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Jornal Oficial

da Unio Europeia
Edio em lngua portuguesa Nmero de informao

C 43

ISSN 1725-2482

Comunicaes e Informaes
ndice

53.o ano 19 de Fevereiro de 2010

Pgina

II

Comunicaes

COMUNICAES ORIUNDAS DAS INSTITUIES, RGOS E ORGANISMOS DA UNIO EUROPEIA

Comisso Europeia

2010/C 43/01

Lista e descrio dos mtodos de anlise referidos no artigo 120.o-G, primeiro pargrafo, do Regula mento (CE) n.o 1234/2007 do Conselho [publicadas em conformidade com o artigo 15.o, n.o 2, do Regulamento (CE) n.o 606/2009 da Comisso, de 10 de Julho de 2009] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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C 43/1

II
(Comunicaes)

COMUNICAES ORIUNDAS DAS INSTITUIES, RGOS E ORGANISMOS DA UNIO EUROPEIA

COMISSO EUROPEIA
Lista e descrio dos mtodos de anlise referidos no artigo 120.o-G, primeiro pargrafo, do Regulamento (CE) n.o 1234/2007 do Conselho (1) [publicadas em conformidade com o artigo 15.o, n.o 2, do Regulamento (CE) n.o 606/2009 da Comisso, de 10 de Julho de 2009 (2)] (2010/C 43/01) O quadro seguinte constitui a lista dos mtodos de anlise aplicveis na verificao da observncia dos limites e requisitos estabelecidos na regulamentao comunitria para a elaborao de produtos vitivincolas. A referncia constante da terceira coluna do quadro para cada parmetro a do mtodo de anlise correspondente descrito na edio mais recente (2009) do Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV disponvel na data da presente publicao. Apenas os mtodos de referncia (tipos I e II da classificao da OIV) so descritos para cada parmetro, excepto quando no se encontre ainda validado um mtodo do tipo I ou II. Os mtodos so descritos no anexo da presente comunicao. Notas: O Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV define os vrios tipos de mtodos de anlise no anexo A, seco I, nomeadamente o tipo I (mtodo de referncia critrio), o tipo II (mtodo de referncia) e o tipo IV (mtodo provisrio). Os mtodos de anlise do chumbo e do cdmio so agora descritos no Regulamento (CE) n.o 333/2007 da Comisso (3), de 28 de Maro de 2007 (parte C, ponto C.3, do anexo). Alm disso, o Regulamento (CE) n.o 401/2006 (4), de 23 de Fevereiro de 2006, estabelece critrios gerais para mtodos de anlise da ocratoxina A no seu anexo II, ponto 4, pelo que no necessrio descrever um mtodo de anlise desta substncia especificamente aplicvel aos produtos vitivincolas.

LISTA DOS MTODOS DE ANLISE


N mero

Parmetro

Mtodo do Compndio da OIV

Tipo

1 2 3 4

Massa volmica / Densidade ndice de refraco Resduo seco total Razo isotpica
18O/16O

AS-2-01-MASVOL AS-2-02-SUCREF AS-2-03-EXTSEC

I I I II

da gua do vinho

AS-2-09-MOUO18

(1 ) (2 ) (3 ) (4 )

JO JO JO JO

L L L L

299 de 16.11.2007. 193 de 24.7.2009, p. 1. 88 de 29.3.2007, p. 29. 70 de 9.3.2006, p. 12.

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N mero

Parmetro

Mtodo do Compndio da OIV

Tipo

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

ndice de Folin Teor de acar (glucose + frutose) Teor de sacarose (determinao por HPLC) Ressonncia magntica nuclear do deutrio do etanol do vinho Ttulo alcoomtrico volmico (%) Razo isotpica Acidez total Acidez voltil cido ctrico cido srbico pH de mostos cido ascrbico CO2 (g/l) CO2 (g/l) (manometria) Sobrepresso de CO2 Lisozima Sulfato de potssio Ferro Cobre Sulfitos (SO2) ou Dixido de enxofre total
13C/12C

AS-2-10-INDFOL AS-311-02-GLUFRU AS-311-03-SUCRES AS-311-05-ENRRMN (em fase de reviso) AS-312-01-TALVOL AS-312-06-ETHANO AS-313-01-ACITOT AS-313-02-ACIVOL AS-313-09-ACIENZ AS-313-14-ACISOR AS-313-15-PH AS- 313-22 ACASCO AS-314-01-DIOCAR AS-314-04-CO2MAN AS-314-02-SURPRES AS-315-14-LYSOZY AS-321-05-SULFAT AS-322-05-FER AS-322-06-CUIVRE AS-323-04-DIOSU

IV II II I I II I I II IV I II II II I IV II IV IV II

do etanol do vinho

As instncias da OIV esto a actualizar o descritivo de alguns mtodos de anlise. Esses descritivos sero publicados numa prxima comunicao da Comisso logo que a OIV publique um texto actualizado, na edio de 2010 do seu Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos.

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ANEXO NDICE 1. MASSA VOLMICA A 20 C E DENSIDADE RELATIVA A 20 C (OIVAS201-MASVOL) Mtodo do tipo I 2. AVALIAO DO TEOR DE ACARES DOS MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS E MOSTOS CONCEN TRADOS RECTIFICADOS, POR REFRACTOMETRIA (OIV - AS2 - 02-SUCREF) Mtodo do tipo I . . . . . . 3. RESDUO SECO TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Matria seca total Mtodo do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . 4. DETERMINAO DA RAZO ISOTPICA 18O/16O DA GUA DOS VINHOS (OIV-AS-2-09-MOUO18) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5. NDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) Mtodo do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. GLUCOSE E FRUTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. DOSAGEM DOS ACARES (SACAROSE) POR HPLC (OIVAS31103SUCRES) Mtodo do tipo II . . 8. DETECO, POR RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR DE DEUTRIO, DO ENRIQUECIMENTO DE MOS TOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICA DOS E VINHOS (OIV-AS-311-05-ENRRMN) Mtodo do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9. TTULO ALCOOMTRICO VOLMICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) Mtodo do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . 10. DETERMINAO, POR ESPECTROMETRIA DE MASSA ISOTPICA, DA RAZO ISOTPICA 13C/12C DO ETANOL DO VINHO OU DO ETANOL OBTIDO POR FERMENTAO DE MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS OU MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06ETHANO) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11. ACIDEZ TOTAL (OIV-AS-313-01-ACITOT) Mtodo do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12. ACIDEZ VOLTIL (OIV - AS-313-02-ACIVOL) Mtodo do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13. CIDO CTRICO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14. CIDO SRBICO (OIV -AS-313-14-ACISOR) Mtodo do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15. pH (OIV-AS-313-15-PH) Mtodo do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16. DOSAGEM SIMULTNEA DO CIDO l-ASCRBICO E DO CIDO D-ISOASCRBICO POR HPLC, COM DETECO NO ULTRAVIOLETA (OIVAS-313-22-ACASCO) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17. DIXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18. DOSAGEM DO DIXIDO DE CARBONO NO VINHO PELO MTODO MANOMTRICO (OIVAS314-04-CO2MAN) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19. MEDIO DA SOBREPRESSO EM VINHOS ESPUMANTES E FRISANTES (OIV-AS-314-02-SURPRES) Mtodo do tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20. DOSAGEM DA LISOZIMA NO VINHO POR HPLC (OIV-AS-315-14) Mtodo do tipo IV . . . . . . . . . . . . 21. SULFATOS (OIV- AS-321-05-SULFAT) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22. FERRO (OIV - AS-322-05-FER) Mtodo do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23. COBRE (OIV AS-322-06) Mtodo do tipo IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24. DIXIDO DE ENXOFRE (OIV - AS-323-04-DIOSU) Mtodo do tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 10 11 12 14 17

18 19

20 27 30 33 36 39 41 45 47 48 51 54 55 56 58

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1 MASSA VOLMICA A 20 C E DENSIDADE RELATIVA A 20 C (OIVAS201-MASVOL) MTODO DO TIPO I 1. DEFINIES A massa volmica o quociente entre a massa de um determinado volume de vinho ou de mosto, a 20 C, e esse volume. Exprime-se em gramas por mililitro e o seu smbolo 20 C. A densidade relativa a 20 C, ou densidade 20 C/20 C, a razo, expressa por um nmero decimal, entre a massa de um determinado volume de vinho ou de mosto, a 20 C e a massa do mesmo volume de gua mesma temperatura. O seu smbolo d20 C 20 C 2. PRINCPIO DOS MTODOS Determinao da massa volmica e da densidade relativa, a 20 C, na amostra para ensaio: por picnometria (mtodo de referncia) ou por densimetria (balana hidrosttica ou densimetria electrnica). Nota: Para determinaes muito precisas, a massa volmica deve ser corrigida do efeito do dixido de enxofre: 20 C = 20 C 0,0006S, 20 C = massa volmica corrigida 20 C = massa volmica observada S 3. = dixido de enxofre total, em g/l.

TRATAMENTO PRVIO DA AMOSTRA Se o vinho ou o mosto contiverem quantidades significativas de dixido de carbono, expulsar a maior quantidade possvel, por agitao de 250 ml de vinho num balo de 1000 ml ou por filtrao, sob presso reduzida, atravs de 2 g de algodo colocado numa alonga.

4. 4.1.

MTODO DE REFERNCIA Equipamento Material corrente de laboratrio, nomeadamente:

4.1.1.

Picnmetro (1) de vidro pyrex, com cerca de 100 ml de capacidade, dotado de um termmetro amovvel com esmerilado, com graduao em dcimos de grau de 10 C a 30 C. Este termmetro deve ser aferido (ver a figura 1).

Figura 1 Picnmetro e frasco-tara O picnmetro dispe de um tubo lateral de 25 mm de comprimento, com dimetro interno mximo de 1 mm, terminado por uma parte cnica esmerilada. O tubo lateral pode ter uma tampa receptora, constituda por um tubo cnico com esmerilado e terminado por uma parte afilada. Esta tampa serve de cmara de dilatao.
(1) Pode ser utilizado qualquer picnmetro de caractersticas equivalentes.

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As duas esmerilagens do dispositivo devem ser feitas com muito cuidado. 4.1.2. Frasco-tara com o mesmo volume externo que o picnmetro (aproximao inferior a 1 ml) e massa igual do picnmetro, cheio de um lquido de densidade 1,01 (soluo a 2 % (m/v) de cloreto de sdio). Camisa termicamente isolada que se adapte exactamente ao picnmetro. 4.1.3. Balana de dois pratos com capacidade de, pelo menos, 300 g, sensvel s dcimas de miligrama ou balana de prato nico com capacidade de, pelo menos, 200 g, sensvel s dcimas de miligrama. 4.2. Calibrao do picnmetro A calibrao do picnmetro compreende a determinao das seguintes caractersticas: tara em vazio, volume a 20 C, massa com gua, a 20 C. 4.2.1. Utilizao de uma balana de dois pratos Depois de colocar o frasco-tara no prato esquerdo da balana e o picnmetro, limpo, seco e munido da respectiva tampa receptora, no prato direito, estabelecer o equilbrio, colocando ao lado do picnmetro massas marcadas. Seja p a massa correspondente, em gramas. Encher o picnmetro cuidadosamente com gua destilada, temperatura ambiente, e introduzir o termmetro. Enxugar cuidadosamente o picnmetro e coloc-lo na camisa termicamente isolada. Agitar, por inverses sucessivas, at que a temperatura lida no termmetro seja constante. Nivelar a gua exactamente pelo bordo superior do tubo lateral. Enxugar o tubo lateral e colocar a tampa receptora. Ler a temperatura (t C) com cuidado e, se necessrio, corrigi-la em funo da inexactido da escala do termmetro. Pesar o picnmetro cheio de gua. Seja p a massa, em gramas, que restabelece o equilbrio. Clculos Tara do picnmetro vazio: Tara em vazio = p+m, m = massa de ar contida no picnmetro m = 0,0012(pp). Volume a 20 C: V20 C= (p+mp)Ft, Ft = factor que consta do quadro I para a temperatura t C V20 C deve ser conhecido com a aproximao de 0,001 ml. Massa de gua a 20 C: M20 C= V20 C0,998203 0,998203 = massa volmica da gua a 20 C. 4.2.2. Utilizao de uma balana de prato nico Determinar: a massa do picnmetro limpo e seco: P, a massa do picnmetro cheio de gua, a t C: P1 (seguir as indicaes do ponto 4.2.1), a massa do frasco-tara: T0.

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Clculos Tara do picnmetro vazio: Tara em vazio: = Pm, m = massa de ar contida no picnmetro m = 0,0012(P1P) Volume a 20 C: V20 C = [P1(Pm)]Ft, Ft = factor que consta do quadro I para a temperatura t C. O volume a 20 C deve ser conhecido com a aproximao de 0,001 ml. Massa de gua a 20 C: M20 C = V20 C0,998203 0,998203 = massa volmica da gua a 20 C. 4.3. 4.3.1. Tcnica de medio Utilizao de uma balana de dois pratos Pesar o picnmetro cheio com a amostra para ensaio (ponto 3), seguindo as indicaes do ponto 4.2.1. Seja p a massa, em gramas, que restabelece o equilbrio a t C. Massa do lquido contido no picnmetro = p+mp. Massa volmica aparente a t C: t C = (p+mp)/(V20 C) Calcular a massa volmica a 20 C por meio de um dos quadros de correco abaixo referidos, consoante a natureza do lquido estudado: vinho seco (quadro II), mosto natural ou concentrado (quadro III), vinho doce (quadro IV). Calcula-se a densidade 20 C/20 C do vinho dividindo a massa volmica a 20 C por 0,998203. 4.3.2. Utilizao de uma balana de prato nico Pesar o frasco-tara. Seja T1 a sua massa. Calcular dT = T1To Massa do picnmetro vazio no momento da medio = Pm+dT Pesar o picnmetro cheio com a amostra para ensaio (ponto 3), seguindo as indicaes do ponto 4.2.2. Seja P2 a sua massa, a t C. Massa do lquido contido no picnmetro, a t C = P2 (Pm+dT) Massa volmica aparente, a t C: t C = (P2(Pm+dT)/V20 C Calcular a massa volmica a 20 C do lquido estudado (vinho seco, mosto natural ou concentrado, vinho doce) como se indica no ponto 4.3.1. A densidade 20 C/20 C obtida dividindo a massa volmica a 20 C por 0,998203. 4.3.3. Repetibilidade da massa volmica: vinhos secos e meio-doces: r = 0,00010, vinhos doces: r = 0,00018. 4.3.4. Reprodutibilidade da massa volmica: vinhos secos e meio-doces: R = 0,00037, vinhos doces: R = 0,00045.

