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y Proteómica 2008
Neovascularización en un modelo
murino de Shock séptico
2
Neovascularización en un modelo murino de Shock séptico
3
ABSTRACT
4
Neovascularization in a murin model of Septic Shock.
5
ÍNDICE
6
RESUMEN……………………………………………………………………… 2
ABSTRACT…………………………………………………………………...... 4
ÍNDICE…………………………………………………………………………... 6
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………. 9
1. NEOVASCULARIZACION…………………………………………………. 10
1.2. Aspectos generales de la angiogénesis………………………...….. 10
1.3. Etapas del proceso angiogénico...................................................... 11
1.4. Shock séptico y neovascularización............................................... 14
1.5. Neovascularización y productos inflamatorios……………………..16
MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………..19
2. ANIMALES USADOS EN LOS ENSAYOS............................................20
3. OBTENCIÓN DE LOS MIOCARDIOCITOS...........................................20
4. OBTENCIÓN DE MACRÓFAGOS.........................................................21
5. ENSAYO DE ANGIOGÉNESIS IN VIVO................................................22
5.1. Preparación de Homogenato de piel................................................24
6. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS.......................................................24
7. INMUNODETENCIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO
VASCULAR-A; PECAM-1 Y METALOPROTEASA-9...............................25
7.1. Ensayos de western blot (Wb)…………...........................................25
7.2. Obtención del tumor de 14 días...................................................... 26
8. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS OXIDO NÍTRICO
SINTASAS..................................................................................................27
9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO......................................................................27
7
10. REACTIVOS GENERALES................................................................ 28
11. EQUIPAMIENTO.................................................................................29
RESULTADOS………………………………………………………………….30
12. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MIOCARDIOCITOS......................31
13. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MACRÓFAGOS........................... 37
14. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS.....................................................39
DISCUSIÓN…………………………………………………………………….. 42
15. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MIOCARDIOCITOS..................... 43
16. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MACRÓFAGOS........................... 43
17. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS.................................................... 45
CONCLUSIONES…………………………………………………………...…. 46
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………48
8
INTRODUCCIÓN
9
El concepto de angiogénesis surgió en los años 70. Fue el
estadounidense Judah Folkman (24 de febrero de 1933 - 14 de enero de 2008)
quien empezó a hablar del mecanismo de la angiogénesis.
1. NEOVASCULARIZACIÓN
10
vascular puede estar mediado por una concentración excesiva de factores
angiogénicos producidos por los macrófagos (Mfs) infiltrantes, otras células del
sistema inmune o células inflamatorias.
11
receptores del tipo tirosina quinasa. Algunos de estos receptores se expresan
preferentemente en células endoteliales, como es el caso de los dos receptores
de VEGF, denominados VEGFR-1/Flt-1 y VEGFR-2/Flk-1 (Yancopoulos GD y
col., 2000). También se ha descrito un tercer receptor del tipo tirosina quinasa,
el VEGFR-3, relacionado estructuralmente con los anteriores y que parece
estar expresado en el endotelio linfático.
Una vez que las células endoteliales se activan por acción del estímulo
angiogénico, su fenotipo cambia notablemente. Además de producirse un
cambio en su forma, de plana a redondeada, se produce la liberación de una
serie de proteasas que le permitirán degradar su membrana basal. Para esto
se requiere la separación de los pericitos que recubren la pared del vaso
sanguíneo.
12
la artritis y la cicatrización de heridas. Algunos factores angiogénicos, tales
como VEGF, FGF, TNF- e interleuquina-1 (IL- 1) estimulan la producción de
MMP-1, MMP-3 y MMP-9 por las células endoteliales. Durante la angiogénesis,
la acción degradadora ejercida por las enzimas proteolíticas participa en al
menos tres pasos del proceso: ruptura de la membrana basal, migración de las
células endoteliales y formación del lumen vascular (Fig. 1 B).
13
1.4. Shock séptico y neovascularización
14
Cascada
de
señalización
15
1.5. Neovascularización y productos inflamatorios
16
OBJETIVOS
GENERALES Y
ESPECÍFICOS
17
El shock séptico inducido por infecciones bacterianas afecta al
miocardio, a las células del sistema inmune y a la microcirculación. El daño es
causado por los propios microorganismos o sus endotoxinas induce la
liberación de sustancias vasoactivas, a nivel de capilares, vénulas y arteriolas
promoviendo, un fenómeno vascular trombótico. Teniendo en cuenta que el
proceso de neovascularización puede contribuir al agravamiento o a la
reparación del tejido dañado, en un modelo murino de infección aguda por LPS
nos proponemos:
18
MATERIALES Y
MÉTODOS
19
2. ANIMALES USADOS EN LOS ENSAYOS.
3. OBTENCION DE MIOCARDIOCITOS.
20
1%, PMSF 1 mM, leupeptina 10 µg/ml, aprotinina 10 µg/ml. Después de 30 min.
en hielo, se centrifugaron a 10.000 rpm por 10 min. a 4°C. Las muestras se
conservaron a –80 ºC y la concentración de proteínas se determinó por el
método de Bradford (1976).
