Cncer de Vescula biliar Dr.

Gustavo Prez INTRODUCCION En Chile, los cnceres digestivos siguen siendo una importante causa de muerte. Los registros de incidencia y prevalencia son poco exactos y en general se calculan en base a mortalidad atribuida a las diferentes neoplasias. En los ltimos aos se ha observado una significativa disminucin de algunos tumores, como el cncer gstrico, mientras el cncer de colon y el de vescula biliar han ido en aumento. Este ltimo se ha constituido en una de las primeras causas de muerte por cncer, especialmente en mujeres.

relacin al cstico, porta y pancreatoduodenales y a lo largo de la arteria heptica hasta los ganglios paraarticos. (Figura) La diseminacin hematgena ms frecuente se produce a hgado y luego pulmn, sea, suprarrenales, piel, etc Los tumores papilares crecen de preferencia. en forma intraluminal, superficial y se diseminen por va intraluminal CLASIFICACION Y ETAPIFICACION La clasificacin del cncer de vescula puede estar basada en su localizacin, tipo histolgico, etc. Sin embargo para el manejo de grupos de pacientes y la comparacin de resultados, pronstico, etc se han agrupado de acuerdo a la profundidad y extensin del compromiso tumoral. Las clasificaciones ms conocidas y usadas son la de Nevin y TNM. Esta ltima usa para la agrupacin de pacientes en estadios de acuerdo a la profundidad de invasin y compromiso de rganos vecinos, el compromiso linftico y la presencia de metstasis a distancia. Clasificacin TNM segn la AJCC (American Joint Committee on Cancer) Tumor primario (T) Tx: El tumor primario no se puede investigar. T0: No hay evidencias de tumor primario. Tis: Carcinoma in situ. T1: El tumor invade la lmina propia o la muscular. T1a: El tumor invade la lmina propia. T1b: El tumor invade la muscular. T2: El tumor invade el tejido conectivo perimuscular y no se extiende ms all de la serosa o al hgado. T3: El tumor perfora la serosa (peritoneo visceral) o invade directamente un rgano adyacente o ambos. La extensin de invasin heptica no supera los 2 cm. T4: El tumor se extiende ms de 2 cm en el hgado y/o en 2 o ms rganos adyacentes (estmago, duodeno, colon, pncreas, omento, va biliar extraheptica o heptica) Compromiso linftico regional (N) Nx: El estado nodal no se puede investigar. N0: Sin metstasis linftica regional. N1:Metstasis en ganglio cstico, pericoledocianos y/o hiliares (ligamento hepatoduodenal). N2: Metstasis en ganglios peripancreticos (slo cabeza) periduodenales, periportales, celiaco y/o mesentricos superiores. Metstasis a distancia (M)

Mx: La presencia de metstasis no es evaluable. M0: Sin metstasis a distancia. M1: Con metstasis a distancia. ESTADIAJE Estadio 0: Estadio I: Estadio II: Estadio III: Tis N0 M0 T1 N0 M0 T2 N0 M0 T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N0 M0 T3 N1 M0 T4 N0 M0 T4 N1 M0 Cualquier T N2 M0 Cualquier T Cualquier N M1

Estadio IVA: Estadio IVB:

ETIOLOGIA, EPIDEMIOLOGIA El cncer vesicular ocupa el primer lugar como causa de muerte por cncer en mujeres y el segundo o tercero en hombres. La relacin hombre: mujer es de 1 : 3 aproximadamente. La asociacin ms conocida es aquella que presenta el cncer de la vescula biliar con la presencia de colelitiasis. En diferentes series nacionales esta asociacin vara entre 75 -85%. Si se analizan series de pacientes sometidos a colecistectoma electiva por colelitiasis, se encuentra un cncer de vescula en el 2-3% de las piezas resecadas. En pacientes portadores de colelitiasis la frecuencia de cncer vesicular aumenta con la edad, alcanzando su mxima frecuencia entre la sptima y octava dcadas de la vida. En series nacionales y escandinavas se ha encontrado una relacin inversa entre la tasa de colecistectoma y la tasa de mortalidad por cncer vesicular. Existen situaciones especiales como la vescula en porcelana que tiene una frecuencia de cncer; esta flucta entre 20 y 60%. Los pacientes con colitis ulcerosa tienen un riesgo hasta diez veces mayor que la poblacin general de desarrollo de cncer vesicular. La colectoma total no altera este riesgo.

