PRESENA DE PLASMDIO COMO MECANISMO DE RESISTNCIA ANTIMICROBIANA EM BACTRIAS ESBL

OLIVEIRA, JS & CARNEIRO, LC3

Universidade Estadual de Gois- UnU Bolsista PIBIC\UEG Prof. Dr. Orientadora
III SEMANA DE PESQUISA E EXTENSO DA UEG UnU. MORRINHOS - 25 a 27 de outubro de 2011

RESUMO
As Extended-Spectrum Betalactamase Betalactamases de amplo expectro (ESBL) constituem um grupo heterogneo de enzimas capazes de inativar as penicilinas, cefalosporinas e por vezes os monobactmicos. As bactrias trocam podem fazer conjugao plasmidial, assim, leva da clula doadora para a receptora genes que lhe confere caractersticas novas, como por exemplo, resistncia a antibiticos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a presena de plasmdeos nas bactrias classificadas como ESBL e verificar a resistncia das bactrias ESBL. Os experimentos foram conduzidos no laboratrio de biologia do curso de cincias biolgicas da Universidade Estadual de Gois Unu Morrinhos GO. As amostras de bactrias determinadas com ESBL foram previamente isoladas em um laboratrio de anlises clnicas da cidade de Goinia GO e gentilmente fornecidas para os experimentos deste projeto. Os resultados parciais sugerem que a maioria das bactrias apresentam sensibilidade aos antibiticos testados; a contagem bacteriana deu resultado incontveis para a maioria das amostras com plasmdeo; a maioria dos testes com estabilidade plasmidial no demonstraram estabilidade nas amostras bacterianas testadas. Palavras chave: beta lactmicos, engenharia gentica e contaminao.

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INTRODUO
As Extended-Spectrum Betalactamase (ESBL) constituem um grupo heterogneo de enzimas capazes de inativar as penicilinas, cefalosporinas e por vezes os monobactmicos. A atividade enzimtica varivel de acordo com o tipo de III SEMANA DE PESQUISA E EXTENSO DA UEG UnU. MORRINHOS - 25 a 27 de outubro de 2011

lactamase produzida ( TEM-1, TEM-2 e SHV-1) e os diversos substratos existentes, algumas cepas hidrolisam apenas penicilina, outras s cefalosporinas, outras cepas produzem enzimas que inativa os dois tipos de antibiticos(SOUSA JUNIOR &

FERREIRA, 2004). Nos ltimos anos vrios frmacos beta-lactmicos tm sido desenvolvidos com finalidade de conferir resistncia ao hidroltica das enzimas beta-lactamases. Porm, a utilizao indiscriminada e indevida desses frmacos tem contribudo para a seleo de bactrias produtoras de ESBL at ento desconhecidas e resistentes a tais frmacos (MEDEIROS, 1997). Estas enzimas so produzidas por bactrias Gram positivas e Gram negativas, aerbicas e anaerbicas e lisam o anel -lactmico dos antibiticos por hidroxilao irreversvel da ligao amida, inativando-os. As bactrias produtoras de ESBL so geralmente multirresistentes devido ao fato da maioria das enzimas serem codificadas por genes localizados em plasmdeos (FERREIRA, 2008). Plasmdeos so elementos extracromossomais com capacidade de replicao independente por possuir uma origem de replicao Oric, por isto, ele se replica de forma independente do cromossomo bacteriano. Os plasmdeos conferem benefcios s clulas, permitindo que os microrganismos se adaptem a condies adversas, garantindo a superioridade evolutiva frente aos microrganismos que no possuem plasmdeos (RYCHILIK, 2006). As bactrias induzem conjugao plasmidial, assim a clula doadora passa para a clula receptora genes que lhe confere caractersticas novas, como por exemplo, resistncia a antibiticos (SOUSA et al., 2004). O aumento no nmero de patgenos

bacterianos que possuem resistncia a antibiticos ressalta a importncia do desenvolvimento de vacinas anti-bacteriana (CURTA et al.,2008). A tecnologia do