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QUADRO I Factores F pelos quais necessrio multiplicar a massa de gua contida no picnmetro de vidro pyrex a t C, para calcular o volume do picnmetro a 20 C [Ver o quadro I do anexo II do mtodo AS2 01 descrito no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV.] QUADRO II Correces, c, de temperatura massa volmica de vinhos secos e de vinhos secos desalcoolizados medida com um picnmetro de vidro pyrex a t C, para a referir a 20 C [Ver o quadro II do anexo II do mtodo AS2 01 descrito no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV.] 20 = t(c)/(1 000) se t C for inferior a 20 C + se t C for superior a 20 C

QUADRO III Correces, c, de temperatura massa volmica de mostos naturais e de mostos concentrados medida a t C com um picnmetro de vidro pyrex, para referir o resultado a 20 C [Ver o quadro III do anexo II do mtodo AS2 01 descrito no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV.] 20 = t(c)/(1 000) se t C for inferior a 20 C + se t C for superior a 20 C

QUADRO IV Correces, c, de temperatura massa volmica de vinhos de 13 % vol ou mais que contenham acar residual, medida com um picnmetro de vidro pyrex a t C, para a referir a 20 C [Ver o quadro IV do anexo II do mtodo AS2 01 descrito no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV.] 20 = t(c)/(1 000) se t C for inferior a 20 C + se t C for superior a 20 C

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2 AVALIAO DO TEOR DE ACARES DOS MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS E MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS, POR REFRACTOMETRIA (OIV - AS2 - 02- SUCREF) MTODO DO TIPO I 1. PRINCPIO DO MTODO Obteno do teor de acares, expresso em gramas por litro e gramas por quilograma, de mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados a partir do ndice de refraco a 20 C, expresso em ndice absoluto ou em percentagem mssica de sacarose, utilizando a tabela correspondente. 2. 2.1. EQUIPAMENTO Refractmetro de Abb O refractmetro utilizado deve dispor de uma escala que indique: percentagens mssicas de sacarose com a aproximao de 0,1 % ou ndices de refraco com 4 casas decimais. O refractmetro deve dispor de um termmetro cuja escala se situe, pelo menos, entre + 15 C e + 25 C e de um dispositivo de circulao de gua que permita fazer as medies a 20 C 5 C. As instrues de utilizao deste instrumento devem ser estritamente respeitadas, nomeadamente no que respeita aferio e fonte luminosa. 3. 3.1. PREPARAO DA AMOSTRA Mostos e mostos concentrados Se necessrio, filtrar os mostos atravs de uma gaze seca dobrada em quatro. Eliminar as primeiras gotas de filtrado e fazer a determinao no produto filtrado. 3.2. Mostos concentrados rectificados Consoante a concentrao do mosto, utilizar directamente o mosto concentrado rectificado ou ento a soluo obtida diluindo at 500 g, com gua, 200 g de mosto concentrado rectificado, pesados com exactido. 4. PROCEDIMENTO Levar a amostra a uma temperatura prxima de 20 C. Colocar uma pequena toma para ensaio no prisma inferior do refractmetro de modo que, quando os prismas estiverem pressionados um contra o outro, a toma cubra uniformemente a superfcie do vidro. Efectuar a medio seguindo as instrues de utilizao do dispositivo. Ler a percentagem mssica de sacarose com a aproximao de 0,1 %, ou o ndice de refraco com 4 casas decimais. Efectuar pelo menos duas determinaes com cada amostra preparada. Anotar a temperatura, t C. 5. 5.1. 5.1.1. 5.1.2. CLCULOS Correco do efeito da temperatura Dispositivos graduados em percentagem mssica de sacarose: utilizar o quadro I para a correco de tempe ratura. Dispositivos graduados em ndice de refraco: a partir do ndice medido a t C, utilizar o quadro II para obter (na coluna 1) o valor correspondente da percentagem mssica de sacarose a t C. Utilizar o quadro I para corrigir este valor do efeito da temperatura, convertendo-o a 20 C Teor de acares de mostos e de mostos concentrados A partir da percentagem mssica de sacarose a 20 C, utilizar o quadro II para obter o teor de acares em gramas por litro e gramas por quilograma. Exprime-se o teor de acares em acar invertido, com uma casa decimal. 5.3. Teor de acares de mosto concentrado rectificado A partir da percentagem mssica de sacarose a 20 C, utilizar o quadro III para obter o teor de acares em gramas por litro e gramas por quilograma. O teor de acares expresso em acar invertido, com uma casa decimal. Se a medio tiver sido efectuada com mosto concentrado rectificado diludo, multiplicar o resultado pelo factor de diluio. 5.4. ndice de refraco de mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados A partir da percentagem mssica de sacarose a 20 C, utilizar o quadro II para obter o ndice de refraco a 20 C. Este ndice expresso com quatro casas decimais. Nota: O ttulo alcoomtrico potencial dos mostos, mostos concentrados e mostos concentrados rectificados pode ser determinado utilizando o quadro de correspondncia constante do anexo I do Regulamento (CE) n.o 1623/2000 da Comisso, de 25 de Julho de 2000 (JO L 194 de 31 de Julho de 2000).

5.2.

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QUADRO I Correco a introduzir no caso de a percentagem mssica de sacarose ter sido determinada a uma temperatura diferente de 20 C. [Ver o quadro I do anexo do mtodo AS2 02 descrito no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV.] TABELA II Quadro indicativo de teores de acares de mostos e mostos concentrados em gramas por litro e gramas por quilograma, determinados com um refractmetro graduado em percentagem mssica de sacarose, a 20 C, ou em ndice de refraco a 20 C. igualmente indicada a massa volmica a 20 C. [Ver o quadro II do anexo do mtodo AS2 02 descrito no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV.] QUADRO III Quadro indicativo de teores de acares de mostos concentrados rectificados em gramas por litro e gramas por quilograma, determinados com um refractmetro graduado em percentagem mssica de sacarose, a 20 C, ou em ndice de refraco a 20 C. igualmente indicada a massa volmica a 20 C. [Ver o quadro III do anexo do mtodo AS2 02 descrito no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV.]

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3 RESDUO SECO TOTAL(OIV-AS-2-03-EXTSEC) MATRIA SECA TOTAL MTODO DO TIPO I 1. DEFINIO O resduo seco total ou matria seca total o conjunto de todas as substncias que, em condies fsicas determinadas, no se volatilizam. Essas condies devem ser fixadas de tal modo que as substncias componentes do resduo sofram o mnimo de alteraes. O resduo no redutor o resduo seco total diminudo dos acares totais. O resduo reduzido o resduo seco total diminudo dos acares totais que excedam 1 g/l, do sulfato de potssio que exceda 1 g/l, do manitol, se estiver presente, e de todas as substncias qumicas eventualmente adicionadas ao vinho. O resduo residual o resduo no redutor diminudo da acidez fixa, expressa em cido tartrico. O resduo expresso em gramas por litro e deve ser determinado com a aproximao de 0,5 g. 2. PRINCPIO DO MTODO [As instncias da OIV esto a actualizar o descritivo deste mtodo de anlise. Esse descritivo ser publicado numa prxima comunicao da Comisso quando a OIV publicar um texto actualizado, na edio de 2010 do seu Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicao, remete-se, a ttulo indicativo, para o captulo 4 do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 da Comisso.]

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4 DETERMINAO DA RAZO ISOTPICA 18O/16O DA GUA DOS VINHOS (OIV-AS-2-09-MOUO18) MTODO DO TIPO II (p.m.) [As instncias da OIV esto a actualizar o descritivo deste mtodo de anlise. Esse descritivo ser publicado numa prxima comunicao da Comisso quando a OIV publicar um texto actualizado, na edio de 2010 do seu Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicao, remete-se, a ttulo indicativo, para o captulo 43 do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 da Comisso.]

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5 NDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) MTODO DO TIPO IV 1. DEFINIO O ndice de Folin-Ciocalteu o resultado obtido por aplicao do mtodo a seguir descrito. 2. PRINCPIO DO MTODO Oxidao dos compostos fenlicos do vinho pelo reagente de Folin-Ciocalteu. Este constitudo por uma mistura de cido fosfotngstico (H3PW12O40) e cido fosfomolbdico (H3PMo12O40), que, ao oxidar os fenis, reduzida a uma mistura de xidos azuis de tungstnio (W8O23) e de molibdnio (Mo8O23). A colorao azul produzida tem o mximo de absoro prximo de 750 nm e proporcional ao teor de compostos fenlicos. 3. REAGENTES Os reagentes devem ser de qualidade analtica. A gua utilizada deve ser gua destilada ou de pureza equiva lente. 3.1. Reagente de Folin-Ciocalteu Este reagente encontra-se disponvel no comrcio, pronto a utilizar. Pode ser preparado do seguinte modo: dissolver 100 g de tungstato de sdio (Na2WO4 2H2O) e 25 g de molibdato de sdio (Na2MoO4 2H2O) em 700 ml de gua destilada. Juntar 50 ml de cido fosfrico a 85 % (20 = 1,71 g/ml) e 100 ml de cido clordrico concentrado (20 = 1,19 g/ml). Levar ebulio, mantendo-a sob refluxo durante 10 horas. Juntar em seguida 150 g de sulfato de ltio (Li2SO4 H2O) e algumas gotas de bromo e levar de novo ebulio, mantendo-a durante 15 minutos. Arrefecer e completar o volume at 1 litro com gua destilada. 3.2. 4. Soluo a 20 % (m/v) de carbonato de sdio (Na2CO3) anidro. EQUIPAMENTO Material corrente de laboratrio, nomeadamente: 4.1. 4.2. 5. 5.1. Bales aferidos de 100 ml. Espectrofotmetro que permita trabalhar a 750 nm. PROCEDIMENTO Vinhos tintos Num balo aferido de 100 ml (ponto 4.1), introduzir, respeitando a ordem: 1 ml de vinho diludo 1:5, 50 ml de gua destilada, 5 ml de reagente de Folin-Ciocalteu (3.1), 20 ml de soluo de carbonato de sdio (3.2). Completar o volume at 100 ml com gua destilada. Agitar para homogeneizar. Esperar 30 minutos, para estabilizar a reaco. Determinar a absorvncia a 750 nm com um percurso ptico de 1 cm, em relao a um branco preparado com gua destilada em vez de vinho. Se a absorvncia lida no for prxima de 0,3, modificar a diluio do vinho. 5.2. Vinhos brancos Proceder do mesmo modo com 1 ml de vinho no diludo. 5.3. 5.3.1. Mostos concentrados rectificados Preparao da amostra Utilizar a soluo com teor mssico de 25 % de acares (25o Brix), preparada como se indica no captulo pH, ponto 4.1.2.

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5.3.2.

Medio Proceder como foi descrito para os vinhos tintos (ponto 5.1), utilizando 5 ml de amostra, preparada de acordo com o ponto 5.3.1, e medindo a absorvncia em relao a um branco preparado com 5 ml de uma soluo a 25 % (m/m) de acar invertido.

6. 6.1.

EXPRESSO DOS RESULTADOS Modo de clculo Exprime-se o resultado sob a forma de um ndice, obtido por multiplicao da absorvncia por 100, no caso dos vinhos tintos diludos 1:5 (ou pelo factor correspondente diluio utilizada), ou por 20, no caso dos vinhos brancos. No caso dos mostos concentrados rectificados, multiplica-se a absorvncia por 16.

6.2.

Repetibilidade A diferena entre os resultados de duas determinaes efectuadas simultaneamente, ou imediatamente uma aps a outra, pelo mesmo analista no deve ser superior a 1. Para se obter uma boa repetibilidade de resultados, h que utilizar equipamento (bales aferidos e clulas do espectrofotmetro) rigorosamente limpo.

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6 GLUCOSE E FRUTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) MTODO DO TIPO II 1. DEFINIO A glucose e a frutose so doseadas individualmente por um mtodo enzimtico, com vista unicamente ao clculo da razo glucose/frutose. 2. PRINCPIO DO MTODO Fosforilao da glucose e da frutose pelo adenosina-trifosfato (ATP), no decurso de uma reaco enzimtica catalisada pela hexocinase (HK), e converso em glucose-6-fosfato (G6P) e frutose-6-fosfato (F6P): glucose + ATP + ADP, G6P frutose + ATP + ADP. F6P Numa primeira fase, o nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato (NADP), em presena da enzima glucose-6-fosfato-desidrogenase (G6 PDH), oxida o glucose-6-fosfato em gluconato-6-fosfato. A quantidade de nicotina mida-adenina-dinucletido-fosfato reduzido (NADPH) que se forma corresponde quantidade de glucose-6-fosfato e, portanto, de glucose: G6P + NADP+ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+. Doseia-se o nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato reduzido, com base na sua absorvncia a 340 mm. Depois de terminada esta reaco, utiliza-se fosfoglucose-isomerase (PGl) para converter o frutose-6-fosfato em glucose-6-fosfato: F6P G6P O glucose-6-fosfato assim formado reage ento com o nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato para formar gluconato-6-fosfato e nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato reduzido, que doseado. 3. EQUIPAMENTO Espectrofotmetro que permita efectuar medies a 340 nm, mximo de absoro do NADPH. Dado que se trata de medies absolutas (no se recorre a uma calibrao, mas sim ao coeficiente de extino do NADPH), as escalas de comprimentos de onda e de absorvncias do aparelho devem ser aferidas. Na falta de um espectrofotmetro que permita efectuar medies a 340 nm, utilizar um espectrofotmetro de espectro descontnuo que permita efectuar medies a 334 nm ou a 365 nm. Clulas de vidro com 1 cm de percurso ptico, eventualmente descartveis. Pipetas de 0,02 ml, 0,05 ml, 0,1 ml e 0,2 ml para as reaces enzimticas. 4. 4.1. REAGENTES Soluo 1: tampo (trietanolamina 0,3 M, pH 7,6, 4103 M de Mg2+): dissolver em 150 ml de gua bidestilada 11,2 g de cloridrato de trietanolamina (C2H5)3N HCl) e 0,2 g de Mg SO4 7H2O; adicionar apro ximadamente 4 ml de soluo 5 M de hidrxido de sdio (NaOH), para obter um pH de 7,6, e completar o volume at 200 ml. A +4 C, esta soluo-tampo conserva-se 4 semanas. 4.2. Soluo 2: soluo de nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato (cerca de 11,510-3 M): dissolver 50 mg de nicotinamida-adenina-dinucletido-fosfato dissdico em 5 ml de gua bidestilada. A +4 C, esta soluo conserva-se 4 semanas. 4.3. Soluo 3: soluo de adenosina-5-trifosfato (aproximadamente 81 10-3 M: dissolvem-se 250 mg de adenosina-5-trifosfato dissdico e 250 mg de hidrogenocarbonato de sdio (NaHCO3) em 5 ml de gua bidestilada. A +4 C, esta soluo conserva-se 4 semanas. 4.4. Soluo 4: Hexocinase/glucose-6-fosfato-desidrogenase: misturar 0,5 ml de hexocinase (2 mg de protena/ml ou seja 280 U/ml) com 0,5 ml de glucose-6-fosfato-desidrogenase (1 mg de protena por ml). A +4 C, esta soluo conserva-se um ano.

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4.5.

Soluo 5: Fosfoglucose-isomerase (2 mg de protena por ml, ou seja, 700 U/ml). A suspenso utilizada sem diluio. A +4 C, esta soluo conserva-se um ano. Nota: Todos os reagentes necessrios esto comercializados.

5. 5.1.

PROCEDIMENTO Preparao da amostra Em funo da quantidade estimada de glucose + frutose por litro, efectuar as seguintes diluies:
Medio a 340 nm ou a 334 nm Medio a 365 nm Diluio com gua Factor de diluio, F

At 0,4 g/l At 4,0 g/l At 10,0 g/l At 20,0 g/l At 40,0 g/l Mais de 40,0 g/l 5.2. Dosagem

At 0,8 g/l At 8,0 g/l At 20,0 g/l At 40,0 g/l At 80,0 g/l Mais de 80,0 g/l

1 + 9 1 + 24 1 + 49 1 + 99 1 + 999

10 25 50 100 1 000

Com o espectrofotmetro regulado no comprimento de onda de 340 nm, efectuar as medies em relao ao ar (sem clula no percurso ptico) ou em relao a gua. Temperatura: 20 C a 25 C. Introduzir em duas clulas com 1 cm de percurso ptico:
Branco Dosagem

Soluo 1 (4.1) a 20 C Soluo 2 (4.2) Soluo 3 (4.3) Amostra a dosear gua bidestilada

2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml

2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml 0,20 ml

0,20 ml

Misturar e, aps aproximadamente 3 minutos, ler a absorvncia das solues (A1). Em seguida, desencadear a reaco adicionando: Soluo 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Misturar e esperar 15 minutos. Medir a absorvncia e verificar a paragem da reaco aps 2 minutos (A2). Adicionar imediatamente: Soluo 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Misturar. Efectuar a leitura ao fim de 10 minutos. Verificar a paragem da reaco aps 2 minutos (A3). Determinar as diferenas de absorvncia A2A1, correspondente glucose, e A3A2, correspondente frutose, para o branco e para a amostra a dosear.

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Deduzir a diferena de absorvncias do branco (AB) da amostra a dosear (AD) e determinar: para a glucose: AG = ADAB para a frutose: AF = ADAB Nota: O tempo necessrio para a aco das enzimas pode variar de um lote para outro e referido apenas a ttulo indicativo. recomendvel que seja determinado para cada lote. 5.3. 5.3.1. Expresso dos resultados Clculo A frmula geral para clculo das concentraes a seguinte: C = (VPM)/(dv1 000)A (g/l), V = volume utilizado na dosagem (ml) v = volume de amostra (ml) PM = massa molecular da substncia a dosear d = percurso ptico na clula (cm) = coeficiente de absoro do NADPH a 340 nm = 6,3 (mmole1lcm1) V = 2,92 ml no caso do doseamento da glucose, V = 2,94 ml no caso do doseamento da frutose, v = 0,20 ml PM = 180, d = 1. Obtm-se: para a glucose: C g/l = 0,417AG para a frutose: C g/l = 0,420AF Se tiver sido efectuada uma diluio na preparao da amostra, multiplica-se o resultado pelo factor F. Nota: Se as medies forem feitas nos comprimentos de onda de 334 nm ou 365 nm, obtm-se: medio a 334 nm: = 6,2 (mmole1lcm1) para a glucose: C g/l = 0,425AG, para a frutose: C g/l = 0,428AF. medio a 365 nm: = 3,4 (mmole1lcm1) para a glucose: C g/l = 0,773AG, para a frutose: C g/l = 0,778AF. 5.3.2. Repetibilidade (r) r = 0,056 xi 5.3.3. Reprodutibilidade (R) R = 0,12 + 0,076xi xi = teor de glucose ou de frutose, em g/l.

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7 DOSAGEM DOS ACARES (SACAROSE) POR HPLC (OIVAS31103SUCRES) MTODO DO TIPO II (p.m.) [As instncias da OIV esto a actualizar o descritivo deste mtodo de anlise. Esse descritivo ser publicado numa prxima comunicao da Comisso quando a OIV publicar um texto actualizado, na edio de 2010 do seu Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicao, remete-se, a ttulo indicativo, para o captulo 6, ponto 3, do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 da Comisso.]