PRESENTACION CLINICA Y DIAGNOSTICO En general los sntomas tempranos estn ausentes y son inespecficos. Muchos de los casos se diagnostican histolgicamente despus de una colecistectoma (hallazgo inesperado). Tumores avanzados pueden manifestarse por ictericia, producida por compresin de la va biliar, especialmente en tumores del bacinete o por sustitucin heptica tumoral en los pacientes con metstasis hepticas. Otras manifestaciones como dolor, mal vaciamiento gstrico por compromiso tumoral del duodeno, fiebre y prurito tambin traducen tumores avanzados en general. En ocasiones se detecta un tumor vesicular por una masa abdominal palpable o por adenopatas supraclaviculares. En el estudio de pacientes con colelitiasis, la ecografa de superficie puede mostrar masas intraluminales que hagan suponer la presencia de una neoplasia. Sin embargo, en nuestro medio esto es infrecuente y en general se asocia a tumores avanzados y de mal pronstico. Ocasionalmente el diagnstico ultrasonogrfico preoperatorio se logra en pacientes con neoplasias papilares con crecimiento hacia el lumen vesicular. En general son superficiales y de mejor pronstico. Especial mencin como causa frecuente de consulta son aquellos pacientes en los cuales se encuentra un plipo vesicular en el curso de una ecografa. La conducta depende de la presencia de sintomatologa biliar, del tamao de plipo y su evolucin en el tiempo. En aquellos pacientes sintomticos desde el punto de vista biliar y con plipos, se aconseja la colecistectoma. En aquellos pacientes asintomticos con plipos de hasta 5 mm y asintomticos pueden ser observados y seguidos ecogrficamente, ya que ms del 90% estn constituidos por cristales de colesterol. En los pacientes con plipos de 10mm o ms y en los pacientes en los cuales el plipo crece, se aconseja la colecistectoma debido al aumento en frecuencia de lesiones neoplsicas con potencial maligno (adenoma) y cncer.

ANATOMIA PATOLOGICA Los tipos histolgicos ms frecuentes son el adenocarcinoma tubular, el papilar y los mucinosos. Menos frecuentes son el adenoacantoma y los espinocelulares. La diseminacin puede ser por vecindad, linftica, hematgena o celmica. En general la diseminacin linftica se produce siguiendo los linfticos en