4. OBTENCION DE MACRÓFAGOS.
Inoculación i.p. de
LPS
Adhesión al plástico
durante 2 h. a 37ºC.
Mfs
Obtención de macrófagos por raspado
Mfs+LPS
21
Figura 4: Obtención de macrófagos (Mfs) peritoneales.
22
Mfs o Mfs+LPS (in vitro)
Mfs en suspención
i.d.
23
5.1. Preparación de homogenatos de piel
24
7. INMUNODETECCIÓN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE ENDOTELIO
VASCULAR-A, PECAM-1 Y METALOPROTEASA-9
25
de bloqueo TBS con Tween 20 al 0,05% (TBS-T) que contiene 5% de leche
descremada durante 1 h. a temperatura ambiente.
Posteriormente las membranas se incubaron durante 18 h. con los
anticuerpos policlonales obtenidos en cabra contra VEGF-A, PECAM-1, MMP-
9, NOS2 y CD40 todos de origen murino, diluido en TBS-T con 5% de leche
descremada. Luego de cuatro lavados con TBS-T se agregó el segundo
anticuerpo policlonal contra IgG de cabra hecho en conejo conjugado con
peroxidasa diluido 1:40000 en TBS-T con 5% de leche descremada durante 1
h. con agitación.
En todos los casos, como control negativo se sembró una calle que no
fue incubada con el primer anticuerpo. Los pesos moleculares de las bandas
proteicas se identificaron por comparación de sus Rf con los estándares de
peso molecular conocidos. La cuantificación se realizó por densitometría en un
analizador de imágenes computarizado. La expresión de la proteína actina se
utilizó como control de carga constante en cada calle en todos los ensayos
realizados. La concentración proteica de las bandas se expresó en unidades de
densidad óptica por mm2 (D.O./mm2).
26
homogenizó en buffer: NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH: 7,4, EDTA 1 mM,
SDS 0,1%, Triton X-100 1%, PMSF 1 mM, deoxicolato de sodio 1%, leupeptina
5 µg/ml, aprotinina 5 µg/ml a 4°C. El homogenato se guardó a –80°C y la
concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford (1976).
Dicha muestra se utilizó como control positivo en todos los ensayos de Wb
realizados.
9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
27
10. REACTIVOS GENERALES
28
- Etanol (Soria).
- Éter etílico (Biopack).
- Etilendiaminotetracético (Merck).
- Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Sigma).
- Glicina (Invitrogen).
- Leupeptina (Sigma).
- Metanol (Cicarelli).
- Naftilendeamina (Sigma).
- Nitrato de sodio (Merck).
- Nitro azul de tetrazolio (Sigma).
- N, N, N`, N`-di-dimetilaminoetanol (Bio Rad).
- Ortovanadato de sodio (Sigma).
- Persulfato de amonio (ICN Biomedicals Inc.).
- Suero fetal bovino (GENSA).
- Trietilamina (Merck).
- Tripsina (GIBCO).
- Tris-HCl (Promega Corporation)
- Tritón X-100 (J.T. Baker).
- Tween 20 (Sigma).
- Urea (Fluka).
11. EQUIPAMIENTO
29
RESULTADOS
30
12. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MIOCARDIOCITOS
3
**
Nº de vasos/mm de piel
*
2
2
0
5 5 6
Control 3.10 5.10 10
MIOCARDIOCITOS
31
b
Figura 6: Angiogénesis inducida por miocardiocitos. Los resultados se expresaron como Nº de
vasos/mm2 de piel. Los valores son promedios ± E.S. de n=4 *p<0,01 y **p<0,001 vs. Piel
normal A (Control) (panel superior). Fotografía del sitio angiogénico: a) Control;
neovascularización inducida por b) 5x105 MC y c) 106 MC (panel inferior).
117 kDa - PECAM-1
Los D.O./mm
ensayos 2 de3,1angiogénesis
2,8 se
2,3 complementaron
6,1 con el estudio de la
expresión de PECAM-1 (CD31) una 5.10
Control 3.105
molécula
5
106
que T14
se expresa particularmente
en los vasos sanguíneos de reciente formación. Para esto se realizaron
B
homogenatos de muestras de piel obtenidas en los ensayos de angiogénesis.
