Biotecnologa

Definicin Historia Procesos en la biotecnologa alimentaria Etapas en el desarrollo de la biotecnologa Aplicaciones de la biotecnologa Areas biotecnolgicas importantes Procesos biotecnolgicos por fermentacin Produccin de aminocidos, biopolmeros, compuestos aromticos y colorantes Hidrlisis para la obtencin de glucosa y fructosa

Biotecnologa
Uso integrado de la bioqumica, microbiologa y de las ingenieras gentica, bioqumica y de procesos para fabricar productos a partir de microorganismos, cultivos celulares y partes derivadas de ellos (Knorr, 1987). La biotecnologa alimentaria puede definirse como el uso de las tecnologas biolgicas para la produccin, transformacin o conservacin de alimentos, o bien para la produccin de materias primas, aditivos y coadyuvantes empleados en la industria alimentaria (Garca Garibay y col., 1993). Ha permitido el desarrollo de procesos con base en las siguientes aplicaciones: 1. Los mecanismos de control de la expresin y regulacin gentica en microorganismos y en clulas utilizadas.

2. Las leyes de la bioqumica y la fisicoqumica que regulan el comportamiento de stos entes biolgicos y de sus molculas. 3. La fisicoqumica y los fenmenos de transporte involucrados en las operaciones de propagacin, recuperacin y utilizacin de los organismos o partes de ellos.
Bioqumica
Microbiologa Biologa molecular

Biotecnologa

Universo de la Biotecnologa

Ingeniera

 Es una de las ms antiguas industrias. La panificacin, produccin de vino y cerveza se remontan al ao 2400 a.c., en India (los Vedas) con un producto similar al yogurt, y en los grabados de una tumba Egipcia describiendo la panificacin y fermentacin alcohlica. Posteriormente los estudios de Luis Pasteur ayudaron a comprender los mecanismos de la fermentacin en la produccin de cerveza, vino, vinagre, etc. Posteriormente se us la papana para la produccin de la cerveza siendo tal vez la primera patente con enzimas exgenas. A principios del siglo pasado (XX) empezaron a prepararse una gran cantidad de productos por fermentacin, tales como la biomasa de microorganismos como alimento, el cido ctrico, y la invertasa de levadura para la hidrlisis del azcar. Muchos alimentos y bebidas comunes se basan en fermentacin natural (queso y yoghurt), o en el uso de enzimas (jarabes fructosados, aspartamo).

 El mayor impacto de la biotec. de alim. es la elaboracin de materias primas y aditivos alimentarios: edulcorantes no calricos, jarabes fructosados, aminocidos, vitaminas, etc. En cuanto a las aplicaciones analticas destacan las enzimas para la determinacin especfica de algunos componentes, microorganismos para la evaluacin de la calidad nutricional de alimentos. Tambin se han desarrollado sondas de DNA de anticuerpos para la determinacin rpida de patgenos (Salmonella, Listeria) adulteraciones de protena de origen animal por una de origen vegetal. El mayor beneficio se ha dado en el sector farmacutico y de salud, ya que son productos de alto valor agregado que pagan el costo de la investigacin rpidamente. Los antibiticos produjeron avances en en la tecnologa de fermentaciones, microbiologa industrial, mutaciones no especficas, control de expresin gentica. En los 70s y 80s la tecnologa del DNA recombinante se ha usado para producir protenas de inters farmacutico: insulina, hormona del crecimiento, interfern, activador del plasmingeno. La industria de los alimentos se encuentra muy departamentalizada y no tiene estructura de grupo, adems el consumo de alimentos es masivo, con bajo valor agregado.

Procesos Involucrados en la Biotecnologa Alimentaria

1. Procesos de fermentacin en alimentos
Naturales o espontneos (cultivos mixtos) : ensilado, cacao, caf, pozol Inoculados: vino, yogurt, tempeh (Rhizopus oligosporus) Produccin de biomasa: protena unicelular, levadura de pan, o de cervecera Elaboracin de materias primas: jarabes fructosados, cido asprtico Procesos de transformacin: malteado, coagulacin de leche Aditivos

2.

Procesos de fermentacin en medios de cultivo

3.

Procesos enzimticos

4.

Cultivo de clulas vegetales:

Elaboracin de materias primas: colorantes Micropropagacin

Perodos de Desarrollo de la Biotecnologa

Primera Generacin: Etapa emprica o pre-Pasteur, donde se elaboran vinagre, bebidas alcohlicas, productos lcteos, alimentos fermentados tradicionales. No se tiene registro histrico. Biotecnologa Industrial: A partir de la segunda mitad del siglo XIX. Se divide en 2 etapas: I) Segunda generacin o era de Pasteur: Entre 1865-1940; desarrollo inicial de la microbiologa y la bioqumica. II) Tercera generacin: Era de los antibiticos, entre 1940-1975, surge la ingeniera bioqumica Cuarta Generacin o nueva Biotecnologa: En la segunda mitad de la dcada de los setenta, con la Ing. Gentica, cultivo de tejidos, anticuerpos monoclonales.

4.

Biotecnologa no-convencional: Procesos de fcil implementacin, de pequea o mediana escala, tendientes a resolver problemas de ndole energtico o ecolgico.

Anticuerpos
Ab: Protenas en forma de Y, localizadas en el suero sanguneo, producidas en respuesta a un antgeno especfico (MW~ 150 kDa)

Inmunidad humoral: IgG (Ab), IgM, IgE (alergia), IgD, IgA (secreciones como saliva, calostro, lgrimas)

IgG: 75% del total de Ig

(Fluorocromo)

Sistema biotina-avidina, que puede ser usado eficientemente en inmunofluorescencia indirecta (IF), Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) y radioinmunoensayos (RIA). Fluorforo: digoxigenina

ELISA competitiva para la deteccin de Salmonella. Al aumentar la densidad de Salmonella, menos Ab estar disponible para enlazarse al Ag recubriendo los pozos. Esto conduce a menos enlace del Ab de deteccin a los Abs de los pozos y menor nmero de producto final (103-105 cel/mL).

ELISA tipo sndwich para la deteccin de una toxina. Un aumento en el nmero de molculas de toxina conducir a un aumento en la formacin de producto final coloreado.

Procedimiento usado para aislar clulas de hibridoma produciendo anticuerpos monoclonales. PEG= polietiln glicol; HAT= hipoxantn aminopterina timidina.

Aplicaciones diagnsticas relevantes al procesamiento y produccin de alimentos

Citometra de Flujo Partculas biolgicas de inters se colocan en suspensin. Se aade un color fluorescente a la suspensin la cual se hace fluir en un tubo que pasa por una fuente de luz, usualmente un rayo lser, una partcula a la vez. La de la luz se elige para que el colorante ligado a las partculas deseadas fluoresca. Una computadora cuenta y/o analiza las clulas o partculas que pasan por el rayo lser y fluorescen, las cuales pueden separarse de las dems y recogerse en recipientes separados. Algunas carctersticas de las partculas como tamao y forma no requieren usar colorantes, porque tienen una dispersin de luz tpica al pasar por el rayo lser.

IMPACTO DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO EN EL PROCESO DE DOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS: Queso Cerveza

Primera Uso emprico de BAL Uso emprico de levaduras generacin Uso emprico de quimosina Uso emprico de malteado

Segunda Aislamiento y uso de BAL Uso de cultivos puros de lev. generacin Extraccin, purific. y carac- Naturaleza enzimtica del terizacin de la quimosina malteado Uso de papana para la clarificacin en fro

Queso Tercera Propagacin masiva de Generac. BAL Seleccin de cultivos lcticos mejorados. Sustitucin de quimosina por proteasas microbianas producidas en gran escala

Cerveza Mejor control de la fermentacin Fermentacin continua para producir cerveza. Prod. y uso de amilasas microbianas para sacarificacin y de -glucanasas termotolerantes. Uso de enzimas (glucosidasas amilasas) para la produccin de cervezas ligeras

Cuarta ADN recombinante para Ing. Gentica para obtener levaduras Generac. producir quimosina y amilolticas y prod. de -acetolactato mejoramiento de BAL descarboxilasa para [diacetilo]<0.5 mg/L Utilizacin ptima de Ing. Gentica y cultivo de tejidos enzimas y m.o. para la para mejoramiento de cebada maduracin acelerada. Procesos con m.o. y enzimas inmovilizadas.

Uso industrial de enzimas: Quimosina (Renina)

La quimosina bovina causa un rompimiento especfico de la kappacasena, que estabiliza las micelas de casena. Reconoce la secuencia de His98 a Lys111 y rompe el enlace peptdico entre Fen105 y Met106 de la cadena de kappa-casena. Es una proteasa producida en el cuarto estmago de la ternera, como precursor (pre-pro-quimosina). un
Despus de una serie de protelisis, la quimosina madura tiene un PM de 35.6 kDa, y se clasifica como una proteasa asprtica o carboxil proteasa. Tambin ataca enlaces Phe-Val, Glu-Ala, Leu-Tyr, Tyr-Leu, Leu-Val, Phe-Tyr pH ptimo de 3.5, aunque mxima estabilidad a pH 5.Experimenta autlisis a pH 3.5 y se desnaturaliza a pH>6.
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Uso industrial de enzimas: Quimosina

(Renina)
Las proteasas de Mucor miehei, M. pusillus y Endothia parasitica, tienen similar estructura y especificidad.

No obstante, estas proteasas no son adecuadas para quesos madurados puesto que tienen un rango diferente de actividades no especficas que la quimosina y no producen los sabores correctos en maduracin prolongada. Las fuentes microbianas son ms baratas y tienen ms estabilidad en su disponibilidad. Adems, los vegetarianos encuentran el uso de la renina bovina inaceptable.