En el estudio diagnstico y de etapificacin de pacientes con masas en relacin a la vescula pueden ser tiles la tomografa axial computada y la resonancia nuclear magntica, que permiten definir el nivel de obstruccin y el compromiso de otras estructuras (rganos vecinos y vasos sanguneos). En la definicin de la anatoma biliar son tiles la colangiografa endoscpica retrgrada y la colangiografa transparietoheptica. A pesar de los avances en los mtodos diagnsticos no invasivos, en ocasiones se requiere de una laparoscopa diagnstica con o sin ultrasonografa intraoperatoria o de una laparotoma para certificar el diagnstico y la resecabilidad. TRATAMIENTO Y PRONOSTICO En general la resecabilidad de los pacientes con cncer de vescula es baja (15-20%) debido al diagnstico tardo. Esto empeora notablemente el pronstico general con sobrevidas que no superan el 5% a 5 aos. El tratamiento en los pacientes con cncer de vescula puede ser curativo en pacientes con tumores confinados a la pared de la vescula, especialmente en aquellos con compromiso mucoso o de la muscular y en los cuales la reseccin es completa. Tambin se pueden incluir los paciente con compromiso del tejido conectivo perimuscular sin compromiso de la serosa. En estos pacientes, la radicalidad de la operacin puede aumentar con la reseccin del lecho heptico y la diseccin ganglionar regional La sobrevidas a cinco aos puede ascender a 30% para los grupos antes descritos y hasta 85% para los ms superficiales. En estos ltimos la simple colecistectoma se considera teraputica y potencialmente curativa. En caso de encontrarse un tumor despus de una colecistectoma laparoscpica, se recomienda la reseccin de los sitios de introduccin de los trocares, debido a la frecuencia de implantes tumorales a este nivel. El tratamiento con quimio y radioterapia neoadyuvante y adyuvante se encuentra en etapa de evaluacin y por ahora debe ser usado en protocolos controlados, en espera de la definicin de grupos de pacientes que se beneficien de estos tratamientos. En aquellos pacientes que no pueden ser sometidos a la extirpacin del tumor y que requieren de tratamiento paliativo por dolor, prurito o mal vaciamiento gstrico, ste debe ser enfrentado forma individual por un equipo multidisciplinario. El dolor puede tratarse en forma progresiva, con analgsicos habituales, opioides sintticos, etc. En ocasiones la alcoholizacin del plexo celaco por va percutnea puede ser de utilidad. El prurito y la ictericia pueden tratarse mediante el drenaje de la va biliar, sea quirrgico (en casos altamente seleccionados), endoscpico retrgrado o percutneo. La obstruccin duodenal puede requerir en ocasiones de una laparotoma ms gastroenteroanastomosis para permitir la alimentacin oral, siempre y cuando las condiciones del paciente y su sobrevida proyectada lo permitan.

Deteccin de micrometstasis en mdula sea de pacientes con cncer de vescula biliar Detection of bone marrow micrometastases in patients with gallbladder cancer Juan C Roa S1 , Xabier de Aretxabala U2 , Anglica Melo A1, Gaspar Fara2 , Juan C Araya O1 , Miguel A Villaseca H1, Pablo Guzmn G1, Ivn Roa E1 .
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El

