TRANSFERENCIA EMBRIONARIA EN EQUINOS Luis Losinno, MV, PhD Laboratorio de Reproduccin Equina, Ctedra de Produccin Equina, Departamento de Produccin

Animal, Facultad de Agronoma y Veterinaria, Universidad Nacional de Ro Cuarto, (5800) Ro Cuarto, Argentina; llosinno@gmail.com La tcnica de transferencia de embriones en equinos es el procedimiento por el cual se recolecta uno o mas embriones a travs de un lavaje uterino transcervical de una yegua donante inseminada o servida por monta natural, 6 a 10 das post-ovulacin, y se transfiere de manera no quirrgica al tero de otra yegua receptora sincronizada previamente. En 1974, simultneamente y de manera independiente Oguri en Japn y Allen en Cambridge fueron los primeros en reportar una preez por TE en equinos. Desde entonces, y coincidentemente con el desarrollo de la ultrasonografia reproductiva, a partir de los primeros reportes a comienzos de los 80, las TE han crecido sostenidamente durante las ultimas tres dcadas, instalndose como una de las herramientas biotecnolgicas de mas alto impacto en sistemas de produccin de equinos de alta performance o valor gentico. En Argentina los primeros ensayos con TE en equinos se realizaron a mediados de la dcada del 80, y los primeros reportes y registros de centros comerciales, comenzaron durante la temporada de 1989, en yeguas de Polo. En la actualidad se encuentran operando al menos 28 centros de TE y se han reportado 6000 preeces en la temporada 2007-2008 lo que ubicara a Argentina en tercer lugar mundial en trminos de produccin de embriones equinos, luego de USA y Brasil. Indicaciones La transferencia embrionaria es una tcnica de reproduccin asistida que tiene el potencial de aumentar la eficiencia reproductiva de la especie, pero es conveniente y necesario remarcar sus limitaciones, dado que a veces las expectativas puestas sobre ellas son infundadas. Las principales indicaciones incluyen: Aumentar el nmero de potrillos por ao en yeguas seleccionadas. En promedio, en su vida reproductiva una yegua de cra puede producir entre 5 y 7 potrillos de manera natural. Con la TE es posible multiplicar por 10 estos valores en programas de produccin continua. Producir potrillos de yeguas en competicin. Producir potrillos en yeguas que no puedan gestar por problemas no reproductivos. Investigaciones sobre las relaciones materno-embrionarias. Disminuir el intervalo generacional en la especie. Eliminar los riesgos de gestacin y parto en yeguas de alto valor. 1