85 kDa -
VEGF-A
D.O./mm2 5 3
2 2,6 3,6 3,2
D
42 kDa -
ACTINA 32
33
Las MMPs son una familia de endopeptidasas dependientes de zinc
capaces de clivar mediadores inflamatorios y degradar componentes de la
membrana basal y de la MEC. Varias de las MMPs son moléculas
características de procesos fisiológicos normales pero su expresión y actividad
se incrementa durante la inflamación. Por lo tanto se investigó la expresión de
la proteína MMP-9 en los homogenatos de piel del sitio angiogénico. En la
Figura 7 C se observó un aumento de la expresión de dicha proteína con
respecto al control. Cabe destacar que la inoculación con 5.105 y 106 MC indujo
la expresión de una segunda banda que esta ausente en el control.
34
A
45 kDa - VEGF-A
Control 1 10 100
LPS µg/ml
92 kDa - MMP-9
Control 1 10 100
LPS µg/ml
C
42 kDa - ACTINA
Control 1 10 100
LPS µg/ml
35
A
Control 1 10 100
LPS µg/ml
40 kDa - CD40
2
D.O./mm _ 0,6 1,8
Control 1 10
LPS µg/ml
C
30
*
*
(uM/mg de proteína)
-
Producción de NO2
20
10
0
Control 1 10 100
LPS (µg/ml)
36
13. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR MACRÓFAGOS
3
#
N° de vasos/mm de piel
#
*
2
2
0
Control LPS LPS LPS
5 5 5
3x10 4x10 5x10
Macrófagos
Figura 10: Angiogénesis inducida por macrófagos tratados o no con LPS 100 µg/ml. Los
resultados se expresaron como Nº de vasos/mm2 de piel. Los valores son promedios ± E.S. de
n=4 *p<0,05 vs. Piel normal (Control) y # p< 0,01 vs. sin tratamiento con LPS.
37
Para confirmar los resultados del ensayo in vivo se estudió la expresión
de PECAM-1. En la Figura 11 A observamos un aumento de la expresión de
dicha proteína cuando se inocularon 5x105 Mfs tratados con LPS.
A
117 kDa - PECAM-1
B
VEGF-A
85 kDa -
D.O./mm2 _ _ 1 _ 2
92 kDa -
MMP-9
D.O./mm2 2,1 1,8 3,2 1,2 3,2
3,8 6,5 4 3,4 6,6
D
42 kDa -
ACTINA
Control LPS LPS
3.105 5.105
38
14. TRATAMIENTO IN VIVO CON LPS
Para investigar el papel que cumplen los Mfs durante una respuesta
inflamatoria aguda decidimos utilizar un modelo de shock séptico en ratones
BALB/c.
39
A
117 kDa -
PECAM-1
D.O./mm2 _ _ _
Control 6 h 24 h
B
65 kDa - VEGF-A
Control 6 h 24 h
C
92 kDa -
MMP-9
D.O./mm2 _ 1,3 1,9
Control 6 h 24 h
42 kDa - ACTINA
Control 6 h 24 h
Figura 12: A) Ensayo de Western blot para detectar la expresión de A) CD31, B) VEGF-A y C)
MMP-9 en lisados de macrófagos. El peso molecular de la proteína está indicado a la izquierda.
D) La expresión de actina se usó como control de carga constante en cada calle. El panel
inferior muestra el análisis de las bandas por densitometría medido en unidades de densidad
óptica por milímetro cuadrado (DO/mm2). Se muestra un ensayo representativo de tres
semejantes.
40
A
130 kDa - NOS-2
Control 6 h 24 h
40 kDa - CD-40
Control 6 h 24 h
C
18
*
Producción de NO 2-
(uM/mg de proteína)
12
0
Control 6 h 24 h 48 h
Figura 13: Ensayo de Western blot para detectar la expresión de A) NOS2 y B) CD40 en
lisados de macrófagos. El peso molecular de la proteína está indicado a la izquierda. El panel
inferior muestra el análisis de las bandas por densitometría medido en unidades de densidad
óptica por milímetro cuadrado (DO/mm2). Se muestra un ensayo representativo de tres
semejantes. C) Macrófagos provenientes de animales inoculados con 0,1 mg LPS/0,1 ml PBS.
La actividad de la NOS fue medida como producción de NO2- (µM/mg de proteína). * p<0,01 vs
Mfs normales (Control), de acuerdo con el test Tukey.