cncer de vescula biliar es muy comn en Chile, siendo la primera causa de muerte por cncer en mujeres sobre los 40 aos. A pesar de los avances del tratamiento del cncer gastrointestinal el pronstico de stos y de los carcinomas avanzados de vescula biliar, en particular, es an muy malo1,2. Los modelos de metstasis indican que las clulas tumorales se extienden desde los tumores primarios va la circulacin (sangre y vasos linfticos) a otros rganos, y por invasin local hacia el hgado y hacia los rganos vecinos. Por tanto, parece ser que existe una muy fuerte asociacin entre la aparicin de clulas tumorales en la sangre y el desarrollo de metstasis. Actualmente la extensin hematgena de los cnceres slidos representa una de las principales fallas del tratamiento oncolgico. Con el mejoramiento de las tcnicas diagnsticas se han introducido mtodos de biologa molecular para identificar el proceso con mayor exactitud y sensibilidad. Las clulas tumorales pueden diseminarse hacia la circulacin aun en las primeras etapas del tumor3. Sin embargo, el nmero de tales clulas es muy pequeo y ellas no pueden ser detectadas por mtodos diagnsticos convencionales tales como los estudios de imgenes o test de marcadores serolgicos4. La amplificacin en cadena mediada por la polimerasa (PCR) puede detectar marcadores celulares que se expresan especficamente en estas clulas y que son indetectables por otros medios en los pacientes con cncer metastsico o con enfermedad localizada. Dos diferentes estrategias han sido usadas para detectar las clulas tumorales diseminadas en la circulacin o en la mdula sea5,6. La primera corresponde a blancos en la secuencia del ADN, esto se refiere fundamentalmente a alteraciones genmicas tales como mutaciones especficas en oncogenes, anlisis de microsatlites y amplificacin gnica. La segunda, al anlisis en las alteraciones en la secuencia de ARN, bsicamente referido a transcriptos especficos de ARN mensajero en las clulas tumorales y de cada tejido en particular. Para estos anlisis se requiere de una reaccin de transcripcin reversa que transforma el ARN a ADNc y luego lo amplifica en forma regular, lo que se conoce como RTPCR. En este sentido varias reacciones de RT-PCR han sido descritas para el antgeno carcino-embrionario (CEA), la citoqueratina 19 (CK19) y la citoqueratina 20 (CK20) para la deteccin de clulas circulantes de cncer colorrectal y cncer gstrico3,7; mamaglobina para los cnceres de mama 8,9, MAGEs para melanoma10, mutacin de K-ras para cnceres pancreticos y de coln11,12, antgeno prosttico especfico (PSA) para cnceres de mama y de prstata13,14. De esta manera el RT-PCR est ofreciendo una significativa promesa de mejorar la deteccin de enfermedad residual mnima en la circulacin perifrica, mdula sea y ganglios linfticos. Las micrometstasis en mdula sea estn presentes en sobre un cuarto de los pacientes que son sometidos a resecciones curativas por cncer gastrointestinal4. En relacin a su validez como factor pronstico, las micrometstasis en los ganglios linfticos estn asociados con una significativa reduccin en la sobrevida a 5 aos de los pacientes en estadio II con cncer colorrectal, especialmente interesante, si consideramos los pacientes en el grupo III de Dukes, los cuales no muestran metstasis ganglionares linfticas en las secciones rutinarias teidas con hematoxilina y eosina15. En otros estudios, la deteccin de micrometstasis en aspirados de mdula sea ha demostrado utilidad como un predictor de mal pronstico en pacientes con cncer bronquial no clulas pequeas16,17. Los pacientes con

Departamentos de Anatoma Patolgica y de 2Ciruga y Traumatologa, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Correspondencia a:

Background: There is a very strong documented correlation between the appearance of cancer cells in blood and occurrence of metastasis in gastrointestinal cancer. Aim: To determine MUC1, CK19, CK20 and CEA mRNA expression in bone marrow of patients with gallbladder cancer and evaluate its clinical significance. Material and methods: Sixty eight samples were analyzed, 38 bone marrow samples of gallbladder cancer patients, 20 healthy donors, and 10 frozen samples of gallbladder cancer. Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction (nested RT-PCR) was used to analyze mRNA expression. Results: All frozen tumors were positive for CEA, CK19, and MUC1 mRNA and 70% were positive for CK20. Seventeen of 20 donor samples were positive for MUC1 and only one sample from donors was positive for both CK20 and CK19 mRNA. Among the 38 blood and bone marrow samples of gallbladder cancer patients, the expression of MUC1, CK19, CK20, and CEA, mRNA was 60.5% (23/38), 31.6% (12/38), 7.9% (3/38), and 7.9% (3/38), respectively. Disregarding the MUC1 results. 37% (14/38), 13% (5/38) and 5% (2/38) were positive for one, two and three markers respectively. Not significant differences were found in survival with a follow up to 12 months. Conclusion: Our results indicate that the molecular detection of tumor cells in bone marrow in patients with gallbladder carcinoma is technically possible, being CEA, CK19 and CK20 gene expression the best markers. The MUC1 gene expression marker was highly unspecific and it should not been considered. The detection of bone marrow micrometastasis might be helpful in prognosis and the selection of clinical treatment but a larger series with a longer follow-up should be studied (Rev Md Chile 2004; 132: 1489-98). (Key Words: Carcinoembryonic antigen; Gallbladder neoplasms; MUC1 gene product; Neoplasm metastasis)

