Modelamento e funcional anlise do receptor Toll-like domnios de reconhecimento ligante

Resumo: Os receptores Toll-like (TLRs) so imunes inata receptores de reconhecimento de padres dotado a capacidade de detectar patgenos microbianos baseados em patgenos padres moleculares associados. A compreenso dos princpios de reconhecimento molecular ligante por TLRs tem sidomuito acelerado por informaes estruturais recentes, em especial a estrutura cristalina deleucina-rica repetir contendo ectodomnios de TLR2, 3 e 4, em complexo com seus ligantescognatos. Infelizmente, para os outros membros da famlia como TLR7, 8 e 9, no estruturalexperimental informao est disponvel no momento. Mtodos como cristalografia de raios X oumagntica nuclear ressonncia no so aplicveis a todas as protenas. Homologia de modelagemmolecular em combinao com dinmica podem oferecer uma alternativa simples, mas poderosa para obterinformaes estruturais a ausncia de experimental (estrutural) de dados, desde que o gerado em trs dimenses modelos aproximados adequadamente o que encontrado na natureza. Aqui, ns relatamos o desenvolvimento de procedimentos de modelagem adaptada para a anlise estrutural dos domnios extracelulares de TLRs. Ns comparao detalhada da estrutura secundria, ngulos de toro, a acessibilidade para glicosilao, carga de superfcie e acessibilidade de solvente entre as estruturas cristalinas epublicado de forma independente construdo TLR2, 3 e 4 modelos de homologia. Constatao de que os modelos eestruturas de cristal estavam em boas acordo, ampliamos nossa abordagem de modelagem para os restantes membrosda famlia de TLR humano e do rato, incluindo TLR7, 8 e 9.

Palavras-chave: modelagem por homologia, dinmica molecular, receptor Toll-like,oligonucleotdeos CpG; relaes estrutura funo; ricas em leucina repetir

Introduo Microorganismos que podem invadir um hospedeiro vertebrado so inicialmente reconhecido pelo sistema imune inato atravs de receptores de reconhecimento de padres com base patgeno associado patterns.1 molecular Ao receptor ligadura, cascatas de sinalizao intracelular so ativado, que rapidamente induzir a expresso de uma variedade de genes, que iniciam e forma adaptativa imunes responses.2 Diferentes classes de reconhecimento de padres receptores, incluindo os receptores Toll-like (RLA), reconhecer distintos componentes microbianos. TLR2 o receptor para lipopeptdeos bacteriana, TLR4 detecta lipopolissacardeo bacteriano, TLR3 doublestranded RNA, enquanto TLR7 / 8 e TLR9 reconhecer single-stranded RNA e DNA no metilado com motivos CpG, 1, respectivamente. Todos os TLRs tm uma glicosilada, repeties ricas em leucina (LRR) extracelular domnio (ECD), uma regio transmembrana, e um evolutivamente conservadas Toll/interleukin-1 intracelular O receptor domain.3 em forma de ferradura TLR ECD consiste de 20 ou mais LRRs individual. Cada LRR caractersticas? 10 resduos relativamente conservada que adotam uma conformao -folha e contribuir para a superfcie cncava do ECD. A parte restante de cada LRR mais varivel e contribui para a superfcie convexa. ''''LRRs irregular encontrada em todos os TLRs contm trechos insero de aminocidos, que foram propostos para projetar-se a espinha dorsal ECD e estar envolvido em binding.4 Apesar de um ligante universal andaime, recentes estudos cristalogrficos sobre TLRs humanos e murinos mostraram que especfica modos de ligao operam para envolver o estruturalmente vastamente ligantes diferentes. Por exemplo, TLR1/TLR2 heterodmeros so colmatadas pelas cadeias acil dos ligante Pam3CSK4 que so inseridos diretamente em canais hidrofbicos alongamento LRRs 9-12,5 Para TLR4, lipopolissacardeo apresentado ao receptor atravs de uma protena de ligao, MD-2, levando a uma reticulao de dois TLR4-MD-2-LPS complexes.6 Em contrrio, em TLR3 dois distintos, de carga positiva manchas da superfcie fazer contato com o doublestranded RNA ligand.7 No entanto, uma significativa escassez de informaes estruturais para terapeuticamente TLRs interessantes, tais como TLR7, 8 e 9 e

