6. RunX2 RunX2 ist ein Transkriptionsfaktor fr die Transkription vieler Knochenspezifischen Gene. Er wird in den Euterepithelzellen gebildet. Seine Rolle in den Euterepithelzellen ist jedoch noch unklar er bildet jedoch einen stabilen Komplex mit dem ubiquitren Transkriptionsfaktor Oct-1 und dieser Komplex kann die Expression von -Kasein aktivieren (13).
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2.8.7. Stat 5a Stat5, signal transducer and activator of transcript protein 5, ist ein primrer Transkriptionsfaktor. Er kommt in zwei Isoformen vor, Stat5a und Stat5b. Die beiden Formen sind sehr ahnlich, was auf eine Genduplikation hindeutet. Stat5 ist nicht milchspezifisch, d.h. es wird in vielen verschiedenen Geweben exprimiert. Das Ende der Lactation hat keinen Einfluss auf die Expression von Stat5. Die Aktivierung von Stat5 erfolgt ber Hormone, Wachstumsfaktoren und Cytokine. Stat5a wird von Prolactin durch Thyrosinphosphorylierung stimuliert (7). In allen Milchproteinen gibt es Bindungsstellen fr Stat5a. Stat5a tritt mit GR in Wechselwirkung und beide bilden einen stabilen Aktivierungskomplex der an den -Kasein Promotor binden kann und somit die Expression von -Kasein aktivieren kann (7).

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3. Zielsetzung
Neben den invasiven Methoden, Schlachtung und Euterbiopsien, ist die Isolation der Euterepithelzellen aus der Milch eine nicht invasive Methode um Epithelzellen zu isolieren. Euterepithelzellen knnen aus der Milch durch zwei verschiedene Methoden gewonnen werden. Bei der in vivo Methode werden die Euterepithelzellen direkt aus der frischen Milch isoliert und bei der in vitro Methode werden die Zellen der Milch in Nhrmedium in Zellkulturflaschen vier Wochen lang kultiviert. Somit ist einer der Hauptunterschiede der beiden Methoden die Zeit, in der die Euterepithelzellen in ihrer natrlichen Umgebung verbleiben. Da sich die Zellen bei der in vitro Methode vier Wochen lang in einer anderen Umgebung befinden, kann es zu nderungen der Expression der Milchproteine kommen. Denn im Nhrmedium sind nicht alle Faktoren enthalten, die die Expression der Milchproteine enthalten. Um Unterschiede in der Milchproteinexpression feststellen zu knnen, wird die RNA aus den gewonnenen Zellen isoliert und die Konzentration verglichen. Auerdem werden im Photometer der Ratio260/280 und der Ratio260/230 ermittelt, die ein Ma fr die Verunreinigung der im Photometer gemessenen Lsung sind. In einem zweiten Teil wird die extrahierte RNA mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Mit der cDNA werden im einer qPCR die Expression einzelner Gene untersucht. Da man Milchproben zu verschiedenen Zeitpunkten der Laktation fr die Versuche ausgewhlt hat, kann man nicht nur die beiden Methoden miteinander vergleichen, sondern mglicherweise auch Unterschiede in der Expression von Cytokeratin 8, Glut-1, Glococorticoidrezeptor, -Kasein, RunX2 und Stat5a feststellen.

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4. Material und Methoden


4.1. Versuchsaufbau und Probennahme
Die Versuchskhe wurden zweimal tglich gemolken; die Milchproben entstammen dem Morgengemelk. Vor dem Melken wurden das Euter und die Zitzen der Khe mit Wasser gereinigt, mit Euterpapier getrocknet und mit 70 % Ethanol besprht. Anschlieend wurde das gesamte Gemelk in einen zuvor mit 70 % Ethanol ausgesprhten Eimer gemolken. Aus dem Gesamtgemelk wurden dann die reprsentativen Proben mit einem autoklavierten Messbecher entnommen und in PE-LDFlaschen (in vivo) oder in autoklavierte Glasflaschen (in vitro) berfhrt. Parallel dazu wurde eine Probe vom Milchprfring Bayern, Wolnzach auf ihre Milchinhaltsstoffe untersucht (Fett, Eiwei, Laktose, Zellzahl, pH-Wert, Harnstoffgehalt). Die Milchmenge wurde ber eine Wiegeeinrichtung erfasst.

4.2. In vivo Isolation von bovinen Euterepithelzellen aus der Milch


Gerte und Reaktionsgefe Abzug Cryovial 3 ml, freistehend Eis AF10 Falcontubes 50 ml HERAfreezeTM Laborzentrifuge 6K10 Magnet Pipettensatz 10 l, 100 l, 1000 l Pipettensatz 40 l, 1000 l pipetman P100 pipetman P1000 Przisionswaage Reaktionsgefe 1,5 ml Reinstwasseranlage Milli-Q (Academic) Rollermixer srt1 Spitzbodenbecher VORTEX MIXER wizard x Zentrifuge 5415 R Zentrifuge Multifuge X3R Waldner electronics Simport SCOTSMAN Greiner Heraeus Sigma Laborzentrifugen GmbH DYNAL MPC-L eppendorf Research Labsystems GILSON GILSON Denver Instruments Eppendorf MILLIPORE Stuart Scientific Nalgene VELP Scientifica Eppendorf Heraeus

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Reagenzien Albumin bovine fraction pH 7,0 Dynabeads Pan Mouse IgG Ethanol > 99,8% KCl KH2PO4 mouse monoclonal antibodies Cytokeratin 8 NaCl Na2HPO4 x 2 H2O PBS-Puffer 1x SERVA Invitrogen Dynal AS ROTH GmbH ROTH GmbH Merck KgaA EXBIO Merck KgaA Merck KgaA 8 mM Na2HPO4 x 2 H2O 2,7mM KCl 1,5 mM KH2PO4 137 mM NaCl Qiagen

QIAZOL Lysis Reagent

Am Probennahmetag werden aus dem Morgengemelk zwei reprsentative Proben zu je 1800 ml Milch entnommen. Die Milch wird in vier Spitzbodenbechern 450 ml berfhrt und bei 1.500 g und 4 C fr 30 min abzentrifugiert, der berstand wird verworfen. Je zwei Zellpellets wird in 50 ml PBSPuffer aufgenommen. Die Zellsuspension wird bei 1.500 g und 4 C fr 15 min abzentrifugiert, der berstand wird verworfen und das Pellet in 1 ml PBS+BSA-Puffer resuspendiert. Die Suspension wird in ein 3ml-Cryotube berfhrt und mit 1 l Cytokreatin 8 Antikrper fr 10 min auf dem Rollermixer bei 4 C inkubiert. Anschlieend wird 1 ml PBS+BSA-Puffer hinzugefgt und bei 300 g und 4C fr 8 min abzentrifugiert. Der berstand wird verworfen und das Pellet in 1 ml PBS-BSA-Puffer resuspendiert. Zu der Suspension werden 25 l Dynabeads gegeben und auf dem Rollermixer bei 4 C fr 20 min inkubiert. Die Epithelzellen werden mit Hilfe des Magneten MPC-L von den brigen Zellen aus der Milch getrennt und der berstand verworfen. Anschlieend werden die Zellen mit 1ml PBS+BSA-Puffer gewaschen und die Eutherepithelzellen erneut mit Hilfe eines Magneten abgetrennt. Der berstand wird verworfen und die gewonnenen Epithelzellen werden in 700 l Qiazol resuspendiert und bei -80 C weggefroren.