41
DISCUSIÓN
42
15. ANGIOGÉNESIS INDUCIDA POR LOS MIOCARDIOCITOS
43
adenocarcinoma mamario murino (Davel L y col., 2002). Además estas células
cumplen un papel significativo en varias enfermedades infecciosas e
inflamatorias humanas. Nosotros demostramos que existe una tendencia a la
formación de vasos a medida que aumenta el número de Mfs inoculados, que
se hace estadísticamente significativa cuando se inyecta una dosis de 5x105
Mfs. Por otro lado observamos que los Mfs tratados con LPS potenciaron el
efecto neovascular que observamos a concentraciones bajas de Mfs. El
aumento de la respuesta angiogénica concordó con un incremento en la
expresión de PECAM-1 y de VEGF-A en la piel inoculada con Mfs tratados con
LPS. El gen de VEGF-A puede generar por un mecanismo de corte y empalme
alternativo 4 formas distintas que se denominan VEGF121, VEGF165,
VEGF189 y VEGF 206, el número indica la cantidad de aminoácidos en la
molécula. El VEGF165 es la forma molecular predominante tanto en células
normales como malignas. Es una glicoproteína básica homodimérica de 45 kDa
con capacidad de unión a la heparina y/o a proteína de la MEC (Ferrara N y
col., 2003). La isoforma que nosotros encontramos tiene un peso molecular de
85 kDa que podría ser una forma de VEGF unida a heparina o a proteínas de
la MEC. Xiong M y col. demostraron que Mfs murinos producen VEGF sin
requerir la adición de ningún estímulo externo. Sin embargo, este nivel
constitutivo de producción de VEGF se incrementó por estimulación de las
células con IFNγ/LPS. En tumores esta descripto que el incremento del NO
contribuye a la angiogénesis tumoral por regulación positiva del VEGF (Xu W y
col., 2002).
44
se sintetizan como pro-proteínas que se activan por clivaje ejercido por otras
proteasas (Chow AK y col., 2007). Por este motivo es probable que la segunda
banda que observamos por Wb en los homogenatos de piel, que está ausente
en la piel normal, se debe a un aumento en la síntesis de esta forma de
zimógeno.
Los resultados obtenidos al tratar los animales con LPS, en una dosis
sub-letal, indican que los Mfs aumentan la producción de factores angiogénicos
y proteasas de manera análoga a lo observado en ensayos in vitro.
Observamos que a las 6 h. post-inoculación, se produce un aumento en la
expresión de NOS2 concomitantemente con un incremento en la producción de
NO y a las 24 h. se incrementan niveles de VEGF y MMP-9, lo que revelaría el
papel regulador del NO sobre estas 2 moléculas.
45
CONCLUSIONES
46
• Los MC murinos son inductores de angiogénesis y el tratamiento
de los MC in vitro con LPS estimula la liberación de moléculas que
participan del proceso angiogénico.
47
BIBLIOGRAFÍA
48
Aoki MP, Guiñazú NL, Pellegrini AV, Gotoh T, Masih DT, Gea S. (2004)
Cruzipain, a major Trypanosoma cruzi antigen, promotes arginase-2 expression
and survival of neonatal mouse cardiomyocytes. Am J Physiol Cell Physiol 286,
C206–C212.
Bradford MM. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem 72, 248-254.
Chow AK, Cena J, Schulz. (2007) Acute actions and novel targets of matriz
metalloproteinases in the Herat and vasculature. Br J Pharmacol 152, 189-205.
de la Torre E, Davel L, Jasnis MA, Gotoh T, de Lustig ES, Sales ME. (2005)
Muscarinic receptors participation in angiogenic response induced by
macrophages from mammary adenocarcinoma-bearing mice. Breast Cancer
Res 7, R345-52.
Eliopoulos AG, Young LS. (2004) The role of the CD40 pathway in the
patogénesis and treatment of cancer. Curr Opin Pharmacol 4, 360-367.
49
Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. (2003) The biology of VEGF and Its
receptors. Nat Med 9, 669-675.
Green LC, Wagner DA, Glowoski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannembaum
SR. (1982) Analysis of nitrate, nitrite and (15N) in biological fluids. Anal Biochem
126, 131-138.
Molin D, Post MJ. (2007) Therapeutic angiogenesis in the heart: protect and
serve. Curr Opin Pharmacol 7, 158-163.
50
Monte M, Davel L, Sacerdote de Lustig E. (1997) Hydrogen peroxide is
involved in lymphocyte activation mechanisms to induce angiogenesis. Eur J
Cancer 33, 676-682.
Ridnour LA, Windhausen AN, Isenberg JS, Yeung N, Thomas DD, Vitek MP,
Roberts DD, Wink DA. (2007). Nitric oxide regulates matrix metalloproteinase-
9 activity by guanylyl-cyclase-dependent and -independent pathways. Proc Natl
Acad Sci 104, 16898-16903.
Urtreger AJ, Ladeda VE, Puricelli LI, Rivelli A, Vidal M del C, Sacerdote de
Lustig E, Bal de Kier Joffé E. (1997) Modulation of fibronectin expression and
proteolytic activity associated with the invasive and metastatic phenotype in two
51
murine mammary tumor cell lines. Int J Oncol 11, 489-496.
Xu W, Liu LZ, Loizidou M, Ahmed M, Charles IG. (2002) The role of nitric
oxide in cancer. Cell Res 12, 311-320.
Yancopoulos GD, Davis S, Gale NW, Rudge JS, Wiegand SJ, Holash J.
(2000) Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407,
242-248.
52