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8 DETECO, POR RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR DE DEUTRIO, DO ENRIQUECIMENTO DE MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS E VINHOS (OIV-AS-311-05-ENRRMN) MTODO DO TIPO I (p.m.) [As instncias cientficas da OIV esto a reexaminar o descritivo deste mtodo de anlise. Esse descritivo ser publicado numa comunicao da Comisso quando a Assembleia-Geral da OIV adoptar um texto definitivo. Enquanto se aguarda essa deciso da OIV, remete-se, a ttulo indicativo, para o captulo 8 do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 da Comisso.]

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9 TTULO ALCOOMTRICO VOLMICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) MTODO DO TIPO I (p.m.) [As instncias da OIV esto a actualizar os descritivos destes mtodos de anlise. Esses descritivos sero publicados numa prxima comunicao da Comisso quando a OIV publicar um texto actualizado, na edio de 2010 do seu Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos. Enquanto se aguarda essa publicao da OIV, remete-se, a ttulo indicativo, para o captulo 3 do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 da Comisso.]

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10 DETERMINAO, POR ESPECTROMETRIA DE MASSA ISOTPICA, DA RAZO ISOTPICA 13C/12C DO ETANOL DO VINHO OU DO ETANOL OBTIDO POR FERMENTAO DE MOSTOS DE UVAS, MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS OU MOSTOS DE UVAS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06-ETHANO) MTODO DO TIPO II 1. DOMNIO DE APLICAO O presente mtodo permite determinar a razo isotpica 13C/12C do etanol do vinho e do etanol obtido por fermentao de produtos vitcolas (mosto de uvas, mosto de uvas concentrado, mosto de uvas concentrado rectificado). 2. REFERNCIAS NORMATIVAS ISO: 5725:1994 Fidelidade dos mtodos de ensaio Determinao da repe tibilidade e da reprodutibilidade de um mtodo de ensaio normalizado por recurso a ensaios interlaboratoriais. Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).

V-PDB: Mtodo AS-311-05-ENRRMN da OIV:

Deteco, por ressonncia magntica nuclear de deutrio (RMN-FINE), do enriquecimento de mostos de uvas, mostos de uvas concentrados, mostos de uvas concentrados rectificados e vinhos.

3.

TERMOS E DEFINIES
13C/12C:

Razo isotpica do carbono (13C em relao ao amostra.

12C)

numa determinada

13C: RMN-FINE:

Teor de carbono 13 (13C), expresso em permilagem (). Fraccionamento Isotpico Natural Especfico, estudado por Ressonncia Magntica Nuclear. Vienna-Pee-Dee Belemnite. A PDB, referncia primria para a determina o das variaes naturais de teores isotpicos de carbono 13, um carbonato de clcio proveniente de um esporo de belemnite do Cret cico da formao Pee-Dee da Carolina do Sul (Estados Unidos da Am rica). A sua razo isotpica 13C/12C ou RPDB RPDB = 0,0112372. A PDB encontra-se esgotada h muito, mas continua a ser a referncia primria utilizada para exprimir as variaes naturais de teores isotpicos de car bono 13, pela qual so calibrados os materiais de referncia disponveis na Agncia Internacional da Energia Atmica (AIEA), em Viena (ustria). Por conveno, as determinaes isotpicas de abundncias naturais de carbono 13 so, portanto, expressas em relao V-PDB. Razo massa/carga.

V-PDB:

m/z: 4. PRINCPIO

A assimilao de dixido de carbono pelas plantas na fotossntese realiza-se por duas vias metablicas principais, o metabolismo C3 (ciclo de Calvin) e o metabolismo C4 (Hatch e Slack). Estes dois mecanismos de fotossntese apresentam um fraccionamento isotpico diferente. Por conseguinte, os produtos, como os acares e o lcool de fermentao, provenientes de plantas C4 possuem teores de carbono 13 superiores aos dos seus homlogos provenientes de plantas C3. A maior parte das plantas, nomeadamente a vinha e a beterraba, pertencem ao grupo C3. A cana-de-acar e o milho pertencem ao grupo C4. A determinao do teor de carbono 13 possibilita, pois, a deteco e quantificao do acar de origem C4 (acar de cana ou isoglucose de milho) adicionado aos produtos da vinha (mostos de uvas, vinho, etc.). A combinao de informaes relativas ao teor de carbono 13 com informaes obtidas por RMN-FINE permite tambm quantificar a adio de misturas de acares ou lcoois provenientes de plantas C3 e C4. Determina-se o teor de carbono 13 no dixido de carbono resultante da combusto completa da amostra. A partir das correntes inicas medidas em trs colectores diferentes de um espectrmetro de massa isotpico, determinam-se as abundncias dos principais isotopmeros, de massa 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 e 12C17O16O) e 46 (12C16O18O), resultantes das diversas combinaes possveis dos istopos 18O, 17O, 16O, 13C e 12C. As contribuies dos isotopmeros 13C17O16O e 12C17O2 podem ser desprezadas, devido fraca

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abundncia dos mesmos. Corrige-se a corrente inica correspondente a m/z = 45 de modo ter em conta a contribuio do 12C17O16O, que calculada em funo da intensidade da corrente medida para m/z = 46 e considerando a abundncia relativa de 18O e 17O (correco de Craig). A comparao com uma referncia calibrada pela referncia internacional V-PDB permite calcular o teor de carbono 13 na escala relativa de 13C. 5. REAGENTES Os materiais e consumveis dependem do equipamento (6) utilizado pelo laboratrio. Os sistemas geralmente utilizados baseiam-se num analisador elementar, que pode ser equipado para a introduo de amostras colo cadas em cpsulas metlicas seladas ou para a injeco de amostras lquidas com uma seringa atravs de um septo. Consoante o tipo de instrumentos utilizado, podem utilizar-se os seguintes materiais de referncia, reagentes e consumveis: Materiais de referncia: fornecidos pela AIEA:
Denominao Material 13C em relao V-PDB (9)

IAEA-CH-6 IAEA-CH-7 NBS22 USGS24

sacarose polietileno leo grafite

10,4 31,8 29,7 16,1

fornecidos pelo IMMR de Geel (B) (Instituto de Materiais e Medies de Referncia):


Denominao Material 13C em relao V-PDB (9)

CRM/BCR 656 CRM/BCR 657 CRM/BCR 660

lcool de vinho glucose soluo hidroalcolica (ttulo al coomtrico volmico: 12 %)


13C/12C

26,93 10,75 26,72 %

Amostra-padro de trabalho, com uma relao internacionais.

conhecida, calibrada por materiais de referncia

Lista indicativa de consumveis estabelecida para sistemas de fluxo contnuo: hlio de qualidade analtica (CAS 07440-59-7), oxignio de qualidade analtica (CAS 07782-44-7), dixido de carbono de qualidade analtica, utilizado como gs de referncia secundrio para o teor de carbono 13 (CAS 00124-38-9), reagente de oxidao para o forno do sistema de combusto por exemplo xido de cobre () para anlise elementar (CAS 1317-38-0), exsicante destinado a eliminar a gua produzida pela combusto por exemplo anidrona (perclorato de magnsio) para anlise elementar (CAS 10034-81-8). No necessrio no caso de equipamentos munidos de um sistema de eliminao de gua por criorreteno ou por um capilar de permeabilidade selectiva). 6. 6.1. EQUIPAMENTO E MATERIAL Espectrmetro de massa de razo isotpica Espectrmetro de massa de razo isotpica que permita determinar o teor natural relativo de 13C do CO2 gasoso com a preciso interna de 0,05 ou mais, expressa em valor relativo (ponto 9). A preciso interna aqui definida como a diferena entre duas medies da mesma amostra de CO2. Os espectrmetros de massa destinados medir razes isotpicas dispem geralmente de um colector triplo, para medir em simultneo as intensidades correspondentes a m/z = 44, 45 e 46. O espectrmetro de massa de razo isotpica utilizado deve dispor tambm de um sistema duplo de introduo da amostra, para efectuar alternadamente medies da amostra desconhecida e da amostra de referncia, ou de um sistema integrado que efectue a combusto quantitativa das amostras e separe o dixido de carbono dos restantes produtos de combusto antes das determinaes de espectrometria de massa.

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6.2.

Dispositivo de combusto Dispositivo de combusto que permita converter quantitativamente etanol em dixido de carbono e eliminar todos os restantes produtos de combusto, incluindo a gua, sem fraccionamento isotpico. O dispositivo pode consistir num sistema de fluxo contnuo integrado no espectrmetro de massa (ponto 6.2.1) ou num sistema de combusto autnomo (ponto 6.2.2). O dispositivo em causa deve permitir obter uma preciso pelo menos equivalente indicada no ponto 11.

6.2.1.

Sistemas de fluxo contnuo Estes sistemas so constitudos por um analisador elementar ou por um cromatgrafo de fase gasosa equipado de um sistema de combusto em linha. No caso dos sistemas equipados para a introduo de amostras contidas em cpsulas metlicas, utiliza-se o seguinte material de laboratrio: microsseringa ou micropipeta volumtrica, com pontas adequadas, balana com aproximao mnima de 1 g, pinas encapsuladoras, cpsulas de estanho para amostras lquidas, cpsulas de estanho para amostras slidas. Nota: Para reduzir o risco de evaporao das amostras de etanol, possvel colocar nas cpsulas um material absorvente (por exemplo chromosorb W 45-60 mesh), desde que se verifique previamente, atravs de um ensaio em branco, que o mesmo no contm quantidades significativas de carbono, que possam alterar as medies. Em caso de utilizao de um analisador elementar dotado de um injector para lquidos, ou se for utilizado um sistema de preparao por cromatografia-combusto, utiliza-se o seguinte material de laboratrio: seringa para lquidos, frascos com sistema de vedao estanque e septo inerte. O material de laboratrio das listas acima indicado a ttulo de exemplo e pode ser substitudo por outro de desempenho equivalente, em funo do dispositivo de combusto e do espectrmetro de massa utilizados pelo laboratrio.

6.2.2.

Sistemas autnomos de preparao Neste caso, as amostras de dixido de carbono resultantes da combusto das amostras a analisar e da amostra de referncia so recolhidas em ampolas, as quais so em seguida instaladas no sistema duplo de entrada do espectrmetro para realizao da anlise isotpica. Podem utilizar-se diversos tipos de dispositivos de com busto descritos na literatura: sistema de combusto fechado, com oxignio gasoso em circulao, analisador elementar, com fluxo de hlio e de oxignio, ampola de vidro selada, com um enchimento de xido de cobre () como agente de oxidao.

7.

PREPARAO DAS AMOSTRAS PARA AS ANLISES necessrio extrair o etanol do vinho antes da determinao isotpica. Efectua-se a extraco por destilao do vinho, como se descreve no ponto 3.1 do mtodo RMNFINE (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN). No caso do mosto de uvas, do mosto de uvas concentrado e do mosto de uvas concentrado rectificado, os acares so primeiro fermentados, com formao de etanol, como descrito no ponto 3.2 do mtodo RMN-FINE (OIVMAAS31105ENRRMN).

8.

PROCEDIMENTO Todas as etapas da preparao devem ser efectuadas sem perdas significativas de etanol por evaporao, facto que alteraria a composio isotpica da amostra.

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A descrio que se segue diz respeito aos procedimentos geralmente utilizados para a combusto de amostras de etanol em sistemas automatizados de combusto disponveis no comrcio. Pode utilizar-se qualquer outro mtodo de preparao do dixido de carbono para a anlise isotpica que assegure a converso quantitativa da amostra de etanol em dixido de carbono, sem perdas de etanol por evaporao. Procedimento experimental baseado na utilizao de um analisador elementar: a) Colocao das amostras em cpsulas: utilizar cpsulas, uma pina encapsuladora e uma placa de preparao limpas, com a pina encapsuladora, pegar numa cpsula de dimenso adequada, com a micropipeta, introduzir na cpsula o volume necessrio de lquido, Nota: So necessrios 3,84 mg de etanol absoluto ou 4,17 mg de destilado com ttulo alcolico de 92 % (m/m) para obter 2 mg de carbono; calcular nesta base a quantidade adequada de destilado, atendendo quantidade de carbono necessria em funo da sensibilidade do espectrmetro de massa. vedar as cpsulas, utilizando a pina encapsuladora, cada cpsula deve ficar vedada de forma totalmente estanque; caso contrrio, deve ser rejeitada, pre parando-se uma nova cpsula, preparar duas cpsulas para cada amostra, colocar as cpsulas, numa posio adequada, na placa do amostrador automtico do analisador ele mentar; cada cpsula deve ser cuidadosamente identificada por um nmero de ordem, colocar sistematicamente, no incio e no final de cada srie de amostras, cpsulas com as referncias de trabalho, inserir regularmente amostras de controlo na srie de amostras; b) Verificao e regulao do analisador elementar e do espectrmetro de massa: regular a temperatura dos fornos do analisador elementar e os fluxos de hlio e de oxignio, para optimizar a combusto da amostra, verificar a ausncia de fugas no sistema de anlise elementar e de espectrometria de massa (por exemplo verificando a corrente inica para m/z = 28, correspondente ao N2), regular o espectrmetro de massa para medir as intensidades das correntes inicas para m/z = 44, 45 e 46, utilizando amostras de controlo conhecidas, verificar o sistema antes de iniciar medies com as amostras. c) Realizao de uma srie de medies As amostras colocadas no amostrador automtico do analisador elementar (ou do cromatgrafo) so introduzidas sucessivamente. O dixido de carbono produzido pela combusto de cada amostra eludo para o espectrmetro de massa, no qual so medidas as correntes inicas. O computador acoplado ao equipamento regista as intensidades das correntes inicas e calcula os valores de correspondentes a cada amostra (ponto 9). 9. CLCULOS O objectivo do mtodo determinar a razo isotpica 13C/12C do etanol extrado do vinho ou de produtos da fermentao de uvas. A razo isotpica 13C/12C pode ser expressa pelo seu desvio relativamente a uma referncia de trabalho. Nesse caso, o desvio isotpico do carbono 13 (13C) calculado, numa escala /1 000, por comparao dos resultados obtidos para a amostra a analisar com os resultados obtidos para a referncia de trabalho, previamente calibrada pela referncia primria internacional (VPDB). Os valores de 13C so expressos em relao referncia de trabalho, de acordo com a frmula: 13Camostra/ref = 1 000(RamostraRref)/Rref, em que Ramostra e Rref so, respectivamente, as razes isotpicas utilizado como gs de referncia.
13C/12C

da amostra e do dixido de carbono

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Os valores de 13C so ento expressos em relao V-PDB de acordo com a frmula: 13Camostra/V-PDB = 13Camostra/ref+ 13Cref/V-PDB+(13Camostra/ref13Cref/V-PDB)/1 000 em que 13Cref/V-PDB o desvio isotpico previamente determinado para a referncia de trabalho em relao VPDB. Durante a medio em linha, podero observar-se pequenos desvios atribuveis variao das condies instrumentais. Nesse caso, os valores de 13C das amostras devem ser corrigidos em funo da diferena entre o valor de 13C medido para a referncia de trabalho e o valor real correspondente, previamente calibrado pela V-PDB por comparao com um dos materiais de referncia internacionais. Pode presumir-se que, entre duas medies com a referncia de trabalho, o desvio e, consequentemente, a correco a aplicar aos resultados obtidos para as amostras, so lineares. Deve efectuar-se uma medio com a referncia de trabalho no incio e no final de cada srie de amostras. Poder assim calcular-se, por interpolao linear, a correco aplicvel a cada amostra. 10. GARANTIA E CONTROLO DA QUALIDADE Verificar se o valor de 13C para a referncia de trabalho no excede em mais de 0,5 o valor admitido. Caso contrrio, verificar e, eventualmente, reajustar as regulaes do espectrmetro. Verificar, para cada amostra, se a diferena de resultados entre duas cpsulas, medidas sucessivamente, inferior a 0,3 . Nestas condies, o resultado final de uma determinada amostra o valor mdio das duas cpsulas. Se o desvio for superior a 0,3 , devem repetir-se as medies. Para verificar se as medies esto a ser correctamente efectuadas, pode medir-se a intensidade da corrente inica para m/z = 44, que proporcional quantidade de carbono injectada no analisador elementar. Em condies normais, a intensidade desta corrente inica deve ser praticamente constante para todas as amostras em anlise. A ocorrncia de desvios significativos pode ser devida evaporao de etanol (por exemplo uma cpsula mal vedada) ou a uma instabilidade do analisador elementar ou do espectrmetro de massa. 11. CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO DO MTODO (PRECISO) Foi realizado um primeiro estudo de colaborao interlaboratorial (ponto 11.1) com destilados alcolicos de origem vnica, de cana e de beterraba, bem como com diversas misturas destas trs origens. Uma vez que o estudo no abrangeu a etapa de destilao, foram tambm utilizadas informaes complementares provenientes de outros ensaios interlaboratoriais realizados com vinhos (ponto 11.2), nomeadamente testes interlaboratoriais de aptido (ponto 11.3) para medies isotpicas. Os resultados demonstram que a utilizao em condies satisfatrias dos diversos sistemas de destilao, nomeadamente de sistemas adaptados s medies RMNFINE, no introduz variabilidade significativa nas determinaes do 13C do etanol do vinho. Os parmetros de fiabilidade observados para os vinhos so praticamente idnticos aos obtidos no estudo de colaborao interlaboratorial (ponto 11.1) com destilados. 11.1. Estudo de colaborao interlaboratorial com destilados Ano do ensaio interlaboratorial: 1996 Nmero de laboratrios: Nmero de amostras: Parmetro determinado: 20 6 amostras em duplicado, em teste cego 13C do etanol

Cdigo das amostras

lcool de origem vnica

lcool de beterraba

lcool de cana

A & G B & C D & F E & I H & K J& L

80 % 90 % 0% 90 % 100 % 0%

10 % 10 % 100 % 0% 0% 0%

10 % 0% 0% 10 % 0% 100 %

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Amostras

A/G

B/C

D/F

E/I

H/K

J/L

Nmero de laboratrios considerado, aps eliminao dos resultados anmalos Nmero de resultados aceite Valor mdio (13C) () Sr2 Desvio-padro de repetibilidade (Sr) () Limite de repetibilidade, r (2,8Sr) () SR2 Desvio-padro de reprodutibilidade (SR) () Limite de reprodutibilidade, R (2,8SR) ()

19 38 25,32 0,0064 0,08 0,22 0,0389 0,20 0,55

18 36 26,75 0,0077 0,09 0,25 0,0309 0,18 0,49

17 34 27,79 0,0031 0,06 0,16 0,0382 0,20 0,55

19 38 25,26 0,0127 0,11 0,32 0,0459 0,21 0,60

19 38 26,63 0,0069 0,08 0,23 0,0316 0,18 0,50

19 38 12,54 0,0041 0,06 0,18 0,0584 0,24 0,68

11.2.

