Tesina Alejandra Calderón

Universidad de Granada
Facultad de Medicina Departamento de Antropologa Fsica
Estudios sobre ADN antiguo. Posibilidades desde una Perspectiva Histrica: El caso de las Islas Canarias
TRABAJO DE INVESTIGACIN
ALEJANDRA CALDERN ORDEZ

MSTER EN ANTROPOLOGA FSICA Y FORENSE EVOLUCIN HUMANA, PALEOANTROPOLOGA Y PALEOECOLOGA
TUTOR: Dr. Juan Carlos lvarez Merino
DIRECTORES: Dra. Matilde Arnay de La Rosa Dra. Rosa Irene Fregel Lorenzo
GRANADA, 2010
Facultad de Medicina Departamento de Antropologa Fsica
TRABAJO DE INVESTIGACIN
MSTER EN ANTROPOLOGA FSICA Y FORENSE EVOLUCIN HUMANA, PALEOANTROPOLOGA Y PALEOECOLOGA
V B del Tutor
Trabajo de investigacin que presenta la Lcda. Alejandra Caldern Ordez, tutelado por el Doctor Juan Carlos lvarez Merino, Departamento de Medicina Legal, Toxicologa y Psiquiatra (UGR); y dirigido por la Dra. Matilde Arnay de La Rosa, Departamento de Prehistoria Antropologa e Historia Antigua (ULL); y la Dra. Rosa Irene Fregel Lorenzo, Departamento de Gentica (ULL). Septiembre de 2010
NDICE
CAPTULO 1 - Introduccin ............................................................................................ 2 CAPTULO 2 - Estado de la cuestin en los estudios de ADN antiguo ....... 3 2.1. Historia de los estudios de ADN antiguo ............................................. 3 2.2. ADN mitocondrial ................................................................................ 4 2.3. Fuentes de ADN antiguo ...................................................................... 5 CAPTULO 3 - Particularidades del ADN antiguo y su estudio ...................... 7 3.1. La molcula del ADN ........................................................................ 7 3.2. La degradacin .................................................................................. 7 3.3. La Contaminacin ............................................................................. 12 3.4. Los inhibidores................................................................................. 14 CAPTULO 4 - Posibles soluciones a las dicultades metodolgicas ........ 16 4.1. Determinacin de la presencia de ADN endgeno ............................. 16 4.2. Solventando las consecuencias de la degradacin ............................ 17 4.3. La lucha contra la contaminacin ...................................................... 19 4.4. Cmo contrarrestar los inhibidores .................................................. 20 CAPTULO 5 -Mtodos de extraccin, amplicacin y secuenciacin ....... 24 5.1. Mtodos de extraccin ............................................... 24 5.2. Mtodos para aumentar el xito de la PCR .................. 26 5.3. Mtodos de secuenciacin de segunda generacin ........................... 28 5.4. Criterios de autenticacin .............................................................. 29 CAPTULO 6 - Algunas reas de aplicacin del ADN antiguo ....................... 34 CAPTULO 7 -Estudios de ADN sobre la poblacin canaria ........................... 38 7.1. Fundamentacin de los estudios genticos ................. 38 7.2. Los Primeros estudios genticos en la poblacin canaria: Grupos sanguneos y polimorsmos enzimticos.. 39 7.3. Marcadores uniparentales.. 42 7.3.1. Linajes maternos: el ADN mitocondrial. 42 7.3.2. Linajes paternos: el cromosoma Y.. 45 7.4. Los marcadores autosmicos: el sistema CD4/Alu 47
7.5. Estudios de ADN antiguo en Canarias 48 CAPTULO 8 -Mtodos para determinar el sexo gentico en restos humanos ................................................................................................................................. 51 8.1. La amelogenina........................................................... 51 8.2. El cromosoma Y para conrmar el sexo. 56 8.3. El papel de los SNPs y las inserciones Alu. 58 CAPTULO 9 - Importancia histrica de los estudios genticos para la determinacin del sexo ................................................................................................. 61 CAPTULO 10 - Posibilidades en el archipilago Canario ............................... 68 CAPTULO 11 - Propuesta metodolgica: Posibles enfoques de los estudios de ADN antiguo en Canarias ..................................................................... 72 CAPTULO 12 - Conclusiones ....................................................................................... 75 CAPTULO 13 - Bibliografa .......................................................................................... 77
Agradecimientos En primer lugar quisiera agradecer a mi familia, y especialmente a mis padres y a Jos Pablo, por creer en mi y en este loco sueo, sin ustedes me habra rendido hace tiempo. A Matilde por apoyarme, por ayudarme a solucionar problemas, por ser un modelo a seguir y por estar ah a lo largo de este camino, espero seguir recorrindolo con ella a mi lado. Al grupo de bioantropologa de la Universidad de La Laguna, Aioze, Guacimara, Alejandro y Nuria, gracias por compartir este sueo y por mantener la ilusin en nuestro proyecto de futuro, espero que sigamos trabajando juntos mucho tiempo. A Vicente por haberme abierto las puertas del laboratorio y haberme ayudado en mis primeros pasos dentro de un universo nuevo para mi, como lo era la gentica. A Rosi, la mejor profesora de biologa molecular que uno puede tener, gracias por todos los buenos consejos y correcciones, espero estar a la altura de todo lo que he recibido. A Bertila y a Cristo, por ser un apoyo incondicional a pesar de seguir caminos diferentes. Gracias por todas las oportunidades que me han dado, espero seguir siendo infiel a mis muertos muchos veranos ms. A toda la gente de El Salt, tanto a los que llevan muchos aos como a los que acaban de llegar, por hacer de cada verano una experiencia nica en la que recargar energas para seguir trabajando. A Jorge, Diana, Caro, Richard, Leo y Efra gracias por ser grandes compaeros de laboratorio, por crear un ambiente de trabajo estupendo y hacerme partcipe de grandes conversaciones. A J. Carlos Alvarez, por su apoyo durante mi estancia en Granada, gracias por ayudarme a saber por donde empezar. A todos mis amigos de El Puerto y de Bogot, por estar ah cuando los he necesitado y por escucharme aunque no siempre supieran de lo que les estaba hablando.
1. Introduccin El presente trabajo se inserta dentro de una de las vas de investigacin del grupo de bioantropologa de la Universidad de La Laguna. Con l se pretende dar continuidad a una disciplina, la del ADN antiguo, que hasta el momento ha dado muy buenos resultados. Se lleva a cabo con el convencimiento de que una profundizacin en este tipo de investigaciones, desde el punto de vista histrico, puede resultar de gran inters dentro de la vocacin multidisciplinar del equipo de investigacin. Teniendo en cuenta que el objetivo principal de este trabajo es la interpretacin histrica, resulta fundamental la participacin en los estudios de ADN antiguo de investigadores con una formacin en Historia, que les permita plantear determinadas preguntas, as como interpretar los resultados desde una perspectiva que realmente contribuya a la construccin de las explicaciones histricas. Como consecuencia resulta necesario una formacin multidisciplinar, para que los historiadores cuenten con herramientas tcnicas y metodolgicas dentro del campo de la biologa molecular que les permitan resolver algunos de los problemas planteados. Este trabajo es una consecuencia directa de esa necesidad de formacin en el campo del ADN antiguo. Ser la base metodolgica que servir de fundamento para el desarrollo de trabajos posteriores encaminados hacia una tesis doctoral. Por ello, se plantearon unos objetivos que constituyan, al finalizar esta fase de la investigacin, la base terico-metodolgica de las investigaciones posteriores, tanto en cuestiones de biologa molecular como en posibles vas de trabajo en el archipilago canario. Dentro de esos objetivos se encuentra un acercamiento a la conformacin de los estudios de ADN antiguo como disciplina, para entender el contexto en el que se inserta esta lnea de investigacin. Resulta fundamental conocer y entender las principales caractersticas de las muestras utilizadas en los estudios de ADN antiguo, para poder comprender las dificultades metodolgicas de stas y las posibles soluciones que se han propuesto para subsanar estos problemas.
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Teniendo en cuenta la perspectiva histrica de este trabajo, es fundamental realizar un repaso sobre algunos de los principales estudios histricos que han utilizado los anlisis de ADN antiguo como parte de su metodologa, sobre todo aquellos en los que stos fuesen fundamentales para sustentar las conclusiones obtenidas. Dentro de esta lnea, otro objetivo ser intentar determinar algunas de las aportaciones que puede dar la determinacin gentica del sexo dentro del campo de la historia, y las problemticas particulares de estos enfoques. Todo lo anterior permitir plantear posibles objetos de estudio y vas de investigacin con los estudios de ADN antiguo para una futura tesis doctoral. 2. Estado de la cuestin en los estudios de ADN antiguo 2.1. Historia de los estudios de ADN antiguo La historia del ADN antiguo se remonta poco en el tiempo, pero desde sus inicios ha tenido un gran impacto meditico que condujo a especulaciones, tanto en la prensa como en las pelculas, que hicieron creer que era posible devolver la vida a criaturas antiguas (Wayne et al., 1999). Cada nuevo descubrimiento serva para confirmarle al pblico la impresin de que los cientficos se estaban acercando rpidamente hacia esa meta. Los primeros trabajos sobre ADN antiguo aparecieron a mediados de los ochenta cuando Higuchi (1984) obtuvo fragmentos del ADN mitocondrial de la extinta quagga, usando un espcimen conservado en un museo. Poco tiempo despus, Pbo (1985) public una secuencia parcial del ADN mitocondrial de un momia egipcia de 2430 aos. Ninguno de estos dos anlisis pudo ser reproducido, y en la actualidad las secuencias obtenidas son vistas con cierta cautela. Lo anterior no significa que, en su momento, estos estudios no tuvieran un gran impacto, porque implicaban la posibilidad de que las molculas de ADN sobrevivieran largos periodos de tiempo. La investigacin en ADN antiguo presenci un avance substancial con el advenimiento de la PCR, reaccin en cadena de la polimerasa, que permiti la amplificacin de cantidades muy pequeas de ADN (Mullis et al., 1986). La aplicacin de esta tcnica pronto revelara los dos grandes problemas del ADN antiguo, la degradacin y las grandes posibilidades de contaminacin (Paabo et al., 1989).
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En los ltimos aos se ha ido confirmando el lmite teortico de supervivencia del ADN alrededor de 100.000 aos, con algunas excepciones en el permafrost que tampoco superan el milln de aos. Por ello, los primeros estudios que se publicaron con secuencias de una antigedad cercana al milln de aos, son cada vez vistos con mayor escepticismo (Cooper and Wayne, 1998). Algunas de estas investigaciones iniciales seran las realizadas sobre fsiles de magnolia con una antigedad de entre 17 y 20 millones de aos. Su publicacin alent a muchos investigadores a buscar ADN de animales como los dinosaurios o insectos preservados en mbar; uno a uno estos resultados fueron cuestionados mostrando que en su gran mayora eran consecuencia de la contaminacin (Wayne et al., 1999). Incluso se demostr que insectos mucho ms recientes preservados en copal, un estado anterior al mbar de las mismas resinas, eran inservibles como fuente de ADN antiguo, con lo que se evidenciaba la diferencia entre una preservacin morfolgica y la conservacin de molculas de ADN (Lindahl, 1997). 2.2. ADN mitocondrial Dentro del campo del ADN antiguo el ADN mitocondrial ha jugado un papel fundamental debido a sus peculiares caractersticas (Pakendorf and Stoneking, 2005, lvarez JC, 2001). En la especie humana, ste consiste en una molcula circular bicatenaria, compuesta por 16.569 20 pares de bases. La primera caracterstica que hace al ADN mitocondrial especialmente til para los estudios de muestras antiguas es el gran nmero de copias que hay en cada clula, desde cientos hasta miles de ellas, en comparacin con la dos copias por clula del ADN nuclear; lo que le da una mayor probabilidad per-locus de ser recuperado usando las tcnicas comunes de laboratorio. La segunda caracterstica es la herencia por va materna exclusivamente, lo que permite a los investigadores trazar los linajes maternos de las poblaciones a lo largo del tiempo. La ltima de estas caractersticas es la mayor tasa de mutacin del ADN mitocondrial en comparacin con el nuclear, lo que resulta ventajoso al estudiar los cambios que se han producido a lo largo del tiempo. El ADN mitocondrial est compuesto principalmente por ADN codificante, con la excepcin de una fragmento largo de aproximadamente 1100 pares de bases conocido como la regin control. Dentro de esta zona se encuentra la regin hipervariable, que por su alta tasa de sustitucin (la ms alta de todo el ADN mitocondrial), se ha convertido en el centro de las investigaciones de ADN antiguo.
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Los estudios iniciales sobre la variacin del ADN mitocondrial se basaron en el anlisis de RFLPs. Con la llegada de la PCR y de los mtodos de secuenciacin, se empezaron a hacer RFLPs de los productos de la PCR, as como anlisis de las secuencias del primer sector hipervariable (HVR1), que se encuentra dentro de la regin control (Pakendorf and Stoneking, 2005). Ser en 2001 cuando se secuenciar el primer genoma mitocondrial antiguo en su totalidad (Ho and Gilbert, 2010), cuando dos equipos presentaron el genoma del moa (Cooper et al., 2001, Haddrath and Baker, 2001). Pasaron cinco aos hasta que en 2006 se presentaron dos secuencias independientes del mamuth lanudo (Krause et al., 2006, Rogaev et al., 2006). La realizacin de estos genomas ha sido posible gracias a mejoras tcnicas y metodolgicas en la secuenciacin, como la PCR de emulsin y la pirosecuenciacin. 2.3. Fuentes de ADN antiguo Una de las primeras cuestiones que se deben explicar son las posibles fuentes de ADN antiguo. Se debe partir de la base de que cualquier substancia de origen biolgico es candidato potencial para proporcionar ADN antiguo, aunque algunas de ellas suelen dar mejores resultados (O'Rourke et al., 2000). El hueso suele considerarse como una fuente ptima de ADN antiguo ya que la unin del ADN con la hidroxiapatita suele ayudar a disminuir su degradacin. Se ha demostrado la relacin entre la preservacin morfolgica a nivel microscpico y la posibilidad de obtener ADN antiguo, aunque no hay necesariamente una relacin directa entre stas y la antigedad de la muestra. La mala preservacin a nivel macro, no siempre implica una mala preservacin a nivel micro, por lo que en principio cualquier muestra es potencialmente portadora de ADN. En la medida de lo posible deben tomarse muestras de huesos sin lesiones, ya que stas son una fuente potencial de contaminacin; tambin se debe intentar que se obtengan de regiones anatmicas con la menor importancia antropolgica y morfolgica posible. El uso de dientes como fuente de ADN antiguo tiene mltiples ventajas. Entre ellas la de poder disponer de muestras independientes y mltiples de cada individuo. Se deben elegir dientes sin caries porque stas permiten la entrada de ADN contaminante dentro de la cavidad pulpar. El ADN puede ser extrado bien triturando el diente hasta convertirlo en
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polvo, o seccionando el diente para extraer el material del interior de la cavidad pulpar. Este ltimo mtodo es especialmente til en las muestras arqueolgicas ya que no se altera la morfologa del diente. En el caso de utilizar tejidos blandos como fuente de ADN, se debe intentar escoger tejidos que no se encuentren en la superficie, para disminuir el riesgo de contaminacin por manipulacin. Parece ser que el tejido blando disecado es una de las mejores fuentes de ADN, porque la deshidratacin protege al ADN de procesos de descomposicin como la hidrlisis, de la que se hablar ms adelante. Este tipo de tejidos tambin presentan una mayor cantidad de inhibidores, que como se hablar en apartados posteriores, dificultan la amplificacin del ADN. Adems de estas fuentes principales, existen otros lugares de donde es posible obtener ADN. Uno de estos son los pelos, aunque es bastante difcil obtener ADN cuando estos no tienen raz, como suele suceder en los casos arqueolgicos, autores como Gilbert (2007b) opinan que pueden ser una buena fuente de ADN . Los coprolitos son otra fuente potencial de cidos nucleicos, aunque su utilizacin implica algunos problemas especficos que se discutirn posteriormente. Se han realizado algunos intentos con plantas de hasta 500 aos de antigedad, de los que de momento se han obtenido algunos resultados prometedores. Tambin se ha logrado obtener ADN antiguo a partir del estudio de sedimentos (Hofreiter et al., 2003, Willerslev et al., 2003).
3. Particularidades del ADN antiguo y su estudio 3.1. La molcula de ADN Para la realizacin de los estudios de ADN antiguo es necesario considerar algunas de las caractersticas particulares de las muestras con las que se trabaja. stas hacen necesario una aproximacin un poco diferente a la que es usual en los estudios de ADN moderno. En primer lugar se deben aclarar algunas de las caractersticas bsicas del ADN que permitan entender las particularidades descritas en los siguientes apartados. La molcula de ADN es un polmero compuesto de unidades de azcar desoxirribosa 2 unidas entre s a travs de enlaces fosfodister. A cada azcar se une una purina (adenina o guanina) o una pirimidina (citosina o timina) en la posicin 1 gracias a un enlace glucosdico. En los organismos vivos la molcula de ADN est constantemente hidratada, por lo que nunca est realmente seca. Adems el ADN nuclear se encuentra unido fuertemente alrededor de protenas histonas que al parecer absorben algunos de los daos producidos por el ambiente alrededor de las molculas (Poinar, 2002). El ADN antiguo presenta tres principales problemas que se producen a raz de algunas de las caractersticas de las molculas, de los procesos postdeposicionales de los restos tras la muerte de los individuos y de los mtodos de laboratorio necesarios para su anlisis. Estos problemas son la degradacin, la contaminacin y la presencia de inhibidores. 3.2. La degradacin Durante la vida de cualquier organismo, su ADN est siendo constantemente sometido a diferentes procesos de degradacin. Sin embargo, los seres vivos cuentan con mecanismos enzimticos de reparacin del ADN. Estos mecanismos dejan de funcionar en el momento de la muerte, haciendo que los daos ejercidos en el ADN se vayan acumulando con el paso del tiempo. A continuacin se explicarn los principales procesos de degradacin y sus consecuencias en los estudios de ADN antiguo.
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Dentro de los tipos de degradacin ms comunes encontramos la ruptura de las cadenas de ADN, las lesiones por oxidacin, los crosslinks de ADN y las lesiones hidrolticas. Estos procesos se van acumulando progresivamente hasta que el ADN pierde su integridad y se descompone con una prdida irreversible de la informacin contenida en la secuencia de nucletidos. (Paabo et al., 2004). Ahora se proceder a explicar las principales caractersticas de este tipo de lesiones. Una de las consecuencias de la degradacin es la disminucin del tamao en las cadenas de ADN, quedando reducidas a entre 100 y 500 pb en promedio. Este descenso se debe tanto a procesos enzimticos que suceden poco tiempo despus de la muerte como a la fragmentacin hidroltica no enzimtica, de los enlaces fosfodiester, en la estructura del fosfato y el azcar, que generan cadenas simples. Los enlaces glucosdicos entre las bases nitrogenadas y los azcares tambin son sujetos de fragmentacin hidroltica dando como resultado posiciones sin base. (Paabo et al., 2004). Adems de las lesiones ya mencionadas hay otras que tambin afectan a la longitud de las secuencias que es posible amplificar con la PCR. Este segundo tipo de lesiones bloquean la elongacin de las hebras de ADN por la Taq polimerasa. Muchas de estas lesiones son inducidas por radicales libres, como los radicales de perxido (O), los de perxido de hidrgeno (HO) y los radicales hidroxilo (OH), que se generan, entre otras causas, como consecuencia de la radicacin de fondo. Existen algunos lugares dentro de las cadenas de ADN que son ms susceptibles al ataque de la oxidacin; entre estos estn los enlaces dobles, tanto de las pirimidinas como de las purinas. (Paabo et al., 2004). El ADN extrado de restos fsiles es susceptible a ser fragmentado por la enzima endonucleasa III, que es especfica de las pirimidinas oxidadas y que bloquea la accin de la Taq polimerasa. Otro tipo de lesin son los cross-links que tambin bloquean la accin de la Taq polimerasa, uno de estos casos seran los productos de Maillard. Identificados principalmente en coprolitos, estos son formados por la reaccin de los grupos carbonilo, que reducen los azcares con los aminos primarios de los aminocidos (Poinar, 2002).
