INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA DIRECCION ACADEMICA DE LA DIVISION DE INGENIERIA Y CIENCIAS BIOLOGICAS

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA I

Ing. Anacleto Flix Fuentes

Depto. de Qumica e Ing. Qumica

CD. OBREGON, SONORA

JUNIO DE 1996
1

INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA

Rector Dr. Oscar Russo Vogel

Vicerrector Acadmico Lic. Javier J. Vales Garca

Director Acadmico de la Divisin de Ingeniera y Ciencias Biolgicas Ing. Mario A. Pablos Tavares

Jefe del Depto. de Qumica e Ing. Qumica Q. Rosa Amelia Beltrn Esparza

Este manual fue editado para uso exclusivo de maestros y alumnos del ITSON que cursan la materia.

PRESENTACION El presente curso tiene como finalidad dar al estudiante una serie de herramientas de gran utilidad para el manejo y aprovechamiento de microorganismos. Ya que la prosperidad del hombre y su bienestar depende en gran parte del dominio que se tenga sobre las poblaciones microbianas, sea en el aspecto biotecnolgico, mdico, agrcola e industrial, para lo cual necesita del conocimiento de las condiciones fsicas, fisiolgicas, bioqumicas y su comportamiento tanto en el mbito parasitario, como en la reproduccin de los mismos, ya sea para el aprovechamiento industrial de subproductos metablicos o bien como fuente de protena unicelular, para lo cual debemos de conocer las caractersticas de su crecimiento, sus condiciones fsicas favorables como son los siguientes parmetros: temperatura, pH y los medios apropiados en el cual se desarrollan tanto "in vivo" como "in Vitro". Tambin es importante conocer las formas de inhibicin y destruccin, as como la extirpacin de muchos de ellos, como es el caso de microorganismos que actan como contaminantes, por ejemplo: En la depuracin del agua, pasteurizacin de la leche, refrigeracin de alimentos, etc., que con dichas tecnologas se tiende al control de las poblaciones microbianas. Como una recomendacin de suma importancia es que el alumno antes de la realizacin de la prctica, comprenda en su totalidad lo que har como se efectuar y por qu. Para as poder lograr los objetivos planteados en las prcticas que contempla este manual.

REGLAMENTO AL CUAL SE SUJETARAN LOS ALUMNOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Las siguientes sugerencias son con el fin de proporcionar algunas ideas que deben considerarse en todo trabajo que desarrolles en el laboratorio de Microbiologa, adems se pretende evitar al mximo las posibles contaminaciones por microorganismos patgenos que en algunas prcticas se manejan. 1. Guarde sus enseres en el cajn de las gavetas, nunca los ponga sobre la mesa de trabajo. 2. Los estudiantes debern entrar siempre al laboratorio con bata blanca limpia. 3. No deber comer ningn alimento, masticar chicle, ni fumar dentro del laboratorio. 4. Acostumbrarse a no llevarse nunca a la boca lpices u otros objetos, ya que se trabaja con microorganismos viables. 5. Mantngase constantemente limpia la mesa as como los aparatos que use. 6. En caso de que un cultivo con grmenes vivos se derrame avise inmediatamente al instructor. 7. Todos los objetos slidos no contaminados tales como algodn, papeles, cerillos, debern tirarse en los recipientes que con ese objeto existen en el laboratorio. 8. En caso de accidente personal tales como cortadas o piquetes en los dedos o cada de cultivo en los ojos, piel, avise al instructor. 9. Al final de la prctica limpie y ponga el material y equipo en su sitio perfectamente limpio y desinfecte cuidadosamente la mesa en su rea de trabajo. 10. Antes de salir del laboratorio verifique que las llaves de gas y agua estn bien cerradas y desconectados los aparatos elctricos (excepto incubadoras y
4

refrigerador).

11. Lave perfectamente sus manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio. 12. Conserve usted notas completas de los experimentos realizados en cada prctica en un cuaderno exclusivamente para este laboratorio, as como su hoja de reportes de prcticas; el instructor del laboratorio indicar la fecha mxima de entrega de reportes.

RECOMENDACIONES PARA EVALUACION - El alumno deber presentarse al laboratorio con su diagrama de flujo. - El alumno presentar y discutir el cuestionario de la prctica, previo a la realizacin de sta. - El reporte de la prctica se har en las hojas correspondientes (incluidas en el manual). La fecha de entrega lo indicar el instructor. - Para la elaboracin del reporte de la prctica se sugiere que el alumno se apoye con material bibliogrfico referente a la misma. - El alumno deber presentarse al 100% en las sesiones de prcticas. - Cuando menos se realizaran 2 exmenes parciales. - La nota final del laboratorio ser "A" (acreditado) o "NA" (no acreditado). - Nota final de laboratorio "NA" equivale a 4 en el curso terico.

INDICE PAGINA PRESENTACION REGLAMENTO RECOMENDACIONES PARA EVALUACION PRACTICA N 1 Equipo y material empleado en el laboratorio de Microbiologa Preparacin de colorantes y reactivos PRACTICA N 2 Instrucciones generales para el uso del microscopio y observacin de microorganismos PRACTICA N 3 Tcnicas de preparacin y esterilizacin del material que se usa en el laboratorio de Microbiologa PRACTICA N 4 Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo PRACTICA N 5 Tcnicas de siembra en medios de cultivo y observacin de caractersticas de crecimiento PRACTICA N 6 Tcnicas de aislamiento de cultivos puros de una mezcla de microorganismos PRACTICA N 7 y 8 Pruebas relacionadas con el metabolismo bacteriano PRACTICA N 9 Efecto del medio sobre las bacterias PRACTICA N 10 Tcnicas de observacin de hongos y levaduras PRACTICA N 11 Anlisis bacteriolgico del agua

08

14

23

28

34

39

44

50

56 61
7

PRACTICA No. 1 EQUIPO Y MATERIAL MAS EMPLEADO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS OBJETIVO El objetivo de esta prctica es conocer, cuidar y saber aplicar el material y equipo para su uso en Microbiologa. As como la preparacin de colorantes y reactivos. INFORMACION GENERAL La gran mayora del equipo y materiales empleados en microbiologa han sido tomados de los que se utilizan en Qumica, en Fsica y de otras ciencias Biolgicas, sin embargo algunos instrumentos y mtodos han sido creados por microbilogos exclusivamente para su especialidad. En la investigacin se necesita ingenio notable y podramos decir que un investigador cabal de laboratorio deber ser diestro en lo que respecta al funcionamiento y conocimiento de artefactos mecnicos. PROCEDIMIENTO Los trabajos en laboratorio de Microbiologa exigen para su realizacin determinado material y equipo cuyo conocimiento es imprescindible. El instructor dar a conocer el uso y manejo del equipo ms empleado en Microbiologa y adems indicar la forma de preparacin de algunos colorantes y reactivos. MATERIAL Cajas de Petri, tubos de ensayo con tapn de rosca, probetas, matraces, morteros, pipetas, matraces volumtricos, matraces erlenmeyer, embudos, frascos de dilucin, cajeros, pipeteros, frascos, goteros, etc. EQUIPO
8

