UNIVERSIDAD CATOLICA DE LA SSMA CONCEPCION Facultad De Ciencias / I Semestre 2010 U.

A 37 / BIO 0221 / Biooquimica /Laboratorio

Practico N 1:
Mtodos Usados en Bioqumica: Espectrofotometra

Integrantes: Valentina Ramrez Karina Villalobos Curso: BIO 0221 Laboratorio Seccin: 3 Docente: Paulina Salas Fecha: 06/05/ 2010

INTRODUCCIN Un espectrofotmetro es un instrumento usado en la fsica ptica que sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o espectrofotmetro de masa. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: 1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra 2. Indicar indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra Fuente de luz La misma ilumina la muestra. Debe cumplir con las condiciones de estabilidad, direccionabilidad, distribucin de energa espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son lmpara de wolframio (tambin llamado tungsteno), lmpara de arco de xenn.kl y lampara de Deuterio que es utilizada en los laboratorios atomicos. Monocromador El monocromador asla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromtica. Est constitudo por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersin. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida. Compartimiento de Muestra

Es donde tiene lugar la interaccin, R.E.M con la materia (debe producirse donde no haya absorcin ni disperisn de las longitudes de onda). es importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de lambert-beer en su mxima expresin, en base a sus leyes de absorcin, y lo implica esto, en lo que concierne a el paso de la molcula de fundamental-excitado.
Fotodetectores

En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la seal en forma simultnea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes mviles del equipo. La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones qumicas y biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Principio de la Espectrofotometra Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. La espectrofotometra ultravioleta-visible usa haces de radiacin del espectro electromagntico, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm , por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la regin ultravioleta y visible del espectro. Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le conoce tambin como rango de uv cercano , la espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo electromagntico de la luz visible , de 400 a 800 nm. Adems, no est de menos mencionar el hecho de que la absorcin y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentracin y de la distancia recorrida. Ley de Beer La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin. Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad de agua pero con ms azcar diluida. El vaso es una celda fotoelctrica, y la solucin de azcar es la que se mide su concentracin.

Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y son absorbidos por estos. Ley de Lambert En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentracin de azcar, pero, el segundo tiene un dimetro mayor que el otro. Segn la ley de Lambert, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y son absorbidos por estos; de la misma forma que se explic en la ley de Beer. Ley de Bouguer-Beer-Lambert Una ley muy importante es la ley de Bouguer-Beer-Lambert (tambin conocida como ley Lambert Bouguer y Beer) la cual es solo una combinacin de las citadas anteriormente. Transmitancia y absorcin de las radiaciones Al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones, por las leyes mencionadas anteriormente, hay una prdida que se expresa con la ecuacin: It/Io=T-kdc'' Donde It , es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoelctrica (llamada radiacin o intensidad transmitida); y Io que es la que intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiacin intensidad incidente) y la relacin entre ambas (T) es la transmitancia. En el exponente, el signo negativo se debe a que la energa radiente decrece a medida que el recorrido aumenta. Donde k es la capacidad de la muestra para la captacin del haz del campo electromagntico, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometra que recorre la radiacin, y c es la concentracin del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta. La ecuacin simplificada de la ley de Beer-Lambert A = .d.c

Comprende a la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbancia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiacin (d) y el factor de calibracin (). El factor de calibracin relaciona la concentracin y la absorbancia de los estndares. La absorcin (o absorbancia) es igual a A, la es el logaritmo del reciproco de la transmitancia: A= log 1/T lo que es igual a: A= -log T Las ecuaciones mencionadas de las leyes son validas solo y solo s:

La radiacin incidente es monocromtica. Las especies actan independientemente unas de otras durante la absorcin. La absorcin ocurre en un volumen de seccin trasversal uniforme

Las aplicaciones principales son:

Determinar la cantidad de concentracin en una solucin de algn compuesto utilizando las frmulas ya mencionadas. Para la determinacin de estructuras moleculares. La identificacin de unidades estructurales especificas ya que estas tienen distintos tipos (grupos funcionales o isomeras). OBJETIVOS.