Uso industrial de enzimas: Quimosina recombinante

Otra alternativa es clonar el gene bovino en una cepa productora adecuada y producir la enzima por fermentacin. Los huspedes posibles para su produccin son: Escherichia coli. Es el organismo ms frecuentemente usado en clonacin de genes. Desafortunadamente, las protenas recombinantes son frecuentemente sintetizadas intracelularmente como cuerpos de inclusin, lo cual incrementa considerablemente el costo del proceso. Adems, E. coli no es generalmente reconocida como segura para el consumo humano. Bacillus sp. Es no patognico y se usan industrialmente para producir amilasas. B. licheniformis produce la quimosina, pero las secuencias seal no permitieron la secrecin de la enzima al medio de cultivo.

Uso industrial de enzimas: Quimosina recombinante

Lactococcus lactis. Se usa en cultivos iniciadores, pero los niveles de produccin encontrados han sido muy bajos. Saccharomyces cerevisiae. Se han tenido dificultades para obtener altos niveles de secrecin en esta levadura. Kluyveromyces lactis. Se usa para producir -galactosidasa, y sus propiedades de fermentacin son bien conocidas. La quimosina pudo producirse en este husped y se han obtenido buenos niveles de secrecin al medio de cultivo. El gen de quimosina se insert en el cromosoma de K. lactis y la levadura se crece por fermentacin en lote alimentado. Despus de la fermentacin, la levadura se destruye aadiendo cido benzoico y la quimosina se separa por filtracion.

Proceso de fermentacin en cervecera

Proceso de fabricacin de cerveza

Tipos de Cerveza
Los egipcios y mesopotmicos tenan en la cerveza un alimento imprescindible. Se producan hasta ocho tipos diferentes de cerveza que en Egipto era un monopolio econmico en manos del faran Los avances en la tecnologa cervecera se afianzan en Baviera, alrededor del ao 1400, al descubrirse las ventajas de la fermentacin, no en superficie sino en la profundidad de la cuba Lager: Elaborada con cepas que crecen en el fondo del tanque: S. cerevisiae. Fermentacin a 6-12C, por 8-14 d, despus se almacena por mximo 3 semanas a -1C, antes de embotellar.

Es la que ms se produce en Alemania, E.U., Mxico, etc. Las lagers de E.U. tienden a tener poco lpulo comparado con las europeas, y no son amargas. Con 40-90 kcal/100 ml y <6 % (v/v) alcohol (legislacin mexicana).

Tipos de cerveza
Ale: Se hacen con cepas de superficie que crecen uniformemente en todo el mosto, son S. cerevisiae o S. carlsbergensis. Crecen a 14-23C por 5-7 d. Es casi exclusiva de Inglaterra, y su periodo de aejamiento es de solo 1-3 d. Tiene sabores ms complejos que las lager por la T de fermentacin (sabor afrutado por steres, etc.). Las ales fuertes tienen >5% de alcohol, stout, porter, pale ale, bitter, con colores de amarillo a negro y sabores de ligeros a muy profundos y complejos Cervezas secas y ligeras. Pueden hacerse de ales o lagers, aunque se usan ms comnmente las lagers. La ligera tiene sabor ms simple por menores niveles de carbohidratos no fermentescibles, obtenindose menos alcohol, y por tanto menos caloras (15-30 kcal/100 ml). Las cervezas secas tienen el mismo alcohol que las convencionales, pero con diferente calidad sensorial con menos sensacin de llenado. Sin alcohol: <1 % (v/v) Cervezas sin alcohol: Evaporacin: los componentes voltiles se recuperan del vapor en forma de esencia por destilacin fraccionada. Rectificacin al vaco: Separar CO2 el cual se lava para recuperar voltiles que se adicionan al destilado al vaco (~42C). smosis inversa a P=5-7,5 MN/m2 . Mtodos ms primarios como la simple detencin del proceso de fermentacin (malos sabores)

Lpulo (Humulus lupulus)

Confiere a la cerveza su sabor amargo caracterstico
Este fenmeno se debe a la isomerizacin de sus resinas Sus componentes amargos son la humulona, lupulona y sus compuestos de transicin, pero tambin tiene aceites esenciales (humuleno, farneseno) y taninos.

Son las flores de la planta femenina del lpulo

Se usa entre 0.4 y 4 g/L Es mejor usar extracto y resinas preisomerizadas

Adems, el lpulo tiene otras funciones

Props. antimicrobianas contra Gram(+) Mayor cuerpo de la cerveza

Fermentacin primaria
La fermentacin es una parte crucial en el proceso de fabricacin de cerveza El proceso de gliclisis y fermentacin fue elucidado primeramente en S. cerevisiae Despus de la coccin se elimina el lpulo, se enfra el mosto y se transfiere al biorreactor. Se agregan ~0.5 L de una suspensin de levadura por 100 L de mosto para disminuir la fase lag. La fermentacin es un proceso anaerbico para generar energa a travs de la reduccin de aceptores electrnicos orgnicos como la G3P o acetaldehdo. Altas conc. de glucosa y otros carbohidratos evitan la respiracin de S. cerevisiae, alterando la estructura mitocondrial, ocasionando que la fermentacin sea la ruta predominante de obtencin de energa, an cuando exista abundante oxgeno, este fenmeno se denomina efecto Crabtree.

Glucosa (180 g) 2 EtOH (92 g) + CO2 (88)

Piruvato descarboxilasa (Mg2+)

Alcohol deshidrogenasa (Zn)

Fermentacin secundaria
Cuando todos los CHO fermentescibles se han convertido en EtOH, la cerveza se transfiere a otro tanque, se enfra y se almacena, an con la presencia de las levaduras. El aejamiento vara de varios das a meses, donde la levadura es capaz de ejercer un metabolismo limitado. Se dan otros cambios debido a reacciones qumicas que mejoran el sabor de la cerveza (steres: etil-, isoamil-, feniletil- acetatos: cidos: etil octanoato y etil caprilato) El cambio ms importante es la reduccin en los niveles de diacetilo, el cual tiene un fuerte sabor a mantequilla, indeseable en la cerveza. El diacetilo se forma a partir de -acetolactato (intermediario en la biosntesis de varios aminocidos) a travs de un proceso no enzimtico. El diacetilo se convierte lentamente a acetona por la levadura. Las cerveceras modernas carbonatan la cerveza antes de envasar. Se agrega glucosa para producir CO2 en el producto final.

-acetolactato
Diacetilo

Acetona

[diacetilo]<0.5 mg/L, para no detectar sabor

Mejoras biotecnolgicas de la cerveza: Represin catablica

La glucosa es la mejor fuente de carbono para las levaduras porque puede pasar directamente a la ruta fermentativa La glucosa es preferencialmente fermentada por las levaduras y se usan otros carbohidratos cuando se termina la glucosa, siendo entonces sujetos a represin catablica (RC) Esto resulta en una disminucin indeseable en la velocidad de produccin de etanol que a lo largo de un ao provoca prdidas significativas en la produccin de la cervecera En levadura, la RC tambin se ha llamado sealizacin de la glucosa. Cuando se termina la glucosa, se inactivan los genes necesarios para su utilizacin y se activan aquellos involucrados en la entrada y uso de otros azcares, como maltosa, ocurriendo un cambio diuxico.

Represin catablica en levaduras

En levaduras los niveles de adenosn monofosfato cclico (cAMP), aumentan cuando la glucosa est presente; esto bloquea la transcripcin de genes que codifican para protenas involucradas en la toma y uso de maltosa y otros azcares, aunque el mecanismo de esta regulacin no est claro todava. Como los mecanismos de la RC en levadura no estn claros no se pueden alterar los genes para modificar la RC. Se ha intentado eliminar la RC en algunas cepas de levadura de cervecera exponindolas a un mutgeno (sustancia que causa cambios aleatorios en la secuencia del DNA), y luego a 2-desoxiglucosa, un anlogo de glucosa, que no puede usarse como fuente de C (y energa) por las levaduras

Represin catablica en levaduras

Clulas con RC normal de las cepas silvestres no pueden usar fuentes alternativas de C debido al efecto inhibitorio de la 2-desoxiglucosa. Uno de los muchos mutantes puede desarrollar una RC alterada, por mutacin de un gen responsable de codificar una protena reguladora clave en la expresin gentica. Tal mutante podra ser capaz de usar otros carbohidratos, a pesar de la presencia de 2-desoxiglucosa. Esta estrategia se ha usado exitosamente para producir levaduras mutantes que pueden usar glucosa, maltosa y maltotriosa simultneamente, evitando la fase lag que normalmente ocurre a medida que declinan los niveles de glucosa. Recientemente los genes mig1 y mig2 se han descubierto como los responsables de la represin catablica

Uso de una estrategia de mutagnesis para aislar cepas de levadura con RC alterada
Exponer la levadura al mutgeno

Mutaciones aleatorias en el genoma de la levadura

Exponer las levaduras a 2-desoxiglucosa La RC previene el uso de otros carbohidratos Mueren las levaduras silvestres Levaduras con RC alterada pueden usar otros carbohidratos

Sobreviven las levaduras mutantes

Mejoras en los procesos industriales

S. cerevisiae utilizada en la industria cervecera flocula al presentarse una falta de nitrgeno, oxgeno o carbono. La floculacin est controlada por una proteina de pared celular con su N-terminal hacia el medio y esta se une a glucoprotenas (manosa) Introduccin de -glucanasa para facilitar el filtrado de la cerveza (-glucanos son muy viscosos) Disminucin del tiempo de fermentacin por delecin de mecanismo de control de expresin de invertasa y maltasa (mig1, mig2), a causa de un incremento en el consumo de maltosa y un decremento en el tiempo de adaptacin cuando se agota la glucosa.