Incubadoras, hornos de calor seco, autoclave, microscopio compuesto, esteroscopio, potencimetro, refrigerador, balanza analtica, homogenizador para medios de cultivo, parrilla elctrica, etc. EQUIPO PERSONAL Bata, franela, cerillos, jabn. PREPARAR LOS SIGUIENTES REACTIVOS 1. AZUL DE METILENO Azul de metileno = 0.3 g Alcohol etlico al 95% = 10 ml Agua destilada = 90 ml Disolver el colorante en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco y dejar reposar 18 horas y filtrar por papel filtro. 2. CRISTAL VIOLETA Cristal violeta = 0.25 g Alcohol etlico al 95% = 10 ml Agua destilada = 90 ml Disolver el colorante en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco reposar 18 horas y filtrar por papel filtro. 3. SAFRANINA Safranina = 0.25 g Alcohol etlico al 95% = 10 ml Agua destilada = 90 ml Disolver la safranina en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco, dejar reposar 18 horas y filtrar por papel filtro. 4. CARBOL-FUCSINA Fucsina bsica = 1 g Alcohol etlico al 95% = 10 ml
9

Fenol al 5% = 90 ml Disolver la Fucsina en el alcohol, agregar la solucin de fenol y dejar reposar por 18 horas y filtrar. 5. FENOL AL 5% Fenol = 25 g Agua destilada = aforar a 500 ml

6. ALCOHOL-ACETONA Alcohol al 95% = 75 ml Acetona = 25 ml 7. ALCOHOL-ACIDO Acido ntrico = 2.5 ml Alcohol etlico al 95% = 97.5 ml 8. LUGOL (I-KI) Yodo = 1 g Yoduro de potasio = 2 g Agua destilada = 300 ml Triturar el yodo y el yoduro de potasio en un mortero hasta obtener una mezcla ms o menos homognea y agregar poco a poco el agua. NOTA: TODOS LOS COLORANTES Y REACTIVOS CONSERVARSE EN FRASCOS GOTEROS COLOR AMBAR. CUESTIONARIO 1. Definir que es un colorante 2. Definir la funcin del grupo cromforo y auxocromo de un colorante 3. Explique las propiedades de los colorantes bsicos 4. Explique las propiedades de los colorantes cidos 5. Investigue las frmulas qumicas y propiedades del azul de metileno, safranina y cristal violeta 6. Qu es un desinfectante?, de 5 ejemplos 7. Qu es un mordiente?, de 3 ejemplos
10

8. Mencione y d los usos de 5 equipos ms utilizados en un laboratorio de Microbiologa.

11

REPORTE PRACTICA N 1 EQUIPO Y MATERIAL MAS EMPLEADO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

12

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

13

PRACTICA N 2 INSTRUCCIONES GENERALES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO Y OBSERVACIONES DE MICROORGANISMOS OBJETIVO El objetivo de esta prctica es conocer y aplicar los conocimientos de la parte mecnica y ptica del microscopio en la observacin correcta de las caractersticas morfolgicas de bacterias, hongos, levaduras y algas. INFORMACION GENERAL El microscopio es una de las herramientas ms utilizadas en el estudio de los microorganismos, ya que nos proporciona la amplificacin necesaria para poder observar a los organismos que no son posibles de ser observados a simple vista. El conocer y entender como funciona este instrumento es de vital importancia para todo trabajo en el laboratorio de Microbiologa. Los microscopios son de dos tipos diferentes: el ptico y el electrnico, segn sea el principio en el cual se basa la amplificacin. En el microscopio ptico se obtiene la amplificacin por medio de un sistema de lentes mientras que en el microscopio electrnico se usa un haz de electrones en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen amplificada. Del microscopio ptico, el ms sencillo es conocido como microscopio simple y consta de una sola lente convergente, tambin conocida como lupa, de capacidad amplificadora muy reducida. El aparato ms utilizado es el microscopio compuesto o microscopio ptico de campo claro que supera extraordinariamente al anterior, ya que bsicamente consta de dos sistemas de lentes, uno de ellos amplia la imagen del objeto observado, que es captada y nuevamente amplificada por el segundo sistema, consiguindose con esto un mayor poder de resolucin. El poder de resolucin puede describirse como la capacidad para distinguir dos puntos muy prximos, de modo que pueden verse separados. Adems del microscopio de campo claro, existen los siguientes tipos; de campo
14

oscuro, luz ultravioleta, fluorescencia y contraste de fase, etc. En cuanto a los microorganismos, tres caractersticas bsicas hacen necesario el empleo de tcnicas especializadas en la investigacin microbiolgica como son: su tamao diminuto, la aparente ausencia de diferencias individuales y su amplia distribucin en la naturaleza. Es por esto necesario emplear estudios microscpicos de alto poder de amplificacin, por consiguiente el procedimiento ms correcto para estudiar la morfologa de los microorganismos principalmente bacterias, consiste en el examen de un frotis, que previa fijacin a un portaobjetos se tie con algn colorante y se examina despus microscpicamente con el objetivo de inmersin, que es el de mayor poder de resolucin. Para obtener un buen frotis, debe "extenderse" el material, con objeto de formar una pelcula delgada, y obtener as una sola capa de bacterias, perfectamente separadas sobre el portaobjetos. Con esta preparacin previa pueden observarse perfectamente clulas aisladas, ya que de otra forma, los microorganismos se aglomeran en masas slidas impenetrables a la luz. Es necesario la tincin, ya que la diminuta clula bacteriana en su estado natural permitir el paso de cantidad excesiva de luz y no se puede tener una buena observacin. Las clulas toman la tincin total o parcialmente de acuerdo con una relacin qumica entre alguna sustancia celular y el colorante o bien, su superficie queda teida por un mecanismo de atraccin. En otras palabras las propiedades tintoriales de una clula dependen de su composicin qumica y las diferencias en sus reacciones de coloracin, constituyen ndices importantes para distinguir unas bacterias de otras. Existen dos grandes mtodos de tincin para diferenciar a las bacterias: la tincin al GRAM que separa a las bacterias en GRAM positivas y GRAM negativas, dependiendo esto de la coloracin que tome la clula. La otra tincin es la de ZIEHL-NEELSEN o de cido-resistencia que se emplea para identificar algunos grupos de bacterias con alto contenido de lpidos. PROCEDIMIENTO El microscopio consta de dos partes fundamentales (el instructor mostrar cada
15

parte del microscopio e indicar su funcionamiento) a) Parte mecnica consta de: Pie o base del microscopio brazo platina tornillo macromtrico tornillo micromtrico revlver de objetivos objetivos b) Parte ptica que consta de: Espejo diafragma condensador lente de luz de los objetivos lentes y espejos del tubo del microscopio lentes de los oculares GENERALIDADES Cuando se va a observar algn objeto al microscopio siempre debe estar en posicin vertical. Aprenda a observar a travs del microscopio teniendo los dos ojos abiertos cuando el microscopio sea monocular, esto reduce el esfuerzo de los ojos usados en la observacin. FUENTE DE LUZ La mejor fuente de luz se obtiene de la luz indirecta del sol, pero debido a la variabilidad de estas condiciones se emplea luz artificial. La luz del espejo es enfocada por el condensador que se encuentra bajo la platina, el objeto de estudio es colocado en el portaobjeto que se pone en la platina, la imagen producida por el objeto es amplificada por el ocular. ENFOQUE El microscopio tiene tres objetivos: el de 16 mm o seco dbil, el de 4 mm o seco
16