micrometstasis en mdula sea o con clulas circulantes tumorales en sangre perifrica son comparables a pacientes con metstasis, en trminos de la localizacin del tumor primario, patrn de recidiva y pronstico de la enfermedad16,18-20. Esta evidencia sugiere que una etapificacin ms precisa basada en el diagnstico de las micrometstasis de mdula sea mediante RT PCR puede ser un mejor predictor de la recurrencia y de la sobrevida a corto plazo, que el mtodo histolgico convencional, con tincin de hematoxilina y eosina y puede servir como un criterio para tomar decisiones clnicas. Las muestras de mdula sea o de sangre perifrica, que se obtienen antes de la manipulacin quirrgica de los tumores primarios, ofrece el mejor indicador de diseminacin sistmica de la enfermedad. Sin embargo, en la mayora de los cnceres de vescula biliar, los pacientes en etapas iniciales son diagnosticados slo despus del estudio de la pieza quirrgica de la colecistectoma. Usualmente la etapificacin de estos pacientes son completados con un mapeo total de la muestra quirrgica y en pacientes con formas potencialmente curativas (invasin restringida a la pared vesicular hasta en la subserosa) se realiza una segunda ciruga con diseccin ganglionar selectiva ms reseccin heptica parcial21. Este estudio fue diseado para desarrollar un mtodo sensible para la deteccin de micrometstasis en mdula sea en pacientes con cncer de vescula biliar mediante la tcnica de RT-PCR. Estudiamos la expresin de CEA, CK19, CK20 y Mucina sialada 1 (MUC1) en mdula sea y exploramos la asociacin entre los 4 genes con algunas caractersticas clnico-patolgicas y sobrevida de los pacientes con carcinoma de la vescula biliar. Pacientes y mtodos Estudiamos 68 muestras correspondientes a 38 muestras de mdula sea de pacientes colecistectomizados con diagnstico de carcinoma de la vescula biliar, 20 muestras de donantes aparentemente sanos desde el Banco de Sangre, pareados por sexo y edad con los casos estudiados y 10 muestras de tumores frescos congelados de vescula biliar, provenientes de los archivos del Departamento de Anatoma Patolgica, de la Universidad de La Frontera y del Servicio de Anatoma Patolgica y Citopatologa del Hospital Regional de Temuco, entre junio de 2002 y julio de 2003. Slo 2 pacientes recibieron quimioterapia con gemcitabina antes que la muestra haya sido tomada. Se obtuvo consentimiento informado en cada paciente. La etapa TNM clnico patolgica fue determinada de acuerdo a la regulacin de la UICC (1997)22. Los aspirados de mdula sea de los pacientes y las muestras de los donantes fueron procesados antes de 4 horas desde el momento de su obtencin. Los leucocitos fueron aislados por una gradiente de centrifugacin usando Linphoprep (Nycomed Pharma Norway) de acuerdo al protocolo sugerido por los fabricantes y luego fueron almacenados en tiocianato de guanidina a una temperatura de -75C hasta el momento de la extraccin del ARN.