Estudo interlaboratorial de dois vinhos e um lcool Ano do ensaio interlaboratorial: 1996 Nmero de laboratrios: 14 no respeitante destilao dos vinhos, dos quais sete tambm para a determinao do 13C do etanol vnico, oito no respeitante medio do 13C da amostra de lcool. trs (vinho branco com ttulo alcoomtrico volmico de 9,3 %; vinho branco com ttulo alcoomtrico volmico de 9,6 %; lcool com ttulo alcoomtrico mssico de 93 %). 13C do etanol.

Nmero de amostras:

Parmetro determinado:

Amostras

Vinho tinto

Vinho branco

lcool

Nmero de laboratrios Nmero de resultados aceite Valor mdio (13C) () Varincia de reprodutibilidade, SR2 Desvio-padro de reprodutibilidade (SR) () Limite de reprodutibilidade, R (2,8SR) ()

7 7 26,20 0,0525 0,23 0,64

7 7 26,20 0,0740 0,27 0,76

8 8 25,08 0,0962 0,31 0,87

Os laboratrios participantes utilizaram diversos sistemas de destilao. As determinaes isotpicas de 13C realizadas num nico laboratrio ao conjunto dos destilados enviados pelos participantes no mostram valores anmalos nem valores significativamente distintos dos valores mdios. A varincia dos resultados (S2 = 0,0059) comparvel s varincias de repetibilidade, Sr2do estudo de colaborao interlaboratorial com destilados (11.1). 11.3. Resultados dos testes interlaboratoriais de aptido para determinaes isotpicas Desde Dezembro de 1994 que tm vindo a ser organizados regularmente testes internacionais de aptido para determinaes isotpicas em vinhos e lcoois (destilados com ttulo alcoomtrico volmico de 96 %). Os resultados obtidos permitem aos laboratrios participantes ter uma noo da qualidade das suas anlises. A explorao estatstica dos resultados permite avaliar a variabilidade das determinaes em condies de re produtibilidade e, consequentemente, estimar os parmetros de varincia e limite de reprodutibilidade. Os resultados obtidos nas determinaes do 13C do etanol vnico e dos destilados so resumidos no quadro seguinte:

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Data

Vinhos N SR S R2 R N SR

Destilados SR2 R

Dezembro de 1994 Junho de 1995 Dezembro de 1995 Maro de 1996 Junho de 1996 Setembro de 1996 Dezembro de 1996 Maro de 1997 Junho de 1997 Setembro de 1997 Dezembro de 1997 Maro de 1998 Junho de 1998 Setembro de 1998 Mdia ponderada

6 8 7 9 8 10 10 10 11 12 11 12 12 11

0,210 0,133 0,075 0,249 0,127 0,147 0,330 0,069 0,280 0,237 0,127 0,285 0,182 0,264 0,215

0,044 0,018 0,006 0,062 0,016 0,022 0,109 0,005 0,079 0,056 0,016 0,081 0,033 0,070 0,046

0,59 0,37 0,21 0,70 0,36 0,41 0,92 0,19 0,78 0,66 0,36 0,80 0,51 0,74 0,60

6 8 8 11 8 11 9 8 11 11 12 13 12 12

0,151 0,147 0,115 0,278 0,189 0,224 0,057 0,059 0,175 0,203 0,156 0,245 0,263 0,327 0,209

0,023 0,021 0,013 0,077 0,036 0,050 0,003 0,003 0,031 0,041 0,024 0,060 0,069 0,107 0,044

0,42 0,41 0,32 0,78 0,53 0,63 0,16 0,16 0,49 0,57 0,44 0,69 0,74 0,91 0,59

N: nmero dos laboratrios participantes.

11.4.

Limites de repetibilidade e de reprodutibilidade Os dados dos diversos estudos interlaboratoriais apresentados nos quadros precedentes permitem estabelecer para o presente mtodo, incluindo a etapa de destilao, os seguintes limites de repetibilidade e de reprodu tibilidade: Limite de repetibilidade, r: 0,24 Limite de reprodutibilidade, R: 0,6.

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11 ACIDEZ TOTAL (OIV - AS-313-01-ACITOT) MTODO DO TIPO I 1. DEFINIO A acidez total a soma das acidezes titulveis quando se leva o pH a 7 por adio de uma soluo alcalina titulada. O dixido de carbono no est includo na acidez total. 2. PRINCPIO DO MTODO Titulao potenciomtrica ou titulao em presena de azul de bromotimol (indicador de fim da reaco), por comparao com um padro de cor. 3. 3.1. REAGENTES Soluo-tampo de pH 7,0: Fosfato monopotssico (KH2PO4): 107,3 g, Soluo 1 M de hidrxido de sdio (NaOH): 500 ml, gua: q. b. para 1 000 ml. Podem ser utilizadas as solues-tampo de referncia comerciais. 3.2. 3.3. Soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (NaOH). Soluo a 4 g/l de azul de bromotimol: Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S) ................................................................................................ ................... lcool neutro a 96 % vol ................................................................................................ ......................................... Aps dissoluo, juntar: gua isenta de CO2 ................................................................................................ .................................................... Soluo 1 M de hidrxido de sdio q. b. para colorao azul esverdeada (pH 7) ................................................................................................ ...... 7,5 ml 200 ml 4g 200 ml

gua, q. b. para ................................................................................................ ........................................................... 1,000 ml 4. 4.1. 4.2. 4.3. EQUIPAMENTO Trompa de vcuo a gua. Balo de vcuo de 500 ml. Potencimetro de escala calibrada em unidades de pH, munido de elctrodos. O elctrodo de vidro deve ser conservado em gua destilada. O elctrodo de calomelanos-cloreto de potssio saturado deve ser conservado numa soluo saturada de cloreto de potssio. mais frequentemente utilizado um elctrodo combinado, que deve ser conservado em gua destilada. Copos de 50 ml (vinhos) e de 100 ml (mostos concentrados rectificados). PROCEDIMENTO Preparao da amostra Vinhos Para eliminar o dixido de carbono, colocar cerca de 50 ml de vinho num balo de vcuo; agitar e, simul taneamente, fazer vcuo com a trompa de gua. A agitao deve durar 1 a 2 minutos. 5.1.2. Mostos concentrados rectificados Introduzir 200 g de mosto concentrado rectificado, pesados com exactido, num balo aferido de 500 ml. Completar o volume com gua at ao trao de aferio. Homogeneizar.

4.4. 5. 5.1. 5.1.1.

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5.2. 5.2.1.

Titulao potenciomtrica Calibrao do potencimetro Calibrar o potencimetro para 20 C, seguindo as instrues de utilizao do aparelho, com a soluo-tampo de pH 7,00, a 20 C.

5.2.2.

Medio Deitar num copo (ponto 4.4) um volume de amostra, preparado como se indica no ponto 5.1, de 10 ml no caso do vinho e 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Juntar aproximadamente 10 ml de gua destilada e deitar com uma bureta soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (ponto 3.2) at atingir pH 7,0, a 20 C. Adicionar lentamente o titulante alcalino, agitando sempre a soluo. Seja n o volume, em mililitros, de soluo 0,1 M de NaOH adicionado.

5.3. 5.3.1.

Titulao com indicador (azul de bromotimol) Ensaio prvio: preparao do padro de cor Deitar num copo (ponto 4.4) 25 ml de gua destilada fervida, 1 ml de soluo de azul de bromotimol (ponto 3.3) e um volume de amostra (preparada como se indica no ponto 5.1) de 10 ml no caso do vinho e 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Adicionar soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (ponto 3.2) at se obter uma colorao azul esverdeada. Juntar 5 ml da soluo-tampo de pH 7 (ponto 3.1).

5.3.2.

Dosagem Deitar num copo (ponto 4.4) 30 ml de gua destilada fervida, 1 ml de soluo de azul de bromotimol (ponto 3.3) e um volume de amostra, preparado como se indica no ponto 5.1, de 10 ml no caso do vinho e 50 ml no caso do mosto concentrado rectificado. Adicionar soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (ponto 3.2) at se obter uma colorao idntica obtida no ensaio prvio (ponto 5.3.1). Seja n o volume, em mililitros, de soluo 0,1 M de hidrxido de sdio adicionado.

6. 6.1. 6.1.1.

EXPRESSO DOS RESULTADOS Modo de clculo Vinhos A acidez total expressa em miliequivalentes por litro dada por: A = 10n Exprime-se com uma casa decimal. A acidez total expressa em gramas de cido tartrico por litro dada por: A = 0,075A Exprime-se com uma casa decimal.

6.1.2.

Mostos concentrados rectificados Acidez total expressa em miliequivalentes por quilograma de mosto concentrado rectificado: a = 5n; Acidez total expressa em miliequivalentes por quilograma de acares totais: A = 500n/(P) P = percentagem mssica de acares totais. Exprime-se com uma casa decimal.

6.2.

Repetibilidade (r) da titulao com indicador (5.3) r = 0,9 meq/l r = 0,07 gramas de cido tartrico por litro, no caso dos vinhos brancos, rosados e tintos.

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6.3.

Reprodutibilidade (R) da titulao com indicador (5.3) Vinhos brancos e rosados: R = 3,6 meq/l R = 0,3 gramas de cido tartrico por litro. Vinhos tintos: R = 5,1 meq/l R = 0,4 gramas de cido tartrico por litro.

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12 ACIDEZ VOLTIL (OIV - AS-313-02-ACIVOL) MTODO DO TIPO I 1. DEFINIO A acidez voltil constituda pelos cidos da srie actica que se encontram no vinho, no estado livre ou na forma de sais. 2. PRINCPIO DO MTODO Titulao dos cidos volteis, separados do vinho por arrastamento com vapor de gua e rectificao dos vapores. Elimina-se previamente o dixido de carbono do vinho. A acidez do dixido de enxofre livre e do dixido de enxofre combinado destilados nestas condies deve ser descontada da acidez do destilado. A acidez do cido srbico eventualmente adicionado ao vinho deve igualmente ser descontada. Nota: O cido saliclico utilizado em alguns pases para estabilizar os vinhos antes das anlises passa em parte para o destilado. necessrio dose-lo e descont-lo acidez. O mtodo de doseamento descrito no ponto 7 deste captulo. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. REAGENTES cido tartrico cristalizado (C4H6O6). Soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (NaOH). Soluo a 1 % de fenolftalena em lcool neutro a 96 % vol. cido clordrico (20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diludo 1:4 (v/v). Soluo 0,005 M de iodo (I2). Iodeto de potssio cristalizado (KI). Goma de amido a 5 g/l: Dissolver 5 g de amido em aproximadamente 500 ml de gua. Levar ebulio, agitando e mantendo a ebulio durante 10 minutos; adicionar 200 g de cloreto de sdio. Completar o volume at um litro depois de arrefecer. 3.8. 4. 4.1. Soluo saturada, aproximadamente 55 g/l a 20 C, de borato de sdio (Na2XB4O7, 10H2O). EQUIPAMENTO Dispositivo de arrastamento com vapor de gua constitudo por: 1) Gerador de vapor de gua; o vapor de gua produzido deve estar isento de dixido de carbono; 2) Borbulhador; 3) Coluna rectificadora; 4) Condensador. Este dispositivo deve cumprir os critrios dos trs ensaios seguintes: a) Colocar no borbulhador 20 ml de gua fervida. Recolher 250 ml de destilado. Adicionar ao destilado 0,1 ml de soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (ponto 3.2) e 2 gotas de soluo de fenolftalena (ponto 3.3). A colorao rosa deve manter-se estvel durante, pelo menos, 10 segundos (vapor de gua isento de dixido de carbono). b) Colocar no borbulhador 20 ml de uma soluo 0,1 M de cido actico. Recolher 250 ml de destilado. Titular com a soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (ponto 3.2). O volume utilizado deve ser igual ou superior a 19,9 ml (cido actico arrastado 99,5 %).

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c) Colocar no borbulhador 20 ml de uma soluo 1 M de cido lctico. Recolher 250 ml de destilado. Titular com a soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (ponto 3.2). O volume utilizado deve ser inferior ou igual a 1,0 ml (cido lctico destilado 0,5 %). Qualquer dispositivo ou tcnica que satisfaa estes ensaios equivale a um dispositivo ou tcnica oficial inter nacional. 4.2. 4.3. 5. 5.1. Trompa de vcuo a gua. Balo de vcuo. PROCEDIMENTO Preparao da amostra: eliminao do dixido de carbono Colocar cerca de 50 ml de vinho num balo de vcuo. Agitar e, simultaneamente, fazer vcuo com a trompa de gua. A agitao deve durar 1 a 2 minutos. 5.2. Arrastamento com vapor de gua Colocar no borbulhador 20 ml de vinho do qual foi eliminado o dixido de carbono como se indica no ponto 5.1. Juntar aproximadamente 0,5 g de cido tartrico (ponto 3.1). Recolher pelo menos 250 ml de destilado. 5.3. Titulao Titular com a soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (ponto 3.2) em presena de duas gotas de soluo de fenolftalena (ponto 3.3). Seja n ml o volume utilizado. Adicionar 4 gotas de cido clordrico diludo 1:4 (ponto 3.4), 2 ml de goma de amido (ponto 3.7) e alguns cristais de iodeto de potssio (ponto 3.6). Titular o dixido de enxofre livre com a soluo 0,005 M de iodo (3.5). Seja n ml o volume utilizado. Juntar soluo saturada de borato de sdio (ponto 3.8) at ao reaparecimento da colorao rosa. Titular o dixido de enxofre combinado com a soluo 0,005 M de iodo (ponto 3.5). Seja n ml o volume utilizado. 6. 6.1. EXPRESSO DOS RESULTADOS Modo de clculo A acidez voltil expressa em miliequivalentes por litro, com uma casa decimal, dada por: A = 5(n0,1n0,05n) A acidez voltil expressa em gramas de cido actico por litro, com duas casas decimais, dada por: 0,300(n0,1n0,05n) 6.2. Repetibilidade (r) r = 0,7 meq/l, r = 0,04 gramas de cido actico por litro. 6.3. Reprodutibilidade (R) R = 1,3 meq/l, R = 0,08 gramas de cido actico por litro. 6.4. Vinhos adicionados de cido srbico Dado que, no caso de um volume de destilado de 250 ml, a percentagem do cido srbico arrastado pelo vapor de gua de 96 %, a acidez correspondente deve ser descontada acidez voltil, tendo em conta que 100 mg de cido srbico correspondem a 0,89 miliequivalentes de acidez, ou a 0,053 g de cido actico, e conhecendo o teor de cido srbico (mg/l) determinado pelo mtodo correspondente. 7. 7.1. DOSAGEM DO CIDO SALICLICO ARRASTADO PARA O DESTILADO DA ACIDEZ VOLTIL Princpio Depois da dosagem da acidez voltil e da correco devida ao dixido de enxofre, identifica-se a presena de cido saliclico, aps acidificao, pela colorao violeta resultante da adio de um sal de ferro (III).