1.- Conocer e interpretar un espectro de absorcin 2.- Aprender a construir una curva de calibracin 3.- Aprender a calcular la concentracin de una muestra problema, a partir de la construccin de la curva de calibracin.

compuestos Nu Punto de fusin

Azul de bromo fenol No regulado. 270 - 273C

Anaranjado de metilo 547-58-0 >300 C

Punto de ebullicin Riesgos Seguridad

279C (se descompone). Irritante y Nocivo leves Inhalacin : concentraciones Altas producen irritacin,Tos. Molestias respiratorias. Contacto con La Piel : irritaciones leves. Contacto con los Ojos irritaciones leves. Molestias. Lagrimeo. Ingestin : irritacin gastrointestinal leve. Posibles nuseas, vmitos y diarrea. C19H10O5SBr4 Irritante Xi Nocivo Xn

~ 100C (~ 212F)

toxico Txico por ingestin. sense guantes adecuados.En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustresele la etiqueta).

Simbologa Pictogramas

C14H14N3NaO3S

T (Txico) Toxicologa Inhalacin : - En caso de paro respiratorio, emplear mtodo de reanimacin cardiopulmonar. - Si respira dificultosamente se debe suministrar Oxgeno. - Conseguir asistencia mdica. Contacto con la piel : Lavar con abundante Agua, a lo menos por 5 minutos. Como medida general, utilizar una ducha de emergencia en caso de ser necesario. Contacto con los Ojos : Lavarse con abundante y rpida Agua en un lavadero de ojos, entre 5 y 10 minutos, separando los prpados. De persistir la irritacin, derivar a un servicio mdico. Ingestin : Lavar la boca con bastante Agua. Dar a beber Agua. Enviar a un centro de atencin mdica, de existir alguna molestia. Lmite Permisible Ponderado : 8 mg/m3 (para Azul de Bromofenol, como Polvos no Clasificados Decreto N 594 - Ministerio de Tras inhalacin: Tomar aire fresco. Tras contacto con la piel: aclarar con abundante agua. Quitar la ropa contaminada. Tras ingestin: beber abundante agua, provocar vmitos. Llamar enseguida al mdico. Tras contacto con los ojos: aclarar con abundante agua, con los prpados bien abiertos. Llamar al oftalmlogo si fuera necesario. Toxicidad aguda: DL50 (oral, rata): 60 mg/kg Informaciones complementarias sobre toxicidad: Propiedad que no puede ser excluida en base a consideraciones relativas a sus efectos estructurales: Tras contacto con los ojos: leves irritaciones. Tras ingestin: No disponemos de una descripcin de sntomas txicos. Informacin adicional: Los colorantes azoicos que contienen una componente arilamnica son potencialmente

Clasificacin de colores Color de almacenaje

Salud) Lmite Permisible Absoluto : 40 mg/m3 (para Azul de Bromofenol, como Polvos no Clasificados Decreto N 594 - Ministerio de Salud) Limite Permisible temporal : No regulado. Otros limites : No reportados. azul: 1 rojo: 0 amarillo: 0 blanco: 1 Verde

cancergenos. As pues, se aconseja manipular el compuesto segn las caractersticas propias de la amina.

verde

RESULTADOS Materiales:

Balanza Pipetas graduadas Tubos de ensayo Espectrofotmetro

Reactivos- soluciones: Azul de bromo fenol Anaranjado de metilo Agua destilada Parte I: Preparacin de solucin stock de Anaranjado de metilo (A.M.). A.- DATOS TERICOS. a.- Concentracin de la solucin (A.M.) : 10% mg b.- Concentracin de la solucin diluida de A.M. para el espectro de absorbancia: c.- Concentracin de solucin diluida de A.M. para la curva de calibracin. Clculo Concentracin de solucin stock de Anaranjado de Metilo: 0.005 mg X mg = 1mL 100mL X= 0.5 mg % Clculo Concentracin diluida de Anaranjado de Metilo para el espectro de absorbancia: 10 mg 0.5 mg = 100mL X mL X= 5.0 mL