fuerte y el de 1.8 mm u objetivo de inmersin. Estos nombres se refieren a la "distancia de trabajo", se puede notar que las dos ltimas distancias de trabajo son cortas por lo que siempre se ajustan con el tornillo de ajuste fino o micromtrico. OBJETIVO DE INMERSION Evite el uso de una cantidad excesiva de aceite de cedro; despus de usar el microscopio siempre se limpia el objetivo. Esta limpieza es muy importante puesto que el residuo gomoso reduce la eficacia de los lentes. LOCALIZACION Y ENFOQUE DEL OBJETO Ajustar la fuente de luz usando el objetivo seco dbil, mirando a travs del tubo de ajuste del espejo hasta que la fuente de luz est en el centro del tambo; el tambo debe quedar iluminado uniformemente. El diafragma debe estar completamente abierto, el condensador totalmente arriba. Para enfocar el objeto que se va a observar, sin mirar por el ocular (viendo el portaobjeto) mueva el tubo hacia abajo con el tornillo de ajuste macromtrico hasta que el lente est a cierta distancia de la preparacin. Ahora mire el ocular, con el tornillo de ajuste macromtrico haga que el objeto sea visible, si es necesario use el tornillo de ajuste micromtrico para enfocar mejor. Estos movimientos se hacen lentamente. LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO Una vez utilizado el microscopio se deber apagar la fuente de la luz artificial, acto seguido, hacer la limpieza con papel de seda, de los objetivos (en especial el de inmersin), de los oculares y de la platina. Cubrir el microscopio con su camisa o colocar en su caja. Limpie perfectamente su rea de trabajo. Al transportar el microscopio, se colocar la base del microscopio sobre la palma de la mano izquierda y con la mano derecha se tomar firmemente del brazo del microscopio. MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA DE LA BACTERIA MATERIAL Portaobjetos, asas, mecheros, cultivos de microorganismos
17

COLORANTES Y REACTIVOS Azul de metileno, safranina, cristal violeta, carbol fucsina, Lugol, alcohol cido, alcohol acetona. OBSERVACION DE PREPARACIONES EN FRESCO PROCEDIMIENTO a) Flamear hasta el rojo el asa de inocular b) Quitar el tapn de uno de los cultivos de microorganismo proporcionado y flamear el borde del tubo. c) Recoger una asada del cultivo y colocarla en el centro del portaobjeto limpio (en caso de que el cultivo sea slido suspenderlo en una gota de agua estril) d) Flamear de nuevo el borde del tubo y volver a taparlo e) Esterilizar el asa de inocular f) Colocar un cubreobjeto sobre la suspensin del cultivo y presionar suavemente g) Observar la preparacin con el objetivo seco dbil y despus con el seco fuerte TECNICA PARA HACER UN FROTIS a) Anotar el nmero correspondiente con lpiz graso sobre el portaobjetos, de la muestra por observar, indicando con ms detalle la descripcin en un cuaderno de anotacin b) Tomar y extender en un portaobjetos con el asa una gota del producto que se va a examinar si ste es fluido. Si es de consistencia ms slida, se diluye una pequea porcin del mismo en una gota de agua estril colocada previamente sobre el portaobjetos con el asa c) Las extensiones deben ser suficientemente finas para que los microorganismos aparezcan bien aislados al examen microscpico y lo suficientemente gruesa para ser localizado y hacer el enfoque con facilidad d) Secar la preparacin al aire, calentar muy suavemente en la corriente del aire caliente del mechero para acelerar la desecacin e) Fijar por medio del calor. Pasar el portaobjetos dos o tres veces con cierta lentitud sobre la llama del mechero hasta una temperatura soportable al aplicarlo sobre el dorso de la mano. Se puede provocar alteraciones en la morfologa de las bacterias si el calentamiento es excesivo
18

f) Dejar enfriar y hacer las siguientes tinciones TINCION SIMPLE a) La preparacin seca y fijada se tie cubrindola durante unos minutos (1 a 3) con una solucin colorante b) Lavar con agua de la llave c) Secar al aire d) Observar con el objetivo de inmersin COLORACION DE GRAM a) Preparar un frotis, dejar secar al aire y fijar a la flama b) Cubra la preparacin con la solucin de cristal violeta dejar actuar el colorante durante un minuto c) Escurra el colorante, lave con agua de la llave, cubra la preparacin con Lugol, dejar actuar este agente durante 15 segundos d) Escurra el Lugol, lave con agua corriente, cubra la preparacin con alcohol-acetona de 30 a 60 segundos, lave abundantemente con agua de la llave e) Cubra la preparacin con safranina por un minuto y lave con agua de la llave, secar la preparacin al aire, se observa con el objetivo de inmersin COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN Es la coloracin de grmenes cido-alcohol resistentes a) Prepare un frotis, seque al aire y fije al calor b) Cubra la preparacin con carbol-fucsina y caliente por el reverso hasta emisin de vapores durante 5 a 10 minutos, cuidando de que no hierva el colorante, aadir colorante de vez en cuando para evitar que este se seque c) Lave con agua y decolore con alcohol-cido, limpiar el reverso del portaobjetos, lado contrario al frotis d) Lave con agua y cubra la preparacin con azul de metileno durante 60 segundos e) Lave con agua, dejar reposar y observe con el objetivo de inmersin CUESTIONARIO 1. Haga un esquema de un microscopio compuesto, dibujando cada una de sus
19

partes e indicando su funcin 2. Explique el sistema ptico de un microscopio compuesto 3. Qu amplificaciones se obtienen con un microscopio compuesto? 4. Cul es la funcin del aceite de inmersin en la observacin microscpica? 5. Mencione las principales caractersticas de un microscopio electrnico, de fluorescencia y de campo obscuro 6. Por qu es importante realizar un buen frotis bacteriano en la observacin microscpica? 7. Explique las diferencias entre una tincin simple y una diferencial 8. Explique el fundamento de la tincin al Gram 9. Mencione las caractersticas morfolgicas de bacterias, levaduras, hongos y algas

20

REPORTE PRACTICA N 2 INSTRUCCIONES GENERALES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO Y OBSERVACIONES DE MICROORGANISMOS FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

21

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

22

PRACTICA N 3 TECNICAS DE PREPARACION Y ESTERILIZACION DEL MATERIAL QUE SE USA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA OBJETIVO Conocer el tipo de material requerido para llevar a cabo las prcticas del laboratorio de microbiologa, as como las diversas tcnicas y aparatos utilizados para la esterilizacin del mismo. INFORMACION GENERAL La esterilizacin es la eliminacin completa de cualquier forma de vida y existen varios mtodos para llevarla a cabo. La eleccin del mtodo depende de la naturaleza fsica del material al que se va esterilizar y del uso que se le piensa dar. Entre los mtodos utilizados tenemos: CALOR AL ROJO Se utiliza para las asas de platino empleadas en la siembra o inoculacin, para las bocas de los tubos de cultivo y frascos, portaobjetos y cubreobjetos. Se esteriliza suspendindolos en la flama del mechero. EBULLICION El agua en ebullicin mata a las formas vegetativas por coagulacin de las protenas, pero no mata a las esporas. Este mtodo raramente se usa en el trabajo de laboratorio. ESTERILIZACION POR VAPOR El vapor esteriliza por coagulacin de las protenas. El vapor a presin es un agente esterilizante debido a que se alcanzan temperaturas superiores a las alcanzadas por ebullicin. El aparato de laboratorio diseado para esterilizar por ste mtodo se llama autoclave.
23