Biotecnologa: Cinco reas tecnolgicas principales

DNA recombinante (rDNA). Insercin de DNA nuevo sistema, donde se clona y se expresa. a un

Tecnologa enzimtica. Se usa la capacidad cataltica de las enzimas en solucin o inmovilizadas. Cultivo de tejidos de plantas. Cultivo in vitro de clulas de plantas para obtener sustancias o biotransformaciones requeridas.

Tcnicas de clulas fusionadas. Fusin de dos clulas diferentes, produciendo hbridos con caractersticas de ambos padres. Ingeniera del procesamiento y tecnologa de fermentaciones.

Usos de la Biotecnologa en el procesamiento de alimentos

1. Diseo de microorganismos que transformen biomasa no comestible en alimento para consumo humano o alimentacin animal. Uso de sistemas biolgicos para ayudar al procesamiento de alimentos ya sea actuando directamente sobre el alimento o suministrando materiales que puedan aadirse al alimento (aditivos) Procesos innovadores en la tecnologa de alimentos: eliminacin de cido ercico del aceite de canola

2.

3.

Categora de Procesos
1. 2. 3. Produccin de clulas microbianas: levadura, vacunas, insecticidas microbianos. Produccin de metabolitos: alcohol, cidos orgnicos, antibiticos, aminocidos, vitaminas y enzimas. Bioconversin de sustratos, no utilizados para crecimiento: hormonas esteroides: Progesterona 11-hidroxiprogesterona por Rhizopus nigricans, luego por sntesis qumica: cortisona y otros tres esteroides (800 tons/ao). Bioconversin de sustratos, usados para crecimiento pero con objeto principal de cambiar su estado fsico: aguas residuales Alimentos fermentados: yoghurt, queso, ensilado, salami, etc. Cultivo de clulas de plantas y animales usando tcnicas microbiolgicas. a) Clulas animales. Anticuerpos monoclonales b) Clulas de plantas

4. 5. 6.

Procesos Biotecnolgicos
Seleccin del organismo Gentica Aplicada (mutacin, recombinacin, manipulacin de genes)
Esterilizacin

Biorreactor (Clulas microbianas, de plantas o animales; enzimas) Procesos de recuperacin

Calor Eliminacin de gases

Elim. de slidos

(rompimiento de pared celular, separacin S-L, concentracin, cromatografa, cristalizacin)

Elim. biomasa

Producto final (enzimas, antibiticos, aminocidos)

Transformacin Gentica de Cultivos

Usos Potenciales de Plantas Transgnicas de Relevancia para Consumidores y la Industria de Alimentos.

Cultivos recombinantes liberados en EUA entre 1994 y 2000

(lino)

Rendimiento del algodn Bt en Mxico

Cutivos de OGM como canola, maz, algodn y soya representarion ms del 99% de cultivos de OGM a nivel mundial en 2001. En 2001 en EUA nicamente stos 4 cultivos ms papaya y calabacita transgnicos produjeron un extra de 4 millardos de lb de alimento y fibra, y aumentaron el ingreso de granjas en $1.5 millardos y redujeron el uso de plaguicidas en 46 millones de lb.
http://whybiotech.com/mexico.asp?id=2701; Council for Biotechnology Information, (2004)

"Plant Biotechnology: Current and Potential Impact for Improving Pest Management in U.S. Agriculture, An Analysis of 40 Case Studies," National Center for Food and Agricultural Policy, June 2002, <www.ncfap.org/40CaseStudies.htm>.

Daar el ambiente? Es seguro para comer? Cmo me beneficia? La nueva tecnologa es riesgosa
Preocupaciones del consumidor

Rechazo del consumidor de alimentos conteniendo plantas transgnicas

Factores que conducen a la hostilidad del consumidor hacia alimentos conteniendo plantas transgnicas

Compuestos indeseables en cultivos comestibles, naturaleza qumica y presencia o ausencia de lneas transgnicas con niveles reducidos de cada compuesto

Procesos biotecnolgicos por fermentacin

Leches fermentadas Grupo I. Lactococcus y leuconostoc. Acidez baja moderada: Jocoque,

buttermilk

Grupo II. Lactobacillus. Acidez moderada/alta: Leche blgara, yakult,

leche acidfila

- Grupo III. Lactobacillus, Streptococcus. Acidez moderada/ alta. Yoghurt,

Bioghurt, Brano

Grupo IV. Bacterias lcticas y levaduras. Acidez y alcohol: Kefir,

Koumis, Blgaros

Suero Produccin de cidos orgnicos (propinico, actico, lctico), etanol, -galactosidasa Medio de cultivo: Protena unicelular (Kluyveromyces marxianus) Levadura para panificacin (S. cerevisiae), despus de hacer disponible los azcares (hidrlisis de lactosa) Bebidas (Rivella, Gefilus)

Composicin del suero lcteo

Proteina 0.70% Lactosa 4.80% Grasa 0.80% Minerales, 0.70%

Agua, 93%

Base hmeda

DBO: 30-50 g/L

Dubach, 1988.

Produccin mundial de suero lcteo

Nueva zelanda, Irlanda 1.89% Italia 1.21% 6.67% Asia, 4.38%

Sudamrica, 5.70%

Polonia 4.28% Alemania 10.03%

Francia 11.36%

Mxico 0.81%

Estados unidos, 20.63%

Canad 2.67%

FAO, 2001

Suero lacteo utilizado

Usos del suero lcteo

Productos lcteos
(WPC, WPI)

Suero aprovechado 10%

Hidrolizados proteicos

Panadera

Confitera Ac. Lctico

suero no aprovechado 90%
Cmara de productos alimenticios elaborados con leche, 1985

Enzimas: inulinasa, lactasa

a partir de K. lactis, o pectinasa y lactasa.

Alimentacin humana
Jarabes de suero Protena unicelular (C. utilis, K. marxianus)

Produccin de 1.15 millones de tons (1984), y 85% ms para 1995.

Programas de investigacin sobre propiedades nutracuticas de productos lcteos

Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina-I (ACE)((Dism. la presin arterial) Glicomacropptido (64 aa) Prebiticos, probiticos y simbiticos -lactoglobulina como acarreador y fijador de retinol Pptidos bioactivos liberados de las estructuras nativas de la casena (casomorfinas, fosfopptidos) Protenas biolgicamente activas (lactoferrina y sus pptidos)

Productos fermentados de leche como alimentos funcionales

Probiticos
Microorganismos benficos

Prebiticos
Incrementan el crecimiento de probiticos

Simbiticos
probiticos y prebiticos juntos

Hidrolizados de protena de leche

Farmacutico dietas de formulacin definida, nutricin enteral, nutricin parenteral Alimentos infantiles hipoalergnicos, no alergnicos, bajo peso al nacer, fenilcetonuria Fortificacin Nutricional - calcio bebidas enriquecidas, bebidas isotnicas para atletas.

Pptidos derivados de la leche bovina con propiedades inmunoregulatorias

Adapted from Gill & Rutherfurd, 1998

Algunos nutracuticos podran ser ms adecuadamente clasificados como frmacos

Inmunizacin Vaca Vaca Hiper- Transgnica inmunizada Ingenera gentica
Tratamiento de enfermedades digestivas.

Bacteria

Tratamiento Inmunoglobulinas basadas en Leche y trmico

calostro (MCBIs) Componentes antibacteriales no especficos Manufactura

Posible actividad anticariognica

Anti-allergy properties of fermented foods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria?
M. L. Cross, L. M. Stevenson and H. S. Gill
International Immunopharmacology Volume 1, Issue 5, May 2001, Pages 891-901
Abstract Clinical reports have suggested that dietary consumption of fermented foods, such as yogurt, can alleviate some of the symptoms of atopy and might also reduce the development of allergies, possibly via a mechanism of immune regulation. Controlled studies have indicated that consumption of fermented milk cultures containing lactic acid bacteria (LAB) can enhance production of Type I and Type II interferons at the systemic level. In animal models, LAB have been shown to promote interferon expression, and to reduce allergen-stimulated production of IL-4 and IL-5 in some cases. Recent results have shown that LAB are potent inducers of pro-interferon monokines (IL-12 and IL18), and that cytokine secretion is stimulated by the interaction of Gram-positive cell wall components with surface receptors of mononuclear phagocytes, via NF-B and STAT signalling pathways. However, it is clear that the extent and quality of LAB-induced immunoregulation is strain-dependent. This review discusses the clinical and laboratory evidence for anti-allergy properties of fermented foods, and proposes a model for the mechanism by which some welldefined strains of immunoregulatory LAB might down-regulate a Th2 allergic phenotype.
Milk and Health Research Centre, Institute of Food, Nutrition and Human Health, Massey University, Palmerston North, New Zealand

-lactalbumina Bovina
PM= 14.2 kDa y es muy parecida a la protena humana. 74% de sus aminocidos son idnticos, y un 6% extra tiene un alto grado de similitud qumca. La alfa-LA bovina consiste de 123 aas y cerca del 10% de la protena bovina est glicosilada. Tiene 4 enlaces disulfuro, Cys6-Cys120, Cys28Cys111, Cys61-Cys77, and Cys73-Cys91. Dos puentes (Cys6-Cys120) y (Cys28-Cys111) estn en el dominio-a, el tercero (Cys61-Cys77) est en el dominio-b. El cuarto (Cys73-Cys91) conecta la hlice-C del dominio-a con una hlice-310 en el dominio-b. No tiene tiol libre y es una metaloprotena que enlaza Ca, en donde el Ca estabiliza la estructura.