Tambin existen otro tipo de daos, muchos de ellos desconocidos, comunes en el ADN antiguo y que generan problemas porque, a pesar de que la amplificacin es posible, generan la incorporacin de bases equivocadas durante la PCR. La forma ms comn de estas modificaciones es la prdida hidroltica de los grupos amino de las bases adenina, citosina, 5-metilcitosina y guanina, dando como resultado hipoxantina, uracilo, timina y xantina, respectivamente. Los productos de la desaminizacin de la citosina (uracilo), del 5-metilcitosina (timina) y de la adenina (hipoxantina) tienen una especial relevancia en la amplificacin del ADN antiguo porque generan la insercin incorrecta de bases (A en lugar de G y C en lugar de T) en el momento de las sntesis de nuevas hebras por parte de la polimerasa. (Paabo et al., 2004). Actualmente tambin se ha llegado a la conclusin de que las modificaciones son mayoritariamente de C a U (Brotherton et al., 2007, Gilbert et al., 2007a, Stiller et al., 2006). Esto traer como consecuencia que los productos amplificados tengan un sesgo hacia transiciones de CG a TA y una menor cantidad de AT en GC. Sin embargo, estas reacciones bioqumicas pueden ser lo suficientemente limitadas como para que el evento de mutacin original pueda ser identificado(Mulligan, 2005). Otra consideracin importante es que este tipo de lesiones al parecer no ocurren de una forma aleatoria sino que se concentran en unos puntos calientes o hot spots, existiendo al parecer una relacin entre estos puntos y los lugares de sustituciones evolutivas, por lo que a la hora de analizarlos pueden llevar a errores, al ser confundidos con cambios evolutivos esperados. (Willerslev and Cooper, 2005) Estos procesos de degradacin son similares a algunos procesos qumicos que pueden ser reproducidos y estudiados en el laboratorio. Los resultados de este tipo de investigaciones sugieren que bajo las condiciones ambientales de la mayora de los depsitos arqueolgicos y geolgicos, la informacin gentica relevante no se conserva por ms de 10 aos. (Chelomina, 2006). Tambin debe tenerse en cuenta que, organismos como las bacterias, los hongos y los insectos, pueden afectar la integridad del ADN. (Poinar, 2002). Algunos autores recogen estudios en los que se plantea que el rompimiento de las molculas de ADN se da principalmente en los momentos cercanos a la muerte de un ser vivo, sobre todo en el
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hueso porque despus las molculas de ADN se uniran a la hidroxiapatita ralentizando las lesiones hidrolticas ya mencionadas. (O'Rourke et al., 2000). Aunque no todos los cientficos estn de acuerdo sobre cul es el lmite temporal para la conservacin del ADN, se suele dar un lmite general en torno a los 100.000 aos. Lo que si est bastante claro es que la conservacin depende ms de las condiciones ambientales especficas de los diferentes lugares de deposicin de los restos que del tiempo transcurrido. Es as como Smith (2003) plantea la importancia de conocer lo que l denomina como la historia trmica de unos restos para poder evaluar la posible conservacin del ADN. Es necesario resaltar que el ndice de degradacin del ADN no es lineal (Yang, 1997), al parecer la degradacin se reduce de manera importante despus de un decaimiento rpido que sucedera a la muerte de un ser vivo. Como ya se ha mencionado la degradacin de ADN depende de factores como la temperatura, el pH y la fuerza inica de la solucin acuosa. Tambin se ha detectado que la presencia de ciertos qumicos orgnicos, como los tocoferoles y los flavonoides, que son liberados por el propio organismo o que son producidos por microorganismos en el sedimento, pueden inhibir la funcin de algunas de las enzimas que destruyen el ADN. Basndose en la manera como actan los procesos de degradacin descritos anteriormente, se podra pensar que las bajas temperaturas y los ambientes secos son algunas de las condiciones ideales para la preservacin del ADN (Willerslev and Cooper, 2005). Es por esto que los hielos glaciares y el permafrost (tierras permanentemente congeladas), con sus bajas temperaturas constantes, parecen ser apropiados para la conservacin a largo plazo de microorganismos y biomolculas, como explican detalladamente Willerslev et al (2004). Los ADNs antiguos con una cronologa ms lejana que han sido autentificados vienen todos del permafrost. Entre ellos se incluye el ADN mitocondrial de un mamut de ms de 50.000 aos, el ADN mitocondrial de un bisonte de 65.000 aos, as como el ADN proveniente de cloroplastos de plantas de entre 300 y 400.000 aos. Adems de las bajas temperaturas, otras caractersticas de este tipo de ambientes como la rpida deshidratacin y las altas concentraciones salinas tambin pueden haber contribuido a la conservacin de las molculas de ADN, pero incluso aqu habra un lmite de conservacin que no superara el milln de aos (Willerslev and Cooper, 2005).
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Adems de los factores medio ambientales de los lugares de deposicin, el almacenamiento posterior a la excavacin tambin puede ser un factor determinante para la conservacin del ADN. Como explica Geigl (2008) cuando se compara la cantidad de ADN preservado en huesos fsiles que han sido sometidos a procedimientos arqueolgicos normales, como lavado, secado y almacenamiento en lugares sin aire acondicionado, y aquella encontrada en restos recin excavados se ha podido determinar que es mucho mayor la degradacin del ADN durante el almacenamiento que mientras los restos estn enterrados. De hecho el ndice de xito de las amplificaciones por PCR de huesos excavados recientemente fue de ms del doble (46%) sobre aquellos que fueron almacenados siguiendo los procedimientos tradicionales (18%). Incluso la cantidad de fragmentos de ADN con una longitud promedio de 150 pb puede llegar a ser seis veces superior en los huesos excavados hace poco que en aquellos sometidos a procedimientos estndar. El autor concluye que el ndice de degradacin del ADN en fsiles conservados en regiones con un clima moderado, como el norte de Francia, puede llegar a ser 70 veces ms rpido que en aquellos restos que se encuentren directamente en el sedimento. Una de las posibles explicaciones para este fenmeno es que la temperatura de almacenamiento estara por encima de la temperatura de preservacin, a lo que se unira a un descenso del pH y a una desalinizacin de los huesos como consecuencia del lavado de los mismos. Una vez explicados algunos de los principales procesos de degradacin de las molculas de ADN, es fundamental repasar brevemente las consecuencias de estos fenmenos, sobre todo las incorporaciones errneas de nucletidos. Como explica Pbo (2004) la existencia de estas bases modificadas suele ser evidente cuando se clonan los productos de la PCR provenientes de restos antiguos y el nmero de diferencias entre los distintos clones es bastante superior a la observada en las amplificaciones de ADN moderno. Hay dos tipos de evidencias para detectar la desaminizacin como la principal causa de las incorporaciones equivocadas. La primera es que el ADN antiguo es sensible a la ADN-uracilo-glicocilasa, una enzima que retira el uracilo del ADN. En segundo lugar se producen un gran nmero de cambios de C a T y de G a A que se observan en los clones de los productos amplificados. Estos cambios seran consistentes con la presencia de residuos de C desaminizados que son idnticos a los residuos de uracilo (U) y que causan la incorporacin de residuos de A en lugar de los de G por la Taq polimerasa.
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Otros de los posibles efectos de la degradacin para los estudios de ADN antiguo son los presentados por Mulligan (2005). Entre ellos se encuentran la limitacin en la longitud de los productos de amplificacin como consecuencia de la fragmentacin del ADN. Los bajos o casi indetectables niveles de ADN antiguo que permiten la amplificacin preferencial de ADN contaminante, de lo que se hablar en detalle en el apartado siguiente. Marlmstrm (2007) encontr una relacin proporcional entre el incremento de molculas endgenas amplificadas y la reduccin del tamao del amplicon. La insercin aleatoria de nucleotidos por la polimerasa en las posiciones sin base y la denominada Jumping PCR en la que fragmentos discontinuos de ADN se terminan uniendo a lo largo de la reaccin de amplificacin. 3.3. La contaminacin El segundo problema al que se enfrentan los investigadores de ADN antiguo es la posibilidad de contaminacin con ADN moderno. Este peligro se debe a que la tcnica principal que permite la recuperacin de ADN tan degradado como es habitual en las muestras antiguas, la PCR, necesita una gran sensibilidad para lograr este objetivo. Esto puede ser contraproducente porque ser igualmente sensible a contaminaciones modernas mnimas y al estar este ADN en mejores condiciones, ser preferentemente amplificado sobre las muestras en peor estado. Teniendo en cuenta este factor, Geigl (2008) hace una clasificacin de los diferentes momentos en que las muestras pueden ser contaminadas y de qu manera esto ocurrira. El primer caso sera la contaminacin post-excavacin en la que, como consecuencia de la rpida degradacin del ADN endgeno una vez que los huesos fsiles son desenterrados y sometidos a procesos como el lavado, el secado y el almacenamiento, se incrementa la posibilidad de obtener falsos positivos provenientes de ADN moderno, sobre todo si se compara con otro tipo de muestras como aquellas provenientes del permafrost. Esto sucede porque entre menor sea la cantidad de ADN endgeno presente en un hueso, mayor ser el riesgo de que el ADN moderno contaminante, proveniente del ambiente, sea finalmente analizado. Existen algunas investigaciones donde se ha intentado rastrear el ADN aportado por los excavadores,
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como sera el caso de un estudio hecho sobre dientes humanos provenientes de contextos neolticos (Sampietro et al., 2006) o el de huesos con antigedades entre 200 y 3300 aos que fueron manipulados de forma indebida intencionalmente (Bouwman et al., 2006). Otro estudio que confirmara este resultado fue el realizado en huesos de perro almacenados en museos en los que se detecto la presencia de ADN humano (Malmstrom et al., 2005). Un ltimo ejemplo sera el trabajo realizado sobre muestras de la Isla Canaria de La Palma, en el que se recuper el ADN externo de dientes y se encontr que, en la mayora de los casos, aunque se poda recuperar el ADN de los antroplogos, ste no coincida con el ADN endgeno (Fregel et al., 2009b). Algunas fuentes de contaminacin pueden provenir del sudor de los excavadores e investigadores, as como del agua utilizada en el lavado que se suele realizar de los huesos. En cuanto a la profundidad de esta contaminacin se han presentado resultados contradictorios. Mientras que algunos estudios muestran que la contaminacin se mantiene en la superficie del hueso, no penetrando ms all de 1 o 2 mm, otros evidencian como la manipulacin de huesos humanos, en este caso provenientes de un contexto medieval y que haban sido excavados en los aos setenta, no mostraban coincidencias con el ADN de los investigadores, por lo que se infiri que los perfiles contaminantes encontrados pertenecan a los excavadores iniciales (Gilbert et al., 2006). La explicacin que se da a este fenmeno es que los huesos y dientes fosilizados pueden ser muy susceptibles a la contaminacin con ADN moderno durante el proceso de excavacin, ya que los poros de los tejidos calcificados an estaran abiertos, cerrndose en el posterior proceso de secado. El problema es que el ADN exgeno puede mostrar las mismas sustituciones en las bases de los nucleotidos que el ADN antiguo, en ste ltimo como consecuencia del dao de las bases, pudindose interpretar entonces el moderno como antiguo con lo que se produciran unos resultados falsos (Sampietro et al., 2006). El segundo momento en el que se puede producir la contaminacin es en los procesos de extraccin del ADN y de la PCR. Podemos encontrar molculas de ADN en el ambiente, en este caso aportadas por los investigadores, siendo inevitable su presencia en los laboratorios y en los reactivos. Partiendo de la base de que el ADN humano y de los microbios est de forma ubicua en todos los laboratorios (Willerslev and Cooper, 2005), resulta prudente asumir que todos los reactivos y herramientas estn
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contaminados con ADN humano y microbiano cuando los enva el proveedor. Una limpieza de los reactivos, por ejemplo con ultrafiltracin, y de las distintas herramientas resulta esencial. Los reactivos y el equipo comercial marcado como estril no estn garantizados como libres de clulas viables o de cidos nucleicos. El ltimo tipo de contaminacin es la de arrastre o carry over; sta se produce como resultado de la presencia de miles de millones de copias de ADN procedentes de amplificaciones y clonaciones anteriores que se encuentran muy concentradas, por lo que es relativamente fcil que se dispersen por el ambiente. Esto tiene una gran relevancia ya que estas molculas son idnticas a la que se utilizaron en primer lugar, pudiendo llegar a distorsionar las replicaciones que se hagan en un mismo laboratorio. Las cifras presentadas por Willerslev (2005), permiten hacerse una idea de la magnitud del problema. Una reaccin de PCR exitosa puede contener entre 10 - 10 molculas amplificadas en un volumen inferior a los 50 l. Por ello el movimiento del aire cuando se abren los tubos o la transferencia de lquidos crea y dispersa gotas de un tamao mnimo, que pueden contener ms de un milln de copias de la molcula origina por cada 0.005 l. Esto hace que los productos de la PCR se puedan dispersar rpidamente a travs de las superficies del laboratorio, de los corredores e incluso expandirse a edificios enteros por medio del movimiento del personal o de los sistemas de ventilacin. Teniendo entonces en cuenta que una gota nfima puede contener fcilmente mil veces ms ADN amplificable que el contenido de un gr de muestra de especmenes antiguos (10 - 10 copias), se hace indispensable que los laboratorios de ADN antiguo estn aislados tanto fsica como logsticamente de otros estudios de biologa molecular. Hay otro tipo de medidas para reducir la contaminacin que sern discutidas en apartados posteriores. 3.4. Los inhibidores Un tercer problema que se presenta en los estudios de ADN antiguo son los denominados inhibidores de la PCR. Son sustancias que se encuentran junto al ADN antiguo, sobre todo provenientes del medio ambiente, y cuyo problema es que evitan que la Taq Polimerasa realice su trabajo durante la reaccin en cadena. La mayor parte de estos segn ORourke (2000) son taninos, cidos hmicos y cidos flvicos, todos ellos comunes en los procesos de degradacin del suelo. Junto con los productos de Maillard, que ya fueron mencionados con anterioridad, los inhibidores de este tipo suelen dar una
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coloracin marrn a los extractos de ADN. Kemp (2006) hace referencia a otros inhibidores, adems de los ya mencionados, y a sustancias como los productos de la porfirina, hematinas y el colgeno tipo I que actan como inhibidores; junto a ellos menciona a los productos de Maillard que, aunque no desactivan a la polimerasa, pueden ser considerados inhibidores ya que el ADN atrapado en estos productos, derivados de la condensacin de algunos azcares, no puede ser alcanzado por la polimerasa. Adems de la coloracin, los extractos con inhibidores al ser sometidos a electroforesis suelen aparecer como una nube borrosa, entre azul y verde cuando se les ilumina con luz UV. Cuando no se amplifica ADN, la presencia de inhibidores puede sospecharse si no se producen dmeros de primer durante la PCR. Estos tres son los principales problemas de los estudios de ADN antiguo y por lo que muchos de los resultados resultan cuestionables. Sin embargo, desde las primeras publicaciones se ha producido un gran avance en la bsqueda de tcnicas que aumenten la fiabilidad de los estudios que se realizan.
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4. Posibles soluciones a las dificultades metodolgicas Desde que se realizaron los primeros estudios sobre ADN antiguo se empezaron a buscar estrategias para superar algunos de los problemas que plantean las caractersticas de este tipo de molculas. En este apartado se explican algunas de las propuestas que se han publicado en los ltimos aos para los distintos retos metodolgicos que plantean los estudios de ADN antiguo. 4.1. Determinacin de la presencia de ADN endgeno Teniendo en cuenta que la mayora de las muestras son ejemplares nicos con un alto valor arqueolgico y el carcter destructivo, en muchos casos, de este tipo de anlisis, es necesario buscar medidas que nos ayuden a seleccionar aquellas muestras con ms posibilidades de dar resultados positivos. Existen varias tcnicas denominadas screening methods o mtodos de rastreo que intentan determinar las posibilidades de que una muestra contenga ADN endgeno. As Hofreiter (2001) plantea que los mtodos de rastreo rpidos son cruciales para identificar las muestras que estn tan mal preservadas que no vale la pena intentar amplificarlas. Resalta los anlisis de aminocidos como un mtodo que ha demostrado ser muy til para evaluar la conservacin del ADN. Destacan aquellos procedimientos que tienen en cuenta la cantidad total de aminocidos preservados en un espcimen, su composicin y la extensin de la racemizacin de varios de ellos. Esta ltima consiste en el cambio de la estructura tridimensional de los aminocidos con el paso del tiempo. Este tipo de anlisis pueden ayudar a sustentar la autenticidad de las secuencias de ADN obtenidas de un espcimen, ya que demuestran que las condiciones de preservacin son tales que la obtencin de macromolculas es posible. Otro mtodo posible, aunque menos extendido y estudiado, para intentar ver la presencia de ADN antiguo es el de la pirlisis unida con una cromatografa de gases y espectrometra de masas (GC/MS). Consiste en un anlisis en el que las macromolculas son descompuestas con calor y los productos de esta reaccin son luego analizados.
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Existen otros mtodos para medir el nivel de degradacin de los huesos, muchos de ellos basados en distintas aplicaciones de los rayos X, en los que no se entrar en excesivo detalle pero que es necesario por lo menos mencionar. Hiller (2006) hace referencia a algunos de ellos como el uso del espectro de transformacin de infrarrojos de Fourier (FTIR) para calcular los ndices de cambio en los cristales del hueso, la difraccin de rayos X (XRD) para determinar la composicin de los cristales y la densidad del hueso, as como la emisin de rayos X de partculas inducidas (PIXE) que examina las substituciones qumicas diagenticas en la estructura mineral. Sin embargo, Hiller (2006) se centra en la propuesta de otro mtodo, la dispersin de rayos X en ngulos pequeos (small-angle X-ray scattering o SAXS) que se considera de utilidad porque permite examinar los cristales de hueso en funcin de su distribucin por tamaos, proporcionando un indicador directo de la preservacin o alteracin de los propios cristales biognicos. El estudio de Hiller (2006), profundiza en la aplicacin de este mtodo y su importancia para determinar la buena conservacin de los tejidos seos, adems de la relacin entre la alteracin de la fase mineral del hueso y la posible conservacin de biomolculas como el ADN.
4.2. Solventando las consecuencias de la degradacin Aunque a travs de los mtodos de rastreo se considere que una muestra est lo suficientemente bien preservada como para realizar estudios de ADN antiguo, esto no significa que sta no se encuentre degradada de una u otra manera. Es por eso que se han realizado importantes esfuerzos para solventar algunos de los efectos de la degradacin. En el caso de los cross-links Reiss (2006) recoge algunas de las propuestas que se han planteado para contrarrestarlos. Entre ellas est un protocolo que busca reparar los cross-links entre las distintas hebras antes de la PCR, sometiendo a las muestras a un tratamiento con ligasa y ADN polimerasa, que son las enzimas responsables de la reparacin del ADN en la clula viva; los primeros experimentos de este tipo fueron realizados con muestras de Homo, aunque tambin se han probado en especmenes antiguos del grupo Equidae. Como complemento se menciona el tratamiento con N- bromuro de phenacylithiazolium (PTB) para eliminar algunos crosslinks como los productos de Maillard, procedimiento que ser explicado ms adelante.
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Otra de las consecuencias de la degradacin son las incorporaciones errneas que se han mencionado en apartados anteriores. Una aproximacin a su tratamiento de cara a los estudios de ADN antiguo es la planteada por Pbo et al. (2004). En ella se evidencia la necesidad de distinguir entre las incorporaciones errneas inducidas por los daos que tiene el ADN antiguo y los errores de la Taq polimerasa que ocurren en cualquier PCR sin importar las condiciones del ADN de la muestra. Una manera de conseguirlo es realizando mltiples amplificaciones de los extractos de ADN y clonar los productos de esas PCR. La comparacin entre las secuencias de mltiples clones de esas amplificaciones, revelar las diferencias en los nucletidos que ocurren en todos los clones de una amplificacin, pero no en las dems amplificaciones que han usado la misma muestra. La mayor parte de esas substituciones, que pueden considerarse consistentes, se debern a errores ocurridos durante los primeros ciclos de la PCR. Por el contrario, las substituciones adicionales que se observen en clones individuales, se podrn deber a incorporaciones errneas ocurridas en ciclos posteriores de la PCR. Por ello si las frecuencias entre estos dos tipos de incorporaciones son comparadas, se podr establecer la diferencia entre las substituciones inducidas por daos en el molde original de ADN y aquellas que se dan como consecuencia de las tasas de error inherentes a la PCR. Esto permitir afinar la fiabilidad de las secuencias, al poder corregir algunos errores de stas. Algunas incorporaciones especficas, como las debidas a la desaminizacin de los residuos de citosina en residuos de deoxiuridina o la desaminizacin unida a una oxidacin que resulta en residuos de 5-hidroxiuridina, pueden ser solventadas tratando el ADN molde con glicocilasa de uracilo-ADN. (Paabo et al., 2004). Para valorar el nivel de degradacin de una muestra se recomienda utilizar la PCR en tiempo real. Como explica Pruvost (2004) este tipo de PCR permite determinar la cantidad de molculas de ADN con las que se inicia la reaccin en cadena. Entre mayor sea la cantidad inicial menor ser el riesgo de incorporaciones que den una secuencia equivocada. Se puede llegar incluso a establecer un mnimo de molculas como barrera inferior para considerar vlidos los estudios de este tipo. Esta metodologa es una de las ms utilizadas actualmente, como lo evidencia la existencia de artculos muy recientes que, con algunas modificaciones, la siguen empleando para la cuantificacin de molculas de ADN (Vural, 2009).
