Tcnicas de tincin El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico.

La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. FIJACION.- Es cuando las clulas son tratadas para coagular el protoplasma, antes de teirlas. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.

COLORANTES.- Son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante li posoluble es el negro Sudn. MORDIENTE.- Es una sustancia qumica, que no es un colorante por si
mismo, pero que permite que algunos colorantes tian mejor a las clulas. Ejem el cido tnico

EL AZUL DE METILENO.- Es un buen colorante simple que acta sobre

todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.

LA TINCIN NEGATIVA.- Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas

EXAMEN DE MUESTRAS AL MICROSCOPIO

SIN TINCIN No se utiliza ningn tipo de colorante. Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc

TINCIN SIMPLE Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china. En la imagen: Candida sp en un examen en fresco. TINCIN DIFERENCIAL Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

la tincin GRAM La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tincin de GRAM Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: 1.-El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal. 2.-Se lava con agua. 3.-Se cubre con solucin Yodada durante 1 min 4.-y se lava de nuevo con agua. 5.-Decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. 6.-Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. 7.-Lavar y secar. 8.-observar al microscopio

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.

Las bacterias gram-positivas 1.-La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. 2.-Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. Las bacterias gram-negativas 1.-La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. 2.-Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular

TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN

Tambin es una tincin diferencial. Se denomina tincin cidoalcohol resistente y es especfica para una serie de bacterias con estructura de pared particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no est basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en cidos miclicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloracin con cido y alcohol que no se produce en casi ningn otro tipo bacteriano. La tincin de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tie toda la preparacin de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparacin con el colorante. La solucin decolorante elimina el colorante primario excepto el los bacilos cido alcohol resistentes. (BAAR). Por ltimo el azul de metileno tie de azul el resto de la preparacin. Esta tincin es til en la deteccin de bacterias del gnero Micobacterium en muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnstico casi definitivo de tuberculosis.

TINCIN DE ESPORAS Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecacin, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas. Slo algunas bacterias son capaces de formar esporas y esta caracterstica puede en algunos casos orientar el diagnstico. Estn descritos varios mtodos para teir esporas. Quizs el ms utilizado sea el de Wirtz-Conklin o tincin con verde malaquita. Este colorante se une fuertemente a las esporas gracias a la utilizacin de calor como mordiente. La fase de decoloracin en este caso se realiza con agua abundante. Las formas vegetativas pierden el color verde y se tien con el colorante de contraste (fucsina o safranina). La deteccin de esporas debe realizarse en cultivos con condiciones estresantes para la clula. Suelen utilizarse cultivos viejos en los que la escasez de nutrientes provoca la esporulacin de las bacterias. La presencia de esporas en el mbito clnico no dirige hacia los gneros Clostridium y Bacillus. Algunas esporas se desarrollan sin deformar a la clula vegetativa. Otras si lo hacen y generan segn la disposicin formas centrales o terminales (palillo de tambor). La posicin relativa y la morfologa de la espora constituyen caracteres taxonmicos en las especies de ambos gneros.