Los tejidos de tumores vesiculares fueron tambin obtenidos y almacenados en tubos con gel criopreservante (Jung, Alemania) a una temperatura de 75C antes de proceder a la extraccin de ARN. Extraccin ARN. La extraccin total de ARN de leucocitos concentrados fue desarrollada de acuerdo al mtodo Chomczyski23. Para los tejidos se utiliz el reactivo de crisol (Life Technology USA) de acuerdo a instrucciones de los fabricantes. Despus de la precipitacin de ARN ste fue resuspendido en 10 l de agua tratada con Dietilipirocarbonato (DEPC) y luego almacenada a -80C. La cuantificacin del ARN fue determinada por un espectofotmetro Genequant (Amersham US). Para asegurar la ausencia de contaminacin de ADN en las muestras de ARN fueron tratadas con RQ1 DNasa (Promega, USA) por 30 minutos a 37C. Reaccin de la transcripcin reversa (RT). Fueron usados dos microgramos de ARN como templados en la primera hebra complementaria del ADN (ADNc) sntesis en 20 l de volumen de reaccin el cual consisti en random primer (3,75 micromoles por reaccin), dNTP (0,5 mM/por reaccin), enzima M-MVL (Invitrogen USA) 200 unidades por reaccin. El ARN fue incubado a 60 por 5 min, despus de la mezcla de la reaccin, incubado luego a 20C por 5 min, ya 37 por 50 min, seguido por una incubacin a 5C por 5 min. Deteccin de expresin gnica mediante PCR. Las condiciones de amplificacin as como la secuencia de los iniciadores primers24,25 se encuentran en la Tabla 1. Para verificar la integridad y pureza del ARN se realiz un PCR simple para el gen DRB1, que permite detectar la presencia de ADN no proveniente de la reaccin de transcripcin reversa. Bsicamente se utiliz 5 a 10 ng de ADN complementario, y concentraciones de 0,2 mM nucletidos y de 1,5 mM de cloruro de magnesio, adicionando 0,6 U de taq ADN de polymerasa (Promega) por reaccin, en un volumen total de 15 l. Los productos finales fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%. Estadstica. Se calcularon sensibilidad y especificidad de la expresin de cada uno de los genes de estudio respecto de los tumores frescos congelados y sensibilidad de los genes en las muestras de mdula sea. Para el clculo de sobreviva se construyeron curvas de Kaplan Meier. Los resultados fueron considerados estadsticamente significativos con un p <0,05. Resultados Las caractersticas generales del grupo estudiado se observan en la Tabla 2. El promedio de edad de los 48 pacientes con cncer de vescula biliar fue de 57,5 aos con rango de 35-77 aos. La muestra incluy slo 6 hombres (12,5%). En su mayora correspondi a tumores avanzados (96% de tumores subserosos o serosos) histolgicamente moderados o poco diferenciados (96% en conjunto).

Las 68 muestras correspondientes a 38 aspirados de mdula sea, 10 tumores de vescula biliar congelados y 20 muestras provenientes de donantes aparentemente sanos, fueron analizadas para la deteccin de la expresin gnica de los genes CEA, CK19, CK20 y MUC1. Todas las muestras estudiadas mostraron calidad y pureza del ADNc mediante amplificacin de DRB1.

La Tabla 3 muestra los resultados de pacientes con cncer, donantes y tumores congelados. La expresin de MUC1, CK19, CEA y CK20 en los aspirados de mdula sea fue de 23 (60,5%), 12 (31,6%), 3 (7,9%) y 3 (7,9%), respectivamente. Sin considerar los resultados de MUC1, 37%

(14/38), 13% (5/38) y 5% (2/38) fueron positivos para 1, 2 y 3 genes, respectivamente. Las muestras congeladas de los cnceres vesiculares fueron todas positivas para CEA, CK19, y MUC1. Siete de los 10 fueron positivos para CK20 ARNm y todas las muestras reunidas de los 20 donantes fueron negativos para CEA, slo un control fue positivo para ARNm de ambas citoqueratinas, CK19 y CK20. Sin embargo, 17 de los 20 donantes fueron positivos para MUC1. En relacin con los tumores frescos congelados la sensibilidad de las mediciones de expresin gnica CK19, CEA y MUC fue de 100% y para CK20 de 70%, sin embargo la especificidad de la medicin en la expresin gnica de MUC1 fue slo de 15% en comparacin con el 95% de CK19 y CK20 y del 100% mostrado por CEA. Debido a la baja especificidad de MUC1, sus resultados no fueron considerados para su anlisis en este manuscrito. En laTabla 4 se muestra el detalle de los valores de sensibilidad, en muestras de mdula sea slo considera a pacientes con enfermedad diseminada, ya que no es posible asegurar que hubiese sido posible detectar tumor en pacientes sometidos a cirugas potencialmente curativas y los valores de especificidad para cada gen se obtuvieron en relacin con los donantes. Doce de las 38 (27,4%) muestras de sangre de los pacientes con cncer fueron positivas para uno de los tres genes estudiados. En aquellos donde la mdula sea fue positiva para los tres genes (2/38), todos se encontraban en un estado metastsico avanzado. Analizamos separadamente grupos de pacientes con pronstico diferente, basado en factores tales como el nivel de infiltracin de la pared o presencia de metstasis (Tabla 5). De los 8 pacientes con aparente buen pronstico, se observ expresin de los genes estudiados en 2 pacientes, lo que corresponde a 25%, de este grupo. Uno tena un compromiso restringido a la tnica muscular, mientras el otro paciente haba sido sometido a una reoperacin. Sin embargo, los ganglios linfticos y el hgado se encontraban sin tumor. Por otro lado, entre los 13 pacientes con enfermedad avanzada, metstasis heptica o diseminacin duodenal, se encontr micrometstasis en 5 pacientes (38%) (Tabla 6). Dos pacientes de este grupo que resultaron negativos para los genes estudiados, fueron tratados previo a la toma de muestra con Gemcitabina. El promedio del seguimiento de este grupo fue de 12 meses, nosotros no hemos, hasta ahora, encontrado diferencia de sobrevida en el grupo estudiado.