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Como complemento de lo anterior, en los ltimos aos se han empezado a utilizar nuevos tipos de polimerasas premium, que tienen unos ndices de incorporaciones errneas inferiores a los de la Taq, as como una mayor sensibilidad. Entre stas se encuentran la Platinum Taq Hifidelity de Invitrogen (Carlsbad, CA) y la Amplitaq Gold de Applied Biosystems (Foster City, Ca) (Gilbert and Willerslev, 2007). 4.3. La lucha contra la contaminacin Como se explic en el apartado anterior, la contaminacin es uno de los mayores problemas en los estudios de ADN antiguo, siendo quizs el tema sobre el que ms se ha escrito. A continuacin se har una pequea revisin de algunas de las propuestas que se han planteado para intentar llevar al mnimo los niveles de contaminacin (Malmstrom et al., 2007). Para evitar la contaminacin en el proceso de excavacin y de anlisis antropolgico de los huesos, se recomienda la utilizacin de guantes as como, en la medida de lo posible, tener un control de las personas que han tenido acceso a los restos y sus perfiles genticos para poder contrastarlos con las secuencias obtenidas de los restos antiguos y descartarlos como fuentes de stas. Tambin se aconseja no lavar los huesos por las diversas razones que se han ido mencionando (Geigl, 2008). Los mtodos seguidos una vez en el laboratorio de biologa molecular deben ser igualmente cuidadosos. Geigl (2008) plantea que la QPCR (PCR cuantitativa) ha demostrado ser uno de los mejores mtodos para la cuantificacin tanto de la contaminacin en los reactivos como de la cantidad de ADN encontrada en un fsil. En primer lugar se hace una QPCR con varias tandas de reactivos; una vez obtenida la media de ADN en los mismos, sta se utiliza como baremo. Lo anterior implica que, slo se considera fiable un resultado cuando la frecuencia de amplificaciones positivas del total de PCRs realizadas est muy por encima de los niveles de los reactivos solos. Este tipo de estudios se hacen sobre todo en las investigaciones sobre animales de las familias de las vacas y los cerdos, porque algunos de los reactivos, como la BSA, tienen un origen bovino o porcino. En cuanto a la contaminacin por arrastre o carry-over, las medidas mnimas recomendadas son la separacin fsica, tanto de los espacios donde se realiza la
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extraccin, como del laboratorio de pre-PCR y el de post-PCR. A esto se deberan unir infraestructuras de presin positiva y de irradiacin ultra violeta como medidas que pueden ayudar a disminuir los riesgos de contaminacin. Otra cuestin es que la circulacin de personal a lo largo de las jornadas debe ser en un slo sentido, desde los lugares de extraccin hacia los de pre-PCR y por ltimo a los de post-PCR, evitando al mximo la circulacin inversa. (Geigl, 2008). 4.4. Cmo contrarrestar los inhibidores Para otra de las grandes dificultades que se dan en los estudios de ADN antiguo, los inhibidores, se han buscado mltiples soluciones. Esto se debe en parte a que la manera como actan los inhibidores y su naturaleza no son an plenamente comprendidas por los cientficos. En Kemp (2006) podemos encontrar, dentro de su propuesta de la extraccin con columnas de slica, un repaso por los principales mtodos para intentar combatir los inhibidores, que se podran dividir en dos grupos. En primer lugar aquellos que contrarrestan los efectos de los inhibidores mediante la manipulacin del ADN molde, los reactivos de la PCR o las condiciones de los ciclos en la PCR. El segundo grupo estara compuesto por aquellos mtodos que eliminan los inhibidores durante la extraccin del ADN antes de la amplificacin por PCR. Dentro del primer grupo de tcnicas estara el diluir los extractos de ADN con agua libre de ste, siendo una de las ms utilizadas. En este caso los inhibidores estaran disueltos lo suficiente como para permitir la amplificacin. La explicacin sobre el por qu de la efectividad de esta tcnica no est an del todo clara, teniendo en cuenta que la relacin entre la cantidad de inhibidores y de ADN se mantiene constante. Sin embargo, es posible que exista un umbral para los inhibidores en donde la concentracin de estos sea la clave, independientemente de la cantidad de ADN. La contrapartida de esta tcnica es que puede influir en la efectividad de la amplificacin en casos donde ya de por s el ADN est degradado y en bajas concentraciones. Una de las soluciones planteadas para este problema es lo que se ha denominado Booster PCR. Este protocolo consiste en tres rondas de doce ciclos de amplificacin a una baja temperatura de anillamiento, en la que en cada uno se utiliza como molde el ADN proveniente de la ronda anterior, siendo el resultante de estas tres rondas, el ADN molde para la PCR definitiva. Lo que se consigue
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con esto es diluir los inhibidores mientras se mantiene una alta concentracin del ADN molde. En los casos en que la inhibicin se da por una inactivacin de la polimerasa, aumentar el nmero de unidades de la Taq en las reacciones de PCR puede contrarrestar dicho efecto. A pesar de ello, en estudios realizados con muestras degradadas, que suelen tener un menor nmero de molculas para amplificar, el aumento en la cantidad de Taq puede ser contraproducente ya que, al incrementar la sensibilidad de sta tambin aumenta el riesgo de contaminacin. La utilizacin de la BSA (Bovine serum albumin), que bloquea algunos inhibidores de PCR, estara promoviendo indirectamente la actividad de la polimerasa. Dentro de la segunda categora de tcnicas, las que eliminan los inhibidores durante la extraccin, se encuentra el uso de CTBA (cetyltrimethylammonium bromide) para incrementar el ADN obtenido de huesos quemados. ste tambin se puede utilizar acompaado con PVP (polyvinyl pyrrolidone) ya que ambos se unen a los polifenoles y a los polisacridos, que son inhibidores, aislndolos del ADN. Para eliminar cidos hmicos, as como polisacridos, se han desarrollado procedimientos para unir el ADN a bloques de agarosa, para luego lavarlos con una solucin de lisis seguida de un tampn de TE. Esta tcnica se aprovecha de la diferencia de tamaos entre las macromolculas de ADN y el menor tamao de las molculas de los distintos inhibidores, que se deslizan fuera de la agarosa. Otra de las ventajas de esta tcnica es que el ADN que se une a la agarosa, que se derrite a bajas temperaturas, puede ser utilizado directamente como molde de la PCR. Tambin se ha demostrado que las muestras precipitadas con isopropanol durante la extraccin presentan unos niveles inferiores de inhibidores que aquellas muestras precipitadas con etanol o las concentradas con las columnas Centricon 30. Adems la precipitacin con isopropanol parece contribuir a la remocin de la coloracin marrn de los extractos de ADN, as como a una reduccin en la intensidad de la fluorescencia azul presente durante la electroforesis, siendo stas dos muestras indirectas de la eliminacin de al menos una fraccin de los inhibidores.
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Partiendo de la hiptesis de que los inhibidores ms problemticos se unen a la doble hebra de ADN, autores como Kemp (2006) han propuesto un procedimiento para liberar los inhibidores en solucin mediante la desnaturalizacin del ADN con 0.4mM NaOH. Cuando la solucin se pasa por columnas como las Microcon-100, la membrana retiene el ADN mientras que los inhibidores de menor tamao pasan a travs de sta. Luego el ADN vuelve a ser naturalizado para ser utilizado como molde de la PCR. Algunos crticos de este proceso consideran que no es el ms adecuado para extractos con poca cantidad de ADN. Otro mtodo es el uso de una gran variedad de columnas de geles y cuentas para remover los inhibidores. Algunos de estos forman parte de kits comerciales como las columnas Sephadex G-50 o G-200, o las Bio-gel P-6 y P-30, entre muchas otras. La efectividad de stas en la eliminacin de los inhibidores es bastante variable. Dentro de este grupo estaran tambin las columnas de silica (Qiaquick) que han demostrado ser ms efectivas que la extraccin tradicional con fenol-cloroformo para eliminar los inhibidores (Kemp et al., 2006). Las tcnicas presentadas hasta ahora varan en su efectividad, dependiendo de cules sean los inhibidores de cada muestra. Como su determinacin no siempre es fcil, se pueden cometer errores a la hora de escoger qu mtodos aplicar a cada muestra, haciendo que las amplificaciones no resulten por causa de inhibidores que no se han tenido en consideracin. Partiendo de este problema Kemp et al. (2006) proponen la aplicacin de una tcnica, la repeat silica extraction, que al ser menos especfica ayuda a eliminar un mayor nmero de inhibidores. Ellos demuestran que es una tcnica lo suficientemente amplia como para funcionar con muestras de hueso y coprolitos de las que se sabe que contienen una gran cantidad de inhibidores y de las que no habra sido posible obtener resultados positivos con otras tcnicas, como la dilucin o la incorporacin de BSA. Este proceso se basa en el principio de que en unas determinadas condiciones de temperatura y pH, el ADN se une a la slica permitiendo lavar el resto de productos que haya en el extracto, incluidos los inhibidores. Una vez lavados, se cambian las condiciones para que la slica libere el ADN, que se encontrar purificado y podr ser utilizado como molde de la PCR. En casos donde fuese necesario este proceso se puede realizar dos veces sobre la misma muestra para as aumentar su efectividad.
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Otros autores (Audic and BeraudColomb, 1997, O'Rourke et al., 2000, Handt et al., 1994, Kim et al., 2008) tambin mencionan las ventajas de la extraccin con slica en lo que respecta a los inhibidores. Algunos como ORourke (2000) apuntan que, en comparacin con varias combinaciones de extracciones con fenol-cloroformo, aquellas realizadas con kits de gel de slica (Qiagen Qiaquick preps) son mucho ms eficientes. En estos casos las columnas actan como concentradores, removiendo la pigmentacin que suele quedar despus de la extraccin con fenol-cloroformo. Sin embargo, tambin tienen inconvenientes porque la cantidad de solucin que puede ser cargada cada vez en las columnas es limitada; esto implica una mayor manipulacin de las muestras lo que aumenta las posibilidades de contaminacin o de prdida de la muestra. A pesar de esto, los ndices de amplificacin siguen siendo bastante altos en estos protocolos, debido a la menor presencia de inhibidores. Aunque no funciona exactamente como un inhibidor, los productos de Maillard tambin afectan los resultados de la PCR como se ha explicado anteriormente. En los ltimos aos se ha visto que el aadir Bromuro de N-phenacylthiazolium (PTB) puede contrarrestar los efectos de estos productos, que se encuentran sobre todo en los coprolitos. Fue utilizado por primera vez en la extraccin de ADN de coprolitos del Pleistoceno tardo (Poinar et al., 1998). Al parecer el PTB mejora el rendimiento de las amplificaciones mediante su unin a las protenas derivadas del azcar que pueden atrapar al ADN. Independientemente de su efectividad, parece ser que el PTB no causa ningn dao a la extraccin de ADN y se puede incorporar de manera sencilla a los protocolos de extraccin (Mulligan, 2005), aadiendose en el mismo momento en que se incorpora la proteinasa K, por lo que su utilizacin no suele estar de ms. En un principio se aadieron concentraciones de 1mM, aunque se han llegado a aadir concentraciones de incluso 200mM en la extraccin de ADN de dientes (Gilbert et al., 2003). El descubrimiento de este producto qumico no tuvo relacin con los estudios de ADN antiguo, sino con un estudio en pacientes diabticos con diversos problemas debido a un exceso de azcares reductoras (glucosa) en la sangre. Estos azcares producen crosslinks que pueden derivar en cataratas y en un endurecimiento de las arterias. Fue en la bsqueda de una solucin para este problema cuando se descubri que el PTB poda restaurar el colgeno afectado por los cross-links a su estado natural, vindose as su utilidad para tratar el ADN antiguo.(Poinar, 2002)
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5. Mtodos de extraccin, amplificacin y secuenciacin 5.1. Mtodos de extraccin Una vez conocidas algunas de las tcnicas ms exitosas para combatir los problemas del el ADN antiguo, resulta necesario un breve repaso por los principales mtodos de extraccin del ADN . El propsito de esta explicacin es clarificar cmo la mayora de los elementos mencionados se van incorporando en unos protocolos cada vez ms estandarizados que permiten una optimizacin de este tipo de estudios. Adems, conocer los protocolos de extraccin bsicos resulta fundamental para entender las propuestas metodolgicas de apartados posteriores. Por ltimo, su conocimiento permite entender el estado actual de las investigaciones de ADN antiguo, en lo que respecta a estandarizaciones metodolgicas. El protocolo propuesto por Maca-Meyer (2002), explicado a continuacin, incluye los pasos que se encuentran en la gran mayora de publicaciones, aunque pueden existir pequeas variaciones. En este caso se habla de la extraccin en piezas dentarias, por ser de las ms usuales en este tipo de estudios, pero las caractersticas generales del proceso son las mismas que en otro tipo de tejidos. Este protocolo se basa en el uso de la slica propuesto por Hss y Pbo (1993). Se eligi porque al tener un nmero reducido de pasos resulta mejor a la hora de combatir la contaminacin. 1. Limpieza de las muestras: Antes de proceder a la extraccin de ADN se debe realizar una limpieza de las piezas dentarias para descontaminar la superficie de stas. Este es un proceso muy importante para intentar eliminar el ADN exgeno proveniente de las personas que han manipulado las muestras. Para ello se lavan con una solucin de alto poder depurinizante (15% cido clorhdrico), la cual inactiva el ADN superficial (Izaguirre, 1998). A continuacin se enjuaga repetidas veces la superficie del diente con agua estril y se deja secar bajo la luz UV durante cinco minutos por cada cara (Sarkar and Sommer, 1990). Una vez secos los dientes se colocan entre dos placas metlicas y se pulverizan golpeando con un martillo. Estos restos se introducen en un tubo de 15 ml de polipropileno (Costar), porque se vio que el uso de los de poliestireno daba como resultado amplificaciones fallidas.
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2. Al diente pulverizado se le aade aproximadamente 1 ml de una solucin comercial de tiocianato de guanidina (DNAzol (MRC, Cincinnati, OH) (Chomczynski et al., 1997) y se deja a temperatura ambiente entre 3 y 4 das agitando espordicamente. Pasado este tiempo, se purifica el ADN mediante el uso de unas columnas comerciales de slica (QIAquick, Qiagen), segn el siguiente protocolo: a. Los tubos con las extracciones se centrifugan durante 5 minutos a 4.000 r.p.m. y se recogen alcuotas de 300 l de la fase acuosa que se introducen en un eppendorf de rosca de 1,5 ml. b. A cada eppendorf se le aade 1 ml de tampn de unin (suministrado por Qiagen) y 45 l de acetato sdico 3M pH 5,2. c. Se pasa el extracto por las columnas centrifugando durante 1 minuto a 4.000 r.p.m. d. Se aade a cada columna 500 l de solucin de lavado (suministrado por Qiagen) y se centrifuga 1 minuto a 4.000 r.p.m. e. Se aade a cada columna 750 l de acetona (Merck) y se centrifuga durante 1 minuto a 4.000 r.p.m. f. Se aaden nuevamente 400 l de solucin de lavado y se centrifuga durante 1 minuto a 4.000 r.p.m. g. A cada muestra se le aade 30 l de agua estril y 30 l de TE (Tris-EDTA pH 8) y se dejan durante 15 minutos en un bao a 50C. h. Se centrifugan las muestras durante 2 minutos a 13.000 r.p.m., se pasan los extractos de ADN a tubos eppendorf de rosca de 0,5 ml y se guardan a -20C Como complemento, Mulligan (2005) nos plantea algunas de las diversas modificaciones que se pueden efectuar al protocolo anteriormente expuesto, as como algunas precauciones que se deben seguir cuando se utiliza el EDTA para la descalcificacin de tejidos seos. i. Si el material del que se obtendr el ADN se encuentra en buenas condiciones y se presume la presencia de ADN endgeno, cantidades menores de hueso o diente pueden ser utilizadas permitiendo el uso de tubos ms pequeos que suelen facilitar el trabajo. ii. Es posible que distintas cantidades de ADN y de inhibidores sean extradas durante la descalcificacin con EDTA. Por ello se recomienda que durante el proceso de descalcificacin el EDTA sea cambiado despus de unos pocos das, reemplazndose
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por EDTA fresco, para luego procesar por separado los dos extractos de EDTA como si fueran muestras distintas. iii. El uso del PTB en las investigaciones recientes parece ayudar a eliminar los productos del Maillard, como ya se explic en apartados anteriores. iv. La Silica-GuSCN tambin suele ser utilizada con frecuencia en los primeros pasos de la extraccin de ADN, combinada con niveles bajos de EDTA (en lugar de confiar nicamente en las altas concentraciones de EDTA). Muchos de los kits de purificacin de ADN se basan en un protocolo de Silica-GuSCN, como por ejemplo el Wizard Plus Megaprep DNA Purification System (Promega, Madison, WI). En este tipo de protocolos , el GuSCN ayuda a unir el ADN a la silica para que las impurezas que no se han unido puedan ser lavadas. Sin embargo, los mtodos basados en la Silica deben ser usados con precaucin porque en algunos casos el ADN antiguo puede estar unido a protenas causando que ste no interactue de la manera de debiera con las resinas a las que debera unirse, trayendo como consecuencia la prdida de ADN. v. La completa descalcificacin de los huesos bien preservados puede requerir varias semanas si la extraccin se realiza a 4C, aunque normalmente sta es llevada a cabo en 3 o 4 das cuando se realiza a temperatura ambiente. El nivel de descalcificacin puede ser monitorizado tocando el material que se encuentra dentro del EDTA, evidentemente utilizando guantes, comprobando la existencia de fragmentos sin acabar de descalcificar. 5.2. Mtodos para aumentar el xito de la PCR El segundo proceso en el anlisis del ADN antiguo es la PCR (Polymerase Chain Reaction), o amplificacin, en el que se realizan copias del ADN molde con el fin de poder analizarlas correctamente, como ya se ha explicado. Durante este procedimiento tambin se han investigado ciertas tcnicas que ayudan a combatir algunos de los problemas presentados por el ADN antiguo. Mulligan (2005), nos explica las tcnicas que han demostrado ser ms productivas. Muchas de ellas tambin son mencionadas por otros autores como Chelomina (2006): a. Mayor cantidad de Taq polimerasa y mayor nmero de ciclos de amplificacin: Una mayor cantidad de Taq polimerasa y un mayor nmero de ciclos de amplificacin suelen ser usados en los casos donde se trabaja con ADN antiguo. Las cantidades
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tpicas son de
entre 1 y dos unidades de polimerasa y entre 40 y 50 ciclos. La
reamplificacin de una alcuota de un producto de PCR o de una banda purificada de ADN no es recomendable porque aumenta las posibilidades de introducir contaminacin. b. PCR de Hot-start: Consiste en retener un componente esencia de la PCR hasta que la reaccin haya alcanzado una temperatura que inhiba la unin de primers de manera inespecfica o la oligomerizacin de los primers. Se utiliza para optimizar el campo de los productos de PCR deseados y evitar amplificaciones inespecficas. La PCR de Hotstart puede conseguirse, bien usando complejos de anticuerpos de la polimerasa en el que las enzimas se encuentran inactivas hasta que alcanzan los 95C por 5-10 minutos (por ejemplo Amplitaq Gold; Applied Biosystems, Foster City, CA) o utilizando cuentas de cera en las que el Mg slo es liberado luego de un calentamiento prolongado (por ejemplo Hot Wax Beads; Invitrogen, Carlsbad,CA). c. Espermidina: Los bajos niveles de espermidina pueden facilitar la amplificacin de algunas muestras de ADN. Sin embargo, el exceso de espermidina puede inhibir la amplificacin por lo que primero se debe intentar la amplificacin sin espermidina. En algunos estudios se ha determinado que la concentracin de espermidina debe estar entre 400 y 800 M. d. El Bovine serum albumin (BSA), el glicerol, el dimetilsulfoxido (DMSO) y la formamida: El BSA y el glicerol son usados para estabilizar la interaccin entre las protenas y el ADN, mientras que reactivos como el DMSO y la formamida, facilitan la separacin de las hebras de ADN al dificultar el emparejamiento de bases. A pesar de ello, el mecanismo de estas interacciones no est bien estudiado y la determinacin del aditivo ms conveniente debe ser seleccionado por medio de ensayo y error. Las concentraciones tpicas de estos aditivos son: 10-100g/ml BSA, 10% glicerol, 5-10% DMSO y 2,5-10% de formamida. La BSA y el DMSO son los aditivos ms utilizados, sobre todo porque suelen ser los que dan ms resultados positivos en la amplificacin. e. PCR anidada: Es la amplificacin de un nico producto de PCR a travs del uso de dos pares de primers en una amplificacin en secuencia en la que el blanco de la segunda PCR est contenido dentro del producto de la primera PCR. Esta estrategia permite que productos de PCR dbiles (o invisibles) puedan ser reamplificados aunque aumenta la especificidad de la reaccin al usar dos pares de primers. f. Betana: Se ha sugerido que la betana ayuda a estabilizar las protenas contra la desnaturalizacin trmica facilitando la separacin de las hebras de ADN mediante la
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isoestabilizacin de las mismas. La betana en concentraciones de entre 0,5 y 2,2 M, tanto en la presencia como en la ausencia del DMSO, ha demostrado que aumenta la amplificacin del ADN y mejora la consistencia de la amplificacin. Tambin se ha demostrado que la betana inhibe algunas de las ADN polimerasas, por lo que su incorporacin puede hacer necesaria la modificacin de los protocolos de PCR. g. PTB: Como ya se ha mencionado, parece que la incorporacin del PTB puede ayudar a contrarrestar los productos de Maillard. h. Mayor cantidad de Mg: Si existe un residuo de EDTA en el extracto de ADN proveniente de la descalcificacin, sta puede reducir la concentracin de Mg en la PCR por debajo de los niveles ptimos. i. Touchdown PCR: Consiste en reducir la temperatura de anillamiento entre 5 y 10C durante los primeros diez ciclos de la PCR. Es un mtodo utilizado cuando no se sabe con certeza la temperatura de anillamiento de los primers con el ADN. Aunque esta incertidumbre no debera existir en los casos de ADN antiguo, puede que este mtodo facilite la amplificacin de un extracto de ADN complejo caracterizado por molculas fragmentadas y la posible presencia de qumicos desconocidos, como los inhibidores. 5.3. Mtodos de secuenciacin de segunda generacin En los ltimos aos, se han desarrollado nuevos mtodos de secuenciacin, que poco a poco se irn imponiendo. Estos son los llamados mtodos de segunda generacin, y ya empiezan a utilizarse en los estudios de ADN antiguo (Mardis, 2008). Este tipo de mtodos harn cada vez ms viable la secuenciacin de genomas completos (WGS), ampliando as, de manera radical, el tipo de resultados que se pueden obtener de las muestras antiguas. Este tipo de tecnologa se basa en la construccin de libreras de secuencias que luego se utilizan para leer una secuencia desconocida. En el campo especfico del ADN antiguo este tipo de tecnologa ha permitido obtener muestras directamente de los genomas nucleares de osos de las cavernas, de mamuts o de Neanderthales. Aunque no se entrar en detalle sobre este tipo de tcnicas, es necesario mencionarlas, ya que seguramente sern de uso comn en un futuro no muy lejano.