Consiste en una doble cmara que puede saturarse de vapor y mantenerse a una determinada presin y temperatura durante un tiempo largo. Es importante que el aire de la cmara sea reemplazado por completo por vapor saturado. Si hay aire presente se alcanzar una temperatura inferior. Este mtodo es empleado para esterilizar medios de cultivo, soluciones, cantidades medidas de agua en tubos o botellas ,etc. Generalmente se opera a una presin de 15 lb/pul2 (121 C). El tiempo de operacin depende de la naturaleza del material por esterilizar, del tipo de recipiente y del volumen. ESTERILIZACION POR CALOR SECO El calor seco, a diferencia del calor hmedo, deshidrata las clulas y oxida sus protenas. Es recomendable exponer el material por lo menos una hora 30 minutos a una temperatura de 180 a 220C, que se controla por medio de un termostato. Este mtodo de esterilizacin se emplea para material de vidrio. RADIACIONES La luz solar tiene un poderoso efecto germicida. Esta propiedad se debe a los rayos muy cortos de alta frecuencia llamados ultravioleta, que matan a las bacterias cuando su intensidad es fuerte. MATERIAL Pipetas, cajas de petri, tubos de cultivo, tubos de ensayo, matraces erlenmeyer, mortero, embudos, portaobjetos, algodn, papel de envoltura (de aluminio), cajeros, pipeteros, canastas, pinzas para crisol. LIMPIEZA DEL MATERIAL DE VIDRIO 1. Sumergir el material a limpiar en una mezcla sulfocrmica preparada de la siguiente manera: K2Cr2O7 50 g H2SO4 100 ml
24

H20

1000 ml

Los objetos de vidrio, podrn permanecer en esta mezcla un tiempo largo proporcional a la cantidad de materia orgnica que contengan, luego se lavan con agua acidificada con HCl y a continuacin con agua alcalina con KOH. Un lavado abundante con agua corriente y destilada al final de la operacin. 2. Secar el material en el horno 3. Proceda a tapar con algodn las bocas de los tubos, matraces y pipetas teniendo especial cuidado de que los tapones de algodn no formen arrugas ni queden flojos. Envuelva las cajas petri, pipetas, matraces y dems material que le proporcionen de acuerdo con la tcnica indicada, cubrir con capuchones de papel los tapones de algodn de los tubos y matraces. Esterilizar el material de vidrio en el horno a una temperatura de 180 a 220 C durante 2 horas. CUESTIONARIO 1. Qu significa esterilizacin? 2. Mencione en qu casos se utiliza el calor seco y el calor hmedo para la esterilizacin? 3. Qu funcin tiene la mezcla sulfocrmica en la limpieza del material de vidrio? 4. Definir qu es el punto trmico mortal? 5. Qu es la esterilizacin por tindalizacin? 6. Por qu es importante un buen lavado del material de vidrio antes de esterilizarlo? 7. Por qu se recomienda que al final del lavado de material de vidrio se utilice agua destilada? 8. Indique cuando menos 4 mtodos de esterilizacin y en que casos los empleara. 9. Cundo se emplean soluciones cidas o bsicas para la limpieza de material de vidrio? 10. Por qu deben taparse con algodn los tubos, matraces y pipetas y por qu deben envolverse o cubrir con papel, cundo este material va a ser esterilizado?
25

REPORTE PRACTICA N 3 TECNICAS DE PREPARACION Y ESTERILIZACION DEL MATERIAL QUE SE USA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

26

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

27

PRACTICA N 4 PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO OBJETIVO Conocer los medios de cultivo que frecuentemente se utilizan para el crecimiento de microorganismos, as como su composicin y forma de preparacin. INFORMACION GENERAL El estudio de algunos procesos bioqumicos fundamentales de las clulas se han realizado en microorganismos debido a que son fciles de cultivar en el laboratorio bajo condiciones controladas que permiten verificar sus caractersticas en generaciones sucesivas en tiempos relativamente cortos. Para cultivar los microorganismos en el laboratorio es necesario conocer los requerimientos nutricionales de cada cepa en particular y controlar factores fsicos como temperatura y pH (la mayora de las bacterias pueden crecer a una temperatura de 30 C o ms aunque algunas cepas se alejan mucho de este rango); el rango normal del pH tolerado es de 5 a 8. Para controlar el pH se usan generalmente medios de cultivo regulados. Todas las clulas requieren para su crecimiento normal de: agua, una fuente de carbono, de nitrgeno, azufre, fsforo, energa y sales minerales en pequeas cantidades como: sodio, potasio, calcio, magnesio. Tanto los microorganismos como las plantas requieren que estos nutrientes estn en solucin para poderlos asimilar. Por ello se debe seleccionar el medio de cultivo de tal manera que contenga los elementos necesarios para el adecuado crecimiento de la cepa que se desea. Los medios de cultivo se han clasificado de acuerdo con su composicin qumica y el uso a que se destinan en: enriquecidos, selectivos, diferenciales principalmente. O bien considerando su consistencia se clasifican en: slidos, semislidos y lquidos.
28

En la preparacin de medios de cultivo existen algunos materiales de uso muy comn como son las peptonas, el extracto de carne, extracto de levadura y el Agar. Estos materiales, nutrientes para la clula, hacen posible el desarrollo de una gran cantidad de microorganismos. El caldo nutritivo y el Agar nutritivo son ejemplos de medios de cultivo lquido y slido que permiten el desarrollo de muchos tipos de microorganismos hetertrofos. PROCEDIMIENTO El instructor indicar los medios de cultivo que se preparan y esterilizan en esta sesin. *TECNICAS PARA PREPARAR MEDIOS DE CULTIVO 1. Segn las instrucciones de cada uno de los medios de cultivo, tomar la parte proporcional de ste y disolverlos en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensin uniforme, calentar agitando frecuentemente, hervir durante un minuto. Tapar el recipiente con algodn de tal manera que quede firme, cubrirlo con papel aluminio. Esterilizar en autoclave a una temperatura de 121C, o sea 15 libras de presin por pulgada cuadrada por 15 minutos (o la temperatura indicada para el medio). Sacar el medio del autoclave, enfriar a una temperatura aproximada de 45C (temperatura soportable al dorso de la mano). Vaciar en placas hasta la altura indicada en las mismas (aproximadamente de 15 a 20 ml), tapar y dejar solidificar con la tapa hacia arriba. 2. Medio en tubo inclinado: Una parte del medio preparado en las instrucciones anteriores y despus de que hierva, pasarlo a los tubos de cultivo y taparlos con algodn, o en su caso con tapn de rosca; colquelos en posicin vertical en un recipiente y esterilice en el autoclave. Despus de la esterilizacin, colquelos en la posicin inclinada levantando la parte donde se encuentra el tapn. Dejando el "botn" lo suficientemente grande par que se conserve mayor tiempo el medio.
29

3. Medios de cultivo para picadura: Siga el mismo procedimiento anterior, slo que en lugar de inclinar los tubos, djelos en posicin vertical. 4. Medios de cultivo lquidos: Siga las instrucciones del medio deshidratado y despus de esterilizar, dejar los tubos en posicin vertical.

*PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA EL USO DEL AUTOCLAVE 1. Comprobar el nivel del agua 2. Colocar en su interior el material a esterilizar 3. Atornillar la tapa, apretar los tornillos por parejas diametralmente opuestas de forma que la tapa encaje perfectamente 4. Abrir la vlvula de vapor y encender la fuente de calor 5. Una vez que salga el vapor por la vlvula, se espera al menos 5 minutos para expulsar todo el aire y cerrar la vlvula 6. Vigilar el manmetro y la vlvula de seguridad. Cuando se alcanza la presin requerida, disminuir la intensidad de calor 7. Dejar que transcurra el tiempo necesario. Apagar la fuente de calor 8. Esperar que el manmetro descienda a cero, abrir la llave de vapor 9. Esperar 5 minutos y abrir la tapa CUESTIONARIO 1. Explique concretamente a qu se llama medio de cultivo 2. Diga a qu se llama medio sinttico y a qu medio no sinttico. Dar cinco ejemplos de cada uno
30

3. Cules son las ventajas y desventajas de emplear medios de cultivos sintticos y no sintticos? 4. Cite algunas propiedades de Agar-Agar y la gelatina 5. Indique un mtodo para ajustar el pH de un medio de cultivo 6. Indique las propiedades qumicas de las peptonas, extracto de carne, extracto de levadura. 7. Cules son los ingredientes del Agar nutritivo y qu tipo de nutrientes proporcionan para el desarrollo de los microorganismos? 8. Indique las diferencias entre un medio de cultivo enriquecido, selectivo y para pruebas bioqumicas. 9. Qu precauciones se deben considerar en la preparacin y esterilizacin de los medios de cultivo?

31

REPORTE PRACTICA N 4 PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

32

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

33

PRACTICA N 5 TECNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO Y OBSERVACION DE CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO OBJETIVO Aprender los diferentes tipos de siembra de microorganismos, as como la observacin de crecimiento en diferentes medios de cultivo. INFORMACION GENERAL La inoculacin de medios para cultivo e identificacin de microorganismos es un procedimiento a la vez fundamental e importante en toda investigacin microbiolgica, es por eso que se debe tener cuidado con esta tcnica con el objeto de evitar la contaminacin de los cultivos; las medidas de precaucin que se aplican para prevenir la contaminacin comprenden el procedimiento denominado tcnica asptica. Es de suma importancia tomar en cuenta que los ingredientes y los utensilios de vidrio que se usan en la preparacin de los medios pueden contener microorganismos indeseables, por tal motivo los medios recin preparados se deben esterilizar inmediatamente, los tubos que contienen medio se tapan con tapn de algodn o tapas metlicas o plsticas con el fin de evitar la penetracin de microorganismos extraos. Otras precauciones que se deben tener en los procedimientos de aislamiento y cultivo de microorganismos es flamear el borde de los tubos y el calentamiento al rojo de la asa o agujas de inoculacin. Esta prctica est destinada a que el estudiante se familiarice con las tcnicas fundamentales de siembra empleadas para aislar y desarrollar cultivos microbianos; adems de observar las diferentes caractersticas de crecimiento como son: turbidez, formacin de sedimento, crecimiento en la superficie en el caso de medios lquidos. En medios slidos se observa la formacin de colonias en su extensin, color, opacidad, consistencia y modificacin que sufre el medio por el metabolismo bacteriano.

34

PROCEDIMIENTO MATERIAL *Para el desarrollo bacteriano general Placas con Agar nutritivo Tubos con caldo nutritivo *Para desarrollo de hongos y levaduras Placas con Agar extracto de malta Placas con Agar dextrosa Papa *Medios para pruebas bioqumicas (diferenciacin) Tubos con Agar Kligler inclinado Tubos con Agar citrato de Simmons inclinado Tubos con medio SIM Tubos con caldo bilis verde brillante Tubos con caldo lactosado TECNICA El instructor demostrar por primera vez algunas tcnicas de siembra, luego cada estudiante har personalmente lo siguiente: a) Inocule los medios lquidos b) Inocule los medios por picadura segn tcnica c) Inocule las placas y los tubos inclinados en estra en la superficie, procurando que la cantidad de materia, sea suficiente pero no excesivo con objeto de tener colonias aisladas y poder hacer un estudio del cultivo d) Incube todos los medios sembrados a 37C e) Estudie y anote las caractersticas de cultivo de las cepas sembradas en medio lquido, anotando el grado de crecimiento, turbidez, sedimento, crecimiento en superficie y otras caractersticas f) Haga el estudio de los cultivos en picadura anotando grado, forma, la extensin, crecimiento en la superficie, color, opacidad y licuacin, etc. g) Anote las caractersticas del cultivo en medios inclinados segn su: forma, elevacin, superficie, borde, color, opacidad, consistencia, modificacin que sufre el medio
35

h) Haga el estudio de las colonias sembradas en la superficie anotando: su forma, tamao, elevacin, estructura, bordes, color, consistencia, etc. i) Las anotaciones que se hagan deben corresponder a las observaciones de: 24, 48 y 72 horas, debiendo ser lo ms cuidadosas y concretas posibles. CUESTIONARIO 1. Describa algunos mtodos de siembra en medios lquidos y slidos 2. Por qu es importante el pH en un medio de cultivo? 3. Cul es el efecto de la temperatura en el desarrollo de los microorganismos? 4. Compare el desarrollo bacteriano en un medio de cultivo slido y uno lquido 5. Mencione 5 medios de cultivo para el desarrollo bacteriano e indicando su contenido nutritivo 6. Mencione 3 medios de cultivo para hongos y levaduras y su composicin qumica 7. En un medio lquido cmo espera que sea el crecimiento de un hongo?