outros membros da famlia TLR humano e do rato (Por exemplo, TLR5 humanos e TLR10, TLR5 murino, TLR11-13) permanece. Apesar dos esforos, experimentalmente, determinar estas estruturas esto em andamento, claro se TLRs de espcies diferentes Homem ou rato sero submetidos a sistemtica experimental anlise estrutural, embora o compreenso das interaes patgeno-hospedeiro no nvel molecular de grande evoluo e comercial interest.8 Comparativas ou homologia modeling9 poderia servir como uma maneira de prever estruturas 3D para os TLR domnios que esto to longe estruturalmente desconhecidos, desde suas previses so uma aproximao exata da natureza, isto , em boa concordncia com os experimentais dados estruturais. Agora possvel gerar abordagem primeiros modelos tridimensionais''''para TLR ECD (ou outros domnios) atravs da apresentao de uma protena seqncia de interesse automatizado baseado na web modelagem por homologia servers.10 No entanto, como existe uma falta de critrios de validao definidas, a qualidade cientfica e confiabilidade destas previses e homologia abordagens de modelagem em geral continuam a ser muitas vezes incerto. Neste estudo, procurou, portanto, determinar a qualidade de uma abordagem de modelagem de homologia que envolve otimizao estrutural por molecular dinmica simulation.11 Assim, gerou homologia modelos foram comparados com os publicados de forma independente estruturas cristalinas para as mesmas molculas de acordo a estrutura secundria, ngulos de toro, a acessibilidade de glicosilao, carga superficial e acessibilidade solvente. Por exemplo, a homologia TLR3 ECD baseado modelos para o TLR25 e ECD TLR46 foram comparados aos respectivos, independentemente publicado estruturas cristalinas. Como ponto de referncia, tambm em comparao ambos, independentemente determinada estrutura cristalina para a mesma molcula, ou seja, TLR3 humanos ECD (IDs APO 2a0z12 e 1ziw13). Os dados que ns aqui presentes demonstram que os modelos de homologia so congruentes com dados experimentais para um nvel de sobreposio aproximando-se entre dois diferentes procedimentos experimentais estruturas para a mesma protena. Este validado abordagem foi extendido ao ECD de todos os TLRs outros humanos e camundongos. As previses para os princpios de atuao do ligante do mouse e humanos TLR9 foram testadas experimentalmente.

Resultados

Gerao de humanos e murinos TLR2 e 4 modelos ECD Para gerar TLR2 humano e do rato e TLR4 modelos de homologia, o ser humano cristal ECD TLR3 estruturas 2a0z e 1ziw foram utilizadas como a nica estruturais modelos disponveis no incio de nossa modelagem efforts11 (ver tambm Materiais e Mtodos). Devido s diferenas no comprimento da seqncia primria (e, portanto, o nmero de LRRs) entre o modelo TLR3 (23 LRR) e as seqncias alvo, h/mTLR2 e h/mTLR4 (19 e 21 LRRs, respectivamente), que primeiro determinar quais blocos individuais de LRR correspondia melhor (Informaes de Apoio Fig. S1). Alinhamentos automatizada LRR revelou homologia de 30% (Informaes de Apoio Tabela S1) e estes alinhamentos foram optimizados manualmente. Todos os gerados alinhamentos de seqncia foram utilizados como arquivos de entrada para MODELLER14 (ver Materiais e Mtodos), e os modelos gerados submetidos dinmica molecular simulao para a minimizao de energia e uma maior optimizao da estrutura, das regies, em especial loop. Correo estricas e contedo energtico foram monitorados e so apresentados na Tabela I e Apoio Informaes da tabela de S2.

Comparao de TLR3 ECD estruturas cristalinas como um ponto de referncia para benchmarking O lanamento do experimental coordenadas para humanos e TLR25 mouse e TLR46 possibilitou comparar e avaliar a preciso da nossa modelagem abordagem. Portanto, um processo de benchmarking foi desenvolvidos considerando (i) elementos de estrutura secundria,

(ii) ngulos de toro (grfico de Ramachandran), (iii) a acessibilidade para estereoqumico posttranslational modificao, por exemplo N-glicosilao, a superfcie (iv) distribuio de carga, e (v) acessibilidade solvente de resduos individuais (ver Materiais e Mtodos detalhadas para os detalhes tcnicos e softwarereferncias). Para obter valores de referncia'','', primeiro em relao os dois de forma independente determinada estrutura cristalina dos direitos humanos TLR3 ECD (2a0z e 1ziw) que tinham sido utilizados como modelos modelos (Fig. 1). Comparao de elementos de estrutura secundria [ver Materiais e Mtodos, Fig. 2 (A) e de Apoio Fig. Informao. S2 (A)] mostrou que a maioria dos resduos (94%) dividiram o conformao estrutural mesmo (Tabela I) e apenas diferenas sutis na regio convexa do ECD [Cf. LRRs na Fig. 6-8. 2 (A)] existiu. A posio e comprimento de todos os b-costas no lado cncavo dos LRR eram idnticos entre os dois [cf estruturas. Apoio Fig. Informao. S2 (A)]. Quanto coluna vertebral ngulos de toro (Ramachandran parcela analysis15) descobrimos que 2a0z e 1ziw compartilhada quase idntico percentagens de resduos em regies mais desfavorecidas, generosamente e adicionais permitidos e no permitidos regies (desvios de menos de 1%; Tabela I). glicosilao N-ligados influencia profundamente a atividade biolgica do proteins.16 muitos Portanto, um modelo confivel 3D deve conter o nmero correto de stios de glicosilao possvel. N-glicosilao s possvel em resduos na superfcie acessvel Asn em um contexto Asn-X-Ser/Thr e depende do fsico propriedades de uma cadeia de glicano acrescentado, tais como a massa, a superfcie acessvel, e raio de gyration.17 Foram comparados os resduos que foram Asn glicosilada nos cristais e avaliou a estereoqumica possibilidade de adio de glicana na resduos remanescentes Asn usando GlyProt.17 Figura 2 (B) mostra que embora as diferenas de N-ligados substituio do acar existente entre ambas as estruturas, todos os resduos de Asn em um contexto Asn-X-Ser/Thr so estereoquimicamente disponveis para alm glicana em ambas as estruturas. Superfcie de carga e / ou as interaes precisa de resduos na superfcie so cruciais para muitos protena-protena ou interaes protena-ligante. Por isso,