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Efectua-se a dosagem do cido saliclico arrastado, com a acidez voltil, para o destilado num segundo destilado de volume igual ao utilizado para a dosagem da acidez voltil. Doseia-se o cido saliclico nesse destilado por um mtodo colorimtrico de comparao, sendo o teor obtido descontado acidez do destilado da acidez voltil. 7.2. 7.2.1. 7.2.2. 7.2.3. 7.2.4. 7.3. 7.3.1. Reagentes cido clordrico (HCl) (20 = 1,18 to 1,19 g/ml). Tiossulfato de sdio (Na2S2O3 5 H2O) 0,1 M. Soluo a 10 % (m/v) de sulfato de ferro (III) e amnio (Fe2(SO4)3(NH4)2SO424H2O). Soluo 0,01 M de salicilato de sdio (1,60 gramas de salicilato de sdio, NaC7H5O3, por litro). Procedimento Identificao do cido saliclico no destilado da acidez voltil Imediatamente aps a dosagem da acidez voltil e a correco devida ao dixido de enxofre livre e combinado, juntar ao erlenmeyer 0,5 ml de cido clordrico (ponto 7.2.1), 3 ml da soluo 0,1 M de tiossulfato de sdio (ponto 7.2.2) e 1 ml da soluo de sulfato de ferro (III) e de amnio (ponto 7.2.3). Em presena de cido saliclico, surge uma colorao violeta. 7.3.2. Dosagem do cido saliclico No erlenmeyer referido, marcar com um trao de referncia o volume de destilado. Esvaziar e lavar o erlenmeyer. Submeter uma nova toma de 20 ml de vinho a arrastamento com vapor de gua e recolher o destilado no erlenmeyer at ao trao de referncia. Juntar 0,3 ml de cido clordrico puro (ponto 7.2.1) e 1 ml da soluo de sulfato de ferro (III) e de amnio (ponto 7.2.3). O contedo do erlenmeyer adquire colorao violeta. Num erlenmeyer idntico ao erlenmeyer com o trao de referncia, deitar gua destilada at ao mesmo nvel que o do destilado. Juntar 0,3 ml de cido clordrico puro (ponto 7.2.1) e 1 ml da soluo de sulfato de ferro (III) e de amnio (ponto 7.2.3). Deitar com uma bureta soluo 0,01 M de salicilato de sdio (ponto 7.2.4) at se obter uma colorao violeta da mesma intensidade que a do erlenmeyer que contm o destilado de vinho. Seja n o volume gasto (em mililitros). 7.4. Correco da acidez voltil Subtrair o volume 0,1 n ml ao volume n ml de soluo de hidrxido de sdio 0,1 M utilizado para titular a acidez do destilado na dosagem da acidez voltil.

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13 CIDO CTRICO (OIV -AS-313-09-ACIENZ) MTODO DO TIPO II 1. PRINCPIO DO MTODO Transformao do cido ctrico em oxaloacetato e acetato, numa reaco catalisada pela citrato-liase (CL): Citrato oxaloacetato + acetato. Reduo do oxaloacetato e do seu derivado de descarboxilao (piruvato) a L-malato e L-lactato, por aco do nicotinamida-adenina-dinucletido reduzido (NADH), na presena da malato-desidrogenase (MDH) e da lactato-desidrogenase (LDH): Oxaloacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+, Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+. Nestas reaces, a quantidade de NADH oxidado a NAD+ proporcional ao citrato presente. A oxidao do NADH medida pela diminuio da sua absorvncia no comprimento de onda 340 nm. 2. 2.1. REAGENTES Tampo de pH 7,8 (glicilglicina 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+: 0,610 3M): Dissolver 7,13 g de glicilglicina em aproximadamente 70 ml de gua bidestilada. Ajustar o pH a 7,8 com cerca de 13 ml de soluo 5 M de hidrxido de sdio (NaOH). Juntar 10 ml de soluo a 80 mg por 100 ml de cloreto de zinco, ZnCl2, e completar o volume at 100 ml com gua bidestilada. A + 4 C, esta soluo mantm-se estvel pelo menos 4 semanas. 2.2. Soluo aproximadamente 610-3 M de nicotinamida-adenina-dinucletido reduzido (NADH). Dissolver 30 mg de NADH e 60 mg de NaHCO3 em 6 ml de gua bidestilada. Soluo de malato-desidrogenase/lactato-desidrogenase (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml): Misturar 0,1 ml de MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml de soluo de sulfato de amnio (3,2 M) e 0,5 ml de LDH (5 mg/ml). A + 4 C, esta suspenso mantm-se estvel pelo menos um ano. 2.4. Citrato-liase (CL) (5 mg de protena/ml). Dissolver 168 mg do liofilizado em 1 ml de gua gelada. A + 4 C, esta soluo mantm-se estvel pelo menos uma semana; congelada, mantm-se estvel pelo menos 4 semanas. aconselhvel verificar a actividade da enzima antes da dosagem. 2.5. Polivinilpolipirrolidona (PVPP) Nota: Todos os reagentes necessrios esto comercializados. 3. 3.1. EQUIPAMENTO Espectrofotmetro que permita efectuar medies a 340 nm (mximo de absoro do NADH). Na falta de um espectrofotmetro que permita efectuar medies a 340 nm, utilizar um espectrofotmetro de espectro descontnuo que permita efectuar medies a 334 nm ou a 365 nm. Dado tratar-se de medies absolutas de absorvncia (no se recorre a uma calibrao, mas sim ao coeficiente de extino do NADH), as escalas de comprimentos de onda e de absorvncias do aparelho devem ser aferidas. 3.2. 3.3. 4. Clulas de vidro com 1 cm de percurso ptico, eventualmente descartveis. Micropipetas que permitam recolher volumes compreendidos entre 0,02 ml e 2 ml. PREPARAO DA AMOSTRA De um modo geral, a dosagem do citrato efectua-se directamente no vinho, sem descolorao prvia nem diluio, desde que o teor de cido ctrico seja inferior a 400 mg/l. Caso contrrio, diluir o vinho de modo que a concentrao de citrato se situe entre 20 mg/l e 400 mg/l (quantidade de citrato na toma para ensaio compreendida entre 5 g e 80 g).

2.3.

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aconselhvel tratar previamente com PVPP os vinhos tintos ricos em compostos fenlicos: Colocar em suspenso em gua aproximadamente 0,2 g de PVPP e deixar repousar 15 minutos. Filtrar com um filtro de pregas. Num erlenmeyer de 50 ml, juntar a 10 ml de vinho a PVPP hmida retirada do filtro com uma esptula. Agitar 2 a 3 minutos. Filtrar. 5. PROCEDIMENTO Com o espectrofotmetro regulado no comprimento de onda de 340 nm, efectuar as medies da absorvncia em clulas de 1 cm, regulando a absorvncia zero em relao ao ar (sem clula no percurso ptico). Introduzir nas clulas de 1 cm de percurso ptico: Branco Soluo 2.1 Soluo 2.2 Amostra gua bidestilada Soluo 2.3 1,00 ml 0,10 ml 2,00 ml 0,02 ml Dosagem 1,00 ml 0,10 ml 0,20 ml 1,80 ml 0,02 ml

Misturar e, aps cerca de 5 minutos, ler as absorvncias das solues branco e de dosagem (A1). Adicionar em seguida: Soluo 2.4 0,02 ml 0,02 ml

Misturar e esperar pelo fim da reaco (cerca de 5 minutos). Ler as absorvncias das solues branco e de dosagem (A2). Determinar as diferenas de absorvncias (A1A2) para o branco e para a soluo de dosagem. Deduzir a diferena de absorvncias do branco da soluo de dosagem. A = ADAT. Nota: O tempo necessrio para a aco das enzimas pode variar de um lote para outro e referido apenas a ttulo indicativo. Recomenda-se que seja determinado para cada lote. 6. EXPRESSO DOS RESULTADOS Apresenta-se o teor de cido ctrico em miligramas por litro (mg/l), sem casas decimais. 6.1. Modo de clculo A frmula geral para clculo da concentrao em miligramas por litro a seguinte: C = VPM/(dv)A V v = = volume utilizado na dosagem, em ml (neste caso, 3,14 ml) volume da amostra, em ml (neste caso, 0,2 ml) massa molecular da substncia a dosear (neste caso, cido ctrico anidro: 192,1) percurso ptico na clula, em cm (neste caso, 1 cm) coeficiente de absoro do NADH a 340 nm 6,3 mmole-1 l cm-1.

PM = d = = =

Obtm-se: C = 479A Se tiver sido efectuada uma diluio na preparao da amostra, multiplicar o resultado pelo factor de diluio. Nota: a 334nm: C = 488A ( = 6,2 mmole a 365 nm: C = 887A ( = 3,4 mmole
1 1

l cm 1)

l cm 1)

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6.2.

Repetibilidade (r) Teores de cido ctrico inferiores a 400 mg/l: r = 14 mg/l. Teores de cido ctrico superiores a 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3.

Reprodutibilidade (R) Teores de cido ctrico inferiores a 400 mg/l: R = 39 mg/l. Teores de cido ctrico superiores a 400 mg/l: R = 65 mg/l.

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14 CIDO SRBICO (OIV - AS-313-14-ACISOR) MTODO DO TIPO IV 1. 1.1. PRINCPIO DOS MTODOS Mtodo de dosagem por espectrofotometria de absoro no ultravioleta Extraco do cido srbico (cido trans,trans-hexa-2,4-dienico) por arrastamento com vapor de gua e dosagem do cido extrado no destilado de vinho por espectrofotometria de absoro no ultravioleta. Elimi nao das substncias que interferem na medio da absoro no ultravioleta, por evaporao at secura da toma para ensaio do destilado, ligeiramente alcalinizada com uma soluo de hidrxido de clcio. Os teores inferiores a 20 mg/l devem ser confirmados por cromatografia em camada fina (sensibilidade: 1 mg/l). 1.2. Mtodo de dosagem por cromatografia em fase gasosa Dosagem por cromatografia em fase gasosa, em presena de um padro interno, do cido srbico extrado com ter etlico. 1.3. Mtodo de pesquisa de vestgios por cromatografia em camada fina Separao, por cromatografia em camada fina, do cido srbico extrado com ter etlico e determinao semi-quantitativa da sua concentrao. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. MTODO DE DOSAGEM POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO NO ULTRAVIOLETA Reagentes cido tartrico (C4H6O6) cristalizado. Soluo aproximadamente 0,02 M de hidrxido de clcio, Ca(OH)2. Soluo de referncia, a 20 mg por litro, de cido srbico Dissolver 20 mg de cido srbico, C6H8O2, em aproximadamente 2 ml de soluo 0,1 M de hidrxido de sdio. Transferir para um balo aferido de 1 000 ml e completar o volume com gua at ao trao de aferio. Pode, igualmente, dissolver-se 26,8 mg de sorbato de potssio, C6H7KO2, em gua e completar o volume at 1 000 ml com gua. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3. 2.3.1. Equipamento Dispositivo de arrastamento com vapor de gua (ver Acidez voltil). Banho de gua a 100 C. Espectrofotmetro que permita efectuar medies no comprimento de onda de 256 nm, equipado com clulas de quartzo de 1 cm de percurso ptico. Procedimento Destilao Colocar 10 ml de vinho no borbulhador do dispositivo de arrastamento com vapor de gua e adicionar 1 g a 2 g de cido tartrico (2.1.1). Recolher 250 ml de destilado. 2.3.2. Curva de calibrao Preparar, por meio de diluies com gua a partir da soluo de referncia (ponto 2.1.3), quatro solues de referncia diludas que titulem, respectivamente, 0,5 mg, 1 mg, 2,5 mg e 5 mg de cido srbico por litro. Medir com o espectrofotmetro as absorvncias destas solues a 256 nm, em relao a gua destilada. Traar a curva das variaes de absorvncia em funo da concentrao das solues. A variao linear. 2.3.3. Dosagem Numa cpsula de 55 mm de dimetro, colocar 5 ml de destilado e juntar 1 ml de soluo de hidrxido de clcio (ponto 2.1.2). Evaporar at secura num banho de gua em ebulio. Utilizando alguns mililitros de gua destilada, arrastar o resduo quantitativamente para um balo aferido de 20 ml e completar o volume com as guas de lavagem at ao trao de aferio. Medir com o espectrofotme tro a absorvncia a 256 nm, em relao a uma soluo branco obtida por diluio de 1 ml de soluo de hidrxido de clcio (ponto 2.1.2) com 20 ml de gua. A partir do valor de absorvncia medido, utilizar a recta de calibrao para obter a concentrao, C, de cido srbico da soluo. Nota: Na prtica corrente, pode dispensar-se a evaporao at secura e medir-se directamente a absorvncia no destilado, diludo 1:4, em relao a gua destilada.

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2.4. 2.4.1.

Expresso dos resultados Modo de clculo A concentrao de cido srbico do vinho, expressa em miligramas por litro, igual a: 100 C C = concentrao de cido srbico da soluo, analisada por espectrofotometria, expressa em miligramas por litro.

3. 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.2. 3.2.1.

MTODO DE DOSAGEM POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA Reagentes ter etlico, (C2H5)2O, destilado no momento de utilizao. Soluo de padro interno: soluo a 1 g/l de cido undecanico, C11H22O2, em etanol a 95 % (vol). Soluo aquosa, diluda 1:3 (v/v), de cido sulfrico, H2SO4 (20 = 1,84 g/ml). Equipamento Cromatgrafo de fase gasosa equipado com um detector de ionizao de chama e com uma coluna de ao inoxidvel (4 m 1/8 de polegada) previamente tratada com dimetildiclorossilano e cheia com uma fase estacionria, constituda por uma mistura de succinato de dietilenoglicol (5 %) e cido fosfrico (1 %) (DEGSH3PO4) ou por uma mistura de adipato de dietilenoglicol (7 %) e cido fosfrico (1 %) (DEGA H3PO4) fixada em Gaschrom Q80 100 mesh. Para o tratamento com o dimetildiclorossilano (DMDCS), passar na coluna uma soluo com 2 g a 3 g de DMDCS em tolueno. Lavar imediatamente a coluna com metanol. Passar uma corrente de azoto, a seguir de hexano e, de novo, de azoto. Encher seguidamente a coluna. Condies operatrias: Temperatura do forno: 175 C. Temperatura do injector e do detector: 230 C. Gs vector: azoto (caudal: 20 ml/minuto).

3.2.2.

Microsseringa de 10 microlitros, graduada em 0,1 microlitros. Nota: H outros tipos de colunas que permitem uma boa separao, especialmente colunas capilares (por exemplo FFAP). O procedimento a seguir descrito apresentado a ttulo de exemplo.

3.3. 3.3.1.

Procedimento Preparao da amostra a analisar Num tubo de vidro de aproximadamente 40 ml, com tampa esmerilada, introduzir 20 ml de vinho e juntar 2 ml de soluo de padro interno (ponto 3.1.2) e 1 ml de soluo diluda de cido sulfrico (ponto 3.1.3). Aps agitao por inverses sucessivas, juntar ao contedo do tubo 10 ml de ter etlico (ponto 3.1.1). Extrair o cido srbico para a fase orgnica por agitao do tubo durante 5 minutos. Deixar decantar.

3.3.2.

Preparao da soluo de referncia Seleccionar um vinho cujo cromatograma do extracto etreo no apresente qualquer pico na zona de eluio do cido srbico. Enriquecer este vinho em cido srbico at concentrao de 100 mg por litro. Tratar 20 ml de amostra assim preparada pelo processo descrito no ponto 3.3.1.

3.3.3.

Cromatografia Injectar sucessivamente no cromatgrafo, com uma microsseringa, 2 l de fase etrea obtida como se indica no ponto 3.3.2 e 2 l de fase etrea obtida como se indica no ponto 3.3.1. Registar os cromatogramas respectivos. Verificar a identidade dos tempos de reteno do cido srbico e do padro interno. Medir a altura (ou a rea) de cada pico registado.

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3.4. 3.4.1.

Expresso dos resultados Modo de clculo A concentrao de cido srbico do vinho analisado, expressa em miligramas por litro, igual a: 100 (h/H) l/i H = altura do pico do cido srbico na soluo de referncia h = altura do pico do cido srbico na amostra a analisar l = altura do pico do padro interno na soluo de referncia i = altura do pico do padro interno na amostra a analisar. Nota: Pode determinar-se do mesmo modo a concentrao de cido srbico a partir das reas dos picos respectivos.

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15 pH (OIV - AS-313-15-PH) MTODO DO TIPO I 1. PRINCPIO DO MTODO Medio da diferena de potencial entre dois elctrodos mergulhados no lquido estudado. Um dos elctrodos tem um potencial que uma funo definida do pH do lquido; o outro, que constitui o elctrodo de referncia, tem um potencial fixo e conhecido. 2. 2.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. EQUIPAMENTO Medidor de pH, graduado em unidades de pH, que permita efectuar medies com a aproximao de pelo menos 0,05 unidades. Elctrodos: Elctrodo de vidro, a conservar em gua destilada. Elctrodo de referncia de calomelanos-cloreto de potssio saturado, a conservar numa soluo saturada de cloreto de potssio. Ou elctrodo combinado, a conservar em gua destilada. REAGENTES Solues-tampo: Soluo saturada de tartarato cido de potssio que contenha pelo menos 5,7 gramas de tartarato cido de potssio (C4H5KO6) por litro, a 20 C. Em presena de 0,1 g de timol por 200 ml, pode conservar-se dois meses. 8 > 3,57 a 20 C > > > < 3,56 a 25 C > > > > : 3,55 a 30 C

2.2.3. 3. 3.1. 3.1.1.

pH

3.1.2.