MUC 1 (Mucina sialada 1). Corresponde a una glicoprotena de transmembrana con un gran dominio extracelular, que se expresa en el fenotipo metasttico26-28. En el cncer de la vescula biliar, la expresin de la mucina sialada 1 (MUC1), en el estroma que rodea a las glndulas tumorales puede ser reconocido mediante un nuevo anticuerpo mAb, MY. 1E1229. La expresin de este antgeno se asocia con una mayor agresividad y con peor pronstico30,31. En el presente trabajo los transcriptos de ARN de MUC1 fueron positivos en 23 de los 38 aspirados de mdula sea, pero tambin fueron positivos en 17 de los 20 donantes (especificidad de 15%). Aparentemente podra haber una reaccin cruzada con la expresin de otros genes expresados en mdula sea o simplemente MUC1 es expresado en la mdula sea de individuos normales. Dent et al concluy en 199932 que MUC1 es expresado en forma extensa en los tejidos hematopoyticos y, por lo tanto, no es recomendable como un marcador de micrometstasis epiteliales. Debido a estas consideraciones los resultados de MUC1 no sern consideradas en esta seccin. Antgeno carcinoembrionario (CEA). Es una glicoprotena que es normalmente expresada en ciertas partes del cuerpo y comnmente sobreexpresada en la mayora de los carcinomas del coln, recto, mama, pulmn y pncreas y del tracto gastrointestinal. Una expresin aumentada del antgeno carcinoembrionario promueve una mayor adhesin intercelular, lo cual favorece la aparicin de metstasis33. Actualmente el CEA es ampliamente usado como un marcador tumoral para la deteccin molecular de clulas tumorales gastrointestinales y de cncer de mama 3,34. Encontramos expresin en 100% de los tumores analizados. Debido a esto debiese ser considerado un buen marcador para la bsqueda de clulas tumorales en sangre perifrica y mdula sea. En nuestro estudio slo 3 de 38 casos (equivalente a 7,9% de los pacientes) con cncer de vescula biliar mostr expresin de transcriptos de CEA. Los tres pacientes en los cuales el CEA fue detectado tenan una enfermedad avanzada. Mory et al han demostrado que la amplificacin mediante RT-PCR de los transcriptos de CEA son un medio eficiente en la deteccin de clulas circulantes de tumores slidos en sangre perifrica y que incluso en los cnceres gastrointestinales se debiese considerar como un indicador de enfermedad sistmica, aun cuando haya sido catalogado como incipiente3. Citoqueratinas (CK19 y CK20). Las citoqueratinas comprenden una familia de multigenes de 20 polipptidos relacionados (CK1-CK20). Codifican los constituyentes de los filamentos intermedios de las zonas epiteliales que son expresados en varias combinaciones, dependiendo del tipo epitelial y el grado de diferenciacin. Particularmente la CK19 y la CK20 muestran un perfil muy restringido de expresin tisular y han sido exitosamente usados para la deteccin de clulas circulantes tumorales en sangre de pacientes con cncer de mama, cncer pulmonar y carcinomas gastrointestinales3,25,35,36. En nuestro estudio encontramos una expresin de transcriptos de CK19 en 13/38 (34%) de las muestras y para CK20 en 3/38 (8%) de las muestras. En nuestro estudio 5 de 13 de los pacientes con enfermedad masiva diseminada, es decir, metstasis heptica, presentaron positividad para la expresin de al menos uno de los 3 genes estudiados (CEA, CK19 y CK20).