comparao cargas superficiais para ambas cristal ECD TLR3 estruturas computados para pH 5,0 (o pH assumido a existir em endossomos onde o cido nucleico de sensoriamento TLRs engajar seus ligands1) e encontraram considervel diferenas entre as duas estruturas [Fig. 2 (C)]. Com relao superfcie de acessibilidade, desenvolvemos um algoritmo para calcular e comparar acessibilidade de superfcie entre duas estruturas 3D de protenas tendo em conta a natureza dinmica do cada cadeia lateral de protenas (ver Materiais e Mtodos para mais detalhes). Em breve, cada estrutura da protena foi submetida a 200 ps de simulao de dinmica molecular, e a acessibilidade de superfcie para cada resduo da protena cadeia foi calculado a partir de 20 frames (20 confrmeros'''') e expressa como um intervalo de solvente acessvel superfcie (em A 2 ). dinmica molecular ajudou na avaliao da flexibilidade de resduos de protenas em termos de mudanas na acessibilidade do solvente. A gamas de acessibilidade assumida para cada resduo foram calculados e comparados entre as estruturas de somando-se para quantos resduos de todos os resduos a acessibilidade em intervalos de 2a0z e 1ziw estruturas sobreposta a 50, 90 ou 100% (veja Materiais e Mtodos de Apoio e Informao Fig. S3). Descobrimos que 93, 68, e 55%, respectivamente, de todos os resduos em relao sobreposta na sua acessibilidade solvente intervalos de 50, 90 ou 100% (Tabela I). Na comparao deste conjunto de ambos, independentemente obtidas estruturas cristalinas para o ser humano TLR3 ECD, em termos de estrutura secundria, de toro ngulos, N-glicosilao, carga de superfcie, ea superfcie acessibilidade nos forneceu um conjunto de valores que serviu de referncia para a comparao de Gerao modelos de homologia e estruturas cristalinas para o TLR2 e 4 ECDs.

TLR2 e TLR4 modelos de homologia ECD correspondam s suas respectivas estruturas cristalinas em a maioria dos benchmarks Algumas das estruturas cristalinas TLR2 e TLR4 fez no abranger todo o ECD seqncia de aminocidos devido abordagem experimental taken.18 Ns portanto, restrita a comparao entre o cristal estruturas e modelos para as regies encontrados tambm na

o cristal. Figura 2 (D), informaes de apoio Figura S2 (B) e na Tabela I mostram que 94% de b-costa resduos em nosso modelo de mostrar o mesmo secundria conformao da estrutura como no ser humano TLR4 ECD 2z63 estrutura de cristal, e 64% de todos os resduos. Este reflete diferenas nos comprimentos (especialmente da b-costas) e posies de elementos da estrutura secundria entre 2z63 estrutura cristalina do TLR4 e o TLR3 modelos 2a0z e 1ziw [cf. Fig. 2 (A, D)]. No entanto, a curvatura geral foi muito semelhante [Cf. Fig. 2 (E, F)] e Discusso. Quanto toro ngulos, humanos TLR4 estrutura cristalina ECD 2z63 e modelo difere em menos de 6%, ea nmero de resduos nas regies permitidas foi comparvel (Quadro I). Resultados semelhantes foram obtidos por elementos de estrutura secundria e comparaes ngulo de toro para os restantes TLR2 e 4 crystalmodel ECD pares (Informaes de Suporte de mesa e S2 Figs. S4-S6). No 2z63 estrutura cristalina do TLR4 humano ECD N309 e N497 s foram N-glicosilada e vrios C-terminal resduos Asn em Asn-X-Ser/Thr sequons no estavam presentes no arquivo de coordenadas [Fig. 2 (E)]. No entanto, todos compartilhavam asparagina eram acessveis para alm glicana em ambos os cristais estrutura e modelo, sugerindo uma previso correta da orientao de todos os resduos Asn. Para TLR4 mouse ECD todos os resduos de Asn Asn-X-Ser / sequons Thr em ambas as estruturas exibido o correto orientao e exposio da superfcie a ser N-glicosilada [Apoio Fig. Informao. S4 (B)]. Similar resultados foram obtidos para TLR2 humano e do rato ECDs, que dispem de 4 e 3 stios de N-glicosilao, , respectivamente. Em hTLR2 (2z7x) todos os quatro sites eram acessveis (sendo trs glicosilada no cristal) e previu corretamente no modelo [de apoio Information Fig. S5(B)], in mTLR2 (2z81) this was true for all three sites [Supporting Information Fig. S6(B)]. Quanto carga de superfcie notamos que, apesar pequenas diferenas no pH 7,0 de superfcie celular (assumido pH), em todos os casos, a diferena entre o cristal estrutura e modelo de correspondente no parecia maior que a observada por dois TLR3 humanos 2a0z e 1ziw [cf. Fig. 2 (C, F), informaes de apoio Figs. S4 (C), S5 (C) e S6 (C)]. Finalmente, em relao a acessibilidade de solvente para os resduos na TLR2 humano e do rato e TLR4 structuremodel ECD