36

REPORTE PRACTICA N 5 TECNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO Y OBSERVACION DE CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

37

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

38

PRACTICA N 6 TECNICAS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS DE UNA MEZCLA DE MICROORGANISMOS OBJETIVO El objetivo de esta prctica es conocer y aplicar las tcnicas para aislar microorganismos y obtener un cultivo puro. INFORMACION GENERAL Los microorganismos en su estado y hbitat natural no existen en forma pura, sino en comunidades o poblaciones microbianas mezcladas. Sin embargo, la mayora de los estudios microbiolgicos, se realizan aislando a los microorganismos y estudiando su comportamiento en cultivos puros (cultivo conteniendo solamente un slo tipo de microorganismos) PROCEDIMIENTO * Mtodo para la obtencin de cultivos puros MATERIAL Agua contaminada, placas con Agar nutritivo, pipetas de 1 ml estriles, tubos con tapn de rosca estriles, agua destilada estril. TECNICA: METODO DE DILUCION a) Disponga usted en una gradilla 5 tubos estriles, tapados y coloque en cada uno de ellos 9 ml de agua o solucin salina estril. Numere sus tubos (1 al 5) b) Con una pipeta estril mezcle usted en el tubo 1, 1 ml de solucin problema (suspensin de bacterias) c) Mezcle perfectamente el contenido del tubo 1 y pase 1 ml de l al tubo 2, despus de mezclar perfectamente, pasar 1 ml de ste al tubo 3, y as sucesivamente hasta terminar en el tubo 5, en ste ltimo mezclar perfectamente y desechar 1 ml
39

d) Verter 1 ml de cada dilucin a cajas de petri estriles, distribuya uniformemente en toda el rea de la caja funda el Agar nutriente y deje enfriar a 45C aproximadamente y aada a las cajas homogenizando, deje solidificar, enumere sus cajas a cada dilucin. Dejar una caja ms sin inculo como control de esterilidad de Agar e) Incube las placas a 37C, durante 24-48 horas; invirtindolas y determine las diferentes formas bacterianas que encuentre, para lo cual necesita hacer un estudio de la morfologa colonial y morfologa bacteriana, afinidades tintoriales de los individuos que integran cada colonia. Tome resultados. Aislar por el mtodo de estras, colonias tpicas de: bacterias, levaduras y hongos, para conservarlos como cultivos puros. METODO DE LAS ESTRIAS a) Tome una asada de agua contaminada e inocule por estra la superficie de una placa de Agar nutritivo, segn instrucciones b) Deje una placa sin inocular como control de esterilidad del Agar y de la tcnica de preparacin de placas c) Invierta las placas e incbelas placas a 37C. Haga las observaciones correspondientes a las 24-48 horas y reporte resultados. CUESTIONARIO 1. Seale usted concretamente las ventajas y dificultades del mtodo de diluciones y el de estras para aislar cultivos puros. 2. Indique usted cuando se debe emplear cada uno de los mtodos anteriores. 3. Qu objeto tiene el invertir las placas al incubarlas? 4. Qu es un cultivo puro? 5. Qu es un cultivo mixto? 6. Cmo se pueden conservar los cultivos puros? 7. Qu es un cepario?
40

8. Es importante la conservacin de un cepario en una institucin educativa?

41

REPORTE PRACTICA N 6 TECNICAS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS DE UNA MEZCLA DE MICROORGANISMOS FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

42

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

43

PRACTICA N 7 Y 8 PRUEBAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO BACTERIANO OBJETIVO El objetivo de esta prctica es la siembra de microorganismos puros en diferentes medios de cultivo para estudiar su metabolismo. INFORMACION GENERAL Las numerosas y variadas reacciones bioqumicas que constituyen el metabolismo sinttico y energtico de los microorganismos se realizan y controlan por medio de las enzimas. Los carbohidratos son fuente principal de energa y estructuras de carbono para la sntesis de sustancias celulares, se ha comprobado que los azcares simples como glucosa y galactosa, son iniciadores de las reacciones metablicas. Existen muchos compuestos que contienen nitrgeno y que tambin participan en el metabolismo de una clula viva. Ejemplos de ellos tenemos a las protenas, urea y algunos compuestos inorgnicos como las sales de amonio y nitratos. Las reacciones bioqumicas en el metabolismo bacteriano se conocen como pruebas bioqumicas y son importantes porque en base a stas se pueden identificar a las bacterias y que en la actualidad son de gran ayuda para el microbilogo en la identificacin de grupos de bacterias de inters sanitario como en el caso del grupo Coliformes. PROCEDIMIENTO MATERIAL Medios de cultivo, tubos con Agar Kligler, tubos con medios SIM, tubos con caldo urea, tubos con caldo RM-VP, tubos con Agar citrato de Simmons, tubos con caldo lactosado, tubos con gelatina, tubos con caldo bilis verde brillante, placas con Agar endo, placas con Agar SS.
44

TECNICAS 1. Medio Agar Kligler inclinado Sembrar por picadura y estra, se determina produccin cido sulfhdrico requerimiento del carbono de lactosa, glucosa con produccin de cido y gas. 2. Medio de SIM vertical Sembrar por picadura, se determina produccin de cido sulfhdrico, Indol del triptfano, movilidad, forma de desarrollo. 3. Medios de caldo urea Se determina aprovechamiento de nitrgeno de urea. 4. Prueba de Voges-Proskauer Para esta prueba se necesitan 10 ml de caldo RM-VP, se determina desarrollo bacteriano en el caldo. Con produccin de acetil-metil carbinol por fermentacin de glucosa durante 48-72 horas. Agregue a cada tubo dos gotas de solucin cloruro frrico al 2% y 5 ml de KOH al 10%, agite y deje reposar, una coloracin rosada indicar reaccin positiva. 5. Prueba del rojo de metilo Para esta prueba se requiere de un cultivo en 5 ml de caldo RM-VP incubado durante 5 das. Despus de incubado agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo. La prueba es positiva si el medio vira a color rosa. 6. Agar citrato de Simmons Siembra por picadura y estra. Se determina aprovechamiento de carbono de citrato. 7. Caldo lactosado (medio de enriquecimiento) Se utiliza para la prueba presuntiva de Coliformes
45

8. Caldo bilis verde brillante (medio selectivo) Se utiliza para confirmar la presencia de Coliformes 9. Medio de gelatina Siembra por picadura. Se determina licuefaccin de la gelatina y forma de desarrollo 10. Placas con Agar endo Siembra por estra. Medio selectivo en el cual se determina bacilos gram (-), enterobacterias, color caracterstico de la colonia (verde brillante metlico, para E. Coli) 11. Placa con Agar SS Siembra por estra, es un medio selectivo para el grupo de Salmonella-Shigella, aunque en ocasiones pueden desarrollar otras enterobacterias. CUESTIONARIO 1. Es necesario un cultivo puro para realizar pruebas bioqumicas Por qu? 2. Qu es una prueba bioqumica? 3. Qu utilidad tienen las pruebas bioqumicas? 4. Qu es una enzima? 5. Qu importancia tienen las enzimas en las reacciones bioqumicas de los microorganismos-medios de cultivo? 6. Qu entiende por metabolismo bacteriano? 7. Dar 3 ejemplos de subproductos obtenidos por el metabolismo de una bacteria
46

8. Describa 3 pruebas bioqumicas diferentes a las estudiadas en esta prctica.

47

REPORTE PRACTICA N 7 y 8 PRUEBAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO BACTERIANO FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

48

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

49

PRACTICA N 9 EFECTO DEL MEDIO SOBRE LAS BACTERIAS OBJETIVO Conocer algunos efectos del medio ambiente sobre el desarrollo de las bacterias INFORMACION GENERAL Las bacterias estn casi por completo a merced de su medio ambiente. Como sabemos, algunos microorganismos poseen mecanismos limitados para regular el pH de su alrededor y algunos otros mviles pueden rechazar sustancias nocivas o bien pueden ser atrados por mecanismos quimiotcticos a una fuente de alimentos. Otro factor es la temperatura de un medio de cultivo ya que rige los ndices de velocidad de crecimiento, multiplicacin y muerte de los microorganismos. Con las radiaciones directas en los cultivos se ha encontrado que tienen dos efectos en los microorganismos. El primero de ellos es la muerte y el otro es la produccin de mutantes en la poblacin superviviente. Las vibraciones sonoras o supersnicas alteran notablemente las clulas causando rotura de la pared celular y su desintegracin total. Otro factor importante es la presin osmtica, que en el caso de las bacterias es mayor que en los medios de cultivo, por contener concentraciones mayores de sales, aminocidos y numerosos compuestos orgnicos e inorgnicos; esto crea una tendencia a la entrada de agua al protoplasma por osmosis a travs de la membrana citoplasmtica semipermeable. En condiciones normales de cultivo, las clulas mantienen un estado de turgencia. PROCEDIMIENTO I. Efecto de la temperatura
50

Material: Tubos con caldo nutritivo, cultivos de bacterias.