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Funktionsweise der Dynabead Pan Mouse IgG Zunchst wird ein primrer mouse IgG-Antikrper zum Zellpellet aus der Milch gegeben. Dieser bindet spezifisch an Cytokeratin 8. Cytokeratin 8 ist ein Oberflchenprotein auf der Zelloberflche der Euterepithelzellen. Anschlieend werden Dynabeads dazu gegeben. Dynabeads sind ein Konstrukt aus einem Anti-Mouse-IgG-Antikrper der spezifisch gegen den primren mouse IgG Antikrper bindet. Da zuerst die Zellen mit dem primren Antikrper inkubiert werden, wird in diesem Versuch die indirekte Technik benutzt. Bei der direkten Technik wrde man die Dynabeads mit dem primren Antikrper inkubieren und dann erst zu dem Zellpellet geben. Nach einer Inkubationszeit von 20 min wird die Lsung in den Magneten MPC-L gegeben. Dadurch werden die Dynabeads vom Magneten angezogen und der berstand kann vorsichtig abpiettiert werden und somit verbleiben die

Euterepithelzellen im Reaktionsgef. Diese Technik ist eine positive Isolation der Epithelzellen.
Abbildung 4: Funktionsweise der Dynabeads

4.3. In vitro Isolation von bovinen Euterepithelzellen aus der Milch


Gerte und Reagenzgefe Axiovert 25 Cell strainer Co 2 Cell Falcontubes 15 ml, 50 ml Glaspipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml HERA safe Kulturflasche 25 cm2 Lamin Air Neubauerzhlkammer pipetus-akku Pipettensatz 10 l, 200 l, 1000 l Spitzbodenbecher Tischzentrifuge 5702 Wasserbaderhitzer Zentrifuge CR412
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ZEISS BD Falcon TM MM- Group SARSTEDT Cellstar R Heraeus Cellstar R Heraeus BRAND Hirschmann-Laborgerte Eppendorf Nalgene Eppendorf HAAKE Jouan

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Reagenzien Amphotericin B Lsung Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12 Ham FKS ftales Klberserum Gentamycin HBSS ITS Nhrmedium Sigma-Aldrich SIGMAR GIBCO Invitrogen SIGMAR SIGMAR SIGMAR Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12 Ham 50 ml FKS 10 ml PenStrep 200 l Amphotericin 5 ml ITS 1 ml Gentamycin Sigma-Aldrich 135 ml autoklaviertes Wasser 15 ml HBSS 3 ml PenStrep 120 l Amphotericin 300 l Gentamycin

PenStrep Waschlsung

Am Probennahmetag werden aus dem Morgengemelk zwei reprsentative Proben ui je 1000 ml Milch entnommen. Das Nhrmedium und die Waschlsung werden vor Arbeitsbeginn im Wasserbad auf 37 C erwrmt. Die Milch wird auf zwei Spitzbodenbecher 500 ml verteilt und fr 15 min bei 3100 rpm und 22 C abzentrifugiert. Unter der Sterilbank wird der berstand verworfen und das Zellpellet in 50 ml Waschlsung aufgenommen. Die Zellsuspensionen werden bei 3000 rpm fr 5 min abzentrifugiert und anschlieend wird der berstand verworfen. Die Zellpellets werden in je 25 ml Waschlsung aufgenommen und ber einen 200 m-Filter in ein 50 ml Falcontube vereinigt. Das Zellpellet wird erneut abzentrifugiert. Der berstand wird verworfen, das Zellpellet in 7 ml Nhrmedium aufgenommen und in eine Kulturflasche berfhrt. Die Zellkultur wird bei 37 C inkubiert (5 % CO2). 24 Stunden nach der Extraktion der Zellen aus der Milch werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit frischem Nhrmedium versorgt. In dieser Zeitspanne heften sich die Epithelzellen an den Flaschenboden an und alle nicht-adhrenten Zellen, die Immunzellen, knnen entfernt werden. Hierzu wird das alte Medium mittels einer sterilen Glaspipette vorsichtig abgesaugt und 1 ml PBS in die Flasche gegeben. Die Zellkulturflasche wird ein paar Mal vorsichtig geschwenkt um die Zellen zu waschen. Anschlieend wird das PBS wieder abgesaugt und die Flasche erneut mit 7 ml Nhrmedium befllt.
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Alle 3 bis 4 Tage wird das Nhrmedium in den Zellkulturflaschen durch neues Medium ersetzt. Gleichzeitig werden die Zellkulturen unter dem Mikroskop betrachtet um das Wachstum der Zellen zu verfolgen und um Aufflligkeiten zu erkennen. Wenn die Zellen konfluent sind, sptestens aber nach 4 Wochen, werden die Zellen geerntet. Dazu wird das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS (im Wasserbad auf 37C erwrmt) gewaschen und der Zellrasen mit 2 ml Accutase fr 30 min bei 37C inkubiert. Der Enzymkomplex Accutase bewirkt das Ablsen der Zellen indem es die Collagenbindungen auflst. Die abgelsten Zellen werden mit einer 10 ml Pipette aufgenommen und in einem 15 ml-Falcontube gesammelt. Aus der Suspension werden 7 l entnommen und auf die Neubauer Zhlkammer aufgebracht. In der Zhlkammer kann die Zellzahl unter dem Mikroskop gezhlt werden.Die Suspension wird zentrifugiert, die Accutase vorsichtig entfernt und das Pellet im Lysis Buffer des NucleoSpin RNA II Kits von Macherey-Nagel aufgenommen und bei -80 C weggefrohren.