pares. Para 50%, 90 e 100 sobreposio entre as gamas de acessibilidade, obtivemos 70, 45 e 38% para o TLR4 humano ECD (Tabela I) e valores acima a 4% menor para mouse ECD TLR4, TLR2 humano ECD, e mouse TLR2 ECD (Informaes de Suporte Tabela S2). Tendo comparado humano e do rato TLR2 e TLR4 estruturas cristalinas com o nosso ECD modelos de homologia correspondente de acordo com cinco critrios de importncia biolgica e estereoqumica, conclumos que as diferenas entre o cristal modelo de estrutura e estrutura-estrutura de cristal eram suficientemente semelhantes para justificar a extenso do mtodo global usados aqui para outras TLR ECD (ver tambm a discusso).

Identificao dos resduos funcionalmente importante em ratos e humanos TLR9 ECD base de mutagnese modelo guiado Usando o ser humano estruturas cristalinas TLR3 ECD como modelos e considerando que LRR individuais melhores blocos corresponderam aos da meta seqncias, foram gerados modelos de homologia de todos humanos e murinos TLR ECD (Informaes de Suporte Fig. S7), em particular humanos TLR7, TLR8 e TLR9 (Fig. 3 e Fig. Informao de Apoio. S8). Esta subfamlia exclusivamente exibe uma regio dentro do ECD, com baixa similaridade com o consenso LRR ou outros motivos estruturais. Esta regio que correspondem a LRR14 foi, portanto, denominado''desestruturadas'' ou''''dobradia regio.4 Mesmo entre TLR7-9 comprimentos de seqncia diferentes e homologias so baixos em nesta regio. Baseado em pesquisas seqncia-estrutura e programas de predio de estrutura secundria, que decidiu este modelo parte de dois LRRs consecutivos 14 e 14, utilizando como modelo de estrutura-poligalacturonase inibindo a protena [1ogq PDB ID: veja Apoio Informao Fig. S8 (B)]. A TLR9 completo ECD estrutura foi montada a partir de diferentes blocos [Apoio Fig. Informao. S8 (A)] e otimizado por simulaes de dinmica molecular. De forma semelhante, modelos para o ser humano (Fig. 3) e murinos (no mostrado) TLR7 e TLR8 tambm foram gerados (cf. Apoio Informao S3 Tabela de fatores de qualidade estrutural). Como evidente a partir da Figura 3 (A), a N-e C-terminal partes do LRR solenide em nosso TLR7-9 ECD modelos diferem na curvatura (raio do solenide LRRs) comparao com a parte central. Um fenmeno semelhante

Observou-se nas estruturas de cristal de TLR25 humanos e TLR4.6 adi Essas estruturas alm disso apresentam um toque na parte central (LRR7-9) da estrutura global superhelical, apresentam uma tpico de protenas LRR, mas difcil de prever em silico.21 Estas caractersticas implicam que ECD diferentes diferem em sua rigidez conformacional, e seu parente orientao ou movimento pode ser importante para funo de receptor adequado, como demonstrado experimentalmente para TLR922 e TLRs usando vrios molecular dynamics.11 interessante notar que o distncia entre N e C-terminal ponto da TLR9 ECD previsto no nosso modelo (? 7,5 nm) corresponde muito bem com os valores experimentais obtidos por Latz et al. (7,3 nm) 22 (cf. informao de apoio Fig. S11). Notamos que no TLR7-9 modelos [Fig. 3 (A)] a superfcie aps o cncavo b folhas (doravante referida como face-B) foi glicana livre como previsto earlier11 e apoiada por cristalografia estudos para TLR1, TLR2, 5 TLR3, 12,13 e TLR4.6 Isto sugere que o B-faces de TLR7-9 pode ser envolvidos em ligante-protena e interaes protena-protena. Em analogia ao hTLR3 onde o cido nuclico ligante obrigada por dois carregados positivamente patches, 7,23 observou-se duas manchas com carga positiva em TLR7 e 9, mas apenas um em TLR8 [Fig. 3 (B)]. Foi intrigante descobrir que as inseres salientes em''''irregular LRRs 2, 5 e 8 forrado a N-terminal metade dos caras-B, sugerindo que as interaes moleculares pode envolver no s a estrutura do ncleo LRR. inseres N-terminal esto ausentes na TLR3. Em hTLR9 as inseres loop continha vrias altamente cistenas conservadas normalmente na empresa de um ou mais resduos de prolina altamente conservado [Fig. 3 (C) e de Apoio Fig. Informao. ] S9. Alm disso, identificamos vrias altamente conservada resduos em um N-terminal de carga positiva patch que tem similaridade funcional a um N-terminalbinding Este site na anlise estrutural TLR3.23 deu a entender o potencial papel funcional destes resduos, qual decidimos avaliar funcionalmente no celular ensaios. Temos abordado o papel dos vrios cistenas por mutao de serina, um aminocido isoestrutural cistena, mas incapaz de formar sulfureto ttulos. Alm disso, mutaes individuais resduos de prolina para alanina. HA-tags expresso construes foram gerados e transfectadas transitoriamente em clulas HEK293 [Fig. 3 (D)]. resduos de prolina mutantes P183A (LRR5) e P269A (LRR8) completamente