DNA recombinante, a descoberta e o isolamento de plasmdeos das bactrias permitem o surgimento de novas tecnologias (BIAGI & AZEVEDO, 1992). Antimicrobianos so produtos obtidos de fungos e bactrias ou sintticos, estes so bactericidas e bacteriostticas a principal funo dos antimicrobianos prevenir ou tratar uma infeco (SOUSA JUNIOR & FERNANDEZ 2004), porm, enterobactrias produzem -lactamases que lhes confere resistncia aos antimicrobianos lactmicos (ABREU, 2006). Atualmente as ESBLs representam o maior grupo de Betalactamases estudado mundialmente e tm sido motivo de extensivas investigaes microbiolgicas, bioqumicas, genticas e epidemiolgicas (FERREIRA, 2008). Segundo BTTCHER (2008) a resistncia microbiana um fenmeno natural que cada vez mais vem aumentando, isto leva a infeces de difcil tratamento. A resistncia bacteriana para bacilos Gram negativos tem preocupado as Unidades de Terapia Intensiva (UTI) e os laboratrios de microbiologia e so o principal problema em UTIs brasileiras, visto que as infeces causadas por estes bacilos so de difcil tratamento por apresentarem resistncia a antimicrobianos e os lanamento de um novo medicamento no mercado e bem demorado (ANVISA, 2007; VIEIRA & OHAYON, 2006). de suma relevncia avaliar a frequncia de bactrias produtoras de ESBL para que se possa estabelecer de forma segura o diagnostico do mdico, evitando assim que o doente receba uma terapia inadequada. Desta forma necessrio criar uma rotina nos laboratrio de microbiologia clnica para a identificao dessas enzimas em isolados clnicos, incluindo antibiticos nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos (FERREIRA, 2008). O presente trabalho teve como objetivo avaliar a presena de plasmdeos nas bactrias classificadas como ESBL e verificar a resistncia das bactrias ESBL. 3
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MATERIAL E MTODOS

Os experimentos foram conduzidos no laboratrio de Biologia do Curso de Cincias Biolgicas da Universidade Estadual de Gois Unu Morrinhos GO.
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Cultivo dos microrganismos As amostras de bactrias determinadas com ESBL utilizadas nesse trabalho foram previamente isoladas em um laboratrio de anlises clnicas da cidade de Goinia GO e foram gentilmente fornecidas para os experimentos deste projeto. Os isolados resistentes a antibiticos e sugestivos da presena do plasmdeos foram selecionados e mantidos no laboratrio em gar nutriente temperatura de 4 C, sendo repicados mensalmente. A extrao do DNA plasmidial foi realizado utilizando o kit de extrao FLEXIPREP da Pharmacia, seguindo informa

Confirmao de ESBL/ Mtodo de aproximao de discos

Todos os isolados foram submetidos aos testes de triagem para ESBL (Ghost zone zona fantasma), (independente da indagao do alerta do software da automao para ESBL). De acordo com a tcnica de disco difuso de Kirby-Bauer (1966) e com base nos procedimentos padronizados pelo National Commit for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) foram efetuados os testes, usando discos impregnados com concentraes fixas de cada antibitico (ceftriaxona, ceftazidima e aztreonam e cefepime, este ltimo ainda no padronizado por este comit), colocados ao redor da placa, marcados em uma distncia de 30 mm de centro a centro em relao ao disco central de amoxacilina

/ cido clavulnico (CLSI, 2009, ROSSI, 2008). Bacilos Gram negativos foram considerados como possveis produtores de ESBL (enterobactrias) que questionados atravs de leitura no aparelho de automao onde

posteriormente pela tcnica do disco difuso (Kirby- Bauer) tiveram o halo de inibio reduzidos para no mnimo de um dos antibiticos avaliados com base no documento do NCCLS, sendo os pontos de corte padronizados em Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Klebsiella oxytoca - Ceftriaxona (30 g) 25 mm, ceftazidima (30 g) 22 mm, aztreonam (30 g) 27 mm e 27 mm para ceftazidima ou cefotaxima em Proteus
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mirabilis. A visualizao do fentipo de formao de zona fantasma e o aumento do halo de sensibilidade em 5 mm na presena do inibidor (amoxacilina/ cido clavulnico) entre qualquer antimicrobiano marcador foi considerada positiva para ESBL. A no formao de ghost zone foi considerada negativa para ESBL (CLSI, 2009; OPUSTIL et al., 2004).