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5.4. Criterios de autentificacin Una vez comprendidas las principales particularidades de los estudios de ADN antiguo resulta evidente la necesidad de establecer unos criterios de autentificacin de los resultados. A continuacin se explicaran los propuestos por Pbo (2004), ya que suelen ser utilizados como referente. Sin embargo, es necesario mencionar que otros autores, como Cooper y Poinar (2000), tambin han propuestos una lista de criterios que, aunque con algunas pequeas diferencias, Pbo ha complementado siguiendo la misma lnea. La existencia de estos criterios, por otra parte, no significa que sean respetados en todas las investigaciones. Roberts (2008) nos da algunos ejemplos de ello en su repaso sobre los artculos que hacen referencia a los estudios de ADN antiguo en el campo de la paleopatologa, mostrando que en una gran cantidad de casos estos criterios no son respetados ni presentados en los resultados de las investigaciones. Lista de criterios 1. Los productos amplificados deben ser clonados rutinariamente y mltiples clones deben ser secuenciados. Esto permite que cualquier heterogeneidad en el producto amplificado pueda ser detectada sin ambigedades. Tambin permite estimar el espectro de errores. 2. Controles negativos de extraccin deben realizarse a la vez que las extracciones de materiales antiguos. De manera similar, siempre deben realizarse controles negativos de PCR cuando se amplifica ADN antiguo. De hecho, teniendo en cuenta que la contaminacin de los reactivos de laboratorio puede encontrarse en cantidades tan pequeas que slo se detecte espordicamente en los controles negativos, se deben realizar varias amplificaciones sin ningn ADN molde por cada experimento. Se ha demostrado til la utilizacin de tres controles. 3. Repetir las amplificaciones de una misma extraccin o de diferentes extracciones de un mismo espcimen es necesario por al menos tres razones. La primera, porque es til para detectar la contaminacin de una extraccin o amplificacin en particular. La segunda razn es porque se podran obtener resultados en los casos donde hay muy pocas molculas en la muestra y donde slo de manera espordica se encuentren molculas de ADN molde en los distintos extractos o en las alicuotas de estos. Tres extractos puede ser un nmero razonable de intentos de extraccin antes de descartar un espcimen de inters como carente de ADN til. La tercera razn es que las
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repeticiones posibilitan la deteccin de las incorporaciones errneas de nucletidos que conllevan cambios consistentes. 4. La cuantificacin del nmero de molculas de ADN amplificables presentes en un extracto permite determinar si la cantidad de molculas con las que se inicia la PCR es muy poca, lo que aumenta la posibilidad de que ocurran cambios consistentes. Se debe resaltar que la cuantificacin basada en la PCR debe hacerse de manera independiente para cada pareja de primers utilizados, porque diferentes primers pueden tener una eficiencia variable al inicio de la amplificacin. Si hay un gran nmero de molculas presentes (ms de 1000 puede servir como baremo), y slo se espera un tipo de secuencia de ADN, no hace falta realizar ms de dos amplificaciones ya que es muy poco probable que ocurran cambios consistentes. Si el nmero de molculas presentes es inferior, es necesario realizar varias amplificaciones. La manera ms econmica de proceder en estos casos es realizar primero dos amplificaciones y secuenciar varios clones de cada una. Si se observa una diferencia consistente entre los dos grupos de secuencias se debe plantear la realizacin de ms amplificaciones. En el caso de que se estudie el ADN mitocondrial, o secuencias de las que el individuo slo debera tener un tipo de ADN, una tercera amplificacin suele ser suficiente para determinar cual de las dos variantes presentes es reproducible. Si se est estudiando una secuencia autosmica para la que pueden existir dos alelos, cuando se empiece con un nmero elevado de molculas, las dos amplificaciones deben presentar aproximadamente un nmero igual de los dos alelos. En el caso de que se empiece con pocas molculas, se hacen necesarias mltiples amplificaciones sucesivas para distinguir los individuos homocigotos de los heterocigotos. Sin embargo, si el genotipo de los individuos no es de inters, dos o tres amplificaciones sern suficientes. 5. Debe darse una correlacin inversa entre la eficiencia de la amplificacin y la longitud del fragmento amplificado. Este criterio es un indicador muy simple de la extensin de la degradacin y de las lesiones bloqueantes presentes en el molde de ADN antiguo. Existe una gran variedad en la longitud de las amplificaciones que pueden conseguirse de distintos especmenes; aunque la mayora de restos antiguos no permiten amplificaciones de ms de 100 o 200 pares de bases de ADN mitocondrial, algunos pocos restos de pjaros no voladores de Nueva Zelanda con unos cuantos miles de aos de antigedad permitieron recuperar fragmentos de unas 500 pb en una sola amplificacin y se han reportado fragmentos de hasta 1,6 kb en restos provenientes del permafrost. En general se puede afirmar que si los fragmentos ms cortos no se amplifican mejor que los fragmentos largos, en comparacin con secuencias de ADN
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moderno, podemos estar frente a una fuente de ADN contaminante. Si las secuencias ms largas se determinan mediante el solapamiento de segmentos ms pequeos, las posiciones variables en los lugares de los primers o de las zonas que se solapan deben confirmar que las dos secuencias estn unidas. 6. Las pruebas bioqumicas de preservacin macromolecular sirven para dos propsitos. En primer lugar apoyan la afirmacin de que un espcimen est lo bastante bien conservado como para que en l se encuentren molculas de ADN. En segunda instancia pueden ser usados como un mtodo rpido de rastreo para identificar especmenes que, basndose en su estado general de conservacin, puedan contener ADN como ya se ha expuesto con anterioridad. Para esto se han sugerido varias tcnicas; siendo la ms utilizada el anlisis de los amino cidos presentes en los especmenes, y la medicin de la preservacin de los mismos. Estos mtodos han evolucionado bastante en los ltimos tiempos, aunque parece ser que la combinacin de la cantidad total de amino cidos, su composicin y su grado de racemizacin son una aproximacin til para valorar la preservacin del ADN en huesos y dientes. A pesar de que la cintica de la racemizacin depende de la posicin de los cidos asprticos en la cadena de protena, los especmenes que contienen muy pocos aminocidos poseen una composicin de stos que indica que sus macromolculas han sido reemplazadas por microorganismos o se han racemizado extensamente, haciendo poco factible que contengan ADN endgeno. Otros mtodos alternativos para este tipo de valoraciones incluyen la estimacin de la relacin entre fragmentos pptidos y aminocidos sencillos, por medio del espectmetro de masas o la histologa directa del hueso; la determinacin de los daos del ADN con cromatografa de gases y espectrometra de masas; la medicin de la porosidad y densidad del hueso y el microscopio de transmisin de electrones. De momento no se han realizado estudios a gran escala sobre la correlacin directa de cada una de estas tcnicas con la preservacin de ADN antiguo, a pesar de la gran aportacin que representaran. 7. Algunas secuencias de ADN derivados de organelos como las mitocondrias, se encuentran frecuentemente en el genoma nuclear. Como el ADN mitocondrial es el de mayor inters en la mayora de los proyectos de ADN antiguo, estas integraciones nucleares pueden, en ocasiones, ser amplificadas en la PCR y ser confundidas con las secuencias del ADN de los organelos. Es ms probable que esto suceda cuando los primers usados difieren de la secuencia de los organelos de ADN de un espcimen individual pero no de la versin de esta misma secuencia que existe como una insercin nuclear. El resultado de ello seran conclusiones errneas con respecto a
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variaciones intraespecficas as como a la filogenia de las especies. Para evitar este problema se pueden usar diferentes grupos de primers solapados y variables para amplificar la misma secuencia, porque es muy poco probable que dos grupos de primers distintos amplifiquen preferentemente la misma insercin nuclear. En cualquier caso, en especies en las que exista un gran nmero de copias nucleares del ADN mitocondrial, se pueden obtener varias secuencias de todos los pares de primers, por lo que la determinacin de las secuencias de ADN mitocondrial resulta imposible. 8. Los resultados cruciales deben ser reproducidos en un segundo laboratorio. Este criterio se ha sugerido al asimilarse la seriedad de la amenaza de la contaminacin para la autenticidad de los resultados. ste cumple la misma funcin que los controles negativos en la extraccin y en la PCR en el laboratorio. Sera una precaucin adicional para excluir la existencia, poco probable, de un contaminante que no apareciera en los controles negativos. Se debera realizar sobre todo cuando se produzca un resultado novedoso e inesperado con grandes consecuencias. En estos caso, las muestras deben enviarse directamente, y de manera independiente, desde el museo o la excavacin a los dos laboratorios para que los potenciales contaminantes no puedan ser transferidos entre los laboratorios. 9. Como criterio complementario se puede obtener el ADN externo, en el caso de muestras dentales, para poder compararlo con el ADN endgeno (Fregel et al., 2009b). Como explica Fregel (2010), se ha destacado que, adems de seguir los criterios de autentificacin, hay que realizar un control a posteriori de los resultados (Bandelt, 2005). Para el estudio de secuencias de ADN, existen tres indicadores que pueden cuestionar la autenticidad de los datos obtenidos: 1. Principio de expectacin filogentica: si los resultados reflejan los marcadores presentes en el equipo de excavacin o en el personal de laboratorio, y no lo que se poda esperar a partir del origen geogrfico de las muestras antiguas, es muy probable stos estn afectados por contaminacin. Por ello es necesario disponer de un panel de secuencias de cada uno de los investigadores que han manipulado las muestras, desde el momento de la excavacin hasta su anlisis molecular. 2. Estructura en mosaico: esto ocurre cuando la secuencia obtenida se compone de varios fragmentos solapantes, que por separado tienen diferentes sentidos filogenticos, y en conjunto, no pertenecen a ningn haplotipo conocido. Esta estructura en mosaico puede ser debida a contaminacin o a la mezcla de muestras.
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3. Espectro anormal de mutacin: cuando existe una aglomeracin de mutaciones poco comunes a lo largo de una molcula antigua, dicho resultado debe descartarse, ya que posiblemente las modificaciones postmortem hayan transformado el material gentico inicial, de forma que ya es imposible conocer su haplotipo real.
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6. Algunas reas de aplicacin del ADN antiguo Una vez comprendidas las limitaciones y las posibilidades de los estudios de ADN antiguo, se plantean algunas de las reas de investigacin posibles con este tipo de estudios. Para ello se recurrir una vez ms a Pbo (2004) que hace un somero recorrido por las principales reas de aplicacin y las posibilidades de cada una. Antes resulta necesario mencionar algunas de las disciplinas involucradas en este tipo de investigaciones (Cipollaro et al., 2005); entre ellas est la arqueologa, la geologa, la vulcanologa, la antropologa, la paleopatologa, la histologa, la qumica, la biologa molecular, la gentica, la microbiologa, la botnica, la zoologa y la bioinformtica . Ya dentro de las reas de aplicacin, la primera sera la filogenia de las especies (Debruyne and Barriel, 2006). Las secuencias de ADN antiguo permiten relacionar especies que se ha extinguido con especies vivas a travs de la filogenia molecular. Algunos ejemplos de las ms de 50 especies extintas estudiadas seran las investigaciones realizadas sobre los lobos marsupiales australianos (Krajewski et al., 1997, Krajewski et al., 1992, Thomas et al., 1989), los moas de Nueva Zelanda (Cooper et al., 2001, Cooper et al., 1992, Haddrath and Baker, 2001) o los gansos endmicos hawaianos (Paxinos et al., 2002). Este trabajo se ha desarrollado sobre todo dentro de los museos de historia natural, ya que cuentan con grandes colecciones con las que realizar diversos anlisis moleculares. En estos casos es ms comn recurrir al estudio de secuencias de ADN mitocondrial o de cloroplastos ya que al haber ms copias de estos por clula existe una mayor probabilidad de que se conserven. Esto implica algunas limitaciones porque al tener unas tasas de mutacin menores, es ms difcil resolver la filogenia de algunas especies que, o bien se han separado recientemente, o de forma tan rpida que las diferentes partes del genoma tienen una filogenia diferente (Paabo et al., 2004). En algunos casos como el de los moas, esto se ha superado al haber sido posible la amplificacin de algunas secuencias de ADN nuclear. Una segunda rea seria la de la historia de las poblaciones y la filogeografa, que estudiaran los cambios de las poblaciones a travs del tiempo. Esto se puede hacer gracias a la conservacin de muchos individuos de una misma localidad, bien sea en los museos, que en este campo cobran gran importancia (Wandeler et al., 2007), o como consecuencia de excavaciones arqueolgicas. Un ejemplo de esto seran los estudios
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realizados en tres poblaciones de ratas canguro en California, en donde se compararon los especmenes de los museos con las poblaciones actuales. Se puede demostrar que las poblaciones han tenido una continuidad a lo largo del tiempo, o por el contrario han sido remplazadas por otras como consecuencia muchas veces de procesos antrpicos (Ramakrishnan and Hadly, 2009, Garrigan and Hammer, 2006). Un rea de gran importancia para la comprensin de nuestra historia ms remota sera el estudio de los homnidos. De momento el impacto de los estudios de ADN antiguo ha sido bastante limitado, por los lmites temporales de la conservacin, adems de los grandes problemas de contaminacin con ADN humano moderno. Sin embargo, se han podido vislumbrar algunas pistas sobre la relacin entre los humanos anatmicamente modernos y los neanderthales, que habitaron Europa desde hace unos 300,000 aos hasta hace poco menos de 30.000 aos, aunque teniendo que hacer frente a una compleja problemtica (Green et al., 2009, Millar et al., 2008, Goldstein and Chikhi, 2002). Se han generado intensos debates sobre la posibilidad de una contribucin gentica de estas poblaciones a las poblaciones actuales; los primeros resultados que se han obtenido parecen demostrar que sta contribucin no tuvo lugar. Sin embargo, publicaciones recientes parecen haber encontrado evidencias de lo contrario (Dalton, 2010), por lo que el debate sigue abierto. Dentro de este campo tambin han cobrado importancia los anlisis que intentan responder cuestiones sobre el origen de los humanos modernos (Harpending and Rogers, 2000). Se puede hablar principalmente de dos corrientes, aquellas que defienden un origen en frica con una posterior expansin por los dems continentes (teora del OOA), y la segunda que defiende un origen multiregional de los humanos anatmicamente modernos. En este caso tambin el debate sigue abierto, aunque la primera teora ha cobrado fuerza a la vez que ha ido matizando algunos de sus planteamientos iniciales. Otro de los posibles campos de investigacin hace referencia al estudio de coprolitos. El anlisis de ADN de este tipo de muestras puede proporcionar informacin no slo sobre el individuo que ha dejado la muestra sino tambin sobre los alimentos, animales o vegetales, que haya ingerido. Este tipo de estudios tambin se realizan en animales salvajes en peligro, o de los que es difcil obtener una muestra de tejido. Un paso ms en la arqueologa de la gentica molecular fue la demostracin de que los sedimentos del permafrost, as como algunos contenidos en cuevas, conservan
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en ocasiones restos de ADN amplificable. Adems, el ADN en este tipo de condiciones se conserva durante periodos de tiempo ms largos, habindose llegado a obtener resultados con muestras de casi medio milln de aos. Esto abre la posibilidad de detectar la presencia de organismos incluso cuando no haya restos macroscpicamente identificables. Sin embargo, esto plantea un inesperado nivel de complejidad a los anlisis tanto de los coprolitos como de los sedimentos, bsicamente porque es imposible saber hasta que punto se han desplazado hacia arriba o hacia abajo las partculas y las molculas, lo que dificulta la adscripcin cronolgica certera de las muestras. Otra de las limitaciones sera la imposibilidad de obtener secuencias ms largas por medio del solapamiento de fragmentos ms cortos mediante Jumping PCR, porque los segmentos podran provenir de diversos individuos, o incluso de especies relacionadas, lo que implica una limitacin en la resolucin taxonmica. Dentro del campo de la arqueologa, existen numerosas preguntas y reas para las cuales los estudios de ADN antiguo pueden ser de gran ayuda. Kemp (2007) y Larsen (2002) nos plantean slo algunos de los mltiples temas en los que se pueden aplicar este tipo de anlisis. Entre ellos encontramos la determinacin del sexo molecular como herramienta para comprender distintos comportamientos humanos en los que el sexo de los individuos juega un rol fundamental, como por ejemplo los sacrificios humanos en los aztecas (De La Cruz et al., 2008). Otros de estos ejemplos seran los anlisis de movimientos poblacionales as como de migraciones; tambin se pueden determinar relaciones biolgicas entre individuos de un mismo enterramiento, lo que permitira una mejor comprensin de las relaciones familiares. Por otro lado se pueden hacer reconstrucciones de la dieta o de estratificaciones econmicas basndose en el acceso a determinados recursos. Centrndose en investigaciones con un caracter ms histrico, vale la pena resaltar los estudios de patgenos como virus y bacterias. Diversos artculos hablan sobre la recuperacin de ADN de la Mycobacterium tuberculosis o de la Yersinia pestis, as como del virus de influenza de la gran epidemia de 1918 (Larsen, 2002). Es un campo potencialmente muy interesante porque la evolucin de algunos patgenos parece ser lo suficientemente rpida como para permitir seguir el cambio gentico a travs de dcadas o de siglos. En contrapartida, existen diversas fuentes potenciales de contaminacin; por ejemplo, las bacterias en la tierra pueden tener secuencias similares las de la bacteria de la tuberculosis, por lo que algunos de los estudios han sido cuestionados. Esto hace
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necesario el desarrollo de estudios rigurosos sobre cuestiones tcnicas que den como resultado unos criterios de fiabilidad (Roberts and Ingham, 2008). Otro campo de estudio de gran relevancia para la historia es la investigacin centrada en los orgenes de la domesticacin. En estos, diferentes loci que no se seleccionaron durante la domesticacin, como los del ADN mitocondrial, puede ser utilizados para examinar si diferentes poblaciones contribuyeron al pool gentico de las especies domsticas o si este proceso se origin en una nica regin. Tambin se pueden identificar los genes seleccionados durante la domesticacin, ya que estos tendrn una variacin ms baja en comparacin con la de sus ancestros salvajes. Una vez que estos genes hayan sido identificados se podra, en principio, determinar el momento en el que los diferentes rasgos fueron seleccionados mediante el anlisis de la variacin en las muestras antiguas. Ejemplos de este tipo de estudios seran los realizados en especies animales como los caballos, las vacas o en especies vegetales como el maz (Schlumbaum et al., 2008). Aunque no se trata directamente de un campo del ADN antiguo, es necesario resaltar la similitud de este tipo de estudios con algunos de los realizados en el campo de la gentica forense. Como resalta Vural (2009) las modificaciones moleculares y la degradacin de las muestras forenses son similares a las experimentadas por las muestras arqueolgicas. Esto significa que la aproximacin tcnica a su tratamiento puede ser similar. Las muestras arqueolgicas se podran asimilar a lo que se suele denominar muestras mnimas en el mbito forense. Esto abre la posibilidad de aprovechar la tecnologa desarrollada y los laboratorios acondicionados para cuestiones forenses, en el estudio de ADN antiguo, como ya se hace en diversos centros.