revogada funo TLR9 e P99A e P100A (LRR2) TLR9 nveis reduzidos de ativao para ? 25%. P109A (LRR2), por outro lado, no significativamente TLR9 influncia de sinalizao. Protena expresso de todos os mutantes no foi afetado [Fig. 3 (E)]. Mutao de qualquer um dos cinco cistenas leva a uma perda completa da sinalizao TLR9 humanos para avaliar a capacidade de responder a oligonucleotdeos CpG 2006 em NF-JB-dependente ensaios de luciferase dupla [Fig. 3 (D)]. Apoio Figura Informao S10 mostra que as mobilidades eletroforticas de WT TLR9 e selecionados mutantes cistena (C98S e C110S) foram idnticas em redutores e no Condies SDS-PAGE, descartando a possibilidade que a gerao de uma cistena desemparelhado pode levaram a reticulao receptores aberrantes. Estes dados demonstram que os resduos individual no loop de inseres hTLR9 so funcionalmente importantes oligonucleotdeos para deteco de CpG. Alm disso, Esses dados confirmam e validam o nosso procedimento de modelagem experimentalmente.

Discusses Neste estudo, ns avaliamos a preciso de um abordagem de modelagem que combina modelagem por homologia e dinmica molecular para a gerao e refinamento dos modelos em 3D usando um conjunto de estereoquimicamente e biologicamente critrios relevantes. A anlise e comparao das duas estruturas cristalinas do mesma protena (hTLR3) serviu como ponto de referncia supondo que ambas as estruturas cristalinas so dois experimental tentativas de descrever a mesma protena estrutural. Para se ter uma idia de como modelagem por homologia fechar poderia''ficar''de prever uma estrutura desconhecida, comparamos os nossos modelos de homologia para humanos e Mouse TLR2 e TLR4 ECD com os respectivos estruturas cristalinas, que geralmente seria visto como a descrio mais precisa da estrutura de uma protena, apesar das deficincias que possam afetar de cristal estruturas e que tm sido discutidas elsewhere.24, 25 Os modelos apresentados para o ser humano e murino TLR2 e TLR4 ECD se assemelham a seus respectivos, independentemente estruturas cristalinas gerados perto de alguns critrios de comparao: fatores de qualidade global, conformao b-costa, ngulos de toro e acessibilidade de glicosilao. A conformao da estrutura secundria de resduos sobre o ECD LRR cncava definidora

superfcie foi corretamente previsto para uma mdia (Considerando o TLR2 quatro humanos e murinos e modelos TLR4 ECD) de 95% de todos os resduos cncava LRRs que foram comparados. Era de esperar, o mais estruturalmente lado convexo diversa foi previu corretamente apenas? 60% dos casos, um valor que precisa ser melhorada. Quanto distribuio dos resduos para as diferentes regies lote de Ramachandran, que diferenas encontradas entre os modelos abaixo e cristais 10% (Tabela I e Tabela de Informaes de Apoio S2). Por causa do papel particular da glicosilao na muitos receptores, incluindo TLRs, 26,27 nfase especial foi colocada sobre se o nmero correto de possveis stios de glicosilao foi destaque no modelos de homologia. Nossa anlise revela que a orientao de todos os 30 modelado, supostamente N-glycanlinked asparagina como estava previsto no cristal estruturas. Identificao de potenciais stios de glicosilao por si s uma tarefa trivial, uma vez que segue seqncia precisa requirements.28 A nvel estrutural, no entanto, no se segue que qualquer
asparagina na posio correta contexto seqncia pode ser automaticamente glicosilada