Pruebas de progenie

Procedimientos Para maximizar el xito de los programas de transferencia embrionaria, deberan ser usados tanto yeguas como padrillos frtiles, pero esto en general no es una opcin del veterinario dado que en general son los clientes los que proponen los cruzamientos. De todos modos lo que si es una opcin del profesional es realizar un informe de aptitud reproductiva potencial de los animales basado en un exhaustivo examen clnico, que determine: a) si el animal (yegua o padrillo) es apto para ingresar a un programa de TE y; b) su produccin potencial en el programa, basado en datos estadsticos. Las yeguas donantes deberan estar en excelente condicin corporal, ovulatorias, reproductivamente aptas y deberan ser inseminadas con una adecuada cantidad de espermatozoides motiles precediendo a la ovulacin en caso de semen fresco o refrigerado, o post-ovulacin en el caso de semen congelado, dependiendo del protocolo utilizado. . Aproximadamente el 80% de las yeguas del hemisferio Sur estn en periodo ovulatorio naturalmente en el mes de octubre y hasta abril-mayo del ao siguiente. El perodo estral de receptividad sexual de la yegua promedia los 7-8 das; de esta manera, el estro y el diestro deben ser manejados para sincronizar de forma efectiva las yeguas donantes y receptoras. Es muy importante determinar para cada individuo el Intervalo Inter-ovulatorio (IIO), es decir el periodo entre una ovulacin y la siguiente, como base para un programa de sincronizacin de ovulaciones. El examen regular del tracto reproductivo de la yegua por tacto rectal y ultrasonografa, representa una ventaja en cuanto al monitoreo preciso del crecimiento folicular y la deteccin de la ovulacin. El da en que la ovulacin es detectada se considera el da 0 del ciclo. La recoleccin de embriones consiste en realizar un lavaje (flushing) del tero de la yegua donante con un volumen total de 2 a 3 litros (de a uno por vez), de una solucin de PBS (Buffer Fosfato Salino) o Ringer Lactato, sin agregado de Suero Fetal Bovino, para luego recuperar el efluente en un sistema cerrado de dos vas, filtrarlo e identificar el embrin. El tero es lavado ntegramente sabiendo que el embrin equino en este periodo se mueve debido a contracciones del miometrio y puede ser encontrado en cualquier rea, dentro del lmen uterino. Para el lavaje se utiliza un catter semirgido tipo Foley especifico para yeguas, de 80 cm de longitud, con un baln inflable de 30-60 cc. El extremo anterior de este catter es pasado a travs del crvix hacia el cuerpo uterino y se llena el baln con el medio usado para el lavaje -o con aire- para evitar el reflujo del medio hacia la vagina. El extremo posterior se conecta a un circuito intermediario interconectado al recipiente con medio de lavaje y al filtro. Tan pronto el efluente est recolectado, el filtro cerrado es llevado al laboratorio donde los 20-30 ml residuales del filtro, son transferidos a cpsulas de Petri estriles 2

donde se realiza la bsqueda del embrin en una lupa estereoscpica y bajo estrictas condiciones de higiene ambiental y operacional. La tasa de recuperacin de embriones por cada intento de colecta vara entre un 20% a un 160%. La variabilidad de estas obtenciones se debe, entre otros factores, a la cantidad y calidad del semen utilizado, la edad y estado reproductivo de la donante, el da post-ovulacin en el que se intente obtenerlo, el nmero de ovulaciones, la tcnica de lavaje utilizada y el entrenamiento del operador. En estudios controlados, las tasas de recuperacin de embriones para yeguas viejas subfrtiles (31%) fueron aproximadamente la mitad de las correspondientes a yeguas jvenes frtiles (71%). Adems, las yeguas subfrtiles producan una alta proporcin de embriones anormales versus los producidos por las yeguas normales. El da ms temprano de recuperacin del embrin es determinado por el tiempo en que ste demora en pasar desde el oviducto al tero. La mayora de los embriones llegan al tero al da 5.5 post-ovulacin. Los intentos para recuperar los embriones en el da 6 resultan en tasas de recuperacin ligeramente ms bajas comparadas con las del da 7, 8 9. El da 8 9 el embrin es de 1-2 mm. de dimetro lo cual permite que ste muchas veces pueda ser visualizado macroscpicamente. Los embriones del da 10 son ms difciles de manejar y requieren de entrenamiento y materiales apropiados, de lo contrario resultan en menores tasas de xito posttransferencia. Considerando todo esto, el da de preferencia de recuperacin de embriones es el da 7,5; el da 8 es la segunda alternativa, pero tambin hay que considerar que en las yeguas viejas es recomendable realizar el lavaje al da 9 o 10 debido a que posiblemente su tiempo de transito tubarico sea mayor y la tasa de crecimiento del embrin, menor. Las yeguas donantes con ovulaciones dobles espontneas son las de preferencia ya que reportamos que las tasas de recuperacin de sus embriones son significativamente mayores 106% vs. 53% y 160% vs. 87%. Las recolecciones pueden ser hechas en la misma yegua donante, en promedio, cada 14 das durante la temporada de reproduccin fisiolgica (octubre-abril en el rea central de Argentina, aproximadamente latitud 33S). Si una yegua donante tiene mltiples folculos mayores de 30 mm, puede optarse por la utilizacin de un inductor de la ovulacin como la gonadotropina corinica humana (hCG) o anlogos sintticos de GnRH (Deslorelina) para aumentar el nmero de ovulaciones as como tambin para sincronizar las mltiples ovulaciones potenciales. Las yeguas que estn en estro con folculos mayores a los 35 mm. se espera que ovulen dentro de las 48 hs. de haber sido tratadas con 1.500 U.I. de hCG IM o 1,5 mg IM de Deslorelina de accin controlada (LAD). Las tasas de ovulacin y de recuperacin embrionaria en programas comerciales de produccin de embriones en yeguas de Polo en Argentina difieren significativamente en relacin a la edad de las donantes y a la droga utilizada (tabla 1 y tabla 2) (Losinno, 2008). Es importante considerar que las tasas de recuperacin embrionaria pueden ser expresadas considerando: a) numero de embriones recuperados/ciclo y b) numero de embriones recuperados/ovulacin detectada. Ambos valores difieren significativamente en yeguas de polo donde la tasa de ovulaciones mltiples es de aproximadamente 30%. El 3