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7. Estudios de ADN sobre la poblacin canaria. 7.1. Fundamentacin de los estudios genticos Uno de los principales objetivos de los estudios genticos en seres humanos es el estudio de la variabilidad, que se da como reflejo de la historia evolutiva de nuestra especie (Relethford, 1998). Esto implica la determinacin del origen y evolucin de las distintas poblaciones mediante el estudio de las variantes genticas, que suelen producirse por fallos en el proceso replicativo, o como consecuencia de la recombinacin gentica o de la prdida de segmentos de ADN. La migracin, el aislamiento o la seleccin, por otro lado, contribuyen a la diferenciacin gentica de las poblaciones. El estudio de dicha variabilidad tambin es un complemento de la investigacin histrica, porque plantea nuevas vas de interpretacin, o confirma hiptesis ya planteadas. En los inicios de las investigaciones sobre variabilidad no era posible el estudio directo del material gentico, por lo que se utilizaban ciertos caracteres morfolgicos como marcadores de variabilidad. Entre estos estaran el color de la piel o del cabello y marcadores antropomtricos como los ndices craneales o la constitucin corporal. Sin embargo, hay que tener en cuenta que estos marcadores no representan la diversidad total del genoma, porque slo tienen que ver con genes o grupos de genes relacionados con dichos caracteres fenotpicos. A esto se le aaden las dificultades que plantean como consecuencia de su herencia compleja, de la subjetividad a la hora de clasificar a los individuos y de que pueden verse influenciados por el ambiente (Fregel, 2010). En un segundo periodo, los estudios poblacionales se fundamentaron en dos tipos de marcadores. Por un lado se utilizaron tcnicas inmunolgicas para determinar diferencias poblacionales en los antgenos eritrocitarios. Posteriormente, se realizaron anlisis de polimorfismos en protenas, tanto estructurales como enzimticas. A pesar de los aportes de este tipo de estudios para la comprensin de la historia evolutiva del hombre, se demostr una relativa homogeneidad entre poblaciones, lo que implica que al no haber una variabilidad excesiva, resulta difcil determinar con exactitud la historia evolutiva de las poblaciones (Jorde et al., 1998). Al igual que ocurre con el estudio de marcadores morfolgicos, en este caso tambin nos centramos en una parte especfica
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de la porcin traducida del genoma que, por lo tanto, puede verse afectada por la seleccin natural. Finalmente, los avances tcnicos permitieron el anlisis directo de la variacin a nivel de ADN, empezando por las hibridaciones y terminando con la secuenciacin directa, pasando por el uso de enzimas de restriccin. La PCR ser, como ya se ha mencionado, la principal responsable de estos avances, al permitir la amplificacin de fragmentos discretos de ADN en cantidades suficientes para un anlisis ms exhaustivo. Este tipo de estudios se puede realizar desde diferentes enfoques de los que Fregel (2010), nos presenta los principales. Entre ellos encontramos la utilizacin de marcadores localizados en los autosomas (cromosomas no sexuales), en el ADN mitocondrial y en los cromosomas sexuales, X e Y. Estos anlisis se pueden abordar mediante procedimientos diferentes como la caracterizacin de determinadas mutaciones puntuales o SNPs (Single nucleotide polimorphism) y la secuenciacin no sesgada de fragmentos de ADN. Aunque muchos de ellos se llevan a cabo con muestras modernas, resultan fundamentales para poder interpretar los resultados obtenidos de las muestras arqueolgicas. 7.2. Los Primeros estudios genticos en la poblacin canaria: Grupos sanguneos y polimorfismos enzimticos Antes de entrar a describir los diversos tipos de estudios que han pretendido explicar la variabilidad de la poblacin canaria, tanto en el pasado como en el presente, es fundamental hacer algunas aclaraciones sobre el proceso de conformacin de la sociedad canaria actual. Hasta la llegada de los europeos a finales de la Edad Media, la poblacin canaria tena un substrato norteafricano, ya que los aborgenes estaban relacionados con grupos berberes. Luego de la incorporacin del archipilago a la corona castellana a finales del siglo XV, se producira una aportacin de poblacin desde Europa, en especial desde la Pennsula Ibrica. Adems de estas dos poblaciones parentales, tambin hay que tener en cuenta la llegada de esclavos subsaharianos durante la edad moderna, aunque su aporte sea inferior al de las otras dos poblaciones (Maca-Meyer et al., 2004b).
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El grupo sanguneo del sistema ABO es fundamental para las transfusiones y transplantes, ya que entre individuos de grupos incompatibles se produce una destruccin y aglutinacin de las clulas sanguneas (Landsteiner, 1901), como consecuencia de una reaccin del sistema inmune ante unas clulas que reconoce como extraas al organismo. Las bases de este fenmeno son las diferencias antignicas de cada uno de los grupos sanguneos, determinadas a su vez, por la presencia o no de determinados residuos de azcares en las glicoprotenas y glicolpidos de las membranas de los eritrocitos. Estos grupos carbohidrato se incorporan a la membrana gracias a la accin de las glicotransferasas A y B. Las diferencias antignicas de los eritrocitos responden a mutaciones en el gen que codifica la glicosiltranferasa, que incorporar un tipo u otro de oligosacrido, o ninguno en el caso del alelo O (Daniels, 1995). En lo que respecta a los estudios en el archipilago canario seran Schwarzfischer y Liebrich (1963), quienes realizaran uno de los primeros anlisis genticos para determinar el grupo sanguneo ABO en restos aborgenes. Estos consistieron en el uso de antgenos eritrocitarios, en los que se pudo observar una alta frecuencia del alelo O, similar a a encontrada en tribus berberes del Atlas (Gaud, 1942, Masserlin, 1951), lo que estara en consonancia con las evidencias arqueolgicas y antropolgicas que relacionan a la poblacin aborigen con pueblos berberes. Estos estudios se veran complementados por aquellos que caracterizaban a la poblacin canaria actual para el grupo ABO, as como para otros grupos sanguneos como Rh, MNSs, FY y P (Fregel, 2010). Las frecuencias allicas de esta poblacin se encontraran dentro del rango de las poblaciones europeas, aunque se detect una aportacin africana minoritaria. Este sera el caso de La Gomera, donde se encontraron unas frecuencias del alelo O similares a las encontradas en el Magreb y a las de los estudios realizadas en momias aborgenes canarias. A finales del siglo XX se realizaron algunos avances importantes en la comprensin del funcionamiento de los genes relacionados con los grupos sanguneos. Yamamoto (1990b) logr clonar y secuenciar el gen de la glicosiltranferasa, determinando las mutaciones que caracterizan los grupos A, B y O. Las nicas diferencias entre la glicosiltranferasa A y B son 7 mutaciones puntuales, de las cuales slo 4 determinan un cambio de aminocido. La principal diferencia entre la glicosiltranferasa A y O radica en la delecin de una citosina en posicin 261, que da lugar a un codn de parada prematuro y
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a la formacin de una protena enzimticamente inactiva (Yamamoto et al., 1990a). Complementando lo anterior, los avances de la biologa molecular tambin han permitido el estudio exhaustivo de la regin codificante de la glicosiltranferasa, encontrndose una gran cantidad de variantes allicas, sobre todo dentro del grupo O (Yip, 2002). Algunos alelos de este grupo son bastante abundantes, como el caso del O01 y el O02, siendo detectados en todas las poblaciones estudiadas hasta el momento. Sin embargo, tambin se han identificado otras variantes menos frecuentes, que evidencia una distribucin geogrfica ms restringida. Para las Islas Canarias son importantes los alelos O03 y O12, ya que son bastante raros y se encuentran en los lugares de origen de dos de las poblaciones parentales del archipilago, los vascos y los berberes (Roubinet et al., 2001). En los ltimos aos se han realizado nuevos estudios sobre los grupos sanguneos ABO (Fregel et al., 2005), en los que se ha confirmado la presencia de los alelos O03 y O12 en Canarias; adems se ha visto una correlacin negativa entre las distancias geogrficas con el continente africano y las frecuencias insulares; esto sera congruente con una colonizacin aborigen desde el este hacia el oeste, cuyas huellas seran visibles todava hoy. Estos complementan otros estudios autosmicos en la determinacin de las estimas de mezcla: siendo la Pennsula Ibrica la que da un mayor aporte (82%), con algunos matices ya que en islas como la Gomera la aportacin norteafricana asciende hasta un 62%. El segundo tipo de estudios que se realizaron en los inicios de las investigaciones genticas en el archipilago, son aquellos relacionados con los polimorfismos enzimticos. Su determinacin est basada en la caracterizacin de isoenzimas, que son aquellas que catalizan la misma reaccin qumica pero que poseen diferencias en sus secuencias aminoacdicas. El anlisis de polimorfismos enzimticos fue utilizado por primera vez para el estudio de las moscas Drosophila pseudoobscura (Hubby and Lewontin, 1966); para ello se emplearon mtodos electroforticos y de tincin de protenas. Esta tcnica fue luego aplicada a la caracterizacin de poblaciones humanas (Harris, 1966), siendo muy usada hasta que se desarrollaron las tcnicas que permitieron el anlisis directo del ADN. En el caso de Canarias se analizaron ocho enzimas sanguneas, tanto en la poblacin del archipilago como en las parentales, la Pennsula Ibrica y el noroeste
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africano (Cabrera et al., 1996, Pinto et al., 1996b). Al igual que ocurre con los grupos sanguneos, las frecuencias de estas alozimas en Canarias son similares a las tpicas de las poblaciones caucsicas, aunque la presencia de la variante allica R en el locus ACP (fosfatasa cida) y del alelo G6PD A+ (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), que suelen relacionarse con poblaciones negroides, podra interpretarse como evidencia de un componente africano, aunque no demasiado significativo, en la poblacin canaria actual. 7.3. Marcadores uniparentales 7.3.1. Linajes maternos: el ADN mitocondrial Se hace referencia a aquellos que son transmitidos exclusivamente por uno de los dos progenitores. Dentro de los linajes maternos estara el ADN mitocondrial. Este es el material gentico que se encuentra presente en las mitocondrias, orgnulos donde se genera la energa necesaria para el funcionamiento celular. Como ya se ha mencionado nos encontramos ante una molcula bicatenaria, circular, cerrada y sin extremos. El ADNmt contiene un pequeo nmero de genes que codifican dos ARN ribosmicos, 22 ARN de transferencia y 13 protenas que participan en la fosforilacin oxidativa. Debido a algunas de las caractersticas particulares de este tipo de ADN, que se han expuesto con anterioridad, como la ausencia de recombinacin o la herencia por va materna, ha sido posible una reconstruccin de la historia evolutiva de nuestra especie. Al no recombinar, las diferencias existentes entre dos secuencias de ADNmt se debern nicamente a nuevas mutaciones. Estas modificaciones se irn acumulando con el paso del tiempo, dando lugar a secuencias cada vez ms diferentes que sern el reflejo de linajes cada vez ms alejados. El conjunto de mutaciones acumulado en una molcula de ADNmt es lo que se denomina haplotipo. Estos pueden relacionarse entre s mediante el uso de redes filogenticas, que permiten clasificarlos en un orden jerrquico, en funcin de las mutaciones compartidas. A un grupo de haplotipos que poseen mutaciones en comn, o mutaciones basales, se le denomina haplogrupo. Si se parte de la suposicin de que no existe retromutacin, se puede deducir que las mutaciones basales relacionan a los distintos linajes dndoles un origen comn. Adems, dada que la tasa de mutacin es conocida, se puede estimar el origen y el tiempo de las migraciones humanas.
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Esta clasificacin parece sencilla, pero existen varios factores que pueden complicar su realizacin. Entre estos encontramos la alta tasa de mutacin de la HVR (regin hipervariable), que puede hacer que las relaciones filogenticas se vean emborronadas como consecuencia de la retromutacin. Esto ocurre particularmente en ciertas zonas con tasas de mutacin particularmente altas, los llamados hotspots. Una posible solucin es la ampliacin de la regin estudiada, por ejemplo recurriendo a la secuenciacin completa del ADNmt, ya que fuera de la regin hipervariable, el nmero de retromutaciones y mutaciones recurrentes es mucho menor. Cuando se empez a analizar la variabilidad del ADNmt en distintas poblaciones, se encontr una diferencia bastante acuciada entre los linajes del frica subsahariana y los dems (Cann et al., 1987). A esto se una que uno de los haplogrupos ms antiguos apareca exclusivamente en frica, apoyando la teora del Out of Africa (OOA), que como ya se ha planteado, propone un origen reciente de los humanos anatmicamente modernos en el continente africano, desde donde se habran expandido. Esto implicara que todos los linajes actuales provendran de un ancestro comn africano, la Eva mitocondrial. Los estudios de este tipo han ido avanzando, permitiendo un refinamiento del rbol filogentico del ADNmt, que a su vez brinda la posibilidad de una clasificacin en haplogrupos y subhaplogrupos cada vez ms detallada (Torroni et al., 2006). Como resultado del estudio global de los haplogrupos del ADNmt, fue posible su adscripcin a regiones geogrficas especficas (Richards et al., 2000). Tres de estos haplogrupos, el L1, L2 y L3, aparecen en el frica subsahariana. Nueve, H, I, J, K, T, U, V, W, y X, comprenderan la mayora de los linajes europeos, norteafricano y caucsicos del sudeste asitico. Por ltimo, tendramos a los haplogrupos A, B, C, D, E, F, G, M y Q que se relacionaran con las poblaciones de Asia, Oceana y los nativos americanos. Como complemento de esto se encuentran los estudios sobre las edades de coalescencia de los grandes macrohaplogrupos. Se detect una primera expansin que partira de frica hace 59.000-69.000 aos aproximadamente. Por un lado se colonizara el oeste asitico y la India y, de manera independiente, seguira hacia el sur alcanzando el sudeste asitico. En un momento posterior, hace alrededor de 39.000-52.000 aos, la rama del oeste asitico se dispers de forma radial llevando linajes caucsicos al norte de frica y Europa, alcanzando la India y expandindose al norte y el este de Asia. Las migraciones ms
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recientes han desdibujado, aunque no las han eliminado completamente, las huellas de las expansiones primitivas del hombre moderno (Maca-Meyer, 2001). Las investigaciones sobre la poblacin canaria, se inician con el estudio preliminar de ADNmt que compar la poblacin de la isla de Tenerife con las poblaciones que se consideraron ms cercanas, tanto histrica como geogrficamente, la Pennsula Ibrica, el norte de frica y el frica subsahariana (Pinto et al., 1996a). En este trabajo se estim que la poblacin canaria estara conformada por una aportacin del 43% de linajes norteafricanos, un 36% de peninsulares y un 21% de subsaharianos. Estos resultados evidenciaban una diferencia importante con aquellos obtenidos del estudio de marcadores autosmicos, que estimaron una contribucin norteafricana de un 21%, peninsular de un 71% y subsahariana de un 8% (Pinto et al., 1994, Roberts, 1966). Una posible interpretacin de estos datos sera la existencia de una fuerte asimetra sexual, en la que los linajes maternos tendran, comparativamente, una mayor aportacin norteafricana y subsahariana. Con posterioridad se llev a cabo un anlisis del ADNmt de la poblacin canaria ms amplio, que inclua a individuos de todas las islas (Rando et al., 1999). Se hizo la secuenciacin de la HVR del ADNmt, estudindose tambin, varias posiciones diagnstico mediante RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) que refinaron la asignacin dentro de los haplogrupos. Adems de los esperados linajes tpicamente europeos, se encontr un subtipo del haplogrupo berber U6, el U6b1, que slo ha sido detectado en el archipilago, y que permite hacer una relacin directa entre la poblacin aborigen de las islas con el noroeste africano. De este haplogrupo se han realizado estudios detallados en los que se ha podido rastrear su filogeografa, partiendo de un proto U6 en el Prximo Oriente desde donde empezara un proceso de expansin y diversificacin, que incluira la aparicin de los subhaplogrupos canarios (Maca-Meyer et al., 2003). A pesar de ello, la estima de la aportacin norteafricana, con tan solo un 33%, fue inferior a la obtenida por Pinto y col. (1996a) siendo mayoritaria la contribucin europea con un 65%. Esta caracterizacin de los linajes maternos tambin contribuy a la explicacin del proceso de colonizacin del archipilago por parte de los aborgenes. Basndose en la composicin haplotpica de las diferentes islas, es posible establecer una correlacin negativa entre la heterocigosidad insular y la distancia al continente africano; lo que
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apuntara a una colonizacin con un nico evento migratorio de este a oeste, procedente del noroeste africano (Rando et al., 1999). 7.3.2. Linajes paternos: el cromosoma Y La contrapartida del ADNmt est representada por la regin no recombinante del cromosoma Y, que constituye el 95% de su longitud (Jobling and Tyler-Smith, 1995). Como consecuencia de su herencia por va paterna y de que no se produce recombinacin, esta regin se transmite, con la excepcin de las mutaciones acumuladas, de padres a hijos sin modificacin. Tiene dos diferencias fundamentales con el ADNmt; la primera es que es de mayor tamao, 60x10 pb en comparacin con las 16x10 pb del ADNmt, y la segunda es que aparece en un menor nmero de copias, una por clula en comparacin con las 3.000 copias aproximadas del ADNmt. Otra de las problemticas que presentan los estudios de la regin no recombinante del cromosoma Y, en comparacin con el ADNmt, es su baja tasa de mutacin, que es entre 5 y 10 veces menor que la de ste. Lo anterior no ha influido para que en la actualidad se hayan descrito ms de 600 SNPs asociados al cromosoma Y (Karafet et al., 2008). Adems, como consecuencia de su baja tasa de mutacin (Thomson et al., 2000), se producen una menor cantidad de retromutaciones y mutaciones recurrentes, lo que aumenta la certeza de que la presencia compartida de un mutacin defina a un grupo de cromosomas relacionados por descendencia, facilitando la construccin de los rboles filogenticos (Karafet et al., 2008, Underhill et al., 2001, Ellis et al., 2002) . Como contrapartida, esta baja tasa de mutacin representa un problema cuando se intenta una divisin en subhaplogrupos ms refinada. En este tipo de casos, se recurre al uso de marcadores de evolucin rpida como los microsatlites, que permiten identificar grupos monofilticos dentro de los haplogrupos (Cruciani et al., 2004, Semino et al., 2004) El uso de microsatlites tambin resulta necesario para determinar las edades de coalescencia de un determinado haplogrupo, ya que el nmero de variantes acumuladas dentro de un determinado linaje, est directamente relacionado con su edad (Jobling and Tyler-Smith, 2003).
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Los estudios basados en el cromosoma Y han demostrado, sobre todo recientemente, ser bastante eficaces a la hora de intentar dilucidar el origen, evolucin y dispersin de las poblaciones humanas. De la misma manera que ocurri con el ADNmt, se pudo determinar que la distribucin geogrfica global de los haplogrupos, era especfica a determinadas regiones, y que su filogenia apoyaba la teora del Adn Cromosmico Y, anlogo a la Eva mitocondrial, que habra vivido en frica hace un 90.000-130.000 aos (Underhill et al., 2000). En lo que respecta a su distribucin, los haplogrupos A y B estaran asociados al frica subsahariana; los haplogrupos E,J y T se distribuiran por frica, Oriente Medio y el sur de Europa; los haplogrupos R, G, I lo haran por el Oriente Medio, el Cucaso y el Mediterrneo. Por ltimo, los haplogrupos C, D, K, F, H, L, M, O, Q y S apareceran en Asia, Australia, Oceana y Amrica (Karafet et al., 2008, Underhill and Kivisild, 2007). En el caso de Canarias, los estudios del cromosoma Y se realizaron una vez determinada la composicin gentica de los linajes maternos. Para ello se analizaron 24 marcadores biallicos y 5 microsatlites del cromosoma Y en poblaciones de las siete islas (Flores et al., 2003), con el propsito de compararlas con aquellos del noroeste africano y la Pennsula Ibrica (Bosch et al., 2001, Flores, 2001, Flores et al., 2004, Hurles et al., 1999, Underhill et al., 2001). Los resultados mostraron que, al contrario de lo que suceda con el ADNmt, el pool gentico paterno tiene un origen mayoritariamente europeo (>90%), lo que vendra a confirmar una asimetra sexual, consecuencia de la colonizacin europea. Sin embargo, la presencia de linajes africanos como el E-M81 apunta a una pervivencia relativa de linajes aborgenes. Basndose en la distribucin y la edad de estos linajes africanos, se plante un proceso de colonizacin en dos fases, lo que coincidira con algunos de los resultados obtenidos mediante estudios antropolgicos, arqueolgicos y lingsticos (Navarro-Mederos, 1997, Springer, 2001), aunque sera contradictorio con el nico evento migratorio detectado para el ADNmt (Rando et al., 1999). Estudios similares se han realizado en las islas atlnticas portuguesas, Madeira y Azores, lo que permite una comparacin con unas situaciones histrico-geogrficas similares (Goncalves et al., 2005).