em 3D, como a cadeia lateral Asn precisa adotar a correta geometria e superfcie de acessibilidade necessrias para N-glicano addition.17 como sites glicana em TLR3 no so em cargos equivalentes em TLR2 ou TLR426 a previso de geometrias Asn no ltimo TLR ECD no estava inclinado para uma orientao''''glicana acessvel. O fato de que todos os 30 Asn modelada em uma glicosilao sequon foram postmodeling glicana acessvel portanto, altamente significativa e refora a significado de nossa abordagem em relao a este parmetro biolgico importante. Se todos os preditos sites sero glicosilada in vivo ser necessrio ser o foco dos estudos bioqumicos futuro. Em termos do benchmark em quarto lugar, a carga superficial, encontramos que existiam diferenas significativas entre os dois estruturas de cristal de referncia [fig. 2 (C)], enquanto que para demais pares modelo de cristal diferenas na superfcie distribuio de carga parecia menos [fig. 2 (F), Apoio Figos Informao. S4 (C), S5 (C), e S6 (C)]. Diferenas no pH da cristalizao conta as diferenas observadas na superfcie carga entre as duas estruturas TLR3 atravs afetando cadeia lateral de orientao e / ou acessibilidade de superfcie carregada de resduos. Se isso fosse assim, o pH dependncia observados para deteco de cido nucleico TLRs19 endossomal pode ser mais complexa do que apenas afetando a protonao dos resduos de histidina. Particular

tnica tambm foi colocada sobre a questo da se os resduos em geral, esto previstos corretamente ser acessvel ao solvente e, portanto, capazes de se envolver em interaes moleculares. Por exemplo, mutaes de ponto em H39, H60 H539, e N541 em TLR3 prestados o receptor dysfunctional29 e revogada ligante interaction.23 Resultados semelhantes foram obtidos para TLR8.30, 31 comparao, o de acessibilidade superfcie dinmica revelou que a modelagem de homologia previsto apenas? 68% de todos os resduos corretamente para humanos TLR2 e TLR4 mouse e pares de ECD modelo de cristal mesmo no mais baixo nvel de 50% de sobreposio. Esta acompanhado por mais de 93% para o TLR3 dois humanos estruturas cristalinas ECD e sugere que a cadeia lateral conformao, como esperado, seria o mais difcil para prever pela modelagem. difcil imaginar como prever a acessibilidade de superfcie, mais precisamente, e os nossos dados mostram que h espao para aperfeioar a processo de modelagem e de melhorar os instrumentos de comparao em termos de carga de superfcie. No entanto, em um puramente base terica das aproximaes obtidas da natureza parece ser rigoroso o suficiente para formular hipteses para as relaes estrutura-funo de estruturalmente TLRs desconhecido que seria vale a pena testar experimentalmente. Tais testes experimentais de naturalmente, ser o derradeiro teste para qualquer modelo de homologia. Anlise do modelo de TLR9 humanos solicitado nos a investigar experimentalmente o papel da cistenae de resduos de prolina nas inseres LRR. Nosso mutacional anlise mostrou que, de acordo com os dados sobre TLR830, 31 de mutao de qualquer uma das cistenas resultou em uma completa perda de TLR9 sinalizao [fig. 3 (D)], a maioria provavelmente pelo rompimento de pontes de dissulfeto de ligao o incio eo fim de cada ciclo, como proposto na Figura 3 (C) (C98-C110 em LRR2, C178, C184 em LRR5 e C255, C268 e C258-C265 em LRR8) e no devido a reticulao receptores aberrantes por cistenas no pareado (Cf. Figura Informao de Apoio. S10). Bissulfureto formao de vnculo pode ser importante na dobradura da insero do loop ou fornecer uma certa quantidade de estabilidade ou rigidez que pode ser exigido para a deteco de DNA. Tal ligao com nossa observao de que a exigncia de um outro funcional para a funo de receptor adequado a presena de prolina resduos, que so conhecidos pela sua invulgar rigidez conformacional. Alternativamente, pode cistenas coordenar ons metlicos como observado no RNA-obrigatria reconhecimento de padres receptor RIG-I.32 Futuro experimentos necessidade de abordar os molecular precisa mecanismo, mas os dados preliminares mostram que todas as

trs inseres LRR N-terminal de contribuir para a sinalizao. Outra observao interessante que na pelo LRR2 diretamente adjacente a um N-terminal Oligonucleotdeo CpG local de reconhecimento na TLR9 murino ECD, que foi muito recentemente proposto com base em um modelo de homologia de TLR9 murino e experimentalmente confirmada pela sinalizao e CpG-binding assays.20 Em Neste estudo, K51 e R74 foram identificados como dois positivamente carregado com resduos semelhantes propriedades espaciais H39 e H60 como, que constituem um dos dois stios cidos nuclicos-obrigatrio em TLR3.7 Curiosamente, a distncia entre a R74 ea insero LRR2 seria menos de 4 Um acordo com a nossa humana TLR9 modelo [fig. 3 (C)], para que tanto pode representar um local permanente de ligao e / ou que o N-terminal correes e inseres LRR agir em concerto em oligonucleotdeo CpG sensoriamento remoto. A noo de CpG N-terminal oligonucleotidebinding sites TLR9 humanos e murinos aparece incompatveis com relatrios anteriores, sugerindo que a C-terminal de fragmento de TLR9 ECD gerados pela clivagem catepsina mediada na regio entre LRR14 e 15 representaram o oligonucleotdeo CpG real sensor, o TLR9 N-terminal, assim, sendo dispensvel para signaling.20, 33 Apesar de uma clivagem do produto foi confirmada a existncia de TLR9 murino em o sistema HEK293, mutaes no N-terminal resduos e K51 R74 claramente prejudicada funo e no gerao de product.20 clivagem Ns no observar um produto de clivagem para TLR9 humanos em nosso experimentos, e nossos dados reforam a importncia de resduos de N-terminal para TLR9 humanos sinalizao mais. clivagem TLR9 podem, todavia, representam um passo importante para regulamentar subsequente deteco de oligonucleotdeos CpG inicial pelo fulllength receptor. Outras experincias com produtos purificados truncamentos ECD seria altamente informativo para esclarecer o impacto da diviso sobre reconhecimento do ligante. De acordo com a nossa modelagem e experimental dados, CpG DNA parece estar envolvido em pelo menos dois locais distintos, em ambos TLR9 humanos e murinos. Como visto na Figura 3 (F), a distncia entre um site e 2 em uma molcula receptora (previsto para ser? 7,5 nm, Fig. Informao de Apoio. S11) pode ser ligados por um 24-mer como CpG 2006 (uma mer 11 includos para comparao abrange tamanho 4,5 nm). O parente distncia do local e um site 2 seria, obviamente, afectados por LRR curvatura, rigidez e conformacional mudanas que ocorrem durante signaling.11, 22 Assumindo que a maior flexibilidade para ocorrer no

''''Da regio da dobradia TLR9, as curvaturas diferentes determinado experimentalmente por Latz et al.22 que traduzir para a distncia site 02/01 a encolher a partir de? 7,5 nm (no estado desacoplado) para? 6,8 nm em CpG ligao, conforme ilustrado na Informaes de Suporte Figura S11. Isso equivaleria a um valor aproximado mudana de um dinucleotdeo. Se a estrutura do ncleo o dobro encalhado com salincias livre 50 e 30, como sugerido com base em estudos biofsicos, 34 ns especulamos que os stios 1 e 2 podem ser simultaneamente contactado em duas molculas receptoras (site distncia 1 10 site2/20-site? 16 nm) que existem como pr-formados dmeros antes ligante binding.22 estudos futuros necessidade de resolver se estas previses so verdadeiras e as posies que papel relativo receptor (tal como proposto para TLR323) desempenha durante ligante e gerao de sinal. Outra questo interessante que pode ser guiada pelos modelos gerados homologia aqui se semelhante para aplicar princpios de ligao o outro cido nuclico sensoriamento receptores TLR7 e 8 [Fig. 3 (B)]. Homologia modelos que construmos para o restantes membros do humana (TLR5, 6 e 10/07; Apoio Fig. Informao. S7), mouse (TLR5, 6, e 11-13; dados no mostrados), vertebrados e outros TLR famlias podem ainda prever uma estruturais perspectiva sobre a evoluo da famlia como uma TLR todo (Kubarenko et al. manuscrito em preparao). Em concluso, os autores apresentam dados sobre o reconhecimento ligante princpios da TLR9 humana sobre validao da nossa modelagem por homologia TLR ECD abordagem. Apesar de validao abrangente no possvel que os modelos correspondentes aos domnios de estrutura totalmente desconhecido, quando o modelo de possveis, procedimentos devem ser validados com correspondentes estruturas cristalinas. Como um nmero crescente de publicaes no campo TLR dependem modelagem por homologia para a interpretao dos resultados experimentais, resultados da modelagem deve ser referenciado a certos benchmarks. Especialmente quando os modelos so usados para retrospectivamente interpretar experimentais obtidos resultados, em vez de dar incio a uma hiptese que posteriormente testadas experimentalmente, a validade do a abordagem utilizada deve ser comprovada e suficiente dados compartilhados para avaliar a qualidade do predio. Ficamos surpresos ao descobrir que o nosso relatrio a primeira a discutir a questo da validao de gerados modelos de homologia de domnios TLR. O envolvimento com esta questo pode promover melhorias nos processos de modelagem, no s para TLR domnios, mas tambm pode aumentar o poder das previses

com base em modelos de homologia. Apesar de cristal estruturas de alguns dos TLRs discutidos aqui seguir, os dados experimentais gerados com base nas modelagem por homologia podem, entretanto, no s fornecer importantes insights sobre a biologia molecular desses receptores, mas tambm constituem a dados funcionais necessrias para validar funcionalmente mesmo as estruturas de cristal de alta resoluo. Materiais e Mtodos Estruturais arquivos de dados As estruturas de cristal. Alm das estruturas cristalinas referenciadas no texto, as estruturas de CD14 mouse (PDB ID 1wwl35) e P. poligalacturonase plebesmoinibio da protena (PDB ID 1ogq, PMID 12904578) tambm foram utilizados. Seqncias de TLR. Para a modelagem de homologia, o seguinte Seqncias de TLR foram usados: hTLR4 (AAF05316), mTLR4 (NP_067272), hTLR2 (AAC34133), mTLR2 (AAD49335), hTLR7 (NP_057646), mTLR7 (NP_573474), hTLR8 (NP_619542), mTLR8 (NP_573475), btTLR8 bovina (NP_001029109), hTLR9 (NP_059138), e mTLR9 (NP_112455). Modelagem por homologia Modelagem foi realizado como previamente described11 usando o pacote Modeller, 14, o TLR3 humanos Estruturas ECD 2a0z e 1ziw, mouse CD14 1wwl, e protena plebesmo P. poligalacturonase, inibindo como modelos de uso de blocos de LRR maior com similaridade entre modelo e alvo (Apoio Figos da Informao. S1 e S8). Aps a modelagem individual blocos, que estavam reunidos para a completa ECD estrutura, atravs da seqncia parcial de estrutura sobreposio na bstrand mais estruturalmente conservadas regio. A fuga server36 foi utilizado para a busca de TLR7-9 LRR14 modelos. GROMACS dinmica molecular e anlise da qualidade (ANOLEA, VERIFY_3D e ERRAT) e visualizao / anlise (SwissPBD Viewer e PyMOL) ferramentas foram utilizados como referenced.11