4.4. RNA-Extraktion aus in vivo gewonnener Euterepithelzellen


Gerte und Reaktionsgefe Abzug Biophotometer Eis AF10 HERAfreezeTM Zentrifuge 5415 R miRNeasy Mini Kit 50 Pipettensatz 10 l, 100 l, 1000 l Quarzkvette LG100-UV-G 6776 VORTEX MIXER wizard x Waldner electronics eppendorf SCOTSMAN Heraeus EPPENDORF QIAGEN eppendorf Research IMPLEN VELP Scientifica

Reagenzien Chloroform Trichlormethan Rotipuran >99% Ethanol > 99,8% water, Molecular Biology Grade ROTH GmbH ROTH GmbH eppendorf

Die RNA in vivo gewonnener Euterepithelzellen wurde nach dem Protokoll Purification of Total RNA, Including Small RNAs, from Animal Cells aus dem Kit miRNeasy Mini Kit 50 der Firma QIAGEN extrahiert. Das RNA-Pellet wurde in 30 l Rnase-freiem Wasser gelst. Die Konzentration der extrahierten RNA wurde im Biophotometer gemessen. Dazu wurden 3 l RNase-freies Wasser als Referenz benutzt. Durch die Messung der optischen Dichte der RNA-Lsung und durch Abgleich mit der Referenz, wird die Konzentration der RNA im Biopchotometer bestimmt.
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4.5. RNA-Extraktion aus in vitro gewonnener Euterepithelzellen


Gerte und Reaktionsgefe Abzug Centrifuge 5415 D Pipettensatz 10 l, 200 l, 1000 l Spectrophotometer "NanoDrop 1000" PRUTSCHER eppendorf eppendorf Promega

Reagenzien NucleoSpinR RNA II Macherey-Nagel

Die RNA in vitro gewonnener Euterepithelzellen wurde nach dem Protokoll Total RNA purification from cultured cells and tissue with NucleoSpin RNA II aus dem Kit NucleoSpin RNA II der Firma Macherey-Nagel extrahiert. Das RNA-Pelett wurde in 30 l Rnase-freiem Wasser gelst. Im Nanodrop 1000 wurde die Konzentration der extrahierten RNA gemessen. Es wurden 1,5 l Rnase-freies Wasser als Referenz verwendet.

4.6. Umschreiben der RNA in cDNA mittels Reverser Transkriptase


Gerte und Reaktionsgefe BiometraR TGradient

Reagenzien M-MLV Reverse Transkriptase Rnase HMInus water, Molecular Biology Grade Promega eppendorf

Nach dem Protokoll M-MLV Reverse Transkriptase Rnase HMInus von Promega wird die RNA in cDNA umgeschrieben. Dazu mssen 500 ng RNA verdnnt werden, so dass sie in 41 g H2O vorliegen. Um die Synthese durchfhren zu knnen, mssen 19 l des folgenden Mastermixes zugegeben werden. 5 x Reaction buffer dNTPs Random Primer 50 mM RT Enzym 12 l 3 l 3 l 1 l

Abbildung 5: Zusammensetzung der RT-Reaktion

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Im Tgradient von BiometraR wird folgende Reaktion durchgefhrt: Temperatur in C 21 C 48 C 90 C 4 C Zeiteinheiten in min 10 min 50 min 2 min hold

Abbildung 6: Reaktionsverlauf der RT-Reaktion

4.7. qPCR
Gerte und Reaktionsgefe LC Carousel Centrifuge Light Cycler R Capillaries (20 l) Light Cycler Light CyclerR Fast Pipettensatz 2,5 l; 10 l; 20 l; 100 l; 200 l; 1000 l Rosche Rosche Rosche Rosche eppendorf

Reagenzien LightCyclerR DNA Master SYBR Green water, Molecular Biology Grade Rosche eppendorf

4.8. Primer
Name Histone H3 Cytokeratin 8 GR Glut-1 -Casein RunX2 Stat5a Ubiqitin for rev for rev for rev for rev for rev for rev for rev for rev Sequenz ACT TGC TAC AAA AGC CGC TC ACT TGC CTC CTG CAA AGC AC AGT GGC AAC GCA GGT GGA CT CCG CAA GAG CCT TTC ACT TG ACC AAT TCC TGT CGG TTC AG TGA GGA ACT GGA TGG AGG AG GTG CTC CTG GTT CTG TTC TTC A GCC AGA AGC AAT CTC ATC GAA TGC AAT GAT GAA GAG TTT TTT CCT AG GAT TGG GAT ATA TTT GGC TAT TTT GT GCC TAG GCG CAT TTC AGG TGC T TGA GTG GTG GCG GAC ATA CCG A GTG AAG CCA CAG ATC AAG CA TCG AAT TCT CCA TCC TGG TC AGA TCC AGG ATA AGG AAG GCA T GCT CCA CCT CCA GGG TGA T Temperatur [C] 60 C 62 C 60 C 61 C 54 C 61 C 62 C 60 C

Abbildung 7: Primer der qPCR

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Die Reagenzien der PCR werden nach dem Protokoll Light Cycler DNA Master SYBR Green I zusammengestelllt. Dabei werden folgende Reaktionskomponenten aus dem Kit LightCyclerR DNA Master SYBR Green mit 1 l cDNA gemischt und anschlieend im Light Cycler gemessen. Reaktionskomponenten H2O MgCl2 Forward Primer, 20 ppm Reversed Primer, 20 ppm Enzym Bentigtes Volumen pro Reaktionsansatz in [l] 6,4 l 1,2 l 0,2 l 0,2 l 1,0 l

In jedem Lauf wurde ein Interplate Calibrator (Mix aus drei verschiedenen Proben) verwendet um bei der anschlieenden Auswertung die PCR-Lufe in Relation setzen zu knnen.

4.9. Statistische Auswertung


Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mittels des Statistikprogrammes SigmaStat 3.0. Die Grafiken sind mit Microsoft Office Excel 2007 erstellt worden. Die Daten wurden auf Normalverteilung geprft. Alle Versuchsergebnisse werden als Mittelwert Standardabweichung angegeben. Mit Hilfe derOne Way Repeated Measures Analysis of Variance wurden mit einer Irrtumswahrscheinlich keit von 5 %, die CP-Werte auf signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen getestet.

4.10. Berechnung der Anzahl gewonnener Euterepithelzellen


Der Milchprfring bestimmt den Fett-, Protein- und Laktosegehalt einer eingereichten Milchprobe, sowie die Gesamtzahl der Zellen in dieser Milchprobe. Bei der in vivo Methode wurden Zellen aus 1800 ml Milch genommen. Da der Milchprfring immer Zellen pro kg Milch angibt, muss die angegebene Anzahl an Zellen mit 1,8 multipliziert werden. Die Anzahl an Euterepithelzellen in der Milch liegt zwischen 0% und 2%, um die Anzahl der Euterepithelzellen einer Probe die nach der in vivo Methode isoliert wurde bestimmen zu knnen wird der Mittelwert 1% genommen. Somit hat man die errechnete Anzahl an Euterepithelzellen in einer Milchprobe der in vivo Methode. Bei der in vitro Methode wurde die Anzahl an Epithelzellen in 1 ml Medium mit Hilfe einer Neubauerzhlkammer bestimmt.