segundo es el ndice ms preciso y el mejor indicador de eficiencia y/o pericia del operario pero es el menos utilizado.

Tratamient o hCG LAD Control

USA)

Ciclos (n) 171 390 849

Tasa Ovulacin (%) Simple (%) 63,2a 56,9b 76,1c

Mltiple (%) 36,8d 43,1e 23,9f

ab-c; de-f p<0.001.

hCG: Ovusyn, Syntex SA; LAD: BET LADes,

Tabla 1. Tasa de ovulacin en yeguas jvenes Polo Argentino donantes de embriones (Losinno et al, 2008) Tratamient o hCG LAD Control
USA)

Ciclos (n) 48 266 327

Tasa Ovulacin (%) Simple (%) 58,3 50,7b 68,8c

Mltiple (%) 41,7d 49,2e 31,2f

ab-c; de-f p<0.001.

hCG: Ovusyn, Syntex SA; LAD: BET LADes,

Tabla 2. Tasa de ovulacin en yeguas viejas Polo Argentino donantes de embriones.(Losinno et al, 2008) Las yeguas que se seleccionan como receptoras deberan ser jvenes (3-12 aos), estar en excelente estado de salud, condicin corporal y aptitud reproductiva. Como condicin esencial, su score de biopsia endometrial grado 1 o 2A (mximo) segn la escala propuesta por Kenney (1978). Resultados de trabajos realizados en nuestro Laboratorio en los ltimos aos, han demostrado que la diferencia en tasas de perdida embrionaria en yeguas receptoras seleccionadas utilizando, adems de los parmetros mencionados, la biopsia endometrial, es significativamente menor (tabla3) (Losinno, 2005; Castaeira, 2008) TP (%) Da 14 72,5 71,8 P E (%) Das 15-130 5,6 8,2b Das 31-60 1,6c 5,4d Tota l 7,2f 13,2 4