Estrutura de programas de comparao Para a comparao das estruturas secundrias e toro ngulos, ProCheck e ProCheck_Comp37 e DSSP38 foram utilizados. Para a anlise de glicosilao, a

pdb foram submetidos GlyProt webserver.17 Cargas superficiais foram calculadas e visualizadas usando PDB2PQR, 39 PropKa, 40 e APBS41 pacotes. Para efeito de comparao acessibilidade solvente 20 quadros correspondentes a cada intervalo de 10 ps de 200 ps GROMACS simulao dinmica molecular foram extrados, e para cada rea do quadro solvente acessvel para cada resduo foi calculado atravs da MSMS mdulo de 42 dentro do pacote CAT (www.md-simulaes. de / CAT). Clulas e reagentes Produtos qumicos e reagentes de cultura de clulas foram Sigma, salvo indicao em contrrio. O oligodeoxynucleotide CpG 2006 (50 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-30) foi sintetizada pelo TIB MolBiol (Ebersberg, Alemanha). Os anticorpos anti-HA foram recebidas Sigma. As clulas HEK293 foram um presente de A. Dalpke, Heidelberg University, na Alemanha e foram cultivadas a 37 C e 5% de CO2 em meio DMEM suplementado com 10% SFB (PAA, Alemanha), L-glutamina, penicilina e estreptomicina / (Invitrogen). Mutagnese dirigida plasmdeo pSEM3_hTLR9-HA foi construda por introduo de um costume recozido sintetizados 50-fosforilada codificao oligonucleotdeo o HA-tag seqncia (YPYDVPDYA) com a restrio enzimas BamHI e NotI. Mutagnese dirigida foi realizada conforme descrito anteriormente, 20 seqncias dos primers podem ser disponibilizados mediante solicitao. Experimentos gene reprter e immunoblot Para os experimentos do gene reprter, a luciferase do firefly reprter construir com um 6xNF JB-elemento responsivo foi utilizado. Um total de 1 106 clulas HEK293 foi formato e imediatamente semeados em 24 transfectadas bem e um volume de 500 meios de comunicao LL. Um total de 50 ng de hTLR9-HA ou o plasmdeo indicado mutante foi transfectadas com 85 ng plasmdeo NF-JB-reprter codificao luciferase de um vagalume, e 8,5 ng TK-PRL (Promega) codificao luciferase Renilla foi transfectado utilizando o mtodo de fosfato de clcio. Vinte e quatro horas aps a transfeco, as clulas foram estimuladas

com um oligonucleotdeo CpG lM 2006 para 18 h, e atividades luciferase foram determinadas usando o Dual Reprter do luciferase Kit Sistema de Ensaio (Promega), em um instrumento Optima Fluostar (Labtech BMG). Os valores mdios de triplicatas (6SD) de um de pelo menos trs experimentos independentes so mostrados. hTLR9HA foi provado sinal semelhante ao untagged hTLR9 neste ensaio (A. Kubarenko, indito observao). Immunoblot HEK293 clulas foram transfectadas como acima de 400 ng do indicado hTLR9-HA plasmdeo. Quarenta e oito horas depois, as clulas foram lisadas por 30 min no gelo em 80 lise LL (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% NP-40, SDS 0,5% desoxicolato de sdio, 0,1% suplementada com inibidor de protease completo cocktail (Roche)) por poo e trs poos agrupados. Lisados foram apuradas por centrifugao a 4 C por 15 min a 11.000 g. Igual quantidade de lisados foram fracionados em 3 "8% Tris-acetato de SDS-PAGE (Invitrogen) gis e transferidos para membrana por transferncia molhada (Invitrogen). As membranas foram bloqueados com PBS suplementado com 3% nonfat leite em p e 0,5% Tween 20, sondou com antiHA (1:2.500) e um Promega anti-mouse HRP (1:10.000), e bandas de reaco cruzada visualizados usando a quimioluminescncia reforada (Pierce) em um Agfa desenvolvedor automatizadas. Agradecimentos Os autores agradecem A. Dalpke para discusses teis e T. Holz para suporte de informtica.