Parte II: Espectro de absorcin del Anaranjado de Metilo

A.- TABLA DE DATOS EXPERIMENTALES. Longitud (nm) 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 Clculos para determinacin %T A = 2 - log % T 1) 0.199 = 2 - log % T - 1.801 = - log % T / -1 1.801 = log % T Antilog. 1.801 = 63.24 % T 2) 0.257 = 2 - log % T - 1.743 = - log % T / -1 1.743 = log % T Antilog. 1.743 = 55.34 % T Absorbancia. 0.199 0.257 0.301 0.331 0.315 0.226 0.112 0.039 0.012 0.003 0.002 % Transmitancia. 63.24 55.34 50.00 46.67 48.42 59.43 77.27 91.41 97.28 99.31 99.54

B .- Graficos

0,35 0,3 0,25 Absorbancia 0,2 0,15 0,1 0,05 0 400

450

500

550

600

650

Longitud de onda (nm)

Grafico N 1: Esta Representada la absorbancia a distintas Longitudes de onda de la solucin de Anaranjado de Metilo.

% Transmitancia v/s Longitud de onda

120 % Transmitancia 100 80 60 40 20 0 400 450 500 550 600 650

Longitud de onda (nm)

Grafico N 2: Esta Representado el % de Transmitanca de Anaranjado de Metilo a distinta longitud de onda. C.- Espectrograma

1. Absorbancia Mxima: 0.331. 2. Transmitancia mnima: 0.002. 3. Longitud de onda de trabajo: 460nm.
Parte III: Curva de Calibracin.

Clculo Concentracin diluida de A.M para la curva de calibracin: 10 mg 100mL 1mg X mL X= 10 mL A.- Tabla N 2: Datos Experimentales. Concentracin (mg%) 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

Tubo N 1 2 3 4 5

%Transmitancia 59.7 45.6 32.7 24.3 17.5

Absorbancia 0,224 0,341 0,486 0,614 0,757

Clculos de las Concentraciones de las disoluciones. A = 2 - log % T 1) 0.224 = 2 - log % T - 1.776 = - log % T / -1 1.776 = log % T Antilog. 1.776 = 59.7 % T Para 2 mL: 1 mg A.M. = 100 mL x 2 mL x= 0.02 mg. Para 4 mL: 1 mg A.M. = 100 mL x 4 mL x= 0.04 mg. 0.04 mg = 10 mL x 100 mL x= 0.4 mg% 0.02 mg = 10 mL x 100 mL x= 0.2 mg%

Grafico

Grafico N3 : Esta Representado con las concentraciones y porcentaje de absorbancia. Parte IV : Muestra Problema. N de Muestra % de Transmitancia Absorbancia (D.O) Concentracin de la solucin problema de trabajo (nm) Regresin Lineal: a: 0.0827 b: 0.6695 r2: 0.999 0.0827 1 59.8 0.222 0.21 460 Ecuacin de la Recta: Y= mx + b 0.222 = 0.6695x + X = 0.222-0.0827 0.6695 X= 0.21 mg Concentracin de la Muestra.

0.21 mg = 10 ml = 2.1 mg % X 100ml

DISCUSIN.