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7.4. Los marcadores autosmicos: el sistema CD4/Alu. Este tipo de marcadores son fundamentales si se pretender obtener una visin conjunta de la evolucin de las poblaciones, ya que son un complemento necesario a los linajes exclusivamente maternos o paternos. Entre los marcadores autosmicos usados en los estudios poblacionales, el sistema de haplotipos CD4/Alu es bastante utilizado ya que es una herramienta efectiva si se pretende trazar el origen y la expansin del hombre moderno (Tishkoff et al., 1996), as como estimar la mezcla entre poblaciones (Destro-Bisol et al., 1999). Este sistema est conformado por dos loci asociados, un locus biallico cuyo estado ancestral es la prdida parcial de un elemento Alu y una repeticin en tndem de un pentanucletido (5 TTTTC 3). En un primer momento se aplic este sistema a las poblaciones parentales de Canarias (Pennsula Ibrica, noroeste africano y frica subsahariana) (Flores et al., 2000). A continuacin se utiliz este mismo marcador para caracterizar a las poblaciones de las islas, para poder realizar una comparacin. Aunque la distribucin de los haplotipos CD4/Alu en Canarias no present una diferencia marcada con la de la Pennsula Ibrica, si se obtuvieron algunos resultados que apuntan a una influencia norteafricana (Flores et al., 2001). Entre estos resultados estara la presencia del haplotipo 110(-), que se relaciona directamente con el noroeste africano, y que apareci en la mayora de las islas con una distribucin que, en algunas de ellas, no se diferenciaba significativamente de las del noroeste africano. Asimismo, se pudo determinar una correlacin inversa entre la heterocigosidad haplotpica de las islas y su distancia con la costa africana, lo que apoyara los resultados obtenidos en el estudio de los linajes mitocondriales (Rando et al., 1999). Tambin se han realizado estudios en las siete islas sobre diez inserciones autosmicas Alu. stas se encuentran dispersas a lo largo del genoma humano, se dan como eventos nicos en nuestra evolucin y son aparentemente neutrales en la seleccin natural (Maca-Meyer et al., 2004b). En estas investigaciones se han detectado alelos especficos de la Pennsula Ibrica y del noroeste de frica. La contribucin ibrica se situara entre el 62 y el 78%, la norteafricana entre el 23 y el 38% y la del frica
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subsahariana alrededor del 3%, lo que sigue sugiriendo un legado aborigen y esclavo en la poblacin actual del archipilago. 7.5. Estudios de ADN antiguo en Canarias. Los estudios de ADN en muestras antiguas presentan gran inters, tanto en el rea de gentica de poblaciones, como en la de los estudios histricos. Para la primera representan una va de confirmar los resultados obtenidos en los estudios con la poblacin actual. Para los segundos pueden representar informacin fundamental en el camino de reconstruccin de los modos de vida de las poblaciones del pasado. Uno de los primeros estudios que se realizaron sobre muestras antiguas fueron los que se hicieron con los restos provenientes de la excavacin de la Iglesia de La Concepcin, en Santa Cruz de Tenerife. Debido a la necesidad de realizar algunas reparaciones arquitectnicas en el edificio, se realiz una excavacin arqueolgica que permiti el acceso a restos pertenecientes a la poblacin del siglo XVIII de esta ciudad. En esos momentos, la colonizacin europea del Nuevo mundo se hallaba en su auge, y Santa Cruz era uno de los puertos ms importantes para la relacin entre las Islas Canarias y el continente americano. El anlisis de la composicin gentica de esta poblacin, as como su comparacin con la poblacin actual, resulta vital para entender la magnitud del impacto de las poblaciones europeas y africanas sobre el sustrato aborigen del archipilago, adems de desvelar relaciones con Amrica no detectadas con anterioridad (Maca-Meyer, 2005). En este caso se procedi al estudio de la secuencia de la regin hipervariable I (HVRI) del ADN mitocondrial y de RFLPs (Region Fragment Length Polymorphisms) diagnsticos. Se estudiaron 208 dientes provenientes de 33 fosas y 5 dientes de la Ermita de San Blas, a 15 Km de Santa Cruz. El 37% de las secuencias pertenecan al grupo H, el 1,56% eran de origen americano, el 15,63% eran de haplogrupos africanos. El subgrupo U6a, de asignacin norteafricana se encontr en una frecuencia del 1,56%, mientras que el U6b1, el subgrupo especfico canario se hall en el 8,59% de los casos. Se concluy que la contribucin por va materna a la poblacin canaria de esta poca sera de un 50% norteafricana, 40% Europea y un 10% subsahariana (Maca-Meyer, 2005). Tambin se hizo el anlisis del gen de la amelogenina, del que se hablar ms adelante, para determinar el sexo gentico de los individuos (Arnay de la Rosa, 2009, Maca-Meyer,
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2005). Sobre estos restos tambin se realiz un estudio que pretenda estudiar la evolucin de las frecuencias allicas del sistema ABO y su relacin con el impacto de la colonizacin europea. Este estudio confirmara la historia demogrfica de las islas propuesta por estudios previos desde la arqueologa y la antropologa. En este estudio las frecuencias allicas relacionan claramente a los aborgenes canarios con las poblaciones berberes del norte de frica (Fregel, 2009). En lo que respecta a los estudios sobre restos aborgenes, habra que destacar el realizado por Maca-Meyer y col. (2004a), en el que se detectaron los linajes U6 en una proporcin mayor a los presentados por la poblacin canaria actual. Sin embargo, al no encontrarse correspondencias exactas de los linajes U6b1 en el norte de frica, no ha sido posible establecer el origen exacto de los colonizadores prehispnicos. Otro ejemplo de estudios sobre muestras antiguas en el archipilago, sera el realizado sobre material aborigen de la isla de La Palma (Fregel et al., 2009b). En este se analizaron 38 dientes provenientes de contextos aborgenes. Se obtuvieron secuencias informativas de 30 individuos (78,9%). El 93% de los linajes eran originarios del oeste de Eurasia, y el 7% restantes tenan una adscripcin del frica subsahariana. La gran mayora de los haplotipos (70%) tenan sus correspondientes en el norte de frica. Sin embargo, el subtipo U6b1, sigue sin encontrarse en el norte de frica, a pesar de ser la cuna de expansin del linaje U6. El grupo H1 result ser el ms abundante en La Palma, estando definido por la transicin 16260, aunque es bastante raro en el norte del continente africano. Esto se interpreta como que la regin exacta de donde provienen los ancestros de los aborgenes canarios no ha sido estudiada an, o las poblaciones han sido remplazadas por migraciones humanas posteriores. La gran diversidad gentica encontrada en La Palma (alrededor del 95%), se encuentra en unos niveles similares a los de Tenerife, a pesar de encontrarse ms alejada del continente. Este descubrimiento ira en contra de la suposicin que se ha hecho sobre una colonizacin desde el continente de isla en isla con un posterior aislamiento. Por otra parte, la gran similitud entre la poblacin aborigen de La Palma y de Tenerife tambin ira en contra la idea de una colonizacin martima independiente de cada una de las islas sin un contacto posterior entre ellas. Los resultados de este estudio encajaran mejor dentro de un modelo de migracin frecuente entre las islas.
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Sobre el cromosoma Y tambin se han realizado investigaciones con restos aborgenes y de la Edad Moderna. En stas se consigui entender mejor la manera como la colonizacin europea afect el pool gentico femenino y masculino de los aborgenes, desde el momento de la conquista hasta la actualidad. Se concluy que la presencia de linajes autctonos del norte de frica, como el E-M81, as como algunos marcadores abundantes en esta regin (E-M78 y J-M267) en las poblaciones aborgenes, apunta a que ste sea el lugar de origen ms probable para estos grupos. En comparacin con las poblaciones aborgenes, la muestra histrica del siglo XVIII muestra una disminucin de las frecuencias de los haplogrupos norteafricanos y un aumento de los europeos. Estos estudios tambin ayudaran a demostrar una evolucin sexual asimtrica en las poblaciones ms recientes, lo que podra explicarse como resultado de una discriminacin negativa hacia los hombres aborgenes en el momento de la reproduccin en favor de los hombres europeos (Fregel et al., 2009a). Por ltimo, hay que mencionar los diversos casos en los que se han utilizado los estudios de ADN antiguo para la determinacin gentica del sexo en restos aborgenes (Arnay-De-La-Rosa et al., 2009, Arnay-De-La-Rosa et al., 2007). Sin embargo, estos estudios sern explicados en detalle en otros apartados.
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8. Mtodos para determinar el sexo gentico en restos humanos 8.1. La amelogenina El uso de la biologa molecular para determinar el sexo de individuos provenientes del registro arqueolgico, ha significado un avance importante en el anlisis de restos infantiles, as como de adultos cuyos esqueletos se encuentran bastante incompletos (Schmidt et al., 2003). Para la determinacin molecular del sexo se ha ido imponiendo el uso del gen de la amelogenina (Nakahori et al., 1991a, Nakahori et al., 1991b), que codifica una de las protenas fundamentales en el desarrollo de los brotes dentales, y que exhibe un dimorfismo de longitud entre el cromosoma X y el cromosoma Y (106 y 112 pb). Si comparamos el gen de la amelogenina con los loci especficos del cromosoma Y que se usaron en los intentos iniciales para determinar el sexo (Hummel and Herrmann, 1991), la gran ventaja de la amelogenina radica en que al estar presente en los dos cromosomas sexuales, acta como un control positivo interno (Maca-Meyer, 2002). El alelo del cromosoma Y contiene algunas variaciones en su primer intrn, incluyendo una delecin de 189 pb (Nakahori et al., 1991b). El problema de utilizar esta diferencia para asignar el sexo es que implicara la amplificacin de un fragmento demasiado grande para lo que se espera obtener de una muestra de ADN antiguo. Es por eso que se est utilizando una regin en la que existe una delecin de 6 pb en el intrn 1 del gen homlogo en el cromosoma X, regin en la que se centra tambin Maca-Meyer (2002). Para ello se usaron unos primers publicados por Sullivan y col (1993).que dan productos de amplificacin de 106 y 112 pb para los cromosomas X e Y, respectivamente. Estos son: Amel-A 5 CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG 3 Amel-B 5 ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 3 Sin embargo, al tener una experiencia negativa con estos primers, Maca-Mayer plantea mantener el primer Amel-A y disear un tercer primer de tal forma que el producto de la amplificacin fuera ms pequeo (60 y 66 pb para los cromosomas X e Y respectivamente). La secuencia sera: Amel-C 5 AATRYGGACCACTTGAGAAAC 3 Donde R=A/G, Y=C/T
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En los primeros momentos de aplicacin de esta tcnica, fueron necesarios algunos estudios sobre la fiabilidad del mismo. Lo que se sola hacer era utilizar una poblacin bien caracterizada antropolgicamente, es decir con el sexo de los individuos bien determinado. Luego se realizaban los anlisis genticos a ciegas, para poder comparar ambos resultados. ste sera el caso del estudio realizado por Matheson y Loy con restos de crneos humanos de unos 9400 aos de antigedad, provenientes de Turqua (2001). En este caso se demostr que el gen de la amelogenina al tener fragmentos bastante grandes podra presentar problemas de amplificacin. Aqu, en lugar de intentar utilizar fragmentos del gen ms pequeo, como lo hace Maca-Meyer (2002), se propone la alternativa del uso del mtodo de repeticiones alfoides de los cromosomas X e Y. Podemos encontrar mltiples ejemplos de la utilizacin de este gen para la determinacin del sexo gentico. Entre ellos estara el estudio hecho por Faerman (1995), en el que analiza esqueletos neolticos provenientes de Israel. De este estudio es necesario resaltar la importancia que se da al anlisis de distintas concentraciones de ADN, ya que debido a la degradacin y a los inhibidores, si hay demasiado o muy poco el resultado de la amplificacin puede verse seriamente afectado. Aqu tambin se resalta la utilidad de la biologa molecular para sexar individuos infantiles, o aquellos cuyos restos se encuentren fragmentados de tal forma que los mtodos antropolgicos tradicionales sean insuficientes. Una ltima cuestin a destacar es que, en este caso, el gen del cromosoma Y produjo mejores resultados que el del cromosoma X, lo que es de gran utilidad. En los casos en los que slo amplifica el Y se puede afirmar que es un individuo masculino, pero adems en los que slo se amplifica el gen del cromosoma X tambin se puede asegurar que es una mujer, porque los resultados no seran consecuencia de una amplificacin preferencial de este gen sobre el del cromosoma Y. En este caso, adems, se utilizan tres primers diferentes en lugar de dos, como ocurre en otros estudios, uno comn y dos que son alelo-especficos. Esto permite realizar una identificacin de los dos cromosomas sin ambigedad porque, a diferencia de los estudios en los que se utilizan slo dos primers, y en los que un individuo con la banda de hembra podra ser un macho con poca cantidad de ADN, los primers alelo-especficos generan amplificaciones independientes.
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Este tipo de estudios tambin se suelen complementar con el anlisis de otras cuestiones. Este sera el caso de los anlisis realizados por Cipollaro y col. (1998), sobre restos del yacimiento arqueolgico de Pompeya, en el que utiliza el gen de la amelogenina para comprobar la relacin entre los buenos resultados de los anlisis histolgicos, y la posibilidad de recuperar ADN de muestras antiguas. En este caso la amplificacin de la amelogenina no slo resuelve un problema antropolgico e histrico, sino tambin la posible conservacin de macromolculas en yacimientos conformados como consecuencia de un determinado tipo de erupciones volcnicas. La determinacin del sexo utilizando el gen de la amelogenina tambin ha representado un gran avance para la antropologa fsica como lo evidencian Arnay y col. (2007). En un estudio con restos aborgenes de la isla de Gran Canaria se compararon los resultados obtenidos mediante el anlisis de la amelogenina, con aquellos producidos utilizando funciones discriminantes de la mandbula. El objetivo era afinar la precisin de estas medidas, para el caso de una poblacin especfica. ste sera un claro ejemplo de la manera como la biologa molecular puede contribuir a la contrastacin de hiptesis fundamentales dentro de los estudios de restos humanos. Tambin se demuestra, una vez ms, que mtodos como las funciones discriminantes deben ser usados con gran cautela, al estar su efectividad fuertemente condicionada por las caractersticas de cada poblacin. La misma metodologa con ligeras variaciones se ha mantenido vigente y ha sido aplicada en investigaciones recientes sobre restos aborgenes de la isla de la Gomera, para intentar ver una posible relacin entre el sexo de los individuos y los patrones dietticos de los mismos, aunque en principio parece no haber una diferencia notable (Arnay-De-LaRosa et al., 2009). En los ltimos aos se han ido mejorando las tcnicas para la identificacin del sexo en especmenes antiguos, aunque la fundamentacin terica sigue siendo la misma. Schmidt (2003), por ejemplo, present un mtodo de PCR multiplex que supone una mejora en este tipo de anlisis. En l, se coamplifica la amelogenina, dos STRs del cromosoma X (DXS6789 y DXS9898) y dos STRs especficos del cromosoma Y (DYS391 y DYS392). Esta coamplificacin aumenta de manera considerable la validez de los resultados al obtener diferentes datos que los confirmen de manera simultnea. Estos nuevos planteamientos se producen, al menos en parte, para contrarrestar un posible sesgo hacia la identificacin de individuos como femeninos, como consecuencia de la
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prdida de alelos que impidan la amplificacin de la secuencia de la amelogenina en el cromosoma Y (Santos et al., 1998). Esta tcnica viene del mundo forense, siendo muy apropiada para muestras muy degradadas, ya que la longitud de los productos amplificados est entre 91 y 116 pb, con los primers que propone Schmidt (2003). La tcnica fue probada en material seo de una caverna de la Edad del Bronce de Liechtenstein, con unos 3.000 aos de antigedad. Otra de las ventajas de los marcadores utilizados es que los loci se encuentran cerca del centrmero de los cromosomas, lo que hace que su degradacin sea menos rpida, ya que esta comienza por el final de los telmeros. Adems los marcadores del cromosoma X utilizados tienen altas tasas de heterocigocis, por lo que en muchos de los casos en los individuos femeninos se ven dos alelos, lo que confirma su asignacin. Como complemento a la determinacin del sexo, Schmidt (2003) tambin propone la utilizacin de estos marcadores para determinar el parentesco, ya que son STRs con una estructura similar a la de los STRs autosmicos. Adems, los STRs del cromosoma Y se heredan como los haplotipos y algunos STRs del cromosoma X de una manera similar que permite usarlos en estudios de parentesco amplio. Las nuevas tcnicas para la visualizacin de los resultados tambin han entrado en los estudios sobre el gen de la amelogenina. As Zoledziewska y col. (2003) utilizan la hibridacin con oligonucletidos marcados con uorescencia y la electroforesis capilar para realizar un estudio sobre restos seos de diversa antigedad, desde 1 ao hasta el Neoltico, pasando por la Edad del Bronce. En este caso tambin se utilizan fragmentos ms cortos para aumentar la sensibilidad en el caso de muestras muy degradas. Una vez ms esto puede ser contraproducente porque tambin se aumentan las posibilidades de contaminacin, lo que hace necesario un control muy estricto para poder validar los resultados. La pirosecuenciacin, un mtodo de secuenciacin relativamente nuevo, basado
en una reaccin enzimtica quimicoluminiscente, tambin ha sido utilizada en estudios ms recientes sobre este gen. Este mtodo se fundamenta en la deteccin luminomtrica de los pirofosfatos liberados durante la incorporacin de nucletidos, en donde cada seal luminosa es proporcional al nmero de nucletidos incorporados. En este caso se utilizaron primers que anquean una insercin de 3 pares de bases (GAT) en el cromosoma Y, colocada en la posicin 1499-1501 del nucletido en el gen humano de la
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amelogenina. La posicin respectiva del cromosoma X es la 1680 (Tschentscher et al., 2008). En este caso se hicieron pruebas en muestras que, debido a la degradacin, no haban dado resultados en ensayos anteriores usando mtodos convencionales. Sin embargo, utilizando la pirosecuenciacin, gran parte de ellas produjeron resultados positivos. La escasa longitud de los fragmentos amplicados se muestra como una gran ventaja, y puede resultar de gran ayuda en muestras degradadas como las de ADN antiguo. Los mtodos para la determinacin del sexo gentico se han ido puliendo,
subsanando algunos de los problemas de las primeras investigaciones. Este es el caso del trabajo presentado por Codina (2009), en el que se propone una PCR multiplex para determinar el sexo de muestras degradadas; aunque se centra en muestras forenses esta metodologa podra ser aplicada a restos antiguos, por la similares caractersticas que ya se han comentado. La propuesta consiste en la co-amplicacin de dos regiones diferentes del gen de la amelogenina (55/58 y 106/112 bp para los alelos AMELX/AMELY respectivamente), una ampliacin de 93 pares de bases del gen SRY y cuatro loci mini XSTR (DXS7424, DXS8378, DXS6803 and GATA 172D05 (cuyos productos de amplicacin mximos no superan las 140 pares de bases)). La eleccin de estos marcadores tiene como criterios: el pequeo tamao de los amplicones, altos niveles de heterocigocis, una distribucin equilibrada de frecuencias, as como un alto polimorsmo. Estas condiciones fueron probadas para su nivel de sensibilidad, midiendo su especicidad con el ADN humano y su comportamiento en casos con mezclas de ADN, obtenindose resultados positivos. Este replanteamiento se da porque se ha visto que pueden producirse resultados errneos cuando se da una mutacin en el sitio de ligamiento de los primers, tanto en el gen AMELX como en el AMELY; adems se suele tener ms problemas para amplicar el AMELY lo que puede dar como resultado falsos femeninos (Codina et al., 2009).
En uno de los estudios ms recientes publicados sobre restos antiguos, Gibbon
(2009) nos muestra una de las ltimas propuestas para estudiar la amelogenina. En este caso se complementan dos sistemas de identicacin. El primero se basa en el anlisis de la secuencia de 10 SNPs especficos a cada sexo, para ver si ambos cromosomas estaban representados (en los varones) o slo el X (en las hembras). El segundo utiliza un indel de 6 pares de bases. En este caso se utiliz la estacin automatizada de
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electroforesis Experion (Bio-Rad), que utiliza una tecnologa de micro-separacin de fluidos, que transporta volmenes muy pequeos de lquidos, lo que permite una separacin y deteccin rpida de las muestras. El uso de esta tecnologa tiene como ventaja, no slo la poca cantidad de muestra que debe cargarse (1l), sino tambin su alto nivel de sensibilidad, con lo que se pueden detectar muestras que seran invisibles con otros mtodos. En este caso se utilizaron los materiales de la coleccin de esqueletos humanos de Raymond Dart que, en su gran mayora provienen de hallazgos fortuitos en las cercanas de Johannesburgo, no siendo producto de excavaciones arqueolgicas. La combinacin de ambos mtodos produjo resultados positivos en un 46,66% de los especmenes, un porcentaje muy aceptable dentro de los estudios de ADN antiguo (Gibbon et al., 2009). 8.2 El cromosoma Y para confirmar el sexo Los estudios sobre genes especficos del cromosoma Y tambin pueden ser utilizados para determinar el sexo gentico, incluso cuando ste no sea el objetivo principal de una investigacin. Este tipo de estudios se fundamentan en que estos marcadores slo sern amplificados en individuos masculinos. El problema es que su ausencia no necesariamente implica que estemos frente a un individuo femenino, ya que sta puede ser tambin consecuencia de la degradacin del ADN o la inhibicin, que impidan la amplificacin de determinados fragmentos. Uno de los primeros estudios de este tipo es el presentado por Hummel y Herrmann (1991), en el que se hizo un estudio sobre restos que ya haban sido identificados como varones, segn sus rasgos mtricos y morfolgicos. Algunos pertenecen a los siglos XVII y XVIII y otros a la Edad Media, y provienen de distintos enterramientos en Alemania. Los primers utilizados en este caso amplificaran un fragmento de 154 pb inscrito dentro de una secuencia de repeticin especfica del cromosoma Y de 3.4- kb. Los amplicones seran luego sometidos a un proceso de digestin con la enzima Eco RI dando como resultado 2 fragmentos, uno de 102 pb y otro de 52 pb.