Eletroforese em gel de agarose De acordo com Sambrook et al., (1989) as amostras de DNA plasmidial foram analisadas em gel de agarose. O DNA plasmidial foi avaliado em gel de agarose 1% (p/v) corado com brometo de etdeo, dissolvida em TEB 0,5X e brometo de etdio (0,2 g/mL). Foi submetido o gel a uma amperagem de 30 mA at que a amostra entrem no poo, sendo posteriormente ajustada para 60 mA. Visualizou-se as bandas de DNA plasmidial por irradiao ultravioleta de baixa intensidade.

Digesto de DNA plasmidial com enzimas de restrio Os sistemas de digesto foram preparados com DNA, enzima apropriada, gua destilada, tampo adequado enzima, seguindo as instrues do fabricante. Foram utilizadas as enzima Eco R1, Bam HI e Pst I na temperatura de 37 C por um perodo de trs horas para digerir os plasmdeos crptico. Os sistemas de digesto foram realizados para auxiliar na observao do perfil plasmidial. 5

Aps digesto, os sistemas foram colocados em gel de agarose a 1% corado com brometo de etdeo e submetidos corrida eletrofortica para confirmar a linearizao e presena dos respectivos plasmdeos.

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RESULTADO E DISCUSSO
No perodo estudado foram pesquisadas 200 cepas de bastonetes Gram negativos, sendo que em 149 (74,50%) houve crescimento bacteriano e nas demais no houve crescimento algum. As enterobactrias avaliadas no presente estudo mostraram-se bastante susceptveis aos carbapenmicos, principalmente meropenem. Dos carbapenems pesquisados o imipenem 97 (65,10%) e meropenem 95 (63,75%) se mostraram eficazes in vitro, porm no foram confirmados pelo teste de Hodge nos casos de resistncia e possvel produo de carbapenemase. O ceftriaxona o que demonstra maior incidncia de resistncia bacteriana (62,41%). Conseqentemente 52,4% dos carbapenmicos no se mostraram ativos para o uso em pacientes, como est representado na tabela 1.

Tabela 1- Incidncia de bactrias resistentes a antimicrobianos encontradas em UTIs de Goinia Incidncia de resistncia bacteriana UTIs de Goinia Espcies Cefepime Aztreonam Cefotaxima Ceftazidima bacterianas 4 7 9 6 Pseudomonas sp
Morganella morgannii Proteus mirabilis Proteus sp Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Klebsiella sp Enterobacter aerogenes Enterobacter agglomerans Escherichia coli Enterobacter cloacae Enterobacter sp Acinetobacter baumanni Citrobacter ferundii Total Total em %