 Embutidos fermentados Los microorganismos reducen la humedad, contribuyen a la estabilidad y proporcionan sabores y aromas caractersticos. M.O.: BAL, Corynebacterium sp., Debaromyces sp., Penicillium expansum, P. nalgioviensis. Pueden ser secos y semisecos, de carne (principalmente cerdo) picada que por accin microbiana llegan a un pH 5.3, y eliminada 25-50% de humedad (secos) 15% (semisecos). - Ahumados/curados (semisecos): Thuringer (alemn). 18-48 h de maduracin a 35-40C, coccin a 105C; 50% humedad - Secos. Salami (italianos). 18-48 h de maduracin a 28-32C; 30-69 d de secado a 10-22C; 35-40% humedad - Ahumados. Boloa (embutido de Lbano, Penn.). Slo de res. 10 d en salmuera a 4C, uso de KNO3; ahumado a 68C por 4-8 d. 50% humedad.

Clasificacin de bebidas alcohlicas segn el sustrato de donde proceden

Sustrato No destiladas
(3.5-14% alcohol)

Destiladas

Fortificada

(35-55% alcohol) (~20% alcohol) Brandy, coac, armaac, pisco grappa

Calvados

FRUTAS
Uva Vino, champaa, vino espumoso
Sidra, sidra espumosa Perry Kirsch Vinos de frutas:
capuln, ciruela, guayaba, pitahaya, etc.

Jerez, oporto, vermouth, moscatel, madeira

Manzana Pera Cereza Otras

Clasificacin de bebidas alcohlicas (Cont.)

Sustrato
Cereales Cebada Maz

No destiladas
Cerveza
Tesgino

Destiladas
Whisky
Bourbon, whisky de maz de Tennessee

Varios (incluyendo papa) Arroz Caa Melazas jugo Cerveza africana

Vodka, ginebra, akvavit

Ron, aguardiente, cachaza, pinga, charanda

Agaves
Miel

Pulque (A. atrovirens)

Vino de miel

Tequila (A. tequilana Weber), mezcal (A. angustifolia)

Qu es el mezcal?

Es aquel producto que se obtiene de la destilacin y rectificacin de mostos preparados directa y originalmente con los azcares de las cabezas maduras de los Agaves, previamente hidrolizadas o cocidas y sometidas a fermentacin alcohlica con levaduras, cultivadas o no. El Mezcal 100% agave puede ser joven, reposado o aejo y susceptible de ser abocado. Este debe ser producido en la Regin del Mezcal en Mxico. Durango, Zacatecas, San Luis Potos, Guerrero y Oaxaca.

NOM-070-SCFI-1994 Bebidas alcohlicas

Materia prima utilizada para produccin de Mezcal en Mxico

OAX GUE DUR ZAC

SLP ZAC

Agave potatorum

Agave scabra

Agave salmiana
GUE

OAX GUE SON

Agave weberi Agave angustifolia haw Otras especies del genero agave excepto A. tequilana.

Proceso de elaboracin del Mezcal

1. Jima
2. Coccin

3. Molienda

5. Destilacin y Almacenamiento

Mezcal

4. Fermentacin

Alimentos y bebidas fermentados tradicionales

Alimentos fermentados por hongos. Productos de origen indonesio como el tempeh (soya fermentada por Rhizopus oligosporus) , y oncom (cacahuate fermentado por neurospora sp.). Alimentos fermentados por bacterias. Generalmente BAL, gnero Bacillus. - Verduras fermentadas. Col (sauerkraut), rbano, pepinos, etc., fermentados en salmuera - Pescados fermentados. Salsas y pastas de pescado usadas como condimento en el sureste asitico. Kecap de Indonesia, patis de Filipinas. - Granos fermentados. Fermentacin por B. subtilis de soya para producir natto (producto viscoso de olor y sabor penetrante) en Japn. - Productos de maz. En frica se fermenta una masa de maz dando el kenkey. La fermentacin dura 3 d y se ha identificado a Corynebacterium sp., Aerobacter cloacae y Lb. plantarum

Alimentos y bebidas fermentados tradicionales

- Productos de arroz. El idli es un pan hind a base de arroz y frijol

negro. Se produce cido y gas por fermentacin natural con L. mesenteroides y S. faecalis. - Productos de yuca. El gari es yuca fermentada por 3-4 d, se fre y se mezcla con agua, azcar, especias Alimentos fermentados por mezcla de hongos y levaduras el ragi de origen chino se usa como inculo en varias fermentaciones asiticas. Se hace fermentando harina de arroz y Mucor, Rhizopus, Candida y Saccharomyces le confieren sabor dulce, un poco cido y alcohlico Alimentos fermentados por hongos, seguido de una mezcla de bacterias y levaduras Se usa como inculo el tane koji que es un polvo verde-amarillento conteniendo esporas de A. oryzae y A. soyae, para la primera fermentacin de la salsa de soya. La segunda fermentacin se hace con bacterias y levaduras. Otro producto similar es el miso y sake

Algunos alimentos mexicanos fermentados

Nombre Alimentos de maz Atole Descripcin Estados donde se consume
SLP, Ver, Hgo, Pue, Gro, DF,Tlax, Mich, Jal, Oax.
SLP, Ver, Hgo, Pue, Gro, DF,Tlax, Mich, Jal, Oax.

Bebida no embriagante (BNE) preparada con masa de maz, de tortillas y mazorcas

BNE de masa de maz negro y fermentado por 4-5 d

Atole agrio

Charagua

BE a base pulque con almbar, chile ancho y hojas de maz tostado. Se calienta y luego se fermenta.

SLP, Ver, Hgo, Pue, Gro, DF,Tlax, Mich, Jal, Oax.

Pozol

BNE cida. Masa de maz nixtama- Tab, Chis, Yuc, Oax, lizado fermentada envuelta en hojas Ver, Gro, QR. de pltano; diluido con agua

Algunos alimentos mexicanos fermentados (Cont.)

Nombre Descripcin Estados donde se consume
Chih, Son, SLP, Zac, Dgo
De consumo general en el pas

Alimentos de frutas
Colonche Tepache

Bebida dulce, gaseosa, ligero olor butirceo, y bajo contenido alcohlico. Fermentacin de jugo de tunas
Bebida dulce refrescante. Se obtiene de la fermentacin de jugo y pulpa de pia, naranja, guayaba, arrallanes Bebida alcohlica elaborada de pia, agua de cebada y masa de maz prieto. Se fermenta por 4 d y se aade dulce, clavo y canela Bebida alcohlica obtenida por infusin del jugo de tunas con cscara de frutos de timbre(4-8cm) (Acacia augustissima)

Chicha

Tejuino

Mtodos para el estudio de comunidades microbianas en alimentos fermentados

Clonacin

ARDRA=Anlisis de Restriccin de DNA Ribosomal Amplificado AFLP= Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados RAPD= Anlisis de DNA polimrfico amplificado al azar RFLP=Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin

Denaturing gradient gel electrophoresis (Urea 6M, Formamida) Temperature Gradient Gel Electrophoresis

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) consiste en amplificar el gen 16S rRNA seguido de una separacin de digeridos con diferentes enzimas de restriccin. Estos patrones de restriccin combinados resultan en perfiles ARDRA que permiten diferenciar entre la mayora de las especies. Por ej. los patrones de restriccin obtenidos con respectivamente CfoI, AluI, MboI, RsaI y MspI numerados respectivamente 1,1,1, 2 and 3 rinden en combinacin el perfil ARDRA 11123 que es caracterstico de A. baumannii. El proceso completo de extraccin de DNA (a partir de un cultivo puro), amplificacin del 16S rDNA, restriccin, digestin y electroforesis en agarosa toma un da (hasta 30 cepas).
Figure 1. Patrones de restriccin obtenido despus de digestion con enzimas de restriccin CfoI,
AluI, MboI, RsaI and MspI para 16S rDNA amplificado de diferentes especies de Acinetobacter.

Perfiles ARDRA de cepas de Acinetobacter previamente identificadas a especies genmicas por el uso de hibridacin DNA-DNA. Los patrones se muestran en la Fig. anterior.

Pattern with enzyme Genomic species 1 (A. calcoaceticus) CfoI 2 3 2 (A. baumannii) 1 1 1 AluI 2 2 1 1 1 MboI 1 1 1 1 1 RsaI 1 1 2 2 2 MspI 3 3 3 1 1+3

Strains (N) 7 1 27 33 4 Reference strain ATCC 23055T RUH 583 ATCC 17904 ATCC 19606T LMD 82.54

AFLP
I paso: digerir DNA genmico con una enzima de restriccin que corte frecuentemente (MseI, 4 pb secuencia de reconocimiento) y otra que corte menos fecuentemente (EcoRI, 6 pb secuencia de reconocimiento). Los fragmentos resultantes se ligan a molculas adaptadoreas extremoespecficas. Se realiza una amplificacin preselectiva por PCR usando primers complementarios a c/u de los adaptadores, excepto por la presencia de una base adicional en el extremo 3, seleccionada por el usuario. Ocurre amplificacin de solo 1/16 de los fragmentos de EcoRI-MseI. En un segundo PCR "selectivo", se usan los productos del primer PCR como plantillas, conteniendo los primers dos bases adicionales, seleccionadas por el usuario. Los primers para los adaptadores especficos de EcoRI estn etiquetados por fluorescencia o radioactividad. El perfil electrofortico revela un patrn (huella digital) de fragmentos representando cerca de 1/4000 de los fragmentos de EcoRI-MseI. Primer preselectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCg Adaptador -------------------------------| Primer selectivo EcoRI GCCTAAGCCGAATTCgtc Adaptador --------------------------------|

AFLP Comparado con RAPD, se requieren menos primers para realizar escrutinios de todos los sitios posibles. El procedimiento de AFLP tpicamente detecta ms polimorfismos por reaccin que los anlisis por RFLP o RAPD. El anlisis AFLP es especialmente til para el escrutinio de individuos que se retrocruzan (backcross). AFLP's, pueden ser marcadores codominantes, como los RFLP's. La codominancia resulta cuando el polimorfismo se debe a secuencias dentro de la regin ampliada. Pero debido al No. de bandas observadas al mismo tiempo, se requiere evidencia adicional para determinar que un grupo de bandas resulta de diferentes alelos en el mismo locus. Si el polimorfismo se debe a la presencia/ausencia de un sitio de unin al primer, la relacin es dominancia. El alelo que no tiene unin al primer no ser detectado como una banda.