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Prinzip der Neubauerzhlkammer

Abbildung 8: Aufbau der Neubauerzhlkammer (14)

Die Neubauerzhlkammer ist in einen Objekttrger eingeprgt. ber diese wird ein Deckglas geschoben und 7 l der geernteten Zellsuspension aufgetragen. Die Neubauerzhlkammer fasst ein Volumen von 1 l. Unter dem Mikroskop werden jeweils die Zellen in den ueren vier 4x4 Quadraten gezhlt. Falls sich Zellen direkt auf den ueren Linien der Quadrate befinden, so werden nur die linke und unteren Zellen mitgezhlt. Anschlieend wird die Anzahl der Zellen aus allen vier Quadraten gemittelt und mit multipliziert, und anschlieend verdoppelt, da man mit 2 ml

Akkutase die Zellen aus 1000 ml Milch erntet. Somit bekommt man die Anzahl der Zellen aus der in vitro Methode. Bei der in vivo Methode knnten die Zellen auch mit Hilfe der Neubauerzhlkammer gezhlt werden, darauf wird jedoch verzichtet und die Anzahl an Euterepithelzellen in der Probe wird, wie in Kapitel 4.10. beschrieben, errechnet.

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5. Ergebnisse
Von 14 Versuchskhen der Rasse Holstein Friesian, die auf der Versuchsstation Veitshof aufgestallt sind, wurden jeweils post partum an den Tagen 8, 15, 22, 29, 43, 57, 113, 141, 148 und am Tag der Schlachtung (ungefhr Tag 150) Milchproben, fr die in vivo Methode genommen. Von denselben Khen wurden am Tag 15, 57, 113 und am Tag der Schlachtung Milchproben fr die Zellkultur, in vitro Methode, genommen. Fr den Vergleich der beiden Isolationsmethoden von Euterepithelzellen standen Proben von 12 Khen am Tag 15 der Laktation, 10 Proben von Tag 57 der Laktation, 8 Proben von Tag 113 und eine vom Tag der Schlachtung zur Verfgung.

5.1. Vergleich der gemessenen RNA-Konzentrationen


5.1.1. Vergleich der RNA-Konzentrationen der beiden Methoden Die RNA-Konzentrationen wurden im Biophotometer bzw. Nanodrop gemessen. CC Mittelwert der RNA-Konzentration in [ng/l] Standardabweichung
Abbildung 9: RNA-Konzentrationen

MEC 115,21 73,95

280,02 161,41

Die Mittelwerte der RNA-Konzentrationen aus den beiden Methoden liegen weit auseinander. Aus den Euterepithelzellen der frischen Milch, in vivo Methode, konnte weniger RNA isoliert werden, als bei der in vitro Methode.

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5.1.2. Vergleich der RNA-Konzentrationen an den Probenahmetagen

Vergleich der gemessenen RNAKonzentrationen


Mittelwerte der RNA-Konzentrationen in [ng/l] 450,00 400,00 350,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 15 57 Tag der Probennahme 113

MEC CC

Abbildung 10: Vergleich der RNA-Konzentrationen

In Abbildung 10 sind die Mittelwerte der RNA- Konzentrationen und deren Standardabweichungen aufgetragen. Um einen Vergleich zwischen den Proben aus der in vivo und der in vitro Methode in Bezug auf die unterschiedlichen Stadien der Laktation machen zu knnen, sind alle Proben fr die jeweiligen Probenahmetage gemittelt worden. Die blauen Balken, MEC, stehen dabei fr die Proben aus der in vivo Methode und die roten Balken, CC, fr die in vitro Methode. In Abbildung 10 wird deutlich, dass die RNA-Konzentrationen bei der in vitro Methode hher sind als die der in vivo Methode. Vergleicht man die Werte der einzelnen Probennahmetage, sieht man, dass die RNA-Konzentration am Tag 113 hher ist als an den anderen beiden Probenahmetagen.

5.2. Vergleich der Anzahl isolierter Euterepithelzellen


MEC Mittelwert der Anzahl isolierter 0,78 Euterepithelzellen Standardabweichung Mittelwerts
Abbildung 11: Anzahl isolierter Euterepithelzellen

CC 466,72

des

1,03

222,8158

Die Tabelle aus Abbildung 11 zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen der berrechneten bzw. gezhlten Euterepithelzellen aus den jeweiligen Milchproben. Bei der MEC hat man
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durchschnittlich 0,78 durchschnittlich 466,72

Zellen pro Milchprobe, d.h. pro 1800 ml Milch. Bei der CC hat man Zellen pro 1000 ml Milch. Somit kann man sagen, dass man aus der in

vivo Isolation von Euterpithelzellen aus der Milch sehr viel weniger Epithelzellen gewinnt, als bei der in vitro Isolation. Die Standardabweichungen sind hoch, bei der MEC sind sie hher als der Mittelwert. cell count (x103) 306 7 870 80 Anzahl der Epithelzellen [*1000] 5,508 0,126 870 80

cow

cells

DIM

sample- milk ID 1 2 1 1 [ml] 1800 1800 1000 1000

RNA

solve RNA [g] 6,87 2,19 5,49 5,49

[ng/l] in l 229 73 182,99 182,89 30 30 30 30

15366 MEC 15265 MEC 34303 25242 CC CC

15 57 57 57

Abbildung 12:Individuelle Variation der Anzahl an Euterepithelzellen

Um die hohe Standardabweichung zu erklren, sind in Abbildung 12 jeweils die Extremwerte der Anzahl an gewonnenen Euterepithelzellen aus der Milch aus beiden Isolationsmethoden aufgefhrt. Mit cell count sind jeweils die vom Milchring angegebenen Zellen aus der Milch aus den eingereichten Milchproben. Daraus ist erkennbar, dass es individuelle Schwankungen in der Anzahl der Zellen in der Milch gibt und damit auch Schwankungen in der Anzahl der Euterepithelzellen.

5.3. Vergleich der A260/280- bzw. A260/230-Werte


Bei der Messung der RNA-Konzentration verwendet man photometrische Messmethoden. Dabei wird ein Spektrum aufgenommen, indem bei jeder Wellenlnge die Extinktion der zu messenden Lsung ermittelt wird. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetztes wird anschlieend die Konzentration errechnet. Um sicher gehen zu knnen, dass die RNA-Lsungen rein sind und somit die errechnete Konzentration nicht durch Kontaminationen, z.B. Kohlenhydrate oder Proteine, verflscht wird, wird der A260/280-Wert, der A260/230 und der A320 Wert mit der RNA-Konzentration angegeben. Das Extinktionsmaximum von Proteinen liegt bei 280 nm. Das Extinktionsmaximum von Nukleinsuren liegt bei 260 nm. Kohlenhydrate und Salzkontaminationen treten bei 230 nm auf. Der A260/280-Wert ist somit ein Ma fr die Reinheit der RNA-Probe in Bezug auf Protein oder Phenolkontaminationen. Der A260/280-Wert sollte bei der Messung der RNA-Konzentration bei ca. 2,0 liegen. Ist er niedriger kann man von einer Kontamination durch Proteine in der Lsung ausgehen.
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Vergleich der A260/280-Werte


Mittelwerte der A260/280-Werte 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 15 57 Tag der Probennahme 113 MEC CC

Abbildung 13: Vergleich der A260/280-Werte

In Abbildung 13 wurden die A260/280-Werte die Proben der jeweiligen Gruppe am Tag 15 der Laktation, Tag 57 und Tag 113 gemittelt. Die blauen Balken, mit MEC gekennzeichnet, entsprechen den Proben, die durch die in vivo Isolation gewonnen wurden. Die roten Balken, mit CC gekennzeichnet, entsprechen demnach den Proben, die durch die in vitro Isolation gewonnen wurden. In Abbildung 13 sieht man eindeutig, dass alle RNA-Lsungen, der in vivo Methode, einen niedrigeren A260/280-Wert haben als die RNA-Lsungen der in vitro Methode, deren A260/280-Wert ca. 2,0 entspricht. Es ist kein markanter Unterschied der Werte zu den einzelnen Probentagen ersichtlich. Die Standardabweichungen sind bei den Proben aus der Zellkultur geringer als bei den Proben aus der frischen Milch. Das deutet darauf hin, dass die Proben der Zellkultur weniger verunreinigt sind als die aus der frischen Milch und die Schwankungen zwischen den einzelnen Proben nicht so gro sind. Bei den in der Zellkultur gezchteten Epithelzellen kann eine bessere und konstantere Qualitt der RNA erziehlt werden.

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Vergleich der A260/230-Werte


Mittelwerte der A260/230-Werte 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 15 57 Tag der Probennahme 113

MEC CC

Abbildung 14: Vergleich der A260/230-Werte

Zum Vergleich der A260/230-Werte wurden in Abbildung 14 die Proben der jeweiligen Gruppe am Tag 15 der Laktation, Tag 57 und Tag 113 gemittelt und aufgetragen. Die blauen Balken, mit MEC gekennzeichnet, entsprechen den Proben, die durch die in vivo Isolation gewonnen wurden. Die roten Balken, mit CC gekennzeichnet, entsprechen den Proben, die durch die in vitro Isolation gewonnen wurden. Im Gegensatz zu den A260/280-Werten weichen die A260/230-Werte vom Idealwert A260/230>2,0 ab. Daraus lsst sich folgern, dass bei beiden Methoden die RNA-Lsungen stark durch Kohlenhydrate und Salze verunreinigt sind. Es besteht dennoch ein Unterschied zwischen den RNALsungen der Methoden. Die A260/230 Werte der in vitro Methode liegen hher als die Werte der in vivo Methode. Womit das Ma der Verunreinigung bei der in vitro Methode hher ist.

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5.4. Cp-Werte
Wie in Kapitel 2.7 qPCR erwhnt kann man mit Hilfe einer qPCR cDNA detektieren und die Amplifizierung bestimmen. Der im Master Mix SYBR Green aus LC Fast Start Reaction Mix enthaltene Farbstoff SYBR Green lagert sich in die Doppelhelix der DNA ein. Das Auftreten der Fluoreszenz ist somit direkt proportional zum Amplifikationsprodukt. Die Cp-Werte geben an, ab welchem Amplifikationszyklus die Fluoreszenz des SYBR Green auftritt. Je frher das Fluoreszenzsignal auftritt, desto mehr Amplifizierungsprodukt entsteht, d.h. niedrige CpWerte sprechen fr eine Aktivitt des untersuchten Gens. Folgende Primer wurden in den Versuchen verwendet: Name Histone H3 Cytokeratin 8 GR Glut-1 -Casein RunX2 Stat5a Ubiqitin Temperatur [C] 60C 62 C 60 C 61 C 54 C 61 C 62 C 60 C

Abbildung 15: Amplificationstemperaturen der Primer

Alle Cp-Werte sind normalverteilt, bis auf die Werte der Proben Ubi-CP-MEC, kCAS-CP-MEC, RunX2CP-CC, die von den Milchproben des 113. Tags der Laktation sind, was durch die geringe Anzahl der Proben an diesem Versuchstag zu begrnden ist. Um die Cp-Werte zwischen den einzelnen Probennahmetagen vergleichen zu knnen und dadurch eine Aussage ber die Expression der Gene whrend der Laktation machen zu knnen, wurden alle Cp-Werte eines Probentages die mit einem Primer gemessen wurden und mit einer gemeinsamen Isolationsmethode isoliert wurden gemittelt und deren Standardabweichung berechnet und jeweils die beiden Ergebnisse aus den beiden Methoden in einer gemeinsamen Grafik gegenbergestellt. In allen Grafiken, die die Cp-Werte betreffen, sind die Proben der in vitro Methode blau dargestellt und die Proben der in vivo Methode rot. Beim Vergleich der Werte muss beachtet werden, dass fr den Mittelwert der Cp-Werte am Tag 15 12 Proben, am Tag 57 10 Proben und am Tag 57 der Laktation nur 8 Proben zur Verfgung standen. Somit ist der Wert des Probennahmetags 15 genauer als der Wert des Probennahmetags 113.
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Cp-Werte von Histon


Mittelwert der Cp-Werte 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 15 57 113 Mittelwert der CpWerte der MEC Mittelwerte der CpWerte der CC

Tag der Probennahme

Abbildung 16: Cp-Werte von Histon

In Abbildung 16 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR des Primers Histon aufgetragen. Es ist kein signifikanter Unterschied der Cp-Werte zwischen den einzelnen Probennahmetagen erkennbar. Jedoch ist ein Unterschied zwischen den Cp-Werten der CC und der MEC erkennbar. Die Cp-Werte der CC sind niedriger als die Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von Histon als in den Zellen aus der frischen Milch.

Cp-Werte von Ubiquitin


Mittelwerte der Cp-Werte 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 15 57 113 Mittelwerte der CpWerte der MEC Mittelwerte der CpWerte der CC

Tag der Probennahme

Abbildung 17: Cp-Werte von Ubiquitin

In Abbildung 17 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR des Primers Ubiquitin abgebildet. Zwischen den Cp-Werten der Probennahmetage 15 57 und 113 ist kein signifikanter Unterschied erkennbar. Jedoch ist ein Unterschied zwischen den Cp-Werten der CC und der MEC erkennbar. Die Cp-Werte der CC sind niedriger als die Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von Ubiquitin als in den Zellen aus der frischen Milch.
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Cp-Werte von Cytokeratin 8


Mittelwerte der Cp-Werte 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 15 57 113

Mittelwerte der CpWerte der MEC Mittelwerte der CpWerte der CC

Tag der Probennahme

Abbildung 18: Cp-Werte von Cytokeratin 8

In Abbildung 18 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR des Primers Cytokeratin 8 abgebildet. Zwischen den Cp-Werten der Probennahmetage 15, 57 und 113 ist kein signifikanter Unterschied erkennbar. Sowohl die Werte der CC als auch die MEC-Werte sind an allen drei Probennahmetagen gleich. Es ist aber ein Unterschied zwischen den Cp-Werten der CC und der MEC erkennbar. Die CpWerte der CC sind niedriger als die Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von Cytokeratin8 als in den Zellen aus der frischen Milch.

Cp-Werte von Glut-1


Mittelwerte der Cp-Werte 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 15 57 113

Mittelwerte der CpWerte der MEC Mittelwerte der CpWerte der CC

Tag der Probennahme

Abbildung 19: Cp-Werte von Glut-1

In Abbildung 19 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR des Primers Glut-1. Zwischen den CpWerten der Probennahmetage ist kein signifikanter Unterschied erkennbar.Es ist ein Unterschied zwischen den Cp-Werten der CC und der MEC erkennbar. Die Cp-Werte der CC sind niedriger als die Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von Glut-1 als in den Zellen aus der frischen Milch.
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Cp-Werte von GR
35,0 Mittelwerte der Cp-Werte 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 1 2 Tag der Probennahme 3 Mittelwerte der Cp-Werte der MEC Mittelwerte der Cp-Werte der CC

Abbildung 20: Cp-Werte von GR

In Abbildung 20 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR mit des Primers GR dargestellt. Zwischen den Cp-Werten der drei Probennahmetage der CC und der MEC ist kein signifikanter Unterschied erkennbar. Die Cp-Werten der CC sind niedriger als die Cp-Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von GR als in den Zellen aus der frischen Milch.

Cp-Werte von -Kasein


30,0 Mittelwerte der Cp-Werte 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 15 57 Tag der Probennahme 113 Mittelwerte der Cp-Werte der MEC Mittelwerte der Cp-Werte der CC

Abbildung 21: Cp-Werte von -Kasein

In Abbildung 21 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR mit des Primers -Kasein dargestellt. Zwischen den Cp-Werten der drei Probennahmetage der CC und der MEC ist kein signifikanter Unterschied erkennbar. Die Cp-Werten der CC sind niedriger als die Cp-Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von -Kasein als in den Zellen aus der frischen Milch.
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Cp-Werte von RunX2


40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 15 57 113 Mittelwerte der Cp-Werte

Mittelwerte der CpWerte der MEC Mittelwerte der CpWerte der CC

Tag der Probennahme

Abbildung 22: Cp-Werte von RunX2

In Abbildung 22 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR des Primers RunX2 abgebildet. Zwischen den Cp-Werten der Probennahmetage ist kein signifikanter Unterschied erkennbar. Jedoch ist ein Unterschied zwischen den Cp-Werten der CC und der MEC erkennbar. Die Cp-Werte der CC sind niedriger als die Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von RunX2 als in den Zellen aus der frischen Milch.

Cp-Werte von STAT5a


Mittelwerte der Cp-Werte 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 15 57 113

Mittelwerte der CpWerte der MEC Mittelwerte der CpWerte der CC

Tag der Probennahme

Abbildung 23: Cp-Werte von Stat5a

In Abbildung 23 sind die gemittelten Cp-Werte aus der qPCR des Primers Stat5a aufgetragen. Zwischen den Cp-Werten der Probennahmetage ist kein signifikanter Unterschied erkennbar. Zwischen den Cp-Werten der CC und der MEC besteht auch ein Unterschied. Die Cp-Werte der CC sind niedriger als die Werte der MEC, somit ist in den Zellen aus der Zellkultur mehr RNA von Stat5a als in den Zellen aus der frischen Milch.
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H3DIM Differenz Mittelwerte Standardabweichung Mittelwerte Standardabweichung Mittelwerte Standardabweichung 113 57 15 5,2 2,4 4,9 2,0 3,7 0,9

UbiDifferenz 6,0 2,3 5,7 3,5 3,5 1,0

CK8Differenz 10,3 1,2 9,5 1,3 7,6 0,8

GRDifferenz 5,3 2,2 4,0 3,6 2,4 1,2

Glut1Differenz 6,4 2,2 7,4 2,8 4,2 0,9

kCASDifferenz -4,7 2,0 -4,2 2,9 -3,0 2,0

RunX2Differenz 6,2 2,0 6,0 3,1 4,4 1,6

Stat5aDifferenz 3,7 2,5 3,8 3,7 1,9 2,1

Abbildung 24: Differenzen der Cp-Werte

Der Zusammenhang zwischen den unterschiedlichen Cp-Werten der MEC und CC hngt dann von einem gemeinsamen Faktor ab, wenn die Differenzen der Cp-Werte der CC und der MEC an allen drei Probenahmetagen gleich sind. In Abbildung 24 sind die Differenzen berechnet. Wie man sehen kann variieren sie sehr stark. Somit kann man keine Beziehung zwischen den Unterschiedlichen Werten der CC und der MEC herstellen. Die Differenzen sind amTag 113 geringer als am Anfang der Laktation, also an Tag 15.

5.5. Vergleich der Cp-Werte


Zur Berechnung der Cp-Werte wird der Mittelwert der Cp-Werte der Houskeepergene, Histon und Ubiquitin, berechnet. Die Mittelwerte der Housekeepergene werden von den Cp-Werten der Zielgene abgezogen. Durchdie Normalisierung werden alle Varianzendie nicht von der Behandlung stammen herausgekrzt. In diesem Versuch entspricht die Zeit der Behandlung. Um eine Aussage ber die Behandlung machen zu knnen, werden mit einem Statistikprogramm die Cp-Werte auf Signifikanz berprft, d. h. wenn eine Signifikanz auftritt, tritt eine nderung in der Genexpression whrend der Laktation der Kuh auf. Ein Vergleich der beiden Methoden untereinander ist jedoch nicht mglich. Bei dem Glucocorticoidrezeptor konnte in der Gruppe MEC ein signifikanter Unterschied errechnet werden, dieser ist jedoch nicht von Bedeutung, weil der ChiQuadrat-Test negativ ausfiel und somit der Tukey-Test griff. Der Tukey-Test lsst sich nicht mit der repeated measures one way ANOVA gleichsetzen.

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Primer Cytokeratin 8 MEC Cytokeratin 8 CC Glut-1 MEC Glut-1 CC GR MEC GR CC k-Casein MEC k-Casein CC RunX2 MEC RunX2 CC Stat 5a MEC Stat 5a CC

Chi-Quadrat-Test bestanden bestanden bestanden bestanden nicht bestanden bestanden bestanden bestanden bestanden bestanden bestanden bestanden

Statistischer Unterschied nicht signifikant nicht signifikant nicht signifikant nicht signifikant signifikant nicht signifikant nicht signifikant nicht signifikant nicht signifikant nicht signifikant nicht signifikant nicht signifikant

Abbildung 25: Ergebnisse des Chi-Quadrat-Tests und statistischer Unterschied

Cp-Werte von Cytokeratin 8


9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 15 57 Tag der Probennahme 113 Mittelwerte der Cp-Werte

Mittelwerte der delta-CpWerte der MEC Mittelwerte der delta-CpWerte der CC

Abbildung 26: Cp-Werte von Cytokeratin 8

In Abbildung 26 sind die Cp-Werte aus der qPCR des Primers Cytokeratin 8 aufgetragen. Aus der Grafik wird ersichtlich, dass sich die Cp-Werte zwischen den beiden Methode unterscheiden. Der Chi-Quadrat Test ist bei den Cp-Werten der MEC bei dem Glococorticoidrezeptor fehlgeschlagen. Im Verlauf der Laktation gab es in beiden Gruppen keine Signifikanten Unterschiede bei der Genexpression von Cytokeratin 8.

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Cp-Werte von Glut-1


Mittelwerte der Cp-Werte 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 15 57 Tag der Probennahme 113 Mittelwerte der delta-CpWerte der MEC Mittelwerte der delta-CpWerte der CC

Abbildung 27: Cp-Werte von Glut-1

In Abbildung 27 sind die Cp-Werte aus der qPCR des Pimers Glut-1 aufgetragen. Die Cp-Werte unterscheiden sich zwischen der in vivo Methode und der in vitro Methode. Bei den Cp-Werte der CC und MEC gibt es keine signifikanten Unterschiede ber die Zeit. Somit tritt im Verlauf der Laktation keine Vernderung in der Genxpression von Glut-1 auf.

Cp-Werte von GR
Mittelwerte der Cp-Werte 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 15 57 113 Mittelwerte der delta-CpWerte der MEC Mittelwerte der delta-CpWerte der CC

Tag der Probennahme

Abbildung 28: Cp-Werte von GR

In Abbildung 28 sind die Cp-Werte aus der qPCR des Primers Glucocorticoidrezeptors aufgetragen. Die Cp-Werte unterscheiden sich zwischen der in vivo Methode und der in vitro Methode. In beiden Gruppen gab es im Verlauf der Laktation keine signifikanten Unterschiede in der Genexpression von GR.
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Cp-Werte von -Kasein


8,0 Mittelwerte der Cp-Werte 6,0 4,0 2,0 0,0 -2,0 -4,0 -6,0 -8,0 Tag der Probennahme 15 57 113 Mittelwerte der delta-CpWerte der MEC Mittelwerte der delta-Cp-Werte der CC

Abbildung 29: Cp-Werte von -Kasein

In Abbildung 29 sind die Cp-Werte aus der qPCR des Primers -Kasein aufgetragen. Aus der Grafik wird ersichtlich, dass sich die Cp-Werte zwischen den beiden Methode unterscheiden. Im Verlauf der Laktation gab es in beiden Gruppen keine Signifikanten Unterschiede bei der Genexpression von -Kasein.

Cp-Werte von RunX2


9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 15 57 Tag der Probennahme 113 Mittelwerte der Cp-Werte

Mittelwerte der delta-CpWerte der MEC Mittelwerte der delta-CpWerte der CC

Abbildung 30: Cp-Werte von RunX2

In Abbildung 30 sind die Cp-Werte aus der qPCR des Primers RunX2 aufgetragen. Aus der Grafik wird ersichtlich, dass sich die Cp-Werte zwischen den beiden Methode unterscheiden. Im Verlauf der Laktation gab es in beiden Gruppen keine Signifikanten Unterschiede bei der Genexpression von RunX2.
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Cp-Werte von Stat5a


Mittelwerte der Cp-Werte 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 15 57 Tag der Probennahme 113 Mittelwerte der delta-CpWerte der MEC Mittelwerte der delta-CpWerte der CC

Abbildung 31: Cp-Werte von Stat5a

In Abbildung 31 sind die Cp-Werte aus der qPCR des Primers Stat5a aufgetragen. Aus der Grafik wird ersichtlich, dass sich die Cp-Werte zwischen den beiden Methode unterscheiden. Im Verlauf der Laktation gab es in beiden Gruppen keine Signifikanten Unterschiede bei der Genexpression von Stat5a.

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6. Diskussion
6.1. Vergleich der gemessenen RNA-Konzentrationen
Bei der in vitro Methode, Zellen aus der Zellkultur, werden die Zellen 4 Wochen und zum Teil noch lnger im Nhrmedium im Inkubator kultiviert. Somit wachsen die Zellen in einer Umgebung, die ihrer natrlichen Umgebung, das Euter der Kuh nicht sehr hnelt. Das Nhrmedium enthlt alle wichtigen Nhrstoffe, die die Zellen zum wachsen bentigen, aber auch Resistenzen, z.B. Gentamycin, die sie vor Pilzbefall schtzen. Im Euter der Kuh bernehmen die Immunzellen den Schutz vor Krankheitserregern. Im Nhrmedium sind auch nicht die spezifischen Wachstumsfaktoren und Aktivatoren der Proteinexpression, die in der Laktationsphase in der Kuh reguliert werden, vorhanden. Das FKS enthlt zwar Wachstumsfaktoren und Hormone etc. jedoch nicht dieselben wie in einer laktierenden Euterepithelzelle. Somit kann man sagen, dass sich durch die nderung der natrlichen Umgebung der Euterepithelzellen auch deren Eigenschaften ndern mssen und somit Unterschiede in der Genexpression auftreten. Da man durch die Messung der RNA-Konzentration die gesamte exprimierte RNA messen kann und nicht die Expression der RNA eines einzelnen betrachteten Proteins, kann man zunchst nur schlussfolgern, dass die Zellen aus der Zellkultur mehr RNA exprimieren als die Zellen aus der frischen Milch. Die im Vergleich zur in vivo Methode erhhte RNA-Konzentration, der Euterepithelzellen aus der Zellkultur kann aber auch daher kommen, da sich durch das Kultivieren der Zellen Kolonien bilden und man somit aus viel mehr Zellen die RNA extrahiert. Nach dem Ernten der Zellen aus den Zellkulturflaschen wird deren Anzahl mit Hilfe der Neubauerzhlkammer bestimmt. Bei der in vivo Methode hat man jedoch keine Mglichkeit die Zellzahl zu bestimmen. Die dadurch geringere Zellanzahl bei der in vivo Methode, versucht man dadurch auszugleichen, indem man Euterepithelzellen aus einer 1800 ml Milchprobe extrahiert und bei der in vitro Methode werden die Euterepithelzellen aus einer 1000 ml Milchprobe isoliert. Die groe Standardabweichung des Mittelwerts der RNA-Konzentration aus den Zellkulturzellen, ist darauf zurckzufhren, dass sich die Euterepithelzellen aus verschiedenen Versuchstieren unterschiedlich gut an das Medium anpassen knnen. Das uert sich darin, dass sie alle unterschiedlich stark und schnell wachsen. Das Verhalten der Zellen wird unter dem Mikroskop alle 3-4 Tage verfolgt. Somit kann es sein, dass man Zellen erntet die nach 4 Wochen einen Zellrasen gebildet haben, der den ganzen Zellkulturflaschenboden bedeckt, somit hat man viele Zellen und somit mehr RNA, als bei Zellen die nach 4 Wochen nur 3-4 kleine Kolonien gebildet haben.

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6.2. Vergleich der Anzahl isolierter Euterepithelzellen


Die Anzahl der Zellen aus der Milch variiert individuell, das hat mehrere Ursachen. Boutinaud et al.(2002) publizierten, dass die Schwankungen in der Zellanzahl in der Milch, auf physiologische Variationen, Hufigkeit des Melkens, Gesundheitszustand der Tiere insbesondere bei Infectionen ist die Zellanzahl sehr hoch, zurckzufhren ist. Der Unterschied der Zellanzahl zwischen den beiden Methoden, liegt daran, dass man bei der CC die Zellen 4 Wochen inkubiert. Da Euterepithelzellen eine Verdopplungszeit von 76,6 Stunden haben und die Zellen einer Probe jedoch 4 Wochen kultiviert werden, hat man nach dem ernten der Zellen mehr Zellen in der Probe als wenn man die Zellen mit der in vivo Methode isoliert.

6.3. Vergleich der A260/280- bzw. A260/230-Werte


Bei der in vivo Methode wird zur Extraktion der RNA das Kit miRNeasy Mini Kit 50 von QIAGEN verwendet. Zur Extraktion der RNA aus den in vitro isolierten Zellen wird das Kit NukleoSpinR RNA II von Machery-Nagel benutzt. In beiden Kits werden die Zellen aufgeschlossen und der Zellinhalt freigesetzt. Die Zellsuspension wird in beiden Methoden in Zentrifugensulchen geladen. Die beiden Kits unterscheiden sich jedoch in der Anzahl der Waschschritte und in den Waschlsungen. Die unterschiedlichen A260/280 bzw. A260/230 Werte sind knnen somit nicht auf die unterschiedlichen Isolationsmethoden der Euterepithelzellen aus der Milch zurck zu fhren sondern resultieren allein aus den unterschielich guten Eigenschaften der Kits die RNA zu extrahieren.

6.4. Vergleich der Cp-Werte


Die Cp-Werte sind direkt proportional zum Amplifikationsprodukt (E), d.h. je niedriger der Cp-Wert ist desto mehr Amplifikationsprodukt liegt vor. Die Auswertung der Ergebnisse hat ergeben, dass bei allen gemessenen Genen in den Proben der Zellkultur, also der in vitro Methode, mehr RNA vorliegt als bei den Proben der frischen Milch. Das liegt daran, dass man durch das Kultivieren der Zellen mehr Zellen zur Verfgung hat aus denen man die RNA Extrhieren kann und somit auch mehr RNA vorliegt. Die Ergebnisse stimmen also mit den Ergebnissen des Vergleichs der RNA-Konzentrationen berein.

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6.5. Vergleich der Cp-Werte


Die Auswertung der Ergebnisse der Cp-Werte hat ergeben, dass keine signifikanten Unterschiede in der Expression der untersuchten Gene im Verlauf der Laktation auftreten. Dieses Ergebnis ist jedoch ungewhnlich. Denn es wurde unter anderem der Transkriptionsfaktor Stat5a untersucht, der mit GR einen stabilen Aktivierungskomplex bildet und dadurch die Expression von -Kasein aktivieren kann (7). Kasein ist ein Milchprotein, das in der Milch vorkommt und whrend der Laktation exprimiert wird. Auerdem wurde das Milchprotein -Kasein untersucht, das die Fllung der Ca2+abhngigen Kaseine verhindert und auch whrend der Lactation gebildet wird (2). Das es keine Unterschiede der Expression von Cytokeratin 8 im Laufe der Laktation gibt ist jedoch nicht auffllig, da Cytokeratin 8 ein Oberflchenprotein der Euterepithelzellen ist und diese auch im Zeitraum in der die Kuh nicht laktiert vorhanden sind (5). Auch das kein Unterschied in der Expression von RunX2 whrend der Lactation stattfindet ist deshalb mglich, da RunX2 ein knochenspezifischer Transkriptionsfaktor ist und dessen Rolle in den Epithelzellennoch nicht geklrt ist (13). Es besteht jedoch eine Signifikanz in der Expression des Glococorticoidrezeptors, da die Cp-Werte jedoch den Chi-Quadrat test nicht bestanden haben, hat die Signifikanz auch keine aussagekraft.

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7. Zusammenfassung
Es gibt zwei Methoden zur Gewinnung von Euterepithelzellen aus der Milch. Bei der in vitro Methode werden die Zellen der Milch in Nhrmedium kultiviert, da die Euterepithelzellen die einzigen adhrenten Zellen der Milch sind, wachsen sie in den Kulturflaschen an und knnen nach vier Wochen geerntet werden. Bei der in vivo Methode werden magnetische Kugeln ber einen AntigenAntikrper-Antikrperkomplex an die Euterepithelzellen gebunden und mit Hilfe eines Magneten von den brigen Zellen der Milch getrennt. Um die Methoden vergleichen zu knnen, wird die RNA der gewonnenen Zellen extrahiert und deren Konzentration und der Ratio260/280 sowie der Ratio260/230 bestimmt. Aus den Zellen der CC wurde mehr RNA extrahiert als in den Zellen der MEC, dass liegt daran, dass man durch das vierwchige Kultivieren der Zellen bei der in vitro Methode mehr Zellen zur Verfgung hat, aus denen man RNA isolieren kann. Die gemessenen A260/280-Werte liegen bei den Proben der CC bei ca. 2, d. h. die RNA-Lsungen der CC Proben sind weniger stark durch Proteine oder Phenol kontaminiert sind als die Proben der MEC, bei denen die A260/280-Werte unter 2,0 liegen. Es ist jedoch in allen Proben der MEC und CC eine Kontamination mit Kohlenhydraten aufgetreten, was man an den niedrigen A260/230 Werten sehen kann. Mit Hilfe der qPCR wurden die Cp-Werte ermittelt, diese sind proportional zum

Amplifikationsprodukt. Die Proben des CC weisenmehr Amplifikationsprodukt auf als die Proben der MEC. ber die Cp-Werte wurden die Cp-Werte ermittelt an denen man eine Unterschied zwischenden Gruppen der einzelnen Probenahmetage ermitteln knnte. Im Fall der betrachteten Gene Cytokeratin 8, Glut-1, GR, Kasein, RunX2 und Stat5a konnte jedoch keine Signifikanz ermittelt werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Qualitt und Quantitt der extrahierten RNA aus den CC Proben besser ist als die RNA der MEC Proben.

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Literaturverzeichnis
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Erklrung
Hiermit versichere ich, die Bachelorarbeit eigenstndig und ohne unzulssige Hilfe Dritter angefertigt zu haben. Mnchen, den 20. Juni 2010 Nicole Berner

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