Soluo 0,05 M de ftalato cido de potssio, que contm 10,211 gramas de ftalato cido de potssio (C8H5KO4) por litro, a 20 C. Durao mxima de conservao: 2 meses. 8 > 3,999 a 15 C > > > > > > > 4,003 a 20 C < > > 4,008 a 25 C > > > > > > : 4,015 a 30 C

pH

3.1.3.

Soluo que contenha:

Fosfato monopotssico, KH2PO4 ................................................................................................ ............................

3,402 g

Fosfato dipotssico, K2HPO4 ................................................................ .................................................................... 4,354 g gua, q.b. para ..................................................................................... .......................................................................... (Durao mxima de conservao: 2 meses.) 8 > 6,90 a 15 C > > > > > > > 6,88 a 20 C < > > 6,86 a 25 C > > > > > > : 6,85 a 30 C 1l

pH

Nota: Podem igualmente ser utilizadas as solues-tampo de referncia comerciais.

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4. 4.1. 4.1.1.

PROCEDIMENTO Preparao da amostra a analisar Mostos e vinhos Trabalhar directamente com o mosto ou vinho.

4.1.2.

Mostos concentrados rectificados Diluir o mosto concentrado rectificado com gua, de modo a obter uma concentrao de 25 % 0,5 % (m/m) de acares totais (25o Brix). Se P for o teor percentual (m/m) de acares totais do mosto concentrado rectificado, pesar uma massa de 2 500/P e completar at 100 g com gua. A condutividade da gua utilizada deve ser inferior a 2 microsiemens por centmetro.

4.2.

Regulao do zero do aparelho Antes de qualquer medio, regula-se o zero seguindo as instrues de utilizao do aparelho.

4.3.

Calibrao do medidor de pH Calibrar o aparelho a 20 C, com as solues-tampo de pH 6,88 e 3,57, a 20 C, seguindo as instrues de utilizao do aparelho. Utilizar a soluo-tampo de pH 4,00 a 20 C para verificar a calibrao da escala.

4.4.

Medio Mergulhar o elctrodo na amostra a analisar, cuja temperatura deve situar-se entre 20 C e 25 C e ser to prxima quanto possvel de 20 C. Ler directamente na escala o valor do pH. Efectuar pelo menos duas determinaes com cada amostra. Tomar como resultado a mdia aritmtica das leituras efectuadas.

5.

EXPRESSO DOS RESULTADOS O pH do mosto, do vinho ou da soluo a 25 % (m/m) (25 Brix) de mosto concentrado rectificado expresso com duas casas decimais.

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16 DOSAGEM SIMULTNEA DO CIDO L-ASCRBICO E DO CIDO D-ISOASCRBICO POR HPLC, COM DETECO NO ULTRAVIOLETA (OIVAS-313-22-ACASCO) MTODO DO TIPO II 1. INTRODUO O cido ascrbico um antioxidante presente naturalmente numa srie de gneros alimentcios. A quantidade de cido ascrbico presente nas uvas diminui durante a elaborao dos mostos e no decurso da vinificao. Dentro de certos limites, pode ser adicionado cido ascrbico aos mostos e aos vinhos. O mtodo descrito foi validado no quadro de ensaios interlaboratoriais, por meio de anlises de amostras de vinho com quantidades adicionadas de cido L-ascrbico e de cido D-isoascrbico de, respectivamente, 30 mg/l a 150 mg/l e 10 mg/l a 100 mg/l. 2. DOMNIO DE APLICAO Este mtodo aplica-se determinao simultnea de teores, compreendidos entre 3 mg/l e 150 mg/l, de cido L-ascrbico e de cido D-isoascrbico (cido eritrbico) no vinho por cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC), com deteco no ultravioleta. necessrio diluir as amostras se o teor exceder 150 mg/l. 3. PRINCPIO Filtrao por membrana e subsequente injeco directa das amostras no sistema de HPLC. Separao dos analitos numa coluna de inverso de fases e deteco dos mesmos no ultravioleta, a 266 nm. Determinao quantitativa dos cidos L-ascrbico e D-isoascrbico em relao a um padro externo. Nota: As colunas e as condies de funcionamento so indicadas a ttulo de exemplo. Tambm pode conseguir-se uma boa separao com outros tipos de colunas. 4. 4.1. 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.1.5. 4.1.6. 4.1.7. 4.1.8. 4.1.9. 4.1.10. 4.2. 4.2.1. REAGENTES E PRODUTOS Reagentes n-Octilamina de pureza 99,0 %. Acetato de sdio tri-hidratado de pureza 99,0 %. cido actico puro (100 %). cido fosfrico, aproximadamente a 25 %. cido oxlico de pureza 99,0 %. Ascorbato-oxidase. cido L-ascrbico ultrapuro ( 99,5 %). cido D-isoascrbico de pureza 99,0 %. gua bidestilada. Metanol p.a. (99,8 %). Preparao da fase mvel Solues para a fase mvel Preparar as seguintes solues para a fase mvel: 4.2.1.1. 4.2.1.2. 4.2.1.3. 4.2.1.4. 12,93 g de n-octilamina em 100 ml de metanol. 68,05 g de acetato de sdio tri-hidratado em 500 ml de gua bidestilada. 12,01 g de cido actico puro em 200 ml de gua bidestilada. Soluo-tampo (pH 5,4): 430 ml de soluo de acetato de sdio (4.2.1.2) e 70 ml de soluo de cido actico (4.2.1.3).

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4.2.2.

Preparao da fase mvel Juntar num copo 5 ml de soluo de n-octilamina (4.2.1.1) a cerca de 400 ml de gua bidestilada. Ajustar o pH dessa soluo entre 5,4 e 5,6, adicionando, gota a gota, soluo a 25 % (4.1.4) de cido fosfrico. Adicionar 50 ml da soluo-tampo (4.2.1.4) e transferir o lquido resultante para um balo aferido de 1 000 ml, completando o volume com gua bidestilada. Antes de ser utilizada, a fase mvel filtrada com uma mem brana (celulose regenerada de 0,2 m) e, se possvel, desgaseada com hlio (durante cerca de 10 minutos), na medida do necessrio para o sistema HPLC utilizado.

4.3.

Preparao da soluo-padro Nota: As solues-padro (soluo de reserva 4.3.1 e solues de trabalho 4.3.2) devem ser preparadas no prprio dia e, de preferncia, ser guardadas no frigorfico antes da injeco.

4.3.1.

Preparao da soluo de reserva (1 mg/ml) Preparar uma soluo aquosa a 2 % de cido oxlico e eliminar o oxignio dissolvido com uma corrente de azoto. Pesar com exactido 100 mg de cido L-ascrbico e 100 mg de cido D-isoascrbico num balo aferido de 100 ml e completar o volume com a soluo aquosa a 2 % de cido oxlico.

4.3.2.

Preparao das solues de trabalho Para obter as concentraes pretendidas de solues de trabalho, diluir a soluo de reserva (4.3.1) com a soluo a 2 % de cido oxlico. Recomendam-se concentraes compreendidas entre 10 mg/l e 120 mg/l. Por exemplo 100 l, 200 l, 400 l, 800 l e 1 200 l diludos a 10 ml, o que corresponde a 10 mg/l, 20 mg/l, 40 mg/l, 80 mg/l e 120 mg/l.

5.

EQUIPAMENTO Material corrente de laboratrio, em especial o seguinte equipamento:

5.1. 5.2. 5.3. 6.

Bomba para HPLC. Injector de anel de 20 l. Detector de UV. PREPARAO DAS AMOSTRAS Antes da injeco, filtram-se as amostras de vinho por meio de uma membrana com poros de 0,2 m de dimetro. necessrio diluir as amostras se o teor exceder 150 mg/l.

7. 7.1.

PROCEDIMENTO Condies de utilizao do sistema HPLC Injectar no cromatgrafo 2 l de amostra filtrada por uma membrana. Pr-coluna: Coluna: Volume injectado: Fase mvel: Caudal: Deteco no UV: Ciclo de lavagem: Por exemplo Nucleosil 120 C18 (4 cm 4 mm 7 m). Por exemplo Nucleosil 120 C18 (25 cm 4 mm 7 m). 20 l. Ver 4.2.2; isocrtica. 1 ml/minuto. 266 nm. Pelo menos 30 ml de gua bidestilada, seguidos de 30 ml de metanol e de 30 ml de acetonitrilo.

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7.2.

Identificao/Confirmao Identificam-se os picos comparando os tempos de reteno dos padres e das amostras. No sistema cromato grfico descrito como exemplo, os tempos de reteno so, respectivamente, 7,7 minutos para o cido L-ascrbico e 8,3 minutos para o cido D-isoascrbico (figura 1, cromatograma A). Para confirmar resultados positivos, adiciona-se s amostras em causa uma pitada de ascorbato-oxidase e efectua-se nova determinao (figura 1, cromatograma B). Devido degradao dos cidos L-ascrbico e D-isoascrbico pela ascorbato-oxidase, nenhum sinal deve ser detectado nos tempos de reteno de ambos os cidos. Caso sejam detectados picos parasitas, deve ser tida em conta a rea dos mesmos no clculo da concentrao dos analitos.

Figura 1 Exemplo de cromatograma de um vinho branco: Antes do tratamento com ascorbato-oxidase (traado A; indicam-se os picos e os tempos de reteno, Rt, dos cidos L-ascrbico e D-isoascrbico); aps tratamento com ascorbato-oxidase (traado B; indica-se a posio correspondente aos picos dos cidos L-ascrbico e D-isoascrbico). Nota: Recomenda-se que a anlise de amostras tratadas com ascorbato-oxidase seja efectuada no final de uma sequncia e que seja seguida de um ciclo de lavagem, de modo a eliminar da coluna os restos da enzima. Caso contrrio, os restos de ascorbato-oxidase poderiam converter os cidos L-ascrbico e D-isoascr bico durante as determinaes por HPLC, afectando os resultados obtidos. 8. CLCULOS Preparar uma curva de calibrao a partir das solues de trabalho (4.3.2). Seguindo o mtodo do padro externo, determinam-se quantitativamente o cido L-ascrbico e o cido D-isoascrbico medindo as reas dos picos desses cidos e obtendo as concentraes correspondentes por comparao com a curva de calibrao. Expresso dos resultados Exprimem-se os resultados com uma casa decimal em mg/l de cido L-ascrbico e mg/l de cido D-isoascr bico (por exemplo 51,3 mg/l). Se o teor exceder 150 mg/l, h que ter em conta a diluio. 9. FIDELIDADE O mtodo foi testado no mbito de um ensaio interlaboratorial organizado em 1994 pelo antigo Bundesge sundheitsamt (Servio Federal de Higiene Pblica) da Alemanha, no qual participaram 27 laboratrios. O programa do ensaio interlaboratorial seguiu o pargrafo 35 da lei alem dos gneros alimentcios, que foi aceite pelo OIV at introduo do novo protocolo (OENO 6/2000).

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O estudo incidiu em quatro amostras diferentes de vinho dois brancos e dois tintos , tendo sido solicitadas cinco repeties de cada amostra. Dado que no era possvel preparar amostras nas quais os analitos de mantivessem suficientemente estveis, devido s velocidades de degradao diferentes, foi decidido enviar aos participantes quantidades definidas de substncias-padro puras, juntamente com as amostras de vinhos. Os laboratrios receberam instrues para transferir quantitativamente os padres para as amostras de vinhos e para efectuarem de imediato a anlise das amostras. Foram analisadas concentraes de 30 mg/l a 150 mg/l, no caso do cido L-ascrbico, e de 10 mg/l a 100 mg/l, no caso do cido D-isoascrbico. Os resultados porme norizados do estudo figuram no anexo publicado pela OIV. A avaliao foi realizada de acordo com a norma DIN/ISO 5725 (verso de 1988). Os desvios-padro de repetibilidade (sr) e de reprodutibilidade (sR) revelaram-se adequados s concentraes dos cidos L-ascrbico e D-isoascrbico. Os parmetros de preciso podem ser calculados do seguinte modo: cido L-ascrbico sr = 0,011 x+0,31, sR = 0,064 x+1,39. x: concentrao de cido L-ascrbico (mg/l) cido D-isoascrbico sr = 0,014 x+0,31, sR = 0,079 x+1,29. x: concentrao de cido D-isoascrbico (mg/l) Exemplo: 50 mg/l de cido D-isoascrbico sr = 1,0 mg/l, sR = 5,2 mg/l. 10. 10.1. Outras caractersticas da anlise Limiar de deteco O limiar de deteco deste mtodo estimado em 3 mg/l para os cidos L-ascrbico e D-isoascrbico. 10.2. Justeza A recuperao mdia calculada a partir dos resultados do ensaio interlaboratorial efectuado com quatro amostras (ver o anexo publicado no Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos da OIV) foi a seguinte: cido L-ascrbico: 100,6 %, cido D-isoascrbico: 103,3 %

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17 DIXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) MTODO DO TIPO II 1. 1.1. PRINCPIO DO MTODO Vinhos tranquilos (sobrepresso de CO2 0,5 105 Pa) (1) Adio de um volume de vinho, tomado da amostra e levado a cerca de 0 C, a um excesso de soluo titulada de hidrxido de sdio, suficiente para se obter um pH de 10 a 11. Titulao com uma soluo cida, em presena de anidrase carbnica. Determinao do teor de dixido de carbono a partir do volume gasto para passar de pH 8,6 (carbonato cido) a pH 4,0 (cido carbnico). De modo a ter em conta o volume de soluo de hidrxido de sdio consumido pelos cidos do vinho, titula-se, nas mesmas condies, um branco de vinho descarbonatado. 1.2. Vinhos frisantes e vinhos espumantes Refrigerao da amostra de vinho a analisar at uma temperatura prxima do seu ponto de congelao. Toma de um determinado volume de vinho, destinado a servir de branco aps descarbonatao, e, em seguida, alcalinizao do vinho restante na garrafa, para fixar todo o CO2 sob a forma de Na2CO3. Titulao com uma soluo cida em presena de anidrase carbnica. Determinao do teor de dixido de carbono a partir do volume de soluo cida gasta para passar de pH 8,6 (carbonato cido) a pH 4,0 (cido carbnico). Para ter em conta o volume de soluo de hidrxido de sdio consumido pelos cidos do vinho, titula-se nas mesmas condies um branco de vinho descarbonatado. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.1.1. 2.1.1.2. 2.1.2. 2.1.2.1. 2.1.2.2. 2.1.2.3. 2.1.3. DESCRIO DO MTODO Vinhos tranquilos (sobrepresso de CO2 0,5 105 Pa) Equipamento Agitador magntico. Medidor de pH. Reagentes Soluo 0,1 M de hidrxido de sdio (NaOH). Soluo 0,05 M de cido sulfrico (H2SO4). Soluo de anidrase carbnica, a 1 grama por litro. Procedimento Arrefecer a amostra de vinho, assim como a pipeta de 10 ml a utilizar para retirar a toma para anlise, a cerca de 0 C. Deitar 25 ml de soluo de hidrxido de sdio (ponto 2.1.2.1) num copo de 100 ml. Juntar duas gotas de soluo aquosa de anidrase carbnica (ponto 2.1.2.3). Com a pipeta arrefecida a 0 C, introduzir no mesmo copo 10 ml de vinho. Colocar o copo no agitador magntico, introduzir o elctrodo e a barra magntica e agitar moderadamente. Quando o lquido atingir a temperatura ambiente, deitar, por afuso lenta, soluo de cido sulfrico (ponto 2.1.2.2) at pH 8,6. Continuar as afuses de cido sulfrico (ponto 2.1.2.2) at atingir o pH 4,0. Seja n ml o volume utilizado entre pH 8,6 e 4,0. Por outro lado, proceder eliminao do CO2 em cerca de 50 ml de amostra de vinho, por agitao sob vcuo durante 3 minutos e aquecendo o balo num banho de gua at cerca de 25 C. Aplicar o procedimento descrito a 10 ml de vinho descarbonatado. Seja n ml o volume utilizado. 2.1.4. Expresso dos resultados 1 ml de soluo titulada 0,05 M de cido sulfrico corresponde a 4,4 mg de CO2. A quantidade de CO2, em gramas por litro de vinho, dada por 0,44 (nn) e exprime-se com duas casas decimais. Nota: No caso dos vinhos com pouco CO2 (teor inferior a 1 g/l), no necessrio adicionar anidrase carbnica para catalisar a hidratao do CO2.
(1) 105 pascal (Pa) = 1 bar.

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2.2. 2.2.1. 2.2.1.1. 2.2.1.2. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. 2.2.3.