RAPD La complejidad del DNA nuclear eucaritico es suficientemente alta para que aleatoriamente existan pares de sitios complementarios a octa- o decanucletidos de una tira en la orientacin correcta y relativamente cercanos unos de otros para que puedan ser amplificados por PCR. Con algunos decanucletidos escogidos al azar no se amplifica secuencia alguna. Con otros, productos de la misma longitud se generan a partir de DNAs de diferentes individuos. Con algunos otros, se dan patrones de bandeo (ver figura) diferentes para cada individuo de una poblacin. La bandas variables son comnente llamadas DNA polimrfico amplificado al azar (RAPD). Tres de las bandas de la figura son bandas RAPD.

RAPDs exhiben polimorfismo y pueden usarse como marcadores genticos RAPDs son dominantes en el sentido de que la presencia de una banda RAPD no distingue entre estados hetero- y homozigotos.

Tecnologa Enzimtica
El mercado mundial para las enzimas de inters industrial se ha estimado en US $ 625 millones (1989) y $ 2 millardos (2004), siendo Novozymes (55%) y Danisco (30%, Dinamarca) los principales productores, con un ritmo de crecimiento de 2-3% anual. En Mxico el mercado estimado es de US $17 millones. En 1985 se produjeron 80 000 tons de productos enzimticos, equivalentes a 4 000 tons de protena activa. La mayora de las enzimas producidas encuentran aplicacin en la industria de los alimentos: la industria alimentaria ocupa el 62 % (con la tercera parte usada en panificacin), la textil el 5 % y la industria de los detergentes el 33 %. En la industria alimentaria las enzimas se utilizan principalmente para el procesamiento del almidn, en seguida para la elaboracin de quesos, jugos, repostera, jarabes fructosados.

Distribucin del mercado mundial de las enzimas

Rao y col., 1998

Selected Industrial Enzyme Companies

AB Enzyme www.abenzymes.com Bio-Cat www.bio-cat.com Danisco Dinamarca www.danisco.com Diversa Corp. www.diversa.com DSM Food Specialties USA www.dsm.com Enzyme Development Corp. www.enzymedevelopment.com Genencor Internationala www.genencor.com National Enzyme Co. www.nationalenzymecompany.com Novozymesb www.novozymes.com
a

Second largest manufacturer b First largest manufacturer

Enzimas en la industria

Kaneka ha encontrado una formiato deshidrogenasa robusta para el reciclaje de cofactores en procesos de oxidacin-reduccin.

Dowpharma ha usado su tecnologa de expresin Pfenex para producir grandes cantidades de enzimas.

Uso Industrial de enzimas: Panificacin

En panificacin, las amilasas, celulasas y proteasas ayudan a procesar el pan y la masa para mejorar las calidades de: textura, volumen, estabilidad y estructura de la miga. La harina de trigo contiene <1% de azcares fermentescibles, Los principales carbohidratos son almidn y pentosanos. La harina contiene ~5-7% del almidn daado el cual es susceptible de ataque enzimtico. Las - y -amilasas actan sobre sta fraccin de almidn produciendo maltosa. La harina quebrada y molida generalmente tiene poca -amilasa y se aade Una dextrinizacin excesiva produce una comnmente a la harina, usualmente como miga con textura suave, pegajosa en la hogaza terminada. La -amilasa tambin es una preparacin fngica.
efectiva para retrasar el envejecimiento del pan.

Uso Industrial de enzimas: Panificacin

La harina de trigo contiene tambin ~ 2.5-3% de pentosanos, tal como arabinoxilanos que representan cerca de un cuarto de la absorcin de agua de la masa. Los pentosanos insolubles deprimen el volumen de la hogaza y hace una estructura de la miga mas abierta. Existe actualmente mucho inters en usar xilanasa en panificacin para reducir el contenido de pentosano insoluble. Las proteasas (de A. oryzae) se aaden a menudo para relajar la masa, resultando en mayor mobilidad y extensibilidad. Esto es probablemente debido a efectos en las fracciones de gluten o gliadina de las protenas. Una acccin excesiva de las proteasas causa pegajosidad en la masa.

Uso Industrial de Enzimes: Panificacin

Otra adicin comn a los sistemas de masa es la lipoxigenasa. Esta enzima oxida los cidos grasos cis, cis-polienoicos a hydroperxidos, oxidando conjuntamente los grupos -SH de las protenas a grupos -S-S-, aumentando la resistencia de la fraccin del gluten en las protenas de la masa. Tambin acta sta enzima como blanqueador ya que decolora los carotenoides de la harina. La enzima es usualmente aadida en forma de harina de soya desgrasada.

Soybean lipoxygenase

Uso Industrial de enzimas: Lipasas en la Industria Lctea

Se usan principalment en la IL para la mejora del sabor y en la maduracin de quesos.

Los cidos grasos libres dan el sabor y aroma caracterstricos de los quesos: liberacin de cidos grasos de cadena corta (C4 y C6) dando sabores fuertes y c. grasos de cadena media (C12 y C14) dan origen a sabores a jabn. Los c. grasos pueden ser biotransformados por la poblacin microbiana del queso, conduciendo a la formacin de compuestos de sabor como acetoacetato, beta-ceto cidos, metil cetonas, steres y lactonas. Tradicionalmente lipasas animales se han usado en los quesos, con cada especie resultando en un perfil de sabor caracterstico. Recientemente, se han introducido lipasas microbianas de Mucor miehei, Aspergillus niger, y A. oryzae.

Queso
Romano Feta

Lipasa
cabrito/cordero pregstrico Mucor miehei

Mozzzarella Ternera/cabrito pregstrico Parmesano Provolone Cheddar A. niger Manchego A. oryzae Azul

Uso Industrial de enzimes: varios

Las pectinases ayudan a romper las paredes ceulares de las plantas, permitiendo ms eficiente extraccin de jugos para bebidas de fruta y vino, y mejorar el proceso de clarificacin. Una gran variedad de enzimas especializadas se han usado para diferentes productos. P. ej. pueden usarse proteasas especficas para hidrolizar compuestos alergnicos en soya o leche, permitindoles un uso seguro como aditivos alimentarios. Las enzimas son tambin valiosas en la produccin de sabores y fragancias para mejorar la calidad de los alimentos.

Enzimas y microorganismos con potencial en la industria de alimentos

Termolisina
(B. thermoproteolyticus)

Sntesis de aspartamo Sacarificacin de almidn

Nuevos disacridos Produccin de jarabes de maltosa Degradacin de cscara de cacahuate Generacin de aroma en quesos

Pululanasa cida
(B. acidopullulyticus)

Fructosil transferasa
(B. subtilis)

-amilasa cida
(B. stearothermophilus)

Ligninasas
(Arthrobacter sp.)

Varias
(Irpex lacteus, Formitopsis pincola)

Produccin industrial de aminocidos

La produccin microbiolgica de aminocidos se basa en la conversin de diferentes fuentes de carbono, tales como melaza, glucosa, hidrolizados de almidn, azcar, etc. Pero no en todos los casos se usa la fermentacin comercialmente. Mtodo Ejemplo Fermentacin (glucosa/melazas) Acido L-glutmico, L-lisina Enzimtico (preparacin de Ac. L-asprtico de ac. fumrico precursores) L-alanina de c. L-asprtico Sntesis qumica DL-metionina Extraccin L-cistena de pelo humano y de equino

Aplicacin de tcnicas modernas de biotecnologa para la produccin de aminocidos

Metodologa
Cultivo continuo Cultivo continuo en cepa transformada genticamente Ingeniera gentica Clulas inmovilizadas/sistema continuo Nueva cepa, sustrato barato, ingeniera gentica

Aminocido
L-lisina L-triptofano L-treonina, L-fenilalanina L-serina L-fenilalanina

Se han usado tcnicas de ADN recombinante eficientemente en Brevibacterium flavum (Lys) y Corynebacterium glutamicum (Glu), con el fin de tener cepas mutantes, con caractersticas regulatorias deseadas e hiperproductoras de aminocidos.

Aminocidos usados en la industria alimentaria

Aminocido
L-Glu (GMS) L-Asp y Ala Gli L-Cys L-Try + L-His L-Lys L-Met DL-Met

Prod. mundial/ ao (tons)1984

~1 milln (2004) 5,000 (Q) 6,000 (sntesis qumica, Q) 700 (Extraccin) 400 70,000 150 enzimtica 120,000 (Q) Varios

Usos

Utilidad
Reforzar sabor, ablandador de carne Enriquecer el sabor Mejorar sabor, punto de inicio en sntesis orgnica Mejorar la calidad; Antioxidante Antioxidante, aditivo nutritivo

Jugo de frutas Alim. Endulzados Nutricin humana Pan, jugos de frutas Varios, leche en polvo

Pan (Japn), Alim. Aditivo nutritivo animal Prods. de soya; Alim. animal. Aditivo nutritivo, uso en hepatitis (teraputico)

Valor de mercado estimado (2004): $ US 3.5 billones; Ajinomoto (30%), ADM y BASF. 52% alimentos, 30% alim. animal, 18% especialidades qumicas y farmacuticas).

Producccin de aminocidos por enzimas inmovilizadas

DL-R-CHCOOH + H2O Aminoacilasa L-R-CHCOOH + RCOOH + NHCOR NH2 D-R-CHCOOH Acetil D,L-aminocido L-aminocido NHCOR
Acil-D-aminocido

Racemizacin Tanabe (Japn) en 1969 desarroll un proceso continuo utilizando aminoacilasa de A. oryzae inmovilizada en DEAESephadex. Con reactores de 1 m3 se obtienen 200-250 kg de aa/da. Se producen por este mtodo L-Ala, L-Met, L-Phen, L-Trp, LVal (520 ton/mes).

Aumento de la productividad de Aminocidos

La fig. siguiente muestra las rutas bioqumicas y los mecanismos regulatorios de metabolitos producidos por m.o. y mtodos de promocin de sobreproduccin de los metabolitos Para tener una sobreproduccin, el aa debe excretarse de la clula, la cual deber seleccionarse de entre otras con cambios en sus mecanismos de control Para el cido glutmico (GLU), la velocidad de crecimiento de las bacterias (Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium glutamicum), aumenta por la adicin de biotina al medio. Pero esto reduce la permeabilidad de la membrana para GLU disminuyendo su sntesis y acumulacin. La adicin de penicilina c. grasos saturados (C16, C18) al cultivo restaura la permeabilidad de la membrana, resultando altos rendimientos y acumulacin de GLU

Mtodos tpicos para promover la sobreproduccin de metabolitos Smbolos Produccin Puntos de Control S: Sustrato
Inhibicin represin

Aceleracin
Desregulacin limitacin

A y B: Intermediario C: Subproducto P: Producto E: Enzima

Funcin
1: Activacin crecimiento celular 2: Aceleracin de la exc. de producto 3: Elim. de la inhib por retroaliment. y represin 4: Enriquecimiento de la activ. enzim. 5: Reduc. de la ac. enz. que conduce a subproductos

Ruta y control de la produccin de Lis en mutantes auxotrficos de C. glutamicum auxtrofo cuando slo
es capaz de proliferar en Oxaloacetato Aspartato un medio de cultivo si a ste se ha aadido Aspartato cinasa alguna sustancia especfica, que el tipo Aspartil fosfato silvestre, llamado prottrofo no requiere, porque es capaz de Aspartato semi-aldehido sintetizarla.

Glucosa

Mutante no tiene homoserina deshidrogenasa

Homoserina

Dihidropicolinato
Diaminopimelato

Metionina

Treonina

Lisina

Penicillin yields raised from 0.15 to 7 g/L by spontaneous or induced mutations

Aminocidos producidos por cepas mutantes

La produccin de L-LIS se obtiene de cepas productoras de L-GLU donde la primera enzima de la ruta biosinttica (Aspartato cinasa; AC) se regula por unos cuantos metabolitos tales como TRE y LIS a travs de una inhibicin por retroalimentacin concertada (el efecto de los moduladores es ms que aditivo). Se han obtenido mutantes regulatorios de C. glutamicum donde la AC es resistente a la inhibicin por LIS, y la enzima homoserina deshidrogenasa se ha eliminado genticamente, por lo cual no se produce TRE ni MET. Suministrando bajos niveles de TRE se han producido industrialmente 170 g/L de LIS y 0.54 mol LIS/mol glucosa Produccin anual de LYS: 300,000 tons ($ US 600 millones)

Principales polisacridos microbianos de inters comercial

Polisacrido Fuente Composicin
Unidad estructural: glucosa, manosa, c. glucurnico (2:2:1), PM~2x106 Da. Se produce a pH>5.0, 28C, en quimiostato con conds. limitadas de N

Xantana

Xanthomonas campestris

Dextrana

Leuconostoc mesenteroides Azotobacter vinelandi

Pseudomonas aeruginosa

Glucosa con enlace -1-6, ramific. 13, 1-4 (5%). nSacarosa Dextrnsacarasa nfructosa+dextrana PM:0.5-1x106 Da. cido gulurnico y manurnico conectados por enlaces -1-4 y -1-4. Sustituyentes acetil. 50-100,000 residuos.

Alginato

Curdlano

Alcaligenes faecalis

Glucano con enlaces -1-3

Fermentation process for the production of microbial xanthan

Xanthomonas campestris
inoculum (<0.2%) a) 1-5% carbohydrates (glucose, sucrose, corn starch hydrolyzates, etc.) b) 0.05-0.1 % nitrogen (yeast extract, peptone, ammonium nitrate or urea) c) Salts (0.27% NH4Cl, 0.5% K2HPO4, 0.01% MgSO47H2O, 0.09% NH4NO3, etc.

Microbiological media
Aerobic batch fermentation
(Fed & continuous culture systems are also patented)
48 h, pH 7.0

Xanthan recovery (25-30 g/L)

(Precipitation, with isopropanol or methanol. This step also kills the culture)

Drying (vacuum or spray) and grinding

Xanthan
(12% moisture; 9-10% ash)

Flow diagram of the production process of microbial alginate

Principales aplicaciones de los alginatos

rea de aplicacin Funcin Ejemplos

Industria de bebidas y alimentos

Industria farmacutica Otros usos

Estabilizante Espesante Gelificante

Estabilizante Gelificante Espesante

Estabilizacin de espumas Suspensin de frutas, espesante de salsas Reconstitucin de alimentos Emulsiones para cosmticos Impresiones dentales, fibras y pelculas, cubiertas para tabletas. Tintas para impresin, inmovilizacin de clulas y enzimas

Biopolmeros producidos por microorganimos con potencial aplicacin industrial

Biopolmero
Celulosa bacteriana (Acetobacter xylinum) Gelana (Pseudomona elodea) PS-10 (Kelco, EUA) (Erwinia tahitica) Emulsana (Acinetobacter calcoaceticus)

Caractersticas
Pelcula extracelular compuesta de microfibras de celulosa Polmero extracelular compuesto de glucosa y rahmnosa. Geles termoreversibles. Producido por Kelco (EUA) Polmeros de glucosa, manosa, fructosa, c. glucurnico. Sustitutos de hidroxi-etilcelulosa en pinturas Lipopolisacrido que funciona como emulsificante

Compuestos Aromticos y Sabores

La legislacin trata de limitar el uso de sabores y aromas artificiales en alimentos y bebidas. Aumento en el rechazo del pblico de alimentos (ingredientes) qumica o sintticamente producidos. Sabores naturales encuentran uso ms amplio en alimentos; de plantas (a menudo en cantidades pequeas o en forma enlazada), o de origen microbiano. Sabores microbianos puede venir de biosntesis (sntesis de novo, de clulas en crecimiento o de su metabolismo secundario; bajos rendimientos) o de biotransformaciones (modificaciones especficas o interconversiones de estructuras qumicas; mayores rendimientos y mas econmicas). Los microorganismos o enzimas pueden producir ya sea sistemas de sabores complejos multicomponentes o compuestos individuales de sabor. El etil-butilato microbiano (sabor a frutas): $ 180/kg, sinttico: $ 4/kg (Hercules, Inc.)

Compuestos aromticos producidos por microorganismos

Microorganismo
Ceratocystis moniliformis

Aroma
Afrutado: pltano, durazno, pera, rosa

Compuestos
3-metil butiril acetato, - y -decalactona, geraniol, citronelol, nerol, linalol, geranil acetato

Mycoacia uda Penicillium decumbens Sporobolomyces odorus Trametes odorata Trichoderma viride

Afrutado: almendras, pasto Pino, rosa, manzana, hongo Durazno Afrutado: miel, rosa, ans Coco

p-metilacetofenona, ptolil-1-etanol 3-octenona, 1-octen-3-ol, -feniletanol, nerodiol

Metil fenil acetato, geraniol, nerol, citronelol 6-pentil-2-pirona

Vanillin
Principal flavor component of vanilla, which is widely used in flavor formulations. US $ 2,500/kg flavor solids. Extracted form pulped wood (vines), and also via microbial biotransformation (also considered natural) Produced from eugenol or isoeugenol by Serratia, Klebsiella or Enterobacer, with a yield of 3.8 g/L. Can also be obtained form callus cells of Vanilla fragrans or V. phaeantha. Higher yields may be obtained by immobilized culture systems with continuous removal of flavor components; passing them through activated charcoal and eluting with 50% ethanol. COO CHO Eugenol Ferulic acid Vanillic acid Vanillin
O O R
O
OCH 3

-lactone

O R

-lactone

OH

-ionone (off flavor in oxidized freeze-dried carrots)

Flavor enhancers: production of 5 nucleotides by enzymatic hydrolysis of RNA

Yeast (C. utilis, S. cerevisiae)
-Extraction by hot alkaline saline (5-20% NaCl, 8 h, 100C) -Precipitation by HCl or ethanol -dry

RNA (70-90 % purity)

-Exonuclease P1 (Penicillium citrinum) or -Streptomyces aureus mutant [5 nucleotidase & phosphatase (-)] -pH 5, 4 h, 65C

5GMP/5AMP/5CMP/5 UMP mixture 5AMP/5GMP mixture IMP/GMP mixture

-Remove CMP/UMP by adsorption on activated charcoal -Elute adsorbed AMP/GMP with methanol/ammonia

- Deamination of AMP by adenyl deaminase (A. oryzae)

-purification by anion exchange chromatograpy

5 IMP + 5 GMP (1.5-3 %)

NUCLEOTIDES

Monosodium Glutamate (MSG)

Fermentation of glucose and sucrose as carbon and energy sources by C. glutamicum. C. glutamicum accumulates -ketoglutaric acid (AGA) because it is uncapable of performing a complete TCA cycle. AGA is directed towards the production of glutamic acid Biotin limiting conditions leads to more production of GLU Limiting biotin reduces phospholipid synthesis and membrane permeability, but it is restored by adding 0.65 mL/mL of oleic acid (18:1). Using Brevibacterium divaricatum, 50-60% of the C source is converted to GLU, at pH 7.8, 38C, in a fed batch process, after 30-35 h, with a yield of 100 g/L.