Los estudios del cromosoma Y sirven adems para establecer relaciones de
parentesco entre individuos masculinos. Tal es el caso del estudio de Gerstenberger y col. (1999), en el que se estudian ocho individuos provenientes de un enterramiento de la familia de los Condes de Knigseld, utilizado entre 1546 y 1749, y que segn la
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documentacin fue utilizado slo para enterrar varones. Sin embargo, los estudios morfolgicos as como los ajuares de algunos de los esqueletos llevaron a dudar sobre el sexo de los mismos. Teniendo en cuenta las caractersticas de la muestra se realizaron, combinados con el anlisis de la amelogenina, estudios de STRs autosmicos y de marcadores especcos del cromosoma Y, que conrmaran no slo las relaciones de parentesco sino tambin el sexo de los individuos, ya que al ser tan polimrcos y cortos como su contrapartida autosmica son igualmente adecuados en los estudios de ADN antiguo. Se utilizaron los loci DYS19, DYS390, DYS389I/II en una amplicacin de cuadruplex, y los primers fueron modicados para que los productos no superaran las 94 pb. Finalmente se clasicaron dos individuos como femeninos y el resto como masculinos. Dentro de los estudios de cromosoma Y, tambin se han utilizado SNPs (Single
Nucleotide Polymorphisms). Tal es el caso de las investigaciones presentadas por Bouakaze y col. (2007), en las que un grupo de 13 SNPs del cromosoma Y, fueron utilizados para identicar los haplogrupos del cromosoma Y ms frecuentes en Asia, aunque como ya mencionamos un resultado paralelo es la conrmacin del sexo de los individuos estudiados. El anlisis se hizo mediante la co-amplicacin de 13 fragmentos dentro de dos PCR de multiplex, que fueron luego detectados con una reaccin de minisecuenciacin utilizando el SNaPshot Multiplex Kit y la electroforesis capilar. Se analizaron 11 muestras antiguas provenientes del sur de Siberia y con unas dataciones de entre 5.500 y 1.800 aos BP. La importancia de este estudio es que permite demostrar la aplicacin y la utilidad de los SNPs en muestras degradadas. En este caso los primers tambin fueron rediseados para que los amplicones se encontraran entre las 81 y las 155 pb. Una vez ms vemos que la longitud de los productos de amplicacin es un elemento fundamental cuando se trabaja con muestras degradadas. Adems se tuvo en consideracin que la diferencia entre unos amplicones y otros fuera la suciente para no generar confusiones durante la electroforesis capilar. Tambin hubo que realizar una adaptacin respecto a los primeros intentos realizados con ADN moderno. En lugar de una sola reaccin con los 13 marcadores, se tuvo de disear una de 6 y otra de 7 marcadores por amplicacin, lo que los autores argumentan es consecuencia de las particularidades del ADN antiguo. De 11 muestras analizadas se obtuvieron resultados positivos en 9, lo que implica un alto grado de eciencia de este mtodo (Bouakaze et al., 2007).
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8.3. El papel de los SNPs y las inserciones Alu Los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), son mutaciones que afectan a un
nico nucletido. Aunque no presentan la hipervariabilidad caracterstica de los microsatelites, representan una fuente casi inagotable de marcadores repartidos por todo el genoma. Hay una estimacin de un SNP por cada 1300 pares de bases y hasta el momento se han identicado ms de un milln de SNPs dentro del proyecto del genoma humano; adems son adaptables a genotipacin automatizada a gran escala, mediante el uso de tcnicas basadas en, por ejemplo, la hibridacin de oligonucleotidos, la extensin de primers y la pirosecuenciacin. Uno de las aplicaciones recientes ms prominentes de los SNPs son los estudios basados en el cromosoma Y. Estos suelen producirse dentro de estudios de evolucin, pero como ya se ha mencionado, resultan igualmente tiles para la conrmacin del sexo gentico de los individuos (Hellborg and Ellegren, 2003). Tambin se han realizado algunos estudios sobre los SNPs propios del cromosoma X que seran complementarios a los primeros, y que podran actuar como control interno, en la determinacin del sexo, al conrmar que los resultados negativos para los marcadores del cromosoma Y no son consecuencia de la degradacin general de la muestra (Vasques and Pereira, 2001).
La principal ventaja para los estudios de ADN antiguo se encuentra en la longitud
de la regin de ADN que se estudia. De hecho, siendo la secuencia necesaria mucho mas corta, los perles de SNPs pueden tener una gran aplicacin en estudios donde slo se dispone de muestras pequeas y degradadas. Adems, se ha demostrado que un grupo relativamente pequeo, de aproximadamente 50 loci sera comparable con los multiplex de STRs existentes (Petkovski et al., 2003).
A pesar de su utilizacin relativamente reciente, los SNPs han ido cobrando fuerza
rpidamente. Adems en su estudio se han ido aplicando las tcnicas ms novedosas del campo de la biologa molecular. Un ejemplo de este es el estudio publicado por Vallone (2004), en el que se construyeron nuevas extensiones de primers multiplex especcas de determinados alelos (ASPE), adems se utilizaron nuevos kits comerciales de hibridacin especca de alelos (ASH) para examinar 50 marcadores Y-SNP. Entre estas dos tcnicas haba un solapamiento de 10 loci lo que permitira comprobar la concordancia entre los
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resultados de los dos mtodos. En el caso del cromosoma Y se han caracterizado alrededor de 600 SNPs en la regin no recombinante de ste (Karafet et al., 2008). En este caso se utilizaron los SNPs para hacer una clasicacin en haplogrupos, pero es necesario insistir en su utilidad complementaria como conrmacin del sexo. Como ya se he mencionado en apartados anteriores uno de los posibles problemas
en la aplicacin del mtodo de la amelogenina es la posible delecin en el gen AMGY que impida su amplicacin y que de como resultado un falso femenino. Como lo explica Cadenas y col. (2007) parece haber una relacin entre estas deleciones y determinados haplogrupos, proviniendo de unos linajes paternos determinados. Como solucin a este problema se propone la utilizacin del conocimiento actual de los SNPs del cromosoma Y, para complementar y contrastar los resultados de los estudios ms tradicionales como el de la amelogenina. Otra propuesta para el problema de las deleciones viene del campo de las
investigaciones forenses. Njoroge y col. (2010), plantean la utilidad de las inserciones Alu. Los elementos Alu son secuencias repetitivas de ADN, que constituyen una clase nica de marcadores moleculares que han atrado la atencin en los ltimos aos como consecuencia de su abundancia en el genoma humano, lo que permite obtener resultados de PCRs incluso con pequeas cantidades de ADN. Son secuencias dimricas de ADN de aproximadamente 330 pb de longitud y son derivadas del gen de ARN 7SL. Este tipo de inserciones polimrcas se han utilizado en estudios poblacionales, en determinaciones de paternidad y en aplicaciones forenses. En particular, estos elementos pueden usarse para la determinacin del sexo as como para determinaciones tnicas, ambos elementos no siempre sencillos utilizando nicamente STRs. En este caso se utiliz la electroforesis basada en micro-chips, sobre todo por sus separaciones muy rpidas, adems de su potencial para procesar muestras en paralelo, y la posibilidad de automatizar el proceso, aunque su funcionamiento se basa en los mismos principios de la electroforesis tradicional. En este caso se utilizaron los loci AluSTXa y AluSTYa, para la determinacin del sexo. La seleccin de las inserciones est condicionada porque la regin homologa en el cromosoma X e Y no puede ser un loci polimrco, que es lo que permite usar el tamao del amplicon como criterio para diferenciar los femeninos de los masculinos, tambin es importante asegurarse de que no hay interferencias con determinaciones tnicas. Las pruebas de este mtodo se realizaron mezclando una cantidad determinada
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de ADN masculino, con diferentes concentraciones de ADN femenino, lo que tambin muestra la utilidad de la metodologa en el caso de mezclas, porque los resultados mantenan el ratio entre X e Y correspondiente a la mezcla de ambos tipos de ADN. En principio esto puede no ser de gran trascendencia en los estudios de ADN antiguo, pero si lo es en casos forenses. Otra de las ventajas de este tipo de inserciones es que al ser especcas de los primates no se amplica ADN de otras especies (Njoroge et al., 2010).
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9. Importancia histrica de los estudios genticos para la determinacin del sexo Una vez explicadas las cuestiones metodolgicas relativas a la determinacin del
sexo en restos antiguos, se hace necesario entender la gran trascendencia que este tipo de estudios pueden tener en la bsqueda de comprensin de los diversos procesos histricos. Quizs una manera ms clara de explicar esta cuestin sea por medio de ejemplos. Por ello a continuacin se presentarn algunos casos de aplicaciones histricas de los estudios genticos, en especial aquellos relacionados con la determinacin del sexo. En algunos casos, la gentica ayuda a conrmar hiptesis planteadas, pero en otros presenta unos resultados contradictorios con las explicaciones de determinados fenmenos, por lo que se hace imprescindible replantear diversas cuestiones, enriqueciendo as las interpretaciones histricas, herramienta fundamental para entender determinados aspectos de las sociedades del pasado. El primer ejemplo que se plantea es el estudio que se hizo sobre unos restos
infantiles de poca romana. El conocimiento del gnero de los nios encontrados en diferentes contextos arqueolgicos tiene implicaciones, no slo porque puede relacionarse con el tipo de enterramiento, sino tambin porque puede establecerse un posible rol del gnero en relacin con cuestiones de sacricios infantiles o infanticidio. En este caso se trata de ms de 100 neonatos encontrados durante las excavaciones arqueolgicas del yacimiento de Ashkelon, con una antigedad de ms de cinco mil aos; los restos seran de poca romana, ya que el yacimiento fue colonizado por este pueblo en el siglo I d.C. . Los restos fueron encontrados debajo de una casa de baos, construida en el siglo IV d.C. y utilizada hasta el siglo VI d.C. Los restos infantiles se hallaban en las caeras de una cloaca junto con restos de animales, trozos de cermica y algunas monedas aisladas; no se observaron signos de un enterramiento cuidadoso o de algn tipo de ajuar. Este sistema casual de desecho de los restos, contrasta con las cuidadas jarras de enterramientos infantiles pertenecientes al mismo periodo, encontrados a corta distancia. A partir del tamao de los huesos y del desarrollo dental se ha determinado que todos eran neonatos, con entre uno y dos das de vida. La combinacin de una muerte tan temprana en una cantidad tan grande de nios y la manera en que fueron depositados, plantea la posibilidad de infanticidio, ms que la de muerte por causas naturales. Ninguno
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de los esqueletos mostraba malformaciones, plantendose entonces que seran otros factores, como el gnero, los motivos para el infanticidio (Faerman et al., 1998).
El ADN para el estudio se extrajo de polvo de hueso, obtenido de 43 fmures
izquierdos, para evitar analizar al mismo individuo dos veces. Se utiliz el procedimiento de extraccin de puricacin con chelex, as como el mtodo basado en la slica. La determinacin del sexo se hizo utilizando alelos de la amelogenina en el cromosoma X e Y. La amplicacin fue exitosa en 19 de los 43 especmenes estudiados. Catorce seran varones y cinco hembras, dando como resultado una frecuencia signicativamente ms alta de nios que de nias (P<0.05). La razn inicial para decidir que los individuos analizados eran vctimas de infanticidio, era la falta de nios de ms de dos das de edad as como su deposicin casual en la cloaca. Si este sitio hubiera servido como lugar de depsito de nios que hubieran fallecido de muerte natural pero que fueran considerados tan poco importantes o demasiado jvenes para ser merecedores de ritos funerarios completos, se podra esperar encontrar individuos que por lo menos alcanzaran los tres meses de edad. Esta idea se ve complementada por una variedad de fuentes escritas que hablan sobre el tema. Lo que sorprende a Faerman y col. (1998), es que la mayora de estudios concuerdan en que en esta poca era mucho ms comn el infanticidio femenino que el masculino, por lo que los resultados obtenidos iran en contra de la idea inicial de que la mayora de los restos perteneceran a nias. Existen varias referencias a la utilizacin de los baos, como el excavados en este caso y que probablemente fueran privados, como burdeles. Adems en este caso parecen estar situados en lo que los autores denominan el barrio rojo de Ashkelon, por lo que su doble propsito parece conrmado. Todo lo anterior los lleva a concluir que probablemente los individuos infantiles sean hijos no deseados de las cortesanas que servan en estos baos. Esta explicacin no slo conrmara el uso de este tipo de establecimientos como burdeles sino que, a su vez, explicara la predominancia de individuos infantiles masculinos. A pesar de que ambos sexos eran reclutados para trabajar como prostitutos en el mundo bisexual romano, las hembras tendran mayor demanda. Por eso proponen que las prostitutas de Ashkelon se quedaran selectivamente con algunos de sus hijos ilegtimos, la mayora nias, para continuar con la profesin y que descartaran a otros (Faerman et al., 1998).
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Existe un estudio similar a ste realizado en el Reino Unido (Mays and Faerman,
2001), cuyo objetivo inicial era conrmar la hiptesis sobre el infanticidio femenino, que se basaba en las fuentes y en la diferencia de enterramientos femeninos y masculinos adultos. Datos combinados de unos 2400 enterramientos adultos revelaban una proporcin de 1.46:1 a favor de los varones. Sin embargo, una vez ms los resultados no fueron los esperados por lo que se hizo necesario un replanteamiento de las interpretaciones dadas. En el registro arqueolgico se ha identicado el infanticidio cuando se observa un pico importante en los individuos muertos muy cerca del nal del periodo de gestacin, ya que si las muertes se debieran exclusivamente a causas naturales, las edades de los individuos seran ms variadas sin picos tan signicativos alrededor del nacimiento. En el caso de Gran Bretaa se dan estos picos durante la poca romana, pero la curva de la edad de la muerte se dispersa en la poca medieval, por lo que se plantea el infanticidio como explicacin a este cambio en la distribucin. Los restos que se utilizaron provenan de dos enterramientos romano-britnicos,
Ancaster, Lincolnshire y Thistleton, Rutland. Los dos forman parte de un conjunto de yacimientos que han sido estudiados y en los cuales la distribucin de la edad de muerte sugiere infanticidio. Se obtuvieron huesos de 31 individuos, 12 de Ancaster y 18 de Thistleton, a los que en primera instancia se les midieron los huesos largos para estimar la edad de la muerte. En este caso el estudio se hizo tambin mediante la amplicacin de los alelos de la amelogenina en el cromosoma X y del Y. De los 31 individuos estudiados se obtuvieron resultados para 13, seis de Ancaster y siete de Thistleton, de los cuales nueve especmenes fueron identicados como varones y cuatro como hembras. Cabe resaltar que se detecto una preferencia para la amplicacin del alelo del cromosoma Y, por lo que se hizo necesario usar otros primers, que amplicaran fragmentos ms pequeos, para que no se diera un sesgo hacia los individuos masculinos y se pudiera amplicar el alelo X, incluso de muestras con un peor estado de conservacin, y no se quedaran fuera estos individuos femeninos. Las edades de los individuos sobre los que se obtuvieron resultados, estara alrededor de 38-41 semanas, lo que corresponde con el nal del periodo de gestacin. La proporcin de los sexos de este estudio sera de 2.25:1 en favor de los varones. Como consecuencia del pequeo nmero de individuos que fue posible sexar, esta proporcin no diere de manera signicativa de aquella presente en las proporciones de neonatos naturales 1.05:1. Estos resultados, por
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tanto no respaldan la hiptesis de un exceso de muertes femeninas perinatales; pero los resultados no son concluyentes debido al bajo xito de las amplicaciones, probablemente por una pobre conservacin del ADN en las muestras (Mays and Faerman, 2001). Otro ejemplo de aplicaciones histricas a los estudios del sexo gentico de los individuos es el presentado por De La Cruz y col. (2008) sobre los nios sacricados a los antiguos dioses aztecas de Tlatelolco. El ritual de sacricio de nios a los antiguos dioses aztecas de la lluvia est documentado por los cronistas espaoles del siglo XVI. Sin embargo, poca evidencia arqueolgica al respecto haba estado disponible hasta que se realizaron las excavaciones del Templo Mayor de Tenochtitln y en Tlatelolco, dos ciudades fundadas en dos isletas vecinas en el Lago de Tezcoco, y cuyas ruinas se encuentran hoy en da en la mitad de Ciudad de Mxico. En las excavaciones recientes del templo R (1428-67 d.C.) se recuperaron los restos de 37 subadultos y seis adultos, acompaados por diversos objetos de valor. En su conjunto representan evidencia de una ofrenda de sacricio en una sola ceremonia y cuyos restos fueron depositados con gran cuidado y orden. Diecisiete individuos infantiles y un adulto fueron enterrados en urnas cermicas globulares, mientras que el resto fueron enterrados directamente en el suelo. La identicacin del sexo de las vctimas de los sacricios puede contribuir a un mejor entendimientos de estas ceremonias. La muestra estaba compuesta por 43 individuos, 37 subadultos y 6 adultos,
encontrados bajo la plataforma del templo R en el centro ceremonial de Tlatelolco. La mayora de los esqueletos subadultos se encontraban bastante bien conservados, slo encontrndose cuatro en estado fragmentario. Sin embargo, los esqueletos adultos se encontraban bastante fragmentados quizs como consecuencia de un desmembramiento de los cuerpos. Como controles positivos se utilizaron restos arqueolgicos cuyo sexo haba podido ser determinado de manera able, mediante la utilizacin de criterios morfolgicos. La edad de los individuos se determin con base en el desarrollo dental segn Ubelaker (1989). Las extracciones se hicieron a partir de las costillas, utilizando el hueso completo, excepto en los casos en los que las costillas se encontraban rotas en los que se hizo un corte a ms o menos un centmetro de la fractura y descartando este pedazo. En algunos casos tambin se realizaron extracciones a partir de los arcos neurales de las vrtebras. La amplicacin fue, una vez ms, de los alelos del gen de la
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amelogenina. Tambin se realizaron anlisis de algunos SNPs del cromosoma Y, aquellos que denan los haplogrupos del cromosoma Y Q-M242 y Q-M3 (De La Cruz et al., 2008).
Las edades de los individuos fue estimada utilizando anlisis morfomtricos
estndares, siendo la mayora de los subadultos (66%) nios de hasta tres aos. Se obtuvo ADN amplicable de 32 de los 37 subadultos y de los 6 adultos de Tlatelolco. Inicialmente todos fueron identicados como masculinos por la presencia del amplicon del cromosoma Y. Sin embargo, slo se pudieron replicar los resultado en 26 individuos. En las replicaciones que se hicieron en un segundo laboratorio slo hubo una contradiccin en los resultados, que los autores atribuyen a la prdida de un alelo en este caso concreto. La alta proporcin de xito (60%) es atribuida a la buena preservacin de los restos esquelticos de ese yacimiento arqueolgico en particular y a los diversos mtodos utilizados para la extraccin del ADN (De La Cruz et al., 2008). En la tradicin azteca, Tlaloc era el principal dios de la lluvia y era ayudado por un
grupo de dioses con pequeos cuerpos, colectivamente conocidos como los Tlaloque. Se crea que estos pequeos dioses vivan en las colinas y montaas y que controlaban la lluvia (Romn, 1990). Ehecatl-Quetzalcoatl, el dios azteca de la lluvia, era considerado parte de los Tlaloque y serva como aquel que soplaba los obstculos del camino para hacer camino para la lluvia. El culto dedicado a Ehecatl-Quetzalcoatl como un dios de la lluvia y las caractersticas especiales de ofrenda masiva encontradas en este templo llevaron a plantear la hiptesis de que este complejo ceremonial fuera el lugar de una ceremonia extraordinaria llevada a cabo durante la gran hambruna de 1454-57 d.C., una fecha consistente con la fundacin de este templo (Guilliem, 1999). Considerando que los Tlaloque tambin eran patrones de varias enfermedades, se ha propuesto que los aztecas crean que los propios dioses elegan a estos nios para los sacricios, siendo esta eleccin manifestada por los sntomas de las enfermedades que presentaban los nios. Anlisis osteopatolgicos y de patologas dentales de los nios sacricados en Tenochtitln y Tlatelolco muestran que muchos de ellos se encontraban en condiciones de salud precarias. Sin embargo, no se han hecho comparaciones cuantitativas entre las patologas encontradas en estos individuos y aquellas presentes en la poblacin en general (De La Cruz et al., 2008).