Vinhos frisantes e vinhos espumantes Equipamento Agitador magntico. Medidor de pH. Reagentes Soluo a 50 % (m/m) de hidrxido de sdio (NaOH). Soluo 0,05 M de cido sulfrico (H2SO4). Soluo de anidrase carbnica, a 1 grama por litro. Procedimento Na garrafa do vinho a analisar, traar uma marca no nvel de enchimento. Arrefecer em seguida a garrafa at ao incio da congelao. Deixar a garrafa aquecer ligeiramente, agitando-a, at ao desaparecimento dos cristais de gelo. Desrolhar rapidamente a garrafa e reservar, numa proveta graduada, 45 ml a 50 ml de vinho, que serviro para uma dosagem em branco. Determinar o volume exacto desta toma, v ml, lendo-o na escala da proveta, quando for atingida a temperatura ambiente. Logo a seguir recolha da toma para o branco, deitar 20 ml de soluo de hidrxido de sdio (ponto 2.2.2.1) na garrafa (est prevista uma capacidade de 750 ml). Esperar que o vinho volte temperatura ambiente. Deitar num copo de 100 ml 30 ml de gua destilada fervida e duas gotas da soluo de anidrase carbnica (ponto 2.2.2.3). Adicionar 10 ml de vinho alcalinizado. Colocar o copo na placa de agitao magntica, introduzir o elctrodo e a barra magntica e agitar modera damente. Deitar, por afuso lenta, soluo de cido sulfrico (ponto 2.2.2.2) at pH 8,6. Continuar as afuses de cido sulfrico (ponto 2.2.2.2) at pH 4,0. Seja n ml o volume utilizado entre pH 8,6 e 4,0. Por outro lado, proceder eliminao do CO2 nos v ml de vinho reservados para a dosagem em branco, por agitao sob vcuo durante trs minutos e aquecendo o balo num banho de gua at cerca de 25 C. Juntar 10 ml de vinho descarbonatado a 30 ml de gua destilada fervida e adicionar duas a trs gotas de soluo de hidrxido de sdio (ponto 2.2.2.1), para levar o pH a 10-11. Em seguida, aplicar o procedimento descrito. Seja n ml o volume utilizado de cido sulfrico 0,05 M.

2.2.4.

Expresso dos resultados 1 ml de soluo 0,05 M de cido sulfrico corresponde a 4,4 mg de CO2. Esvaziar a garrafa que contm o vinho alcalinizado e determinar, com a aproximao de 1 ml, o volume inicial de vinho, enchendo-a com gua at ao trao marcado. Seja esse volume V ml. A quantidade de CO2, em gramas por litro de vinho, dada por: 0,44(nn) (Vv+20)/(Vv) e exprime-se com duas casas decimais.

2.3.

Clculo da sobrepresso terica A sobrepresso a 20 C, Paph20, expressa em pascal, dada pela frmula: Paph20 = Q/[1,951 105(0,860,01A)(10,00144S)]Patm, em que: Q: A: S: Patm: teor, em gramas, de CO2 por litro de vinho, ttulo alcoomtrico do vinho a 20 C teor, em gramas, de acares por litro de vinho, presso atmosfrica, expressa em pascal.

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18 DOSAGEM DO DIXIDO DE CARBONO NO VINHO PELO MTODO MANOMTRICO (OIVAS314-04-CO2MAN) MTODO DO TIPO II (p.m.) [As instncias da OIV esto a actualizar o descritivo deste mtodo de anlise. Esse descritivo ser publicado numa prxima comunicao da Comisso quando a OIV publicar um texto actualizado, na edio de 2010 do seu Compndio dos Mtodos Internacionais de Anlise dos Vinhos e Mostos.]

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19 MEDIO DA SOBREPRESSO EM VINHOS ESPUMANTES E FRISANTES (OIV-AS-314-02-SURPRES) MTODO DO TIPO I 1. PRINCPIO Estabilizao trmica e agitao da garrafa, seguidas de medio da sobrepresso com um afrmetro (medidor de presso). Expresso da sobrepresso em pascal (Pa) (mtodo do tipo I). Este mtodo tambm se aplica aos vinhos espumantes gaseificados e aos vinhos frisantes gaseificados. 2. EQUIPAMENTO Designa-se por afrmetro um aparelho que permite medir a sobrepresso em garrafas de vinhos espumantes e de vinhos frisantes. A constituio do aparelho depende do tipo de tampa da garrafa (cpsula metlica, coroa, rolha de cortia ou de plstico). 2.1. Garrafas com cpsula ou com coroa O afrmetro constitudo por trs partes (figura 1): a parte superior (parafuso porta-agulha), constituda pelo manmetro, por um anel de aperto manual, por um parafuso sem-fim (que se enrosca na parte mdia) e por uma agulha, que atravessa a cpsula. A agulha dispe de um orifcio lateral que comunica a presso ao manmetro. Uma junta assegura a estanqueidade do conjunto sobre a cpsula da garrafa; a parte mdia (porca), que serve para centrar a parte superior. Enrosca-se na parte inferior, de maneira a manter firmemente o conjunto sobre a garrafa; a parte inferior (suporte), munida de uma pea de adaptao que se posiciona sob o anel da garrafa de maneira a fixar o conjunto. Existem anis adaptados a cada tipo de garrafa. 2.2. Garrafas com rolha O aparelho constitudo por duas partes (figura 2): a parte superior, idntica do aparelho anterior, embora a agulha seja mais comprida. Esta formada por um tubo oco longo, em cuja extremidade colocada uma ponta que permite perfurar a rolha. A ponta amovvel e cai dentro do vinho, uma vez atravessada a rolha; a parte inferior, formada por uma porca e por uma base que se coloca sobre a rolha. Dispe de quatro parafusos de aperto, que servem para manter o conjunto sobre a rolha.

Figura 2: Afrmetro para rolhas

Figura 1: Afrmetro para cpsulas ou coroas

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Observaes sobre os manmetros que equipam os dois tipos de aparelhos: podem ser mecnicos, com tubo de Bourdon, ou digitais, com captador piezoelctrico. No primeiro caso, o tubo de Bourdon obrigatoriamente de ao inoxidvel; so graduados em pascal (abreviatura Pa). No caso dos vinhos espumantes, mais prtico utilizar como unidade 105 pascal (105 Pa) ou o quilopascal (kPa); podem ser de diferentes classes. A classe de um manmetro a preciso da leitura em relao escala completa, expressa em percentagem (por exemplo manmetro 1 000 kPa, classe 1 significa presso de utilizao mxima de 1 000 kPa e leitura a 10 kPa). Para medies rigorosas, recomenda-se a classe 1. 3. PROCEDIMENTO A medio efectua-se em garrafas cuja temperatura esteja estabilizada h pelo menos 24 horas. Depois de perfurada a coroa ou a rolha de cortia ou de plstico, agitar vigorosamente a garrafa, at se obter uma presso constante para efectuar a leitura. 3.1. Garrafas com cpsula ou com coroa Posicionar a pea de adaptao do suporte sob o anel da garrafa. Apertar a porca de modo que o conjunto fique bem fixado sobre a garrafa. Enroscar a parte superior na porca. A fim de evitar perdas de gs, a perfurao da cpsula ou coroa deve efectuar-se o mais rapidamente possvel, para que a junta fique em contacto com a cpsula ou coroa. Agitar em seguida vigorosamente a garrafa, at a presso ser constante, para efectuar a leitura. 3.2. Garrafas com rolha Colocar uma ponta na extremidade da agulha. Posicionar o dispositivo completo sobre a rolha. Apertar os quatro parafusos contra a rolha. Enroscar a parte superior (a agulha perfura e atravessa a rolha). Para que a presso possa transmitir-se ao manmetro, a ponta deve cair para dentro da garrafa. Efectuar a leitura depois de agitar a garrafa at a presso ser constante. Recuperar a ponta aps a leitura. 4. EXPRESSO DOS RESULTADOS Exprime-se a sobrepresso a 20 C (Paph20) em pascal (Pa) ou quilopascal (kPa), consoante a preciso do manmetro (exemplo: 6,3 105 Pa ou 630 kPa e no 6,33 105 Pa ou 633 kPa, no caso de um manmetro de 1 000 kPa, escala completa, de classe 1). Se a temperatura de medio for diferente de 20 C, necessrio corrigir o resultado, multiplicando a presso medida pelo coeficiente apropriado (ver o quadro 1). Quadro 1 Relao entre a sobrepresso, Paph20, de um vinho frisante ou espumante a 20 C e a sobrepresso, Papht, temperatura t
C C

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1,85 1,80 1,74 1,68 1,64 1,59 1,54 1,50 1,45 1,40 1,36 1,32 1,28

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

1,24 1,20 1,16 1,13 1,09 1,06 1,03 1,00 0,97 0,95 0,93 0,91 0,88

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5.

AFERIO DOS RESULTADOS Mtodo de determinao directa de parmetros fsicos (mtodo critrio do tipo I) Verificao dos afrmetros Os afrmetros devem ser verificados regularmente (pelo menos uma vez por ano). A verificao feita com um banco de calibragem, que permite comparar o manmetro a testar com um manmetro de referncia, de classe superior, aferido pelos padres nacionais e montado em paralelo. Pretende-se comparar os valores indicados nos dois aparelhos a presses crescentes e, em seguida, decrescentes. Se houver diferenas entre os dois manmetros, um parafuso de regulao permite efectuar as correces neces srias. Os laboratrios e os organismos autorizados esto equipados com estes bancos de calibragem, de que os fabricantes de manmetros tambm dispem.

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20 DOSAGEM DA LISOZIMA NO VINHO POR HPLC (OIV-AS-315-14) MTODO DO TIPO IV 1. INTRODUO prefervel utilizar para a lisozima um mtodo analtico no baseado na actividade enzimtica. 2. DOMNIO DE APLICAO Este mtodo permite determinar quantitativamente (em mg de protena por litro) a lisozima presente em vinhos brancos e tintos sem relao com a actividade enzimtica da matriz (que poderia ser afectada por uma desnaturao parcial ou por fenmenos de complexao e de co-precipitao). 3. DEFINIO A cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC) uma via analtica baseada nas interaces estereoqumicas, polares ou de adsoro entre a fase estacionria e o analito, no tendo, portanto, relao com a actividade enzimtica efectiva da protena. 4. PRINCPIO Anlise por HPLC, associada a um detector espectrofotomtrico e a um detector espectrofluorimtrico. Clculo do teor desconhecido de lisozima da amostra de vinho com base na rea do pico cromatogrfico e no mtodo do padro externo. 5. 5.1. REAGENTES Solventes e solues Acetonitrilo (CH3CN) para HPLC. cido trifluoroactico puro. gua desionizada para HPLC. Soluo-padro: cido tartrico a 1 g/l, lcool etlico a 10 % (v/v), ajustado a pH 3,2 com tartarato de potssio neutro. 5.2. Eluentes A: 1 % de CH3CN, 0,2 % de cido trifluoroactico, 98,8 % de H2O. B: 70 % de CH3CN, 0,2 % de cido trifluoroactico, 29,8 % de H2O. 5.3. Solues de referncia Dissolver 1 mg a 250 mg de lisozima padro num litro de soluo-padro, com agitao contnua durante pelo menos 12 horas. 6. 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. MATERIAL Aparelho de HPLC com sistema de bombagem preparado para efectuar um gradiente de eluio. Forno para termostatizao da coluna. Detector espectrofotomtrico associado a um detector espectrofluorimtrico. Anel de injeco de 20 l Coluna polimrica de inverso de fases com grupos fenilo (dimetro dos poros = 1 000 , limite de excluso = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel fenil 5PW RP 7,5 cm 4,6 mm de dimetro interno (a ttulo de exemplo). Pr-coluna do mesmo material que a coluna, Tosoh Bioscience TSK-gel fenil 5PW RP Guardgel 1,5 cm 3,2 mm de dimetro interno (a ttulo de exemplo). PREPARAO DA AMOSTRA Acidificar as amostras de vinho com HCl 10 M diludo 1:10 e, passados 5 minutos, filtr-las por meio de um filtro de poliamida com poros de 0,22 m de dimetro. Efectuar a anlise cromatogrfica imediatamente aps a filtrao. 8. 8.1. 8.2. CONDIES OPERATRIAS Caudal de eluente: 1 ml/minuto. Temperatura da coluna: 30 C.

6.6. 7.

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8.3. 8.4. 8.5.

Deteco espectrofotomtrica: 280 nm. Deteco espectrofluorimtrica: ex = 276 nm ; em = 345 nm ; Ganho = 10. Programa do gradiente de eluio
Tempo (minutos) Soluo A (%) Soluo B (%) Gradiente

100

0 isocrtico

100

0 linear

10

65

35 isocrtico

15

65

35 linear

27

40,5

59,5 linear

29

100 isocrtico

34

100 linear

36

100

0 isocrtico

40 8.6. 9.

100

Tempo de reteno mdio da lisozima : 25,50 minutos. CLCULO Analisam-se triplicados de solues de referncia com as seguintes concentraes de lisozima: 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l, 50 mg/l, 100 mg/l, 200 mg/l e 250 mg/l. Determinam-se em cada cromatograma as reas dos picos correspondentes lisozima e traa-se um diagrama dessas reas em funo das concentraes respectivas, de modo a obterem-se rectas de regresso linear do tipo y = ax+b. O coeficiente de determinao, r2, deve ser > 0,999.

10.

CARACTERSTICAS DO MTODO A fim de avaliar a adequao do mtodo ao objectivo estabelecido, realizou-se um estudo de validao com base na linearidade, nos limiares de deteco (LD) e de quantificao (LQ) e na preciso do mtodo. Este ltimo parmetro foi determinado com base nos nveis de preciso e de exactido do mtodo.
Reprodutibili dade (n=5) desvio-padro de reprodutibi lidade (%) Padro1

Intervalo de lineari dade (mg/l)

Coeficiente Declive da de deter LD (mg/l) LQ (mg/l) recta minao (r2)

Repetibilidade (n=5) desvio-padro de repetibilidade (%)

Padro1

V. T.2

V. B.3

UV Deteco fluorim trica

5-250 1-250

3,786 52,037

0,9993 0,9990

1,86 0,18

6,20 0,59

4,67 2,61

5,54 2,37

0,62 0,68

1,93 2,30

Quadro 1: Dados relativos s caractersticas do mtodo (Padro1 = soluo-padro; V. T.2 = vinho tinto; V. B.3 = vinho branco).

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10.1.

Linearidade do mtodo Com base nos resultados obtidos pela anlise de regresso linear, o mtodo revelou-se linear nos intervalos indicados no quadro 1.

10.2.

Limiares de deteco e de quantificao Calcularam-se os limiares de deteco e de quantificao como os sinais equivalentes, respectivamente, a 3 vezes e a 10 vezes o rudo de fundo cromatogrfico, em condies de trabalho com matriz real (quadro 1).

10.3.

Preciso do mtodo Consideram-se os parmetros repetibilidade e reprodutibilidade. Indicam-se no quadro 1 os valores desses parmetros correspondentes soluo-padro e a vinho branco e tinto, expressos em desvio-padro percentual das determinaes repetidas a diversas concentraes.

10.4.

Exactido do mtodo Calculou-se a percentagem de recuperao com solues-padro que continham 5 mg/l e 50 mg/l de lisozima e s quais foi adicionada uma quantidade determinada de lisozima, como se indica no quadro seguinte.
Concentrao inicial nominal (mg/l) Adio (mg/l) Concentrao terica (mg/l) Concentrao determinada (mg/l) Desvio-padro Recuperao (%)

UV a 280 nm Deteco fluo rimtrica UV a 280 nm Deteco fluo rimtrica

50 50 5 5

13,1 13,1 14,4 14,4

63,1 63,1 19,4 19,4

62,3 64,5 17,9 19,0

3,86 5,36 1,49 1,61

99 102 92,1 97,7

Figura 1 Cromatograma de vinho tinto com lisozima pura (adicionou-se ao vinho soluo-padro a 1 000 mg/l de lisozima, de modo a obter uma concentrao final de lisozima de 125 mg/l). A: detector UV a 280 nm; B: detector UV a 225 nm; C: detector espectrofluorimtrico (ex = 276 nm; em = 345 nm).