Sntesis de Aminocidos y ciclo de Krebs

Flavor enhancers
5 GMP + 5 IMP: their maximum influence in savory flavor is on fish and vegetable proteins. Less effect on meats, cereals, milk, eggs. MSG: Most profound influence on: meat, followed by fish, vegetables, cereals, egg, milk. UMAMI compounds have a most pronounced effect on chicken, and weaker enhancement on beef, turkey and pork Savory ingredients market: $ US 1 billion/year. HVP, Autolyzed yeast extract, soya bean sauce, MSG, I+G.

Clasificacin de los colorantes

I. Naturales 1.- Orgnicos a) Vegetales: Antocianinas, betalanas, carotenoides, flavonoides, clorofila, otros b) Animales: Acido carmnico (de grana cochinilla), cido kermsico (obtenido de las hembras fecundadas de los insectos Kermes ilicis
L. y Kermes vermilio Planchn, parsitos de la encina (Quercus ilex L.) y de la coscoja (Quercus coccifera L.), respectivamente), otros

2.- Inorgnicos a) Minerales: Azul ultravioleta, dixido de titanio, negro carbn II. Sintticos 1.- Orgnicos: Azoicos, antraquinonas, difenilmetano, otros

Pigmentos alimenticios de origen natural

Componente
Tetrapyrroles Clorofilas Grupos Hemo Carotenoides Caroteno Xantofilas

Fuente
Vegetales verdes, de hoja Carnes
Zanahorias (-caroteno), tomates (licopeno), Chiles del gnero Capsicum (capsantina), salmon (astaxantina), zempaschitl (lutena)

Benzopiranos Antocianinas Uvas (enocianina), bayas, manzanas Flavonas y flavanonas Nueces, piel de cebolla, t Betalanas Betacianina Betabel Betaxantinas Betabel Pigmentos derivados de Procesos Caramelo Miel, jarabes, refresco de cola, licores Melanoides Jarabes

Produccin de monascina por diferentes tcnicas Cepa

Cultivo Sumergido Monascus anka

Condiciones de cultivo
Polvo de arroz 3%; MgSO47H2O 0.1%, KNO3 0.15%, KH2PO4 0.25%, 96 h a 30C Idem, 72 h a 35C Polvo de arroz 5%, Glutamato monosdico 0.15%, MgSO4 7H2O 0.1%, KH2PO4 0.25%, 144 h a 30C

M. kaolinus S-11 M. anka V-204

Cultivo slido M. anka Polvo de arroz 168 h, 30-40C M. anka Harina de pan, 192 h, 32C M. kaoliang R 10847 Harina de Mantou 144 h, 32C

Historia de los procesos de hidrlisis para la obtencin de glucosa

Epoca Hasta 1950s Materia prima (almidn 30-45% materia seca) Acidificacin (HCl, pH 1.5). Hidrlisis (T=150C). ED= funcin del tiempo de hidrlisis. Con 45 min: ED =90 con 86% glucosa

Hasta 1960s

Acidificacin (HCl, pH 1.5). Hidrlisis (5-10 T=150C; ED= 12-20). Reaccin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5, T=60C, 48-100 h. J. gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)

Entre 1960s y 70s Licuefaccin con -amilasa (pH5.5-7.0, T=70-90C), ED=20-30. Sacarificacin con amiloglucosidasa (pH=44.5; T=60C, 48-100 h). J. de gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa. Despus de 70s Licuefaccin -amilasa termorresistente (6 a 105C, 2 h a 95C), ED=8-12. Sacarificacin con amiloglucosidasa (pH=4-4.5; T=60C, 48-100 h). J de gluc: ED=96-98 (92-96% glucosa)

Almidn H2O Enzimas (10%) CaCl2

Enzima (90%)

atmsfera

Vapor

Cocedor jet (140C, 30 s) Bomba de desplazamiento positivo ED = 8-15

90-95C, 2 h

Sistema de licuefaccin con -amilasa termorresistente

Process flowchart for dextrose production

Glucoamilasa de A. niger o Rhizopus. El proceso puede ser por lotes o continuo. El rendimiento de glucosa de una suspensin de almidn (32-35 % p/p ) es 95-96%. El rendimiento puede aumentarse por sacarificacin a 10-12 % (p/p) de slidos y usando pululanasa, resultando en aumentos del 0.5-1% En 1998: dextrosa anhidra $ 1.12/kg; dextrosa monohidrato $ 0.51/kg; jarabe de maz $ 0.21 /kg

(50-55% solids)

Jarabe de maz de alta fructosa (HFCS)

La conversin enzimtica de glucosa a fructosa se report en 1957 y fue patentada en 1960 por la compaa CPC (USA) Un desarrollo Japons usando GI de Streptomyces logr la primera produccin comercial de HFCS en 1967 en USA (por lotes). Los problemas que evitaban su competencia con sacarosa y azcar invertido incluyeron - Alto costo de la enzima - Formacin de productos coloreados - Produccin de azcar no metabolizable (D-psicosa) - Inhibicin enzimtica por minerales (Ca2+) La GI inmovilizada re-utilizable permiti una produccin continua en 1972 Este fue el primer uso a escala industrial de enzimas inmovilizadas, cuyas caractersticas son (40-50 %w/w) : - Reduccin significativa de costos de produccin - Costos competitivos con la produccin de sacarosa

(30-40% dry solid; pH 6-6.5)

-amylase Ca2+ (100-200 ppm)

DE=94-98; 31% TS

Mg2+activator

60C, pH 7.0, de-aeration

(87% glucose, 5% F)
Resina fuertemente cida cationica, Ca2+, retrasa fructosa y no Separation retiene DP>3-4 C treatment

70-85% TS

US HFCS producers

HFCS
La produccin anual global de HFCS es 10 millones de tons, en base seca (1999). Para esto se utilizan 1500 tons de GI inmovilizada (GII; 1999) Los mayores productores de GII son Genencor (Danisco) y Novo. La GII de Genencor se produce por adsorcin de la enzima purificada en resinas de intercambio inico, reticulada con polietilnimina y glutaraldehdo, y granulada por extrusin. La productividad es de 12-15 tons de HFCS (bs)/kg GII, con t=1900-3600 h. La GII de Novo (Sweetzyme T) se prepara por reticulacin de clulas de Streptomyces murinus con glutaraldehdo, seguido de extrusin Se usa en biorreactores de 1.5 m(d)x5 m(h) a 60-65C, pH 7.5-8.5 (1 h reaccin; 0.5 tons/da) para producir jarabe con 42% de fructosa, que por fraccionamiento se convierte a 55% de fructosa.

Catalizadores formulados con Glucosa Isomerasa

Compaa
Miles (Takasweet)

Actividad (IGIU/g)* 171

Catalizador
Clulas de Flavobacterium aborescens, extruidas y reticuladas

t1/2 & (hrs) 1800

Gist-Brocades

675
(MGIU/L)

Enzima de Streptomyces missouriensis en gelatina reticulada con glutaraldehdo

Enzima en DEAE-celulosa

1500

CPC Int. Inc.

1487

Novo A/S
Finnsugar (Spezyme, IGI)

200

Clulas de B. coagulans entrecruzadas

Enzima de Streptomyces Rubiginosus en DEAE celulosa y poliestireno con TiO2

1500
1200

*IGIU: Cantidad de enzima que produce un mol de fructosa por minuto &Tiempo de vida media, bajo condiciones ptimas de reaccin.

cido Ctrico
Su produccin rebasa las 3x105 tons/ao Pfizer tiene la mayor planta con capacidad mayor a 8x104 tons/ao 70% es consumido por industria de alimentos y bebidas, donde representa el 55-65% del total de acidulantes 18% se dirige a industria farmacutica Se produce por Aspergillus y Penicillium, aunque tambin levaduras y bacterias pueden acumular c. ctrico a partir de glucosa en un menor tiempo de fermentacin. Su produccin requiere de una operacin defectuosa del CAT y su transporte fuera de la clula.

Degradacin de glucosa a cido ctrico a travs de gliclisis y ciclo de los cidos tricarboxlicos

Produccin de cido ctrico (AC)

Todas las reacciones del CAT excepto la condensacin del AC ctrico son reversibles. Se bloquea la transformacin del AC reduciendo a un mnimo la presencia de iones fierro (cofactor de aconitasa) Se interrumpe entonces la formacin de los dems intermediarios esenciales en biosntesis, por lo cual se requieren reacciones adicionales llamadas anaplerticas de reabastecimiento que regeneren los intermediarios del CAT, aprovechando la reversibilidad del ciclo Tres reacciones anaplerticas pueden ocurrir

Reacciones Anaplerticas del ciclo de Krebs (CAT)

 La nica reaccin anaplertica comprobada en A. niger es la carboxilacin del piruvato, permitiendo la fijacin del CO2 removido de piruvato durante su descarboxilacin a acetil-CoA A partir de glucosa se han tenido rendimientos de 70-90% (w/w), con el mximo terico de 112%. La participacin del ciclo del glioxilato durante la fermentacin ctrica de A. niger es controvertida y solo se ha comprobado en levaduras. Para evitar esta reaccin: Oxalacetato oxalacetato hidrolasa oxalato + acetato Se conduce la reaccin a pH 3.5, al cual sta enzima no acta Los altos niveles de AC inhiben la fosfofructocinasa, la cual se protege en presencia de iones NH4+ a concentraciones superiores a las fisiolgicas

 La deficiencia de Mn2+ permite la acumulacin de iones NH4+, modificndose la sntesis normal de lpidos La consecuencia de esto es la presencia de membranas celulares defectuosas con mayor permeabilidad al AC, as como un mayor flujo de C hacia el AC como resultado de la disminucin de lpidos en los componentes celulares Cuando se usan levaduras para producir AC, la fermentacin es independiente de Mn2+, requieren de un pH menos cido (4.5-6.5), requieren de tiamina y se acumula AC en condiciones de limitacin de N

Aspectos Nutricionales
La produccin de AC est relacionada inversamente con el crecimiento celular Los carbohidratos deben ser simples : melaza (14-240 g/L); N: sales de amonio (0.1-0.4 g/L); 0.1-0.2% de fosfato, Fe2+ y Mn2+ en bajos niveles, por lo que se debe remover el Fe de las melazas (EDTA, polietilenamina).