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Segn Broda (1971), las vctimas escogidas para los sacricios en los antiguos
rituales aztecas se convertan en la personicacin viva del dios a quien eran ofrecidas. En el caso de los Tlateloque, los nios eran frecuentemente seleccionados para personicar estas pequeas deidades. Tambin se ha propuesto que los nios eran escogidos como vctimas de los sacricios porque su juventud les daba una pureza propicia para comunicarse con los dioses y obtener su favor (Lpez Austin, 1984). Los resultados de este estudio tienden a apoyar la postura de Broda porque, partiendo de que Ehecatl-Quetzalcoatl era una deidad masculina, las vctimas masculinas personicaran mejor al dios que las femeninas. Por ende, los resultados de los estudios morfolgicos y moleculares presentados en el trabajo de De La Cruz y col. (2008) apoyan la interpretacin arqueolgica de la ceremonia llevada a cabo en el templo dedicado a Ehecatl-Quetzalcoatl en Tlatelolco. Un tercer caso de aplicacin histrica de los estudios de ADN antiguo sera el
presentado por Dudar y col. (2003), en el que se recupero ADN de un cementerio de pioneros canadienses del siglo XIX. Los genotipos obtenidos se usaron para inferir las relaciones de parentesco. Estos resultados son relacionados con la informacin obtenida de las prcticas mortuorias y los registros histricos para sustentar las conclusiones sobre esta sociedad en particular. Dentro de los estudios de ADN antiguo se encuentra el potencial de establecer denitivamente genotipos individuales y, por tanto, determinar posibles prcticas de enterramiento relacionadas con el parentesco, siendo un ejemplo de esto el caso de los Romanov, la antigua familia imperial rusa. Sin embargo, si se pretende hacer una contribucin signicativa a un entendimiento ms amplio de la historia de las poblaciones, las investigaciones sobre ADN antiguo deben ir ms all de las relaciones biolgicas individuales para incluir sistemas de parentesco de las poblaciones del pasado. El trabajo sobre los pioneros canadienses, es una investigacin preliminar sobre la ecacia de los anlisis de ADN antiguo para determinar un sistema de parentesco dentro del registro arqueolgico. Para ello se utilizan aproximaciones estadsticas provenientes de las teoras del parentesco convencionales y de las ciencias forenses (Wenk et al., 1996, Allen et al., 1998). El ADN recuperado de las muestras de huesos y dientes fueron sometidas al anlisis del ADNmt y de distintos STRs para determinar los genotipos que permitieran calcular la probabilidad de parentesco matrilineal por azar (PrMKBC por sus siglas en ingls) y un ndice de parentesco (IK por sus siglas en ingls). El sistema de
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parentesco de esta sociedad se inere mediante la integracin de las relaciones biolgicas putativas con la cultura material arqueolgica, los registros histricos y otras fuentes etnohistricas de informacin (Dudar et al., 2003).
Los restos provienen del cementerio de Harmony Road en Toronto y se componen
de 38 individuos: 27 adultos jvenes, adultos y seniles (15 varones y 12 hembras, seis sub-adultos de menos de 18 aos y cinco infantiles que murieron antes del primer ao. Las fechas estimadas para la utilizacin de este cementerio, estn entre 1827 y 1850, para 7 individuos, 1850 y 1878, 16 individuos, y 1878 y 1900 (12 individuos). Tambin se consulto un inventario del cementerio que incluye 117 enterramientos con 38 apellidos, de los cuales 11 representan familias multiregionales. Para establecer los haplotipos mitocondriales y una base de datos de frecuencias allicas de los STRs se utilizaron muestras provenientes del cementerio de la iglesia anglicana de St. Thomas, Belleville, Ontario, que estuvo en uso desde 1821 hasta 1874 (Dudar et al., 2003). Tambin se realiz la determinacin del sexo gentico para contribuir a la
identicacin individual mediante la comparacin con documentacin histrica de los enterramientos. Adems se hizo la amplicacin de la regin hipervariable II del ADNmt, as como el polimorsmo del gen de la tirosina hidroxilasa humana (HUMTH01), una repeticin en tndem de cuatro nucleotidos (AATG). Tambin se aplicaron sistemas comerciales de tipado multiplex para amplicar seis loci STR. Unicando los datos de estos anlisis fue posible generar 45 perles nicos de ADN antiguo, con coherencia logentica. Algunas de las conclusiones que se proponen es que el sistema de parentesco tiene una residencia patrilocal, lo que explicara el comportamiento de los linajes mitocondriales, y aunque se intento apoyar esta hiptesis con los resultados obtenidos de los STRs, estos eran demasiado escasos como para proponer cualquier opcin de manera concluyente.
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10. Posibilidades en el Archipilago Canario Una vez planteados algunos ejemplos sobre la gran utilidad de los estudios de ADN
antiguo para la interpretacin histrica, se propondrn algunas de las posibles vas de investigacin en las Islas Canarias. Se trata de algunas cuestiones que se han ido trabajando desde diversas perspectivas y disciplinas y en las cuales la biologa molecular puede hacer una aportacin fundamental. Para ello se propondrn cuatros ejemplos de cuestiones histricas del archipilago, para las cuales la identicacin del sexo gentico sera un gran avance en la comprensin de estos procesos. El primero hace referencia a la cuestin del infanticidio en Gran Canaria, como un
sistema de control de la natalidad. Sobre este asunto hay varias informaciones etnohistricas y algunos datos arqueolgicos, en especial los encontrados en el yacimiento de Cendro, Telde, un asentamiento troglodita del Guanartemato de Telde (Cuenca Sanabria J., 1996). Las fuentes etnohistricas hacen referencia a la prctica del infanticidio por parte de los aborgenes canarios, como medida drstica para controlar la natalidad en momentos de caresta alimenticia, que en ocasiones se ha justicado en la insularidad y por ende en la limitacin de los recursos. Las excavaciones del yacimiento de cendro se iniciaron en 1983 y que se continuaron por varios aos. El asentamiento de Cendro hara parte junto con Tara y Caserones del complejo conocido como Telde en fuentes histricas, como los escritos de Torriani y sus mapas. A mediados del siglo XV la isla de Gran Canaria fue vctima de un periodo de gran
inestabilidad, en el que se sucedieron guerras, epidemias y una alta mortalidad, que producira casi 30 aos de inestabilidad social y econmica, agravada por una hambruna generalizada, consecuencia de los aos de luchas. Una de las soluciones que presentara el consejo de guerra aborigen, o Sabor, sera la adopcin de la medida conocida como el Estatuto de matar nias. Algunos autores sitan este hecho en torno a la segunda mitad del siglo XV, aunque tambin puede haberse producido despus de intensicarse la guerra tras la cada de la colonia europea de Telde en 1473 (Cuenca Sanabria J., 1996). Varias fuentes hacen referencia a este fenmeno, aunque no se ponen de acuerdo en cuanto al tiempo en el que este tipo de medidas se mantuvieron vigentes, as como si slo se aplicaban a las hembras o a todos los nios por igual:
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Haba en esta isla muchos hombres, y muchas ms mujeres, que se dice juntarse
catorce mil hombres. Y viendo cmo iban en crecimiento, y los mantenimientos les faltaban y no se cogan frutos que bastasen a su sustento, por no vivir en estrechura, entrando en consulta y congregacin, que llamaban sabor, acordaron y hicieron un estatuto que se matasen todas las hembras que de all adelante naciesen, con tal que no fuesen los primeros partos que las mujeres hacan (porque a tales vientres reservaban para su conservacin), y as supliesen los frutos que la tierra produjese, y no les faltasen, como haba sucedido aos atrs. Este estatuto y ordenanza dur poco aos, porque fue Dios servido dar en esta isla una grave enfermedad, en que de tres partes de la gente faltaron las dos (Abreu Galindo, 1977).
Pocos aos antes de que la isla de Canaria fuese conquistada, bien por fecunda
inuencia del cielo o por vivir la gente con salud por espacio de muchos aos, seguan naciendo sin que os acompaasen en igual cantidad las defunciones. De este modo, creci la gente en tanta cantidad, que ya no bastaban las cosechas para su manutencin, y empezaron a padecer caresta, a tal punto, que, obligados por la necesidad, para que no perecieran todos, hicieron una ley inhumana, que matasen todos los hijos despus de primer parto; en cuya crueldad slo fueron iguales a s mismo. (Torriani, 1959). Algunos de los materiales ms relevantes de las excavaciones de Cendro sern los
restos antropolgicos. En primer lugar porque se trata de huesos de recin nacidos y de neonatos, que no son demasiado comunes en los yacimientos del archipilago. En segundo lugar porque parte de estos individuos se encontraban depositados en el interior de vasijas cermicas y rodeados de una gran cantidad de fragmentos seos animales, cermicos y algunas piezas lticas. Para J. Cuenca y col (1996) estos restos seran evidencias en favor de la hiptesis sobre el infanticidio. Los posibles anlisis para la determinacin del sexo en restos de los que autores como Cuenca denominan Horizontes de infanticidio(1996), pueden resultar claves para intentar comprender este tipo de procesos histricos. Los estudios de biologa molecular tambin pueden signicar una salto cualitativo
importante en el camino de reconstruccin de los modos de vida de las poblaciones del pasado, como los aborgenes canarios. Un ejemplo de esto es el estudio sobre restos de
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la Gomera que se ha mencionado en apartados anteriores (Arnay-De-La-Rosa et al., 2009). En ste se ve como la determinacin del sexo, entre otras aplicaciones de los estudios genticos, ayuda por un lado a conrmar los datos obtenidos de los anlisis antropolgicos y por el otro permite responder a preguntas sobre las diferencias de gnero en estas sociedades. En este estudio en particular parece no haber una diferencia marcada entre la alimentacin de hombres y mujeres. Sin embargo, al no contarse con resultados de un gran nmero de individuos, estas conclusiones resultan de momento provisionales. Es por ello que este sera un camino de estudio viable en el resto del archipilago; la comparacin de las condiciones generales de vida, nutricin, patologas, etc. con el sexo determinado con el ADN antiguo pueden dar una nueva posibilidad de enfocar este tipo de estudios, teniendo en cuenta el componente de gnero en nuestra comprensin de las sociedades pre-hispnicas canarias. Las poblaciones aborgenes canarias resultan particulares en muchas cuestiones
con respecto a otras poblaciones, tanto del norte de frica como de la Pennsula Ibrica. Es por ello, que en muchas ocasiones resulta difcil aplicar los mismos criterios sobre todo en lo que respecta a cuestiones antropolgicas. Las funciones discriminantes resultan muy tiles para identicar el sexo de restos humanos incompletos, lo que permite estudios de paleodemografa al contar con una muestra mucho mayor clasicada. El problema de esta metodologa es que su efectividad depende de cada poblacin, por lo que la tendencia es a realizar y utilizar funciones construidas a partir de poblaciones lo ms cercanas posibles a la poblacin estudiada. Por ello resulta fundamental dar continuidad a estudios como los realizados por Arnay y col. (2007), en donde se utilizan los anlisis de ADN antiguo para poner a punto funciones discriminantes especcas de la poblacin canaria. En este ejemplo se utilizaron slo las mandbulas, pero los resultados positivos obtenidos permiten pensar en que este sistema puede ser igualmente til con funciones de otras regiones anatmicas. La incorporacin de los anlisis de gentica molecular en el archipilago canario,
no se restringen al estudio de los restos aborgenes. Dentro de la denominada arqueologa histrica tambin tienen un amplio rango de posibilidades, ya que en estos casos los restos suelen aparecer en un mal estado de conservacin, lo que diculta la observacin macroscpica para la determinacin del sexo. Esta aplicacin se podra plantear desde dos enfoques diferentes, pero complementarios. El primero se centrara en
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el estudio de la niez. En investigaciones recientes sobre la infancia durante la Edad Moderna en el archipilago (Ramos Prez, 2009), se han podido entrever particularidades en los modos de vida de este grupo frente a los adultos. Sin embargo, debido a la dicultad para determinar el sexo de los individuos infantiles, no se ha podido precisar si estas diferencias tienen adems un componente de gnero. Es en este tipo de preguntas es donde la biologa molecular puede resultar fundamental, ya que permitira una clasicacin de los individuos segn su gnero, lo que hara posible una comparacin entre ambos grupos. El segundo enfoque se vinculara con los estudios que se han realizado sobre los
modos de vida de las poblaciones de la Edad Moderna, como el que se hizo con los restos excavados en la Iglesia de La Concepcin, en Santa Cruz de Tenerife (Arnay de la Rosa, 2009). Este caso sera un ejemplo de como el estudio de cuestiones paleonutricionales, mediante anlisis de oligoelementos o de istopos estables, puede verse beneciado de la aplicacin de la determinacin del sexo gentico. En este caso sirvi para corroborar que no hay diferencias signicativas entre los resultados paleonutricionales de hombres y mujeres. An si las hubiera, la relacin entre los dos resultados, lleva a plantearse preguntas que deben intentar responderse desde la interpretacin histrica. La importancia de los estudios de ADN antiguo en este tipo de casos es que llevan a plantear hiptesis que de otra manera quizs ni siquiera se tendran en consideracin. Aunque estos son algunos ejemplos puntuales, parece bastante claro que las
posibilidades de compaginar los estudios de ADN antiguo en general, y la determinacin del sexo gentico en particular, a las investigaciones histricas en Canarias puede signicar un avance importante sobre las preguntas que se pueden llegar a plantear y, quizs, a responder.
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11. Propuesta Metodolgica: Posibles enfoques de los estudios de ADN antiguo en Canarias. Una vez comprendido el estado de la cuestin de los estudios de ADN antiguo,
tanto a nivel general como en el contexto del archipilago canario, se plantean algunas de las posibles opciones a seguir en esta disciplina. Teniendo en cuenta los trabajos arqueolgicos que se estn realizando en la
actualidad, sobre todo en la isla de Gran Canaria, se puede llegar a pensar en la posibilidad de analizar series ms amplias. En el caso de restos aborgenes aquellos provenientes de la necrpolis de Maspalomas resultan verdaderamente interesantes. Al ser parte de un mismo yacimiento arqueolgico se pueden proponer investigaciones que pretendan establecer posibles relaciones genticas entre los distintos individuos, as como las similitudes y diferencias de los comportamientos y tratamientos, tanto antemortem como postmortem, segn el sexo de los individuos. Tambin se estn realizando excavaciones de arqueologa histrica que permitiran ampliar los datos obtenidos de investigaciones anteriores, como los de la Iglesia de La Concepcin, y compararlos entre s para estudiar las posibles similitudes y diferencias. Una segunda propuesta, que podra llevarse a cabo con el material disponible en el
presente, es de carcter ms metodolgico. Se tratara de intentar comparar la preservacin del ADN en restos recin excavados con aquellos que llevan almacenados varios aos. Aunque ya existen algunos estudios de este tipo (Sampietro et al., 2006), en este caso resultara particularmente interesante porque seran restos provenientes del mismo yacimiento, por lo que las dems condiciones seran las mismas y se podra establecer realmente una comparacin entre muestras cuya nica diferencia sera el tiempo que ha transcurrido desde el momento de su excavacin. La diferencia entre ambas situaciones ha sido comentada en numerosas ocasiones, ya que parece ser un factor determinante en la posibilidad de que se conserven molculas de ADN endgeno en restos antiguos. De llevarse a cabo, este estudio permitira de alguna manera cuanticar el peso especco de este factor y por tanto valorar mejor las posibilidades de obtener resultados positivos en determinadas muestras.
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En cuanto al tipo de anlisis sobre las muestras, las posibilidades son muy
diversas. Sin embargo, existen kits que permiten el anlisis de varios marcadores a la vez que posibilitaran obtener perles bastante amplios de los individuos estudiados. Se debe enfatizar en que cuando se diseen los experimentos se incluyan marcadores sexuales como la amelogenina, porque aunque no siempre la determinacin del sexo sea el centro de la investigacin, se ha demostrado de manera bastante contundente a lo largo de este trabajo, las ventajas que esta informacin puede tener para los historiadores. Teniendo en cuenta que en la mayora de las ocasiones incluir este marcador no implica un aumento signicativo en la dicultad de los anlisis, parece ser que la relacin coste benecio justica el que se tenga en cuenta. Como complemento a estos marcadores, y considerando los avances de los
ltimos aos, resultara interesante intentar aplicar algunas de las tcnicas ms recientes. Es por eso que se propone comprobar e incluso mejorar los resultados obtenidos con marcadores como la amelogenina, en su aplicacin ms tradicional, con los obtenidos mediante el uso de SNPs tanto de este gen como de otros relacionados con los cromosomas sexuales. Esto permitira que algunas muestras ms degradadas puedan dar resultados positivos, lo que ampliara el tamao la muestra, y por lo tanto la abilidad de las relaciones y conclusiones obtenidas a partir de sta. Esto tambin puede ser complementado con la aplicacin de marcadores especcos del cromosoma Y, que sustenten y autentiquen los resultados de otros marcadores. Partiendo de los grandes problemas que presenta el ADN antiguo se hace patente que todas estas propuestas son necesarias para vericar los resultados obtenidos, dando as mayor credibilidad a este tipo de estudios. Una ltima cuestin fundamental en el futuro de los estudios de ADN antiguo en el
archipilago canario, es su integracin dentro de un discurso histrico ms amplio. Este planteamiento supone que, ms all de los retos tcnicos y metodolgicos que suponen este tipo de estudios, y cuya superacin ya es un mrito en s mismo, los resultados obtenidos estarn incompletos si no se incorporan dentro de una interpretacin histrica. Antes de acometer estudios de este tipo, se deben plantear unas hiptesis y objetivos de carcter histrico para los que la biologa molecular pueda ayudar a dar respuesta. En esa medida las posibilidades de futuro del ADN antiguo en Canarias son muy elevadas. Primero porque se estn presentando oportunidades de estudios con materiales mejor contextualizados que aquellos de los que se ha podido disponer hasta el momento. En
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segundo lugar, porque existe un banco de resultados que se han obtenido de diversos anlisis y que se encuentran a la espera de ser interpretados e introducidos dentro de una discurso histrico que nos acerque a la comprensin de las sociedades que habitaron las islas en el pasado. Slo si se consigue este objetivo, se podr realmente hablar de interdisciplinariedad, porque si no se seguir fallando en una verdadera articulacin de las diferentes disciplinas y seguir trabajando cada uno por su lado.
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12. Conclusiones - Cuando se analizan las caractersticas de los estudios de ADN antiguo se pueden ver claramente todas las dicultades que conllevan, pero a su vez es posible vislumbrar como, en multitud de casos, stas son superadas por los investigadores. Siendo una disciplina con mltiples complicaciones tericas, tcnicas y metodolgicas, los intentos que en estos estudios se emprenden no resultan intiles ya que en el caso de obtener resultados positivos, los datos obtenidos son de gran valor. - Los resultados que pueden llegar a dar este tipo de estudios, permiten a los investigadores plantearse preguntas que en otros momentos resultaban impensables. Sin embargo, como demuestra el camino recorrido desde las primeras publicaciones sobre estos temas, la prudencia debe ser una mxima, ya que las posibilidades de errores son muy altas. Las implicaciones de estas armaciones errneas pueden ser de gran envergadura por lo que se debe intentar utilizar todos los mecanismos de vericacin, para garantizar, en la medida de lo posible, la veracidad de los resultados. - A pesar de las grandes dicultades planteadas por el anlisis de muestras de las caractersticas aqu planteadas, un repaso por las ltimas investigaciones pone de maniesto que muchas de ellas se han ido subsanando. Las posibilidades son muy variadas y la eleccin de unas sobre otras debe determinarse de acuerdo a las caractersticas especcas de cada investigacin. A su vez podemos llegar a pensar que los avances en los prximos aos traern solucin a los problemas no resueltos o perfeccionarn las ya existentes. - Una vez analizados los estudios de ADN antiguo queda patente la necesidad de una verdadera interdisciplinariedad. sta implica que los investigadores de las distintas reas implicadas establezcan verdaderos canales de comunicacin. Se debe partir de la construccin de un lenguaje comn que permita a los investigadores establecer unos canales de comunicacin y unos objetivos conjuntos, para cuya consecucin cada uno aporte distintos enfoques desde sus propias reas de conocimiento. Debe haber un verdadero inters por los conocimientos aportados por otros, porque slo comprendindolos es posible integrarlos dentro del propio trabajo. Para ello es
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indispensable una formacin mnima en las distintas reas que permita el entendimiento mutuo. - El trabajo conjunto y el dilogo constante entre los diferentes implicados en el proceso de investigacin, arquelogos, antroplogos, bilogos, etc. resulta fundamental para garantizar el xito de los anlisis. Problemas particulares de este tipo de muestras, pueden ser subsanados con relativa facilidad si realmente existe una colaboracin por parte de todos los investigadores. Esto ayudar a evitar problemas que puedan poner en juego los resultados de las diferentes disciplinas implicadas. - Siendo conscientes de la limitacin del material disponible para el estudio de ADN antiguo, se hace indispensable un uso responsable del mismo. Es por ello que este tipo de investigaciones deberan estar guiadas por preguntas inmersas dentro de un discurso histrico. De otro modo se harn gran cantidad de anlisis que agotaran las muestras disponibles pero cuyos resultados no aportarn una informacin relevante para entender los procesos histricos en los que estos individuos se vieron inmersos. - Se puede decir que los estudios de ADN antiguo plantean una nueva perspectiva para diversas preguntas histricas. En ocasiones como complemento y armacin de hiptesis existentes y, en otras, planteando dudas sobre interpretaciones que parecan claras, lo que puede conllevar al replanteamiento de las mismas. - Por ltimo, queda patente que son ms las preguntas planteadas que las respuestas. Hasta qu punto los estudios de ADN antiguo son ables? y si lo son, Hasta donde pueden ser tiles para responder preguntas histricas? o Qu tipo de respuestas nos pueden dar?Son estas de interpretacin unvoca a la hora de introducirlas dentro de un discurso histrico?. stas son slo algunas de las dudas que quedan expuestas y a las que se debera intentar dar respuesta en investigaciones posteriores.
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