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21 SULFATOS (OIV- AS-321-05-SULFAT) MTODO DO TIPO II 1. 1.1. PRINCPIO DOS MTODOS Mtodo de referncia Precipitao do sulfato de brio e pesagem. Elimina-se o fosfato de brio, que precipita nas mesmas condies, por lavagem do precipitado com cido clordrico. No caso dos mostos e vinhos ricos em dixido de enxofre, deve efectuar-se uma dessulfitagem prvia, por ebulio ao abrigo do ar. 1.2. Mtodo de ensaio rpido Classificao dos vinhos em vrias categorias pelo mtodo dito dos limites, baseado na precipitao do sulfato de brio com uma soluo titulada de brio. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.2. 2.2.1. MTODO DE REFERNCIA Reagentes Soluo 2 M de cido clordrico. Soluo de cloreto de brio (BaCl22H2O) a 200 g/l. Procedimento Caso geral Num tubo de centrifugao de 50 ml, introduzir 40 ml da amostra a analisar. Adicionar 2 ml de cido clordrico 2 M e 2 ml de soluo de cloreto de brio a 200 g/l. Agitar com uma vareta de vidro. Lavar a vareta com um pouco de gua destilada e deixar em repouso. Centrifugar durante 5 minutos e, em seguida, decantar com precauo o lquido sobrenadante. A seguir, lavar o precipitado de sulfato de brio, procedendo do seguinte modo: adicionar 10 ml de cido clordrico 2 M, colocar o precipitado em suspenso e centrifugar 5 minutos; separar com precauo o lquido sobrenadante; repetir duas vezes a lavagem do precipitado nas mesmas condies, de cada vez com 15 ml de gua destilada. Transferir o precipitado quantitativamente, lavando com gua destilada, para uma cpsula de platina tarada, que se coloca sobre um banho de gua a 100 C, at secura. Em seguida, calcinar vrias vezes sobre uma chama o precipitado seco, pouco tempo de cada vez, at obteno de um resduo branco. Deixar arrefecer num exsicador e pesar. Seja m a massa, em miligramas, de sulfato de brio obtida. 2.2.2. Caso particular: mostos sulfitados e vinho com teor elevado de dixido de enxofre Eliminar previamente o dixido de enxofre. Num erlenmeyer de 500 ml, munido de uma ampola com torneira e de um tubo de escape, introduzir 25 ml de gua e 1 ml de cido clordrico puro (20 = 1,15 1,18 g/ml). Levar esta soluo ebulio, para expulsar o ar, e introduzir 100 ml de vinho pela ampola, mantendo a soluo em ebulio. Prosseguir a ebulio at o volume de lquido no balo estar reduzido a cerca de 75 ml. Aps arrefecimento, transvasar quantitativamente esse volume para um balo aferido de 100 ml. Completar o volume com gua at ao trao de aferio. Dosear os sulfatos, numa toma para ensaio de 40 ml, como se indica no ponto 2.2.1. 2.3. 2.3.1. Expresso dos resultados Clculos O teor de sulfatos, expresso em miligramas de sulfato de potssio (K2SO4) por litro, o seguinte: 18,67 m O teor de sulfatos do mosto ou do vinho expresso em miligramas de sulfato de potssio por litro, sem casas decimais. 2.3.2. Repetibilidade At 1 000 mg/l: r = 27 mg/l; Cerca de 1 500 mg/l: r = 41 mg/l. 2.3.3. Reprodutibilidade At 1 000 mg/l: R = 51 mg/l; Cerca de 1 500 mg/l: R = 81 mg/l.

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22 FERRO (OIV - AS-322-05-FER) MTODO DO TIPO IV 1. PRINCPIO DOS MTODOS MTODO DE REFERNCIA Dosagem do ferro por espectrofotometria de absoro atmica, aps diluio adequada do vinho e eliminao do lcool. MTODO USUAL Mineralizao do vinho com perxido de hidrognio e reduo a Fe (II) do ferro que se encontra no estado Fe (III). Dosagem com base na colorao vermelha formada com a ortofenantrolina. 2. 2.1. 2.1.1. MTODO DE REFERNCIA Reagentes Soluo-padro concentrada de ferro (III), a 1 g/l Utilizar uma soluo-padro a 1 g/l comercial. Para preparar esta soluo, dissolver 8,6341 g de sulfato de ferro (III) e amnio (FeNH4(SO4)2 12H2O) em gua destilada, ligeiramente acidificada com cido clordrico 1 M, e completar o volume at 1 litro. 2.1.2. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3. 2.3.1. Soluo-padro diluda de ferro, a 100 mg/l. Equipamento Evaporador rotativo, com banho de gua termostatizado. Espectrofotmetro de absoro atmica, equipado com um queimador de ar-acetileno. Lmpada de ctodo oco, de ferro. Procedimento Preparao da amostra Eliminar o lcool do vinho, reduzindo o volume da amostra para metade, num evaporador rotativo (50-60 C). Repor em seguida o volume inicial, com gua destilada. Se necessrio, diluir antes da dosagem. 2.3.2. Calibrao Em cinco bales aferidos de 100 ml, colocar 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml e 5 ml da soluo de ferro a 100 mg/l (ponto 2.1.2) e completar o volume at 100 ml com gua destilada. As solues assim preparadas contm, respectivamente, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg e 5 mg de ferro por litro. Conservar estas solues em frascos de polietileno. 2.3.3. Dosagem Seleccionar o comprimento de onda de 248,3 nm. Regular o zero da escala de absorvncias com gua destilada. Aspirar directamente para o queimador do espectrofotmetro a amostra diluda e depois, sucessiva mente, as solues-padro, preparadas como se indica no ponto 2.3.2. Registar as absorvncias. Efectuar as determinaes em duplicado. 2.4. 2.4.1. Expresso dos resultados Modo de clculo Traar a curva de variao da absorvncia em funo da concentrao de ferro das solues-padro. A partir do valor mdio de absorvncia obtido para a amostra de vinho diludo, utilizar essa curva para determinar a concentrao de ferro, C. A concentrao de ferro, expressa em miligramas por litro de vinho com uma casa decimal, dada por: C F, F = Factor de diluio.

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23 COBRE (OIV - AS-322-06) MTODO DO TIPO IV 1. PRINCPIO DO MTODO Espectrofotometria de absoro atmica. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. EQUIPAMENTO Cpsula de platina. Espectrofotmetro de absoro atmica. Lmpada de ctodo oco, de cobre. Gs de alimentao: ar-acetileno ou xido nitroso-acetileno. REAGENTES Cobre metlico. cido ntrico concentrado a 65 % (HNO3, 20 = 1,38 g/ml). cido ntrico diludo 1:2 (v/v). Soluo de cobre a 1 g/l Utilizar uma soluo-padro de cobre a 1 g/l comercial. Para preparar esta soluo, pesar 1 000 g de cobre metlico e transferir quantitativamente a massa pesada para um balo aferido de 1 000 ml. Juntar a quantidade de cido ntrico diludo 1:2 (3.3) estritamente necessria para dissolver o metal. Adicionar em seguida 10 ml de cido ntrico concentrado (3.2) e completar o volume com gua bidestilada, at ao trao de aferio. 3.5. Soluo de cobre a 100 mg/l Tomar 10 ml da soluo 3.4 e introduzi-los num balo aferido de 100 ml, completando o volume com gua bidestilada at ao trao de aferio. 4. 4.1. PROCEDIMENTO Preparao da amostra e dosagem do cobre Introduzir 20 ml de amostra num balo aferido de 100 ml e completar o volume com gua bidestilada at ao trao de aferio. Se necessrio, adaptar a diluio. Regular o zero da escala de absorvncias com gua destilada e ler em seguida a absorvncia da amostra diluda no espectrofotmetro de absoro atmica, ao comprimento de onda de 324,8 nm. Se necessrio, preparar uma diluio adequada com gua bidestilada. 4.2. Traado da curva de calibrao Numa srie de bales aferidos de 100 ml, introduzir 0,5 ml, 1 ml e 2 ml da soluo a 100 mg de cobre por litro (ponto 3.5) e completar o volume com gua bidestilada. As solues obtidas contm, respectivamente, 0,5 mg/l, 1 mg/l e 2 mg/l de cobre. Traar a curva de calibrao com os valores de absorvncia destas solues, medidos como se descreve no ponto 4.1 5. EXPRESSO DOS RESULTADOS A partir da absorvncia lida para a amostra de vinho diludo, utilizar a curva de calibrao para determinar a concentrao C, em mg/l, correspondente. Sendo F o factor de diluio, o teor de cobre do vinho, expresso em miligramas por litro, FC. O resultado apresentado com duas casas decimais. Notas: a) As solues para o traado da curva de calibrao e as diluies da amostra so escolhidas em funo da sensibilidade do aparelho utilizado e da concentrao de cobre da amostra.

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b) No caso de concentraes muito baixas de cobre na amostra, o procedimento o seguinte: introduzir 100 ml de amostra numa cpsula de platina, evaporar num banho de gua a 100 C, at obter uma consistncia xaroposa, e juntar, gota a gota, 2,5 ml de cido ntrico concentrado (ponto 3.2), procurando cobrir todo o fundo da cpsula. Incinerar o resduo, com precauo, sobre uma placa elctrica de aque cimento ou sobre uma pequena chama. Em seguida, introduzir a cpsula numa mufla regulada a 500 C 25 C, deixando-a nessas condies cerca de uma hora. Aps arrefecimento, humedecer as cinzas com 1 ml de cido ntrico concentrado (ponto 3.2), esmagando-as com uma vareta de vidro, e evaporar e incinerar de novo, como anteriormente. Levar novamente a cpsula mufla durante 15 minutos. Repetir pelo menos trs vezes este tratamento com cido ntrico concentrado. Dissolver as cinzas, juntando cpsula 1 ml de cido ntrico concentrado (ponto 3.2) e 2 ml de gua bidestilada. Transferir para um balo aferido de 10 ml. Lavar a cpsula trs vezes, com 2 ml de gua bidestilada de cada vez, e completar o volume com gua bidestilada at ao trao de aferio. Efectuar a dosagem como se indica no ponto 4.1, utilizando os 10 ml de soluo; ter em conta o factor de concentrao na expresso dos resultados.

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24 DIXIDO DE ENXOFRE (OIV - AS-323-04-DIOSU) MTODO DO TIPO II 1. DEFINIES Designa-se por dixido de enxofre o dixido de enxofre presente num mosto ou num vinho sob as formas H2SO3 e HSO3, cujo equilbrio funo do pH e da temperatura: H2SO3 + HSO3 H+ H2SO3 representa o dixido de enxofre molecular. Designa-se por dixido de enxofre total o conjunto das diferentes formas de dixido de enxofre presentes, no estado livre ou combinadas com os componentes do vinho. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.1.1. DIXIDO DE ENXOFRE LIVRE E DIXIDO DE ENXOFRE TOTAL Princpio dos mtodos Mtodo de referncia Vinhos e mostos Arrasta-se o dixido de enxofre com uma corrente de ar ou de azoto. Em seguida, fixa-se e oxida-se o dixido de enxofre, por borbulhagem numa soluo diluda neutra de perxido de hidrognio. Doseia-se o cido sulfrico formado com uma soluo titulada de hidrxido de sdio. O dixido de enxofre livre extrado do vinho por arrastamento a frio (10 C). O dixido de enxofre total extrado do vinho por arrastamento a quente (cerca de 100 C). 2.1.1.2. Mostos concentrados rectificados Dilui-se o mosto concentrado rectificado e extrai-se o dixido de enxofre total por arrastamento a quente (cerca de 100 C). 2.1.2. Mtodo de ensaio rpido (vinhos e mostos) Doseia-se o dixido de enxofre livre por titulao iodomtrica directa. Doseia-se a seguir o dixido de enxofre combinado, por titulao iodomtrica aps hidrlise alcalina. Somando o dixido de enxofre combinado ao dixido de enxofre livre, obtm-se o dixido de enxofre total. 2.2. 2.2.1. 2.2.1.1. Mtodo de referncia Equipamento O dispositivo utilizado deve corresponder ao esquema seguinte, principalmente no que respeita ao condensa dor.

Figura 1 As dimenses so indicadas em milmetros. Os dimetros internos dos quatro tubos concntricos que cons tituem o condensador so de 45 mm, 34 mm, 27 mm e 10 mm.

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O tubo de admisso dos gases ao borbulhador, B, termina numa pequena esfera de 1 cm de dimetro, dotada de 20 orifcios de 0,2 mm de dimetro no seu permetro horizontal mximo. Esse tubo pode igualmente terminar numa placa de frita de vidro, que assegura a formao de um grande nmero de microbolhas e permite assim um bom contacto das fases gasosa e lquida. O dispositivo deve ser percorrido por um caudal gasoso de cerca de 40 l/h. O frasco do lado direito do dispositivo destina-se a limitar a 20-30 cm de gua a depresso produzida pela trompa de gua. Para se poder regular esta depresso de modo que o caudal seja correcto, conveniente inserir um caudalmetro de tubo semicapilar entre o borbulhador e o referido frasco. 2.2.1.2. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. Microbureta. Reagentes cido fosfrico (H3PO4) a 85 % (20 = 1,71 g/ml). Soluo de perxido de hidrognio a 9,1 g de H2O2/litro (3 volumes). Reagente indicador: vermelho de metilo ................................................................................................ .......................................................... 100 mg azul de metileno .................................................................................. ............................................................................. 50 mg lcool a 50 % vol ................................................................................................ ........................................................... 100 ml 2.2.2.4. 2.2.3. 2.2.3.1. Soluo 0,01 M de hidrxido de sdio (NaOH). Dosagem do dixido de enxofre livre Procedimento Antes da dosagem, conserva-se o vinho durante 2 dias a 20 C, numa garrafa cheia e rolhada. Introduzir no borbulhador, B, 2 ml a 3 ml de soluo de perxido de hidrognio (ponto 2.2.2.2) e 2 gotas de reagente indicador; neutralizar esta soluo com soluo 0,01 M de hidrxido de sdio (ponto 2.2.2.4). Ligar o borbulhador ao dispositivo. No balo A, de 250 ml, do dispositivo de arrastamento, introduzir 50 ml de amostra e 15 ml de cido fosfrico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balo no dispositivo. Em seguida, borbulhar ar (ou azoto) durante 15 minutos. O dixido de enxofre livre arrastado oxidado a cido sulfrico. Retirar o borbulhador do dispositivo e titular o cido formado com soluo 0,01 M de hidrxido de sdio (ponto 2.2.2.4). Seja n o volume utilizado, em mililitros. 2.2.3.2. Expresso dos resultados O dixido de enxofre livre expresso em miligramas por litro (mg/l), sem casas decimais. 2.2.3.2.1. Clculo Dixido de enxofre livre, em miligramas por litro: 6,4n. 2.2.4. 2.2.4.1 Dosagem de dixido de enxofre total Procedimento

2.2.4.1.1. No caso dos mostos concentrados rectificados, diluir a amostra a analisar a 40 % (m/v), como se indica no captulo Acidez total, ponto 5.1.2. No balo A, de 250 ml, do dispositivo de arrastamento, introduzir 50 ml dessa soluo e 5 ml de cido fosfrico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balo no dispositivo. 2.2.4.1.2. Vinhos e mostos Se o teor previsvel de SO2 total da amostra for inferior ou igual a 50 mg/l, introduzir no balo A, de 250 ml, do dispositivo de arrastamento 50 ml de amostra e 15 ml de cido fosfrico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balo no dispositivo. Se o teor previsvel de SO2 total da amostra for igual ou superior a 50 mg/l, introduzir no balo A, de 100 ml, do dispositivo de arrastamento 20 ml de amostra e 5 ml de cido fosfrico (ponto 2.2.2.1). Inserir o balo no dispositivo.

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Introduzir no borbulhador, B, 2 ml a 3 ml de soluo de perxido de hidrognio (ponto 2.2.2.2), neutralizar como anteriormente e levar o vinho contido no balo A ebulio por meio de uma pequena chama, de 4 cm a 5 cm de altura, que deve tocar directamente o fundo do balo. No colocar uma tela metlica debaixo do balo, mas pous-lo num disco com uma abertura de 30 mm de dimetro. Evita-se deste modo a piroge nao das matrias extradas do vinho nas paredes do balo. Manter a ebulio durante a passagem da corrente de ar (ou de azoto). Em 15 minutos, o dixido de enxofre total ter sido arrastado e oxidado. Dosear o cido sulfrico formado com soluo 0,01 M de hidrxido de sdio (ponto 2.2.2.4). Seja n o volume utilizado, em mililitros. 2.2.4.2. Expresso dos resultados O dixido de enxofre total expresso em miligramas por litro (mg/l) ou em miligramas por quilograma (mg/kg) de acares totais, sem casas decimais. 2.2.4.2.1. Clculo Vinhos e mostos Dixido de enxofre total, expresso em miligramas por litro: Amostras com baixo teor de dixido de enxofre (toma para ensaio de 50 ml): 6,4n Outras amostras (toma para ensaio de 20 ml): 16n Mostos concentrados rectificados: Dixido de enxofre, em miligramas por quilograma de acares totais (toma para ensaio de 50 ml de amostra preparada (ponto 2.2.4.1.1)): 1,600 n/P P=teor percentual (m/m) de acares totais. 2.2.3.4.2. Repetibilidade (r) Teor < 50 mg/l (toma para ensaio de 50 ml): r = 1 mg/l. Teor > 50 mg/l (toma para ensaio de 20 ml): r = 6 mg/l. 2.2.3.4.3. Reprodutibilidade (R) Teor < 50 mg/l (toma para ensaio de 50 ml): R = 9 mg/l. Teor > 50 mg/l (toma para ensaio de 20 ml): R = 15 mg/l.

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