Estos hallazgos indican que la deteccin molecular de CEA, CK19 y CK20 en los aspirados de mdula sea puede tener un valor pronstico para pacientes con carcinoma de vescula biliar. Los protocolos basados en PCR aumentan la sensibilidad de la deteccin de clulas tumorales en circulacin de 1-10 clulas tumorales en 10 millones de clulas normales, debemos hacer notar adems la especificidad por la casi ausente expresin ya sea de CK19 o CK20 en las muestras obtenidas de los 20 donantes, aparentemente normales de nuestro estudio, alcanzando una especificidad de 95% para CK19 y CK20. El nico caso que present positividad para CK19 y CK20, lo hizo en forma simultnea en un donante y no hemos podido hasta ahora lograr ubicar a ese individuo para verificar su actual estado de salud. Sin embargo, no podemos tampoco dejar de mencionar que algunos reportes han demostrado que la CK19 y la CK20, son expresados en muestras sanguneas de individuos sanos y algunos investigadores demostraron que las diferencias en la sensibilidad de los ensayos y en la forma de tomar la muestra podran producir estas diferencias37,38. Esto demuestra que los resultados falsos negativos pueden ser debido a un bajo nivel de expresin en el gen, que se est buscando a pequeas cantidades de clulas tumorales o a la presencia de clones poco diferenciados que no expresan los marcadores titulares especficos que estn siendo analizados. Por esta razn, es ms posible que una correlacin positiva se pueda observar al analizar ms de un gen a la vez, de manera de minimizar la aparicin de falsos negativos. Del mismo modo el discontinuo desprendimiento de clulas tumorales hacia la circulacin puede tambin resultar en falsos negativos, dependiendo del momento en que la muestra es analizada39,40. Estos problemas deben ser minimizados por el uso de mltiples marcadores y anlisis de sangre y de mdula sea en diferentes tiempos. En conclusin, aunque el nmero total de pacientes es pequeo para obtener conclusiones definitivas, la determinacin de CEA, CK19 y CK20 mediante RT-PCR podra convertirse en una herramienta poderosa para la deteccin de micrometstasis de carcinoma de vescula biliar en los aspirados de mdula sea, que permita guiar en forma racional el tratamiento y predecir en forma oportuna el pronstico de los pacientes. El foco de este estudio debiese ser el anlisis de pacientes con buen pronstico, con el objetivo de detectar aquellos en los cuales la diseminacin puede ser precedida o diagnstica en etapas iniciales. Para lograr este objetivo el estudio de una serie de mayor tamao, que incluya mayor cantidad de pacientes potencialmente curativos, debe ser analizado.

Discusin En este estudio analizamos cuatro diferentes marcadores (MUC1, CEA, CK19, y CK20 mARN), con el objetivo de determinar los lmites que estos cuatro test ofrecen para la deteccin de clulas de cncer de vescula biliar y si la presencia de transcriptos de ARN epitelial en los aspirados de mdula sea de los pacientes con cncer de vescula biliar se correlaciona con caractersticas clnico patolgicas.