Tcnica: a) Inocule cuatro tubos con caldo nutriente (dos asadas) b) Numrelos del I al IV e incbelos a las siguientes temperaturas, durante 24-48 horas. TUBO I Refrigerador 4C TUBO II Temp. Lab. TUBO III 37C TUBO IV 55C

c) Observe crecimiento y anote resultados de acuerdo al siguiente sistema 0 no crecimiento + crecimiento pobre ++ buen crecimiento +++ crecimiento excelente II. Punto trmino mortal Material: Termmetro, bao mara, cajas de petri con Agar nutritivo, cultivos en caldo de 24 horas. Tcnica: a) Haga frotis con cada uno de los cultivos que se le proporcionen y talos al Gram para determinar su pureza b) Marque sus cajas con cada una de las temperaturas que se indicarn c) Caliente el agua del bao mara a una temperatura de 45C d) Despus de sembrar una caja de Agar nutritivo que servir de control, coloque sus tubos de cultivo en bao mara y djelos ah durante 11 minutos e) Al final de este perodo, siembre en cajas de petri (despus de enfriados los cultivos) f) Eleve ahora la temperatura del agua del bao mara a 70C y repita la operacin g) Incube invirtiendo las cajas a 37C durante 48 horas y anote los resultados obtenidos III. Efecto de rayos ultravioleta
51

Material: Cajas de petri con Agar nutritivo, cultivos de bacterias Tcnica: a) Inocule sus cajas con Agar nutritivo con los microorganismos proporcionados (inoculando por toda el rea de la caja) b) Coloque un papel negro que cubra la mitad de la caja (quita previamente las tapas) c) Exponga las cajas a la accin directa de los rayos ultravioleta durante 5 minutos, tape la caja de petri e invirtala. d) Incube a 37C durante 48 horas y anote los resultados IV. Efecto de la presin osmtica Material: Tubos con caldo nutritivo con las siguientes concentraciones de NaCl (5%, 10%, 20%, 40%), cultivos bacterianos Tcnica: - Inocule sus tubos con los microorganismos proporcionados - Incube durante 5 das a 37C - Observar cada 24 horas - Hacer frotis y teir al Gram al quinto da CUESTIONARIO 1. En base a la temperatura, Cmo se clasifican los microorganismos? 2. Qu entiende por temperatura ptima de crecimiento? 3. Cul es la respuesta de los microorganismos a temperatura bajo cero? 4. Qu es el pH? 5. Cul es el efecto del pH en los microorganismos? 6. En qu forma alteran las radiaciones a los microorganismos? 7. Qu es un microorganismo halfilo?
52

8. Citar algunas clases de radiaciones microbicidas

53

REPORTE PRACTICA N 9 EFECTO DEL MEDIO SOBRE LAS BACTERIAS FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

54

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

55

PRACTICA N 10 TECNICAS DE OBSERVACION DE HONGOS Y LEVADURAS OBJETIVO Aprender las tcnicas de observacin microscpica de hongos y levaduras para diferenciar sus caractersticas morfolgicas. INFORMACION GENERAL LEVADURAS Tpicamente las levaduras son organismos unicelulares aunque frecuentemente despus de la fisin quedan varias clulas reunidas. Las clulas de las levaduras son de 20 a 100 veces ms voluminosas que la mayor parte de las bacterias y se pueden presentar en forma esfrica, ovoide y elipsoidal. Las levaduras se pueden teir con colorantes sencillos como el azul de metileno o safranina. La tincin hace ms fcil la observacin de las clulas microscpicas, debido a esto se ha creado una tincin especial para levaduras "TINCION GSTEIN" que ayuda al microbilogo a cuantificar el porcentaje de viabilidad de los cultivos de levaduras, que es de gran utilidad en los procesos fermentativos. HONGOS Los hongos son plantas que carecen de clorofila, el pigmento verde que efecta la fotosntesis. El grupo Eumicetos incluye tambin hongos voluminosos, comestibles y similares, as como tambin hongos y levaduras microscpicas. Los hongos estn muy difundidos en la naturaleza y ejercen profunda influencia sobre el medio en que viven, pudren la madera, las hojas y otros vegetales, formando el humus que enriquece al suelo y devuelven dixido de carbono a la atmsfera que aprovechan las plantas verdes; los hongos se utilizan en la industria de fermentaciones para producir cidos, alcoholes y muchos compuestos y son origen de algunos antibiticos. Morfolgicamente los hongos estn constituidos por el micelio, que es un
56

agregado de filamentos filiformes o hifas. Estas hifas son de dos tipos funcionales: hifas vegetativas, que penetran en el sustrato para absolver las sustancias nutritivas e hifas frtiles que producen las clulas reproductoras. Estas caractersticas de los hongos es lo que hace diferenciarse fcilmente de los dems microorganismos. PROCEDIMIENTO MATERIAL Portaobjetos Cubreobjetos Asas Aguja de diseccin Microscopio REACTIVO NaOH al 10% Azul de metileno Lugol Safranina Acido tnico CEPAS Aspergillus sp Sacharomyces sp Cndida sp

1. Coloque una gota por separado de NaOH 10%, azul de metileno, Lugol, safranina, sobre un portaobjetos. Tome una muestra de la colonia del medio de cultivo conteniendo desarrollo de colonia de hongos con una asa en forma de gancho y depostelo sobre las gotas. Disgregue el micelo, ayudndose de las agujas de diseccin y coloque sobre el medio en cubreobjetos, observe al microscopio con seco fuerte y seco dbil. Dibuje la morfologa que observe. 2. Del cultivo de Sacharomyces sp y Cndida sp, haga frotis de la misma manera como si fuera un frotis microbiano. a) Talo por el mtodo de Gram, obsrvelo en microscopio con inmersin b) Talo por coloracin simple, obsrvelo en microscopio con inmersin c) Dibuje la morfologa que observe. 3. Tincin de Gstein para levaduras Reactivos - Solucin al 1% de azul de metileno en agua destilada - Solucin al 5% de cido tnico en agua destilada
57

- Solucin al 1% de safranina en agua destilada NOTA: Estos reactivos deben prepararse en pequeas cantidades antes de usarse. Desarrollo: - Hacer un frotis, dejar secar al aire, fijar al calor pasndolo por la flama (temperatura soportable por la mano) 20 veces. - Teir con la solucin azul de metileno durante 4 minutos. Enjuagar con agua de la llave durante 30 segundos. - Teir con la solucin cido tnico durante 2 minutos y lavar con agua durante 30 segundos. - Teir con safranina 1 minuto, enjuagar con agua durante 30 segundos, dejar secar y observar en el objetivo de 40x y 100x. CUESTIONARIO 1. Describa el proceso ms comn de reproduccin de las levaduras. 2. Dibuje los diferentes tipos de esporas que son comunes en los hongos. 3. Compare la morfologa de las bacterias, levaduras y hongos. 4. En qu difieren los hongos de otros vegetales? 5. Describa el procedimiento para obtener un cultivo puro de hongo. 6. Compare las exigencias nutritivas de los hongos y las levaduras. 7. Dnde podemos encontrar levaduras? 8. Qu importancia tiene la tincin Gstein?