Yeguas Con Biopsia Sin biopsia

n 119 4 926

Total

212 9

72,2

6,8

3,2

9,8

a-b; cd; ef p<0,001. TP: Tasa de preez; PE: Perdida embrionaria

Tabla 3. Tasas de preez y prdida embrionaria en yeguas receptoras de embriones. (Castaeira et al, 2008) No se han reportado diferencias significativas en cuanto a tasas de preez cuando las yeguas receptoras ovularon entre el da -1 a +3 das en relacin a la ovulacin de la donante. Sin embargo, recientemente, Wilsher y col (2008) reportaron que embriones de da 10 post-ovulacin pueden ser transferidos a receptoras ovuladas -5 a +2 das en relacin a la donante sin disminucin significativa en los ndices de preez. (Wilsher, 2008) El ciclo estral de las yeguas donante y receptora puede ser sincronizado mediante administracin de prostaglandinas F2 alfa (PGF2 alfa) o progesterona la cual mantiene la fase luteal, induciendo luego lutelisis con prostaglandina (y ovulacin con hCG o LADes). Se espera que las yeguas ovulen 7-10 das posteriores a la suspensin de progesterona o a la inyeccin de PGF2 alfa. Las yeguas receptoras anovulatorias o que han sido ovariectomizadas, mantenidas bajo tratamiento con progesterona y a las que luego se les transfiri un embrin, han concluido su gestacin con el nacimiento de potrillos vivos y es una herramienta muy importante en el manejo de las receptoras durante los periodos transicionales y anovulatorio anual en el extremo del hemisferio sur. Los embriones equinos pueden ser transferidos quirrgica o no quirrgicamente. Las transferencias no quirrgicas de embriones producen ms altas tasas de preez comparadas con las transferencias quirrgicas y es el mtodo mas difundido en el mundo. En la tcnica no quirrgica transcervical, una pajuela de 0.25 o 0.5 ml conteniendo el embrin y una pequea cantidad de medio de transferencia es cargada en una pipeta de inseminacin estril y transferido a travs del cerviz. El extremo de la pipeta es colocado dentro del cuerpo uterino donde es depositado el embrin. El uso de una vaina de plstico estril como tcnica protectora para cubrir la pipeta durante la transferencia mejor las tasas de preez (45% vs. 19%; tcnicas resguardadas y no resguardadas, respectivamente). Es necesario tomar recaudos especiales respecto a la higiene del rea perineal y en cuanto a la habilidad en la manipulacin del crvix. La viabilidad de los embriones equinos en medio holding puede ser de hasta 8 horas en condiciones controladas de laboratorio dependiendo de la calidad del embrin y las condiciones ambientales. Entre los factores ms importantes que pueden condicionar los resultados de un programa de TE merecen destacarse: 1. Fertilidad del semental 2. Dificultad en superovular las donantes; 3. Edad y condicin reproductiva de la donante 5

4. 5. 6. 7.

Correcta deteccin de la ovulacin Condicin reproductiva/nutricional/sanitaria y edad de la receptora Entrenamiento del operador Calidad del embrin (Losinno y Alvarenga, 2006).

Una de las mayores limitantes en la yegua, en comparacin con otras especies domsticas, es la dificultad de inducir una respuesta superovulatoria efectiva, en trminos de nmero de embriones recuperados, con la consiguiente limitante en las posibilidades de obtener mas de un embrin y el mayor costo operativo por cada intento. Desde comienzos de los 80 se han ensayado experimentalmente protocolos superovulatorios con extractos crudos o purificados de hipfisis equinas, FSH equina purificada, FSH equina recombinante; Gonadotrofina Menopausica Humana (hMG); GnRH natural y anlogos, y anticuerpos anti-inhibina. En algunos casos se obtuvieron incrementos en la tasa ovulatoria (1.7 a 3.6 ovulaciones/ciclo) y en otros casos un leve aumento en la tasa de recuperacin embrionaria, pero los protocolos aun no estn estandarizados como para ser comercialmente aplicables. La inconsistencia de los resultados y la ausencia de estudios cientficos controlados multicentricos independientes determinan, en mi opinin que no hay hasta la fecha un protocolo recomendable para induccin de ovulaciones mltiples en la yegua. La yegua es considerada en general una hembra monovular, pero la incidencia espontnea reportada de ovulaciones mltiples vara entre 2 y 43 %. La gran diferencia entre los reportes considera factores como raza, edad, poca del ao, estado reproductivo, factores genticos y estacin del ao. En la raza Sangre Pura de Carrera comparada con otras razas, bajo las mismas condiciones de manejo, las ovulaciones mltiples varan entre 15 y 30 %, pero no esta permitida, hasta el momento, la TE. En programas comerciales de TE conocer la incidencia, repetibilidad, probablemente la heredabilidad de las ovulaciones mltiples y los factores intrnsecos (edad, pedigree) y extrnsecos (mes, hs. luz, alimentacin) que pueden afectarlas, podra ser un elemento muy importante en la programacin de los trabajos, expectativas de numero de embriones obtenidos, numero de lavajes necesarios por yegua por temporada, etc, que se traduciran en una mayor eficiencia global y por consiguiente producira un impacto econmico positivo sobre el sistema. Recientemente Mortensen et al (2008) reportaron tasas de recuperacin significativamente mas bajas, calificacin embrionaria de mayor grado y alteraciones en el intervalo interovulatorio en yeguas sometidas a programas de entrenamiento (ejercicio) en condiciones de altas temperaturas y humedad ambientales. Resultados esperados Bajo condiciones ideales (donantes, receptoras, padrillos frtiles y personal capacitado), es posible esperar una tasa de recuperacin de embriones de 50 a 80 % y una tasa de preez de 50 a 80 %, lo que determinara una tasa de eficiencia total del 25 al 65 %. Tanto la tasa de recuperacin como la de 6

preez post-transferencia de yeguas subfrtiles son significativamente mas bajas comparadas con yeguas normales (20-30% vs 60-80%). Por sta tcnica es posible obtener, en promedio, 4 mas potrillos por ao hijos de la misma yegua, pero existen evidencias (en Argentina) de una yegua de polo de la que se obtuvieron 14 preeces en la misma temporada reproductiva (2004/5) sin utilizar protocolos superovulatorios. Para una actualizacin completa del tema se recomienda las recientes revisiones de Stout (2006); Losinno y Alvarenga (2007) y los resmenes de Society for Theriogenology. Embryo Transfer Proceedings,Monterrey, CA, USA, 2007 y VIIth International Symposium on Equine Embryo Transfer, Havenmeyer Foundation Monograph Series, 2008. Bibliografa 1. Losinno L; Alonso C; Castaeira C. Escore na bipsia endometrial e aptido
reprodutiva em guas receptoras de embrio-resultados parciais. Acta Scientiae Veterinariae, 33 (suppl 1) 201, 2005 2. Squires EL. Integration of future biotechnologies into the equine industry. Animal Reproduction Science 89:187-198, 2005. 3. Stout TAE. Equine embryo transfer: review of developing potential. Equine Veterinary Journal 38(5)467-478, 2006 4. Wilsher S: Kolling M; Allen WR. Meclofenamic acid extends donor-recipient asynchrony in equine embryo transfer. Equine Veterinary Journal 38 (428-432), 2006 5. Losinno L, Alvarenga M. Critical factors on equine embryo transfer programs. Acta Scientiae Veterinaria,34(1), 39-49, 2007. 6. McCue P: Gee EK: Woods GL: Squires EL. Hormone and other medical therapies in embryo transfer recipient mares. Society for Theriogenology. Embryo Transfer Proceedings, (27-35),Monterrey, CA, USA, 2007 7. Losinno L; Alonso C; Rodriguez D; Douglas RH. Ovulation and embryo recovery rates in young and old mares treated with hCG or Deslorelin. VIIth International Symposium on Equine Embryo Transfer, (96-97), 2008. 8. Castaeira C; Alonso C; Vollenwieder A: Losinno L. Uterine biopsy score and pregnancy loss in embryo recipient mares. VIIth International Symposium on Equine Embryo Transfer, (96-97), 2008. 9. Wilsher S; Clutton-Brock; Allen WR. Transfer of day 10 embryos to asynchronous recipient mares. VIIth International Symposium on Equine Embryo Transfer, (50-51), 2008. 10.Castaneira C; Aguilar J; Vollenwieder A, Losinno L. Utilizacion de Gonadotrofina Menopausica Humana (hMG) para la estimulacion ovarica en yeguas donantes de embriones. I Jornadas Internacionales del INITRA, Bs. As. 2008 11.Mortensen CJ; Choi YH; Hinrichs K; Ing NH; Kraemer DC; Vogelsang SG; Vogelsang MM. Embryo recovery from exercised mares. Animal Reproduction Science (en prensa), 2008