Ceftriaxona

Cefuroxima

Imipenem

Meropenem

10 0 1 1 21 0 0 21 2 5 1 2 4 3 22 0 93 62,41

3 0 1 1 3 3 0 21 2 5 1 2 8 4 0 0 55 36,91

6 0 0 0 13 0 0 4 0 2 1 1 0 1 11 0 39 26,17

6 0 0 0 11 0 0 4 0 3 1 0 1 1 12 0 39 26,17

0 1 1 7 0 0 20 2 5 1 1 4 3 22 0 71 47,65

0 1 1 6 0 0 20 2 5 1 1 4 3 21 0 72 48,32

0 1 1 22 0 0 21 2 5 1 2 4 3 17 0 88 59,06

0 1 1 9 0 0 21 2 5 1 1 4 3 22 0 76 51

A tabela 1 demonstra a atividade dos cabapenmicos em pacientes. Devido serem drogas resistentes a hidrlise das betalactamases os carbapenems so escolhidos para o tratamento de infeces causadas por bactrias Gram negativas, mas recomendvel o uso racional desses antibiticos, visto que eles podem induzir o desenvolvimento de mecanismos de resistncia bacteriana, como o caso das metalobetalactamases em Pseudomonas aeruginosa e ESBL em Klebsiella pneumoniae (SAMRA et al.; 2007 e TORRES et al; 2006). 7

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A figura 1 mostra a relao das cefalosporinas com a sensibilidade a antibiticos. De uma maneira geral, das 149 amostras testadas em relao s cefalosporinas; cefepime, representado por 69 (46,30%) foi o antibitico com maior sensibilidade; seguido de ceftazidima 68 (45,63%), ceftriaxona 50 (33,55%), cefotaxima 46 (30,87%) e cefuroxima 36 (24,16%). O nico monobactmico testado foi aztreonam que se
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mostrou sensvel em 66 (44,3%) dos casos (figura 1).

Figura 1- Ao dos antimicrobianos testados nas amostras coletadas de UTIs de Goinia.

A ocorrncia de ESBL positivo nas amostras estudadas foi de 10,74 % (figura 2). Essa porcentagem foi presuntiva pela produo de betalactamase visualizada

fenotipicamente pelo mtodo de aproximao de discos (Ghost Zone). Sendo a Klebsiela sp a principal espcie produtora de ESBL.

Figura 2- Incidncia de bactrias produtoras de ESBL encontradas nas UTIs de Goinia.

Foram identificadas 12 cepas de Klebsiella spp como produtoras de ESBL. Estes dados so confirmados em uma pesquisa realizada por SOUSA et al. (2004) na qual relata que cepas de Klebsiella spp e Escherichia coli produtoras de ESBL. so as bactrias mais comuns

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Perfil Plasmidial

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Figura 3- Gel A e B perfil plasmidial das amostras de bactrias.

No gel A observamos a presena de um plasmdeo acima de 5 Kb na linha 3, nas demais linhas os plasmdeos apresentam aproximadamente 10 Kb. No gel B h um plasmdeo acima se 10 kb. No presente trabalho 24 amostras foram analisadas quanto a presena de plasmdeo, sendo que 10 amostras foram constados plasmdeos, correlacionando com a resistncia das bactrias aos antibiticos podemos assim sugerir que o plasmdeo pode ser um fator de resistncia.

CONCLUSO
Com base nas correlaes entre a resistncia bacteriana aos antibiticos e as amostras que conferiram plasmdios, podemos sugerir que o plasmdio pode ser um fator causador da resistncia. Houveram amostras que no apresentaram este tipo de 10 resistncia e cresceram na presena dos beta lactmicos, nesses casos, podemos sugerir que a resistncia aos antibiticos advinda de material gentico cromossomal.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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2002.2006.119f.

Tese

(Doutorado

em

Medicina-

Doenas

Infecciosas

Parasitrias) - Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro. 2006. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA: Investigao e controle de bactrias multirresistentes. 2007. BETTCHER, L. O paciente portador de Enterococcus resistente a vancomicina em um hospital pblico de Belo Horizonte: aspectos demogrficos, epidemiolgicos e Microbiolgicos. 2008.107f. Dissertao (Mestrado) Programa de Ps-Graduao do Curso de Mestrado da Escola de Enfermagem. Faculdade de Enfermagem Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2008. BIAGI, C. M. R. De.; AZEVEDO, J. L. De. Deteco de bacteriocinas produzidas por bacterias fitopatognicas dos gneros Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas. Revista Scientia Acricola. Piracicaba.v.49, no 1, p.1-8, 1992. CURTA, J. C.; SIMO, R. C. G. De.; SEGER, J. Vacina de DNA contra doenas

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