58

REPORTE PRACTICA N 10 TECNICAS DE OBSERVACION DE HONGOS Y LEVADURAS FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

59

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

60

PRACTICA N 11 ANALISIS BACTERIOLOGICO DEL AGUA OBJETIVO Determinar la calidad bacteriolgica de un agua potable INFORMACION GENERAL La determinacin de la calidad de un agua es de vital importancia para el bienestar de la comunidad, ya que un agua contaminada puede provocar epidemias en una poblacin. La determinacin de la potabilidad de un agua puede hacerse utilizando diferentes ndices de contaminacin. En este caso se va a determinar la presencia o ausencia de Escherichia Coli, el NMP de coliformes totales, coliformes fecales y la cuenta estndar en placa. PROCEDIMIENTO I. Cuenta estndar en placas Material: Muestra de agua, tubos para dilucin, pipetas graduadas de 1 ml esterilizadas, Agar nutritivo. Tcnica: 1. Agitar vigorosamente el frasco que contenga la muestra unas 25 veces y tomar 1 ml para hacer las diluciones convenientes. 2. Colocar 1 ml de la dilucin en la caja de petri y verter encima Agar nutritivo previamente fundido y enfriado a una temperatura entre 43 y 45 C. 3. Homogenizar, dejar solidificar e incubar invirtiendo las cajas a 35 C. 4. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas. Contar el nmero en aquellas placas en las que haya entre 30 y 300 UFC.
61

5. Hacer los clculos para determinar el nmero de microorganismos por ml de la muestra original. II. Tcnicas de los tubos de fermentacin para coliformes A. Prueba presuntiva Material: Muestra de agua, pipetas esterilizadas, graduadas de 10 ml, pipetas graduadas esterilizadas de 1 ml, 5 tubos de fermentacin con 10 ml de caldo lactosado de doble concentracin, 2 tubos de fermentacin con 10 ml de caldo lactosado de concentracin sencilla. Tcnica: 1. Inocular 10 ml de la muestra de agua en cada uno de los 5 tubos con caldo de doble concentracin. 2. Inocular respectivamente con 1 ml y 0.1 ml los tubos con caldo lactosado de concentracin sencilla. 3. Incubar a 35 C. Examinar a las 24 horas para ver si hay presencia de gas. En caso negativo continuar la incubacin 24 horas ms. 4. A las 48 horas los tubos que hayan permanecido negativos se descartan. Interpretacin: La formacin de cualquier cantidad de gas y turbidez dentro de las 48 horas en los tubos de fermentacin constituyen una prueba positiva (presuntiva). La ausencia de gas se considera como una prueba presuntiva negativa. Si la prueba presuntiva es positiva hay que proseguir el anlisis para confirmar la presencia de miembros del grupo coliformes. B. Prueba confirmativa Material: Tubos positivos de la muestra anterior, tubos de fermentacin con caldo62

bilis-lactosa-verde-brillante, 1 caja petri con Agar Endo, 1 caja petri con Agareosina-azul de metileno, 1 alambre para siembra con asa. Tcnica: En cuanto los tubos de la prueba presuntiva muestren gas, proceder de inmediato a efectuar la siembra en los medios para la prueba confirmativa de la siguiente manera: 1. Tomar del tubo positivo y transferir 1 asada al tubo con caldo bilis-lactosado verde brillante. Incubar a 35 C durante 48 horas. 2. Tomar de alguno de los tubos que dieron la prueba positiva una cantidad muy pequea con el asa. Sembrar sobre la caja de petri con Endo, utilizando alguna de las tcnicas de aislamiento. Incubar a 35 C durante 24 horas invirtiendo la caja. 3. Hacer exactamente lo mismo en la caja de eosina-azul de metileno. Interpretacin: La formacin de gas y turbidez en cualquier cantidad dentro de las 48 horas, constituye una prueba positiva, debiendo entonces continuarse la prueba a la fase de prueba completa. En las cajas de petri con endo se consideran colonias tpicas todas aquellas que son nucleadas tengan o no brillo metlico, como atpicas las opacas, no nucledas, mucoides despus de 24 horas de incubacin y de color rosa y negativas todas las dems. En el medio de eosina-azul de metileno se consideran tpicas todas aquellas que tengan centro negro (cuando se ven por la parte de abajo, contra la luz) y se denominan nucleadas. Las colonias atpicas son las nucleadas de color rosa y opacas. El resto se consideran como no-coliformes. C. Prueba completa

Material: Tubos positivos de la prueba anterior, colonias tpicas o atpicas, aisladas en las cajas de petri, tubos de Agar nutritivo inclinado, asa para siembra y
63

alambre recto para siembra, portaobjetos, colorantes y reactivos para coloracin Gram.

Tcnica: 1. Utilizar los tubos con caldo verde brillante, para proseguir la prueba, simbrese entonces sobre placas con Endo-o-eosina-azul de metileno, del tubo en cuanto aparezca gas, sin esperar a que pasen las 48 horas. 2. En el caso de preferir las cajas de petri, escjase una colonia que sea tpica o atpica y simbrese en un tubo de fermentacin y en el tubo con Agar inclinado, usando el alambre recto para evitar tocar otra colonia. 3. Incubar ambos tubos a 35 C durante 24 y 48 horas. Observar la presencia o ausencia de gas en el tubo de fermentacin. Hacer la tincin de Gram. Interpretacin: La formacin de gas en el tubo de fermentacin y la presencia de bacterias Gram negativas, no esporuladas, se considera como una prueba completa positiva. D. Prueba diferencial o reacciones IMVIC 1. Prueba del Indol Material: Tubos con medio SIM, tubos positivos de la prueba anterior a las cajas de petri, reactivo de Kovac, alambre recto para siembra, pipetas graduadas de 1 ml. Tcnica: a) Seleccione una colonia tpica bien aislada de alguna de las placas de la prueba confirmativa y siembre ah, tomando con el alambre recto en un tubo con medio SIM. Incube 24 horas a 35 C. b) Agregue 0.2 a 0.3 ml del reactivo de Kovac y agite. Deje reposar durante
64

10 minutos y observe el resultado. Interpretacin: El color rojo que aