INTRODUO Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e no ao aumento das dimenses celulares.

Na tcnica de contagem em placa, estimado o nmero de clulas que so capazes de se reproduzir na amostra (viveis). feita a inoculao, em meio slido, de alquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento. Aps a incubao dos meios, feita a contagem das colnias, e como normalmente uma colnia originada a partir de um organismo, o total de colnias que se desenvolvem no meio corresponde ao nmero de clulas viveis presentes na amostra. Deve sempre se realizar vrias diluies das amostras. A contagem pode ser feita por: - semeadura em superfcie (spread plate)- a amostra inserida em uma placa, contendo meio de cultura, j pronta. colocada normalmente 0,1 mL do microorganismo, para evitar que as colnias se sobreponham. - semeadura em profundidade (pour plate)- coloca-se primeiro a amostra na placa, e depois verte-se o meio de cultura morno ( para no solidificar) por cima dela. Pode ser feita com 0,1 a 1,0 ml de clulas. uma tcnica precisa quando o nmero de colnias contadas est entre 30 e 300 UFC e quando as condies ambientais esto adequadas para os microrganismos analisados, mas tambm est sujeito a erros, quando, por exemplo, duas clulas esto muito prximas. Minimiza-se o erro, fazendo mais de uma vez cada diluio. Cmara de Neubauer tambm conhecida como hemocitmetro, uma lmina grossa de uso microscpico, com formato retangular e normalmente de vidro, com uma leve depresso no centro, utilizada para fazer contagem de clulas por unidade de volume de uma suspenso. No centro desta lmina existem vrias linhas perpendiculares que formam vrios quadrantes. Estes quadrantes so usados para fazer as contagens que dever ser feita em microscpico com a objetiva de imerso, e assim determinar a concentrao de clulas em um determinado volume de fluido, para poder calcular a concentrao de clulas no lquido total. MATERIAIS E MTODOS Micrococcus luteus em meio de cultura lquido (para pour plate) Candida em meio de cultura lquido (para spread plate e cmara de Neubauer) 10 Tubos contendo soluo salina Pipetas estreis Micropipeta Cmara de Neubauer Placas de petri contendo agar Placas de petri estreis Ala de em becher com lcool Bico de Bunsen Fsforos Ala de Drigalski

Spread plate 1) Retirou-se com o auxlio de uma pipeta estril, 1 mL da suspenso de bactrias e transferiu-se para um tubo contendo 9 mL de soluo salina. 2) Agitou-se o tubo no vrtex. 3) Repetiu-se estes procedimentos para cada diluio, sempre pegando uma amostra de 1 mL da ltima soluo preparada (fez-se diluies at 10-5). 4) Retirou-se 0,01mL das diluies 10-2 e 10-3, com auxilio de uma micropipeta e adicionou-se cmara de Neubauer. 5) Retirou-se 0,1 mL das 3 ltimas diluies, utilizando-se uma micropipeta e espalhou-se por toda a superfcie da placa de agar, utilizando-se a ala de gawski. (foram utilizadas duas placas para cada diluio). 6) Incubou-se a 36C durante 48 horas. Pour plate 1) Retirou-se com o auxlio de uma pipeta estril, 1 mL da suspenso de bactrias e tranferiu-se para um tubo contendo 9 mL de soluo salina. 2) Agitou-se o tubo no vrtex. 3) Repetiu-se estes procedimentos para cada diluio, sempre pegando uma amostra de 1 mL da ltima soluo preparada ( fez-se diluies at 10-5). 4) Retirou-se 1 mL das trs ltimas diluies e colocou-se em placas de petri estreis. ( Foram utilizadas duas placas para cada diluio). 5) Verteu-se aproximadamente de 15 a 20 mL do meio de cultura padro na temperatura de cerca de 45C sobre a amostra inoculada. Homogeneizou-se bem e incubou-se a 36C durante 48 horas.

RESULTADOS Cmara de Neubauer

Tabela 1. Resultados da contagem na cmara de Neubauer

Diluio

N de colnias (1 quadrante) 35 20

N de colnias (2 quadrante) 40 22

N de colnias (3 quadrante) 43 37

N de colnias (4 quadrante) 38 30

N de colnias (Mdia dos quadrantes) 39 27,25

Total1

10-2 10-3

3,9 x 107 CEL/mL 2,725 x 108 CEL/mL

1- Total (CEL/mL) = mdia do nmero de colnias observadas x fator de diluio da cmara ( 104) x fator de diluio

Pour Plate
Tabela 2. Resultados da contagem no mtodo pour plate

Diluio 10-3 10-3 10-4 10-4 10-5 10-5

N de colnias 139 121 59 74 25 50

Tabela 3. Resultados das mdias da contagem no mtodo pour plate

Diluio 10-3 10-4 10-5 Spread Plate

N de colnias (mdia das duas placas) 130 66,5 37,5

Total1 130 x 103 UFC/mL 665 x 103 UFC/mL 3750 x 103 UFC/mL

1- Total (UFC/mL) = mdia do nmero de colnias observadas x fator de diluio x 1 (vol.= 1 mL)

Tabela 4. Resultados da contagem no mtodo spead plate

Diluio 10-3 10-3 10-4 10-4 10-5 10-5 N de colnias (mdia das duas placas) 406 225

N de colnias Incontvel Incontvel Erro de tcnica 406 225 Erro de tcnica Total 1 40600 x 103 UFC/mL 225000 x 103 UFC/mL

Tabela 5. Resultados das mdias da contagem no mtodo spread plate

Diluio 10-4 10-5

1- Total (UFC/mL) = mdia do nmero de colnias observadas x fator de diluio x 10 (vol.= 0,1 mL)

DISCUSSO Nas diluies 10-3 (em ambas as placas) do mtodo spread plate no foi possvel fazer a contagem, pois as duas placas deram incontveis, com menos de 30 colnias as duas, no podendo se realizar a contagem e se tirar a mdia. E em uma das placas de 10-4 e 10-5 do mtodo spread plate no foi possvel fazer a contagem, pois houve erro de tcnica com a possvel contaminao do meio, fazendo com que as placas ficassem com boa parte com grandes borres opacos, inabilitando a contagem.

CONCLUSO Concluiu-se que a melhor diluio para se fazer a contagem , no pour plate, 10-4, por no ter um nmero nem muito alto e nem muito baixo de colnias, facilitando a contagem. J no spread plate, 10-5, por estar entre 30-300 UFC (Unidade Formadora de Colnias), que a faixa ideal para se realizar a contagem. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS www.icb.ufmg.br/mic/mic/m-42.html - acessado dia 8/11/2010 Departamento de Microbiologia ICB/UFMG

Curso Tcnico em Controle Ambiental Microbiologia Contagem de bactrias pelas tcnicas de spread plate e pour plate e cmara de Neubauer

TURMA: CAM 171 PROFESSOR: Edimir

DATA DE REALIZAO: 27/10/2010 e 06/11/2010 COMPONENTES DO GRUPO Carlos Henrique Felipe Rocha Gabriel de Lima Raianne Vasconcellos

NILPOLIS NOVEMBRO DE 2010