Aspectos Fisicoqumicos
Temperatura de 25-30C, ya que a T mayor se acumula c. oxlico pH inicial 3.5-4.5, pero se mantiene en 2 durante la etapa productiva

Cintica de la fermentacin para producir cido ctrico por A. niger. La fermentacin es sumergida, aerbica en grandes biorreactores de acero inox. en un medio deficiente en hierro.

Diagrama simplificado del proceso de produccin de cido ctrico por cultivo sumergido a partir de melazas

Microorganismos usados para elaborar productos valiosos en la industria de alimentos

Gene encoding protein of interest

Sequence encoding 6 His in frame with cloned ORF

Clone producing His-tagged protein Expression vector

Tagging Proteins for Affinity Purification

Ni Affinity Column

Clone producing His-tagged protein of Interest

Crude Extract

EluentCompetes for Ni Matrix

Ni Column

Affinity Chromatography

Pure Protein

PAGE Results of a Protein Purification

Separacin de DNA por Electroforesis en Gel

Propsitos Herramienta analtica - Identifcar o conocer algo acerca de un fragmento particular de DNA: tamao, topologa, patrn de restriccin, pureza, concentracin Herramienta Preparativa - Separar un fragmento de inters de una mezcla compleja de fragmentos de DNA.

Gel Electrophoresis

El Gel Tamiza las Molculas Pequeas Molculas Migran ms Rpido

DNA de Alto PM, incremento en la friccin

DNA de bajo PM, disminucin en la friccin

+
Tiempo

Electroforesis en Gel
Molculas cargadas se movern en un campo elctrico Se usa una matriz de gel para tamizar las molculas
Agarosa floja; amplio rango de separacin Acrilamida ms apretada; estrecho rango de separacin

El movimiento a travs del gel depende de la carga y forma NO de la masa Para que el movimiento sea proporcional a la masa (PM) la molcula debe tener un relacin carga/masa constante.

Electroforesis en Gel
El DNA tiene 2 cargas negativas (fosfato disteres) por par de bases Todas las molculas lineales de doble tira del DNA tienen (esencialmente) la misma forma Por tanto el movimiento es proporcional a la longitud (MW)
Distancia 1 / log (MW)

Gel Electrophoresis
DNA cargado en pozos

Movimiento de fragmentos de DNA

+
A B C D E

Bromuro de Etidio Colorante para visualizar DNA

NH3

+
Fluorescencuia se incrementa por enlace al DNA

+H N 3
Absorbe a ~520nm Fluoresce a 605nm (Fluoresce naranja bajo luz UV)

Bromuro de Etidio Intercalado

en la hlice del DNA

XhoI

KpnI

Marker
48

XbaI

ApaI

33
25 17

Anlisis de Restriccin

10

Informacin de Electroforesis en Gel

Tamao
Distancia migrada es inversamente proporcional al logPM (o log(# pb).

Cantidad - Enlace del etidio es directamente proporcional a la MASA del DNA

Quantitation of DNA by Ethidium Bromide Marker DNA Staining

Known size and quantity

10 Kb

1011 Molecules x 10 Kb = 1012 Kb = ~100 ng 2x1011 Molecules x 5 Kb = 1012 Kb = ~100 ng

5 Kb

1 Kb

1012 Molecules x 1 Kb = 1012 Kb = ~100 ng

Clicker Question
You have purified your favorite plasmid from a strain of E. coli. You run an agarose gel with a standard of known concentration to quantitate the DNA. But what about protein contamination? Does the presence of contaminating protein interfere with this procedure? A.Yes B.No

La Densidad de la Matriz Define la Resolucin del Gel

Porcentaje de Agarose

Resolucin de molculas muy grandes de DNA por Electroforesis en Gel de Campo Pulsante
180 KiloBP El campo elctrico se reorienta constantemente mientras se corre el gel. Consecuentemente, las molculas de DNA tienen que reorientarse. Pequeos fragmentos se reorientan ms fcilmente.

90 KiloBP 45 KiloBP

Digerir muestra de DNA Con enzimes de restriccin

Southern Blot
Transferir DNA a membrane

Electroforesis

Aadir fragmento de DNA etiquetado e hibridizar

Inventado por E. Southern Oxford University

EcoRI
Strain 1 Strain 2

EcoRI

x x
EcoRI EcoRI Probe

sonda etiquetada se hibrida a la secuencia complementaria

3-TCCGTAATC**** -5

5CCGGCTAAC -3 5AGGCATTAG -3 3-TCCGTAATC**** -5

5TTTAACGCG -3

Premio Nobel Qumica 2006

Roger D. Kornberg, a structural biologist at Stanford University, has been awarded the 2006 Nobel Prize in Chemistry for his studies on the molecular basis of eukaryotic transcription, the process by which the genetic code of DNA is converted into messenger RNA for later translation into proteins.

Kornberg has used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model eukaryotic organism. He developed an in vitro yeast transcription system that contained highly purified RNA polymerase II and five helper proteins known as general transcription factors. However, the system did not respond to the addition of other transcription factors known to activate specific genes in cells. This observation led Kornberg to discover a protein complex known as Mediator, which serves to transfer signals from genespecific transcription factors to RNA polymerase II and the general transcription factors.

Mighty Machine In this ribbon structure of part of the yeast RNA polymerase II complex, the clamp protein (yellow) closes on the DNA (blue and green) and growing RNA transcript (red). The bridge helix is shown in green and the complex's active site magnesium ion is shown in pink.

In 2001, Kornberg and his colleagues published high-resolution X-ray crystal structures of a 10-subunit yeast RNA polymerase and of a complex consisting of RNA polymerase, template DNA, and product RNA (Science 2001, 292, 1863 and 1876). These structures showed that the two largest subunits of RNA polymerase lie in the center on either side of a nucleic acid-binding cleft, with the smaller subunits on the outside. The cleft is bridged by an -helix that acts like a ratchet to move the growing RNA transcript out of the active site during RNA synthesis.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es un mtodo para la amplificacin rpida de DNA in vitro que produce grandes cantidades de genes especficos para clonar, secuenciar o para propsitos de mutagnesis Se requiere conocer una parte de la secuencia nucleotdica del gen que se desee amplificar, stos son los iniciadores, a partir de los cuales se sintetiza la hebra complementaria por la DNA polimerasa (Thermus aquaticus [Taq] polimerasa) 1. Dos oligonucletidos (degenerados o no) iniciadores en los extremos del DNA blanco se fabrican en un aparato de sntesis de oligonucletidos y se aaden en mucho exceso al DNA blanco desnaturalizado por calor 2. Cuando se enfra la mezcla, se asegura que el exceso de iniciadores (primers), relativos al DNA blanco, se hibridicen a las hebras separadas con los iniciadores y no entre ellas (alineamiento)

3.

La DNA polimerasa extiende los iniciadores usando las hebras blanco como plantilla 4. Despus de un tiempo adecuado de incubacin, la mezcla se vuelve a calentar para separar las tiras, y se contina con este ciclo unas 20-30 veces (calentamiento, alineacin, extensin) Los productos de extensin de un iniciador, pueden servir como plantilla para otro iniciador en el siguiente ciclo Cada ciclo ( aprox. 5 min) involucra: 1. Desnaturalizacin por calor 93C, 5 min (despus de 1er ciclo: 1 min) 2. Enfriamiento para alineamiento de iniciadores 45C, 1 min 3. Extensin de iniciadores 70C, 1 min. Despus del ltimo ciclo se deja 10 min para finalizar las extensiones En cada ciclo se duplica el contenido del DNA blanco original, obtenindose en 20-30 ciclos aumentos en 106-109 de la secuencia blanco

PCR para amplificar secuencias de DNA. (a) calentamiento del DNA blanco y exceso de dos iniciadores, uno complementario de una tira y el otro de la tira complementaria, ms DNA polimerasa. (b) alineamiento y extensin, originndose dos tiras hijas. (c) nuevo ciclo. (d) 2a copia de DNA. (f) Efecto de 20 ciclos PCR en un DNA blanco conteniendo 10 copias inicialmente (la grfica es semilog)

 La Taq polimerasa no tiene funcin correctora, por lo cual comete errores en la extensin Cuando la exactitud es crucial, puede usarse la DNA polimerasa del arqueano Pyrococcus furiosus (Top=100C; Pfu), ya que tiene actividad correctora La amplificacin in vivo tomara varios das, por lo cual los termocicladores son muy tiles. La DNA polimerasa termoestable se ha clonado en E. coli y se produce en grandes cantidades El PCR es muy til en la clonacin de DNA porque si se conoce la secuencia en sus extremos puede amplificarse antes de clonar Como herramienta para la secuenciacin de DNA, el PCR produce grandes cantidades de DNA que pueden usarse como plantillas

 El PCR puede producir grandes cantidades de DNA mutado Usando oligonucletidos con algunas bases que no se hibridizarn como iniciadores, pueden introducirse mutaciones. Los mutantes puede entonces amplificarse por PCR El DNA mutado puede usarse para transformar clulas, formando derivados mutantes El PCR puede usarse para estudios comparativos evolucionarios, amplificando genes de diferentes fuentes, donde el DNA ya se ha clonado y secuenciado, usando iniciadores que no sean perfectamente complementarios, pero que sean regiones altamente conservadas Con los iniciadores adecuados, puede identificarse una sola clula bacteriana, en presencia de otras, en una muestra Puede usarse para identificacin de individuos (huellas dactilares de DNA)