La espectrofotometra se refiere a los mtodos, cuantitativos, de anlisis qumico que utilizan la luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como mtodos espectrofotomtricos y, segn sea la radiacin utilizada, como espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra), ultravioleta, infrarroja Las ventajas de la espectrofotometra sobre otros mtodos analticos de laboratorio son varias, entre ellas destaca que es rpida, precisa, verstil, fcil de usar, eficiente en costo, especfica y sensible. Los espectrofotmetros se han mejorado en precisin y versatilidad en los ltimos aos con los avances de tecnologa, y hoy se consideran indispensables en un laboratorio de qumica. El registro de la variacin del coeficiente de la absorbancia A, o de la transmitancia T, en funcin de la longitud de onda da origen a la curva espectral de una sustancia qumica e indica las caractersticas de absorcin de dicha sustancia con relacin a la longitud de onda. Cada componente de la solucin tiene su patrn de absorcin de luz caracterstico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de absorcin de luz de la muestra versus las soluciones standard, fue posible determinar la identidad y la concentracin de componentes disueltos en la muestra problema. En muchas ocasiones la curva espectral se presenta como Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de absorcin, o en funcin de la transmitancia, denominndose el espectro, espectro de transmisin. Dentro del aspecto de anlisis la espectrofotometra es un mtodo analtico indirecto porque se basa en la medicin de la absorbancia o transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la actualidad para la identificacin de un analito en una muestra problema. En el anlisis de la solucin stock de concentracin 1 mg% fue elegida la longitud de onda de trabajo de 460nm, esto debido a que era la que presentaba la mayor absorbancia (0.331 DO), y menor % de transmitancia (46.67%) de todas las mediciones obtenidas. La determinacin de la concentracin de la muestra problema se hizo en base a la construccin del grfico absorbancia versus concentracin del cual se determin la ecuacin de la recata y a partir de sta se obtuvo la concentracin de la muestra, alcanzando un valor de 2.1 mg% La curva de calibracin es una curva que se construye a partir de diferentes concentraciones de un analito y su respuesta frente a una reaccin. Este grfico tiende a ser lineal, mientras progrese segn la ley de Lambert Beer CONCLUSIN.

El espectrofotmetro sirve para medir la luz absorbida por una sustancia. En general, los espectrofotmetros miden en % de transmitancia (T) y absorbancia (A). El porcentaje de transmitancia se refiere a la cantidad de radiacin que pasa a travs de la muestra y alcanza el detector. La espectrofotometra en bioqumica se utiliza para determinar la concentracin de la sustancia, para medir el curso de una reaccin, determinar compuestos, etc. La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin.(2) En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz.(2) La ley de Lambert-Beer permite determinar concentracin en una solucin de algn compuesto.(2) la cantidad de

Para determinar la longitud de onda ms apropiada se debe realizar un espectro de absorcin del mismo y seleccionar aquella longitud de onda donde su absorbancia sea mayor. (1) Si se diluye sucesivamente una sustancia coloreada y, de cada solucin, se mide el valor de la absorbancia a una longitud de onda optima al representar grficamente estos valores (A v/s ) se obtiene una curva de calibracin de la sustancia. A partir de la curva de calibracin de una sustancia es posible conocer la concentracin de la muestra, para ello se mide su absorbancia a la misma longitud de onda y, con base en ese valor, se interpola la concentracin. (2) La absorbancia y transmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentracin y de la distancia recorrida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. A la longitud de onda de 460nm se registr la mayor absorbancia, 0.331 D.O, y adems se registr la menor transmitancia. La muestra problema registr un porcentaje de transmitancia de 60% y un absorbancia de 0.222 D.O La muestra problema tenia una concentracin de 2.1 mg % Tanto en las mediciones de la solucin stock como en la de los tubos de ensayos (5 tubos) la absorbancia y % de transmitancia son inversamente proporcionales.

La longitud transmitancia-

de

onda

es

directamente

proporcional

al

de

La concentracin es directamente proporcional a la absorbancia.

BIBLIOGRAFA

(1) Soborg S, M, Vilanova G, E, Tcnicas Analticas de Contaminantes qumicos, editorial Daz de Santos, Espaa, (2004), Pg 86 (2) Quesada M, S, Manual de Experimentos de Laboratorio de Bioqumica, editorial EUNED, primera edicin, Costa Rica, (2007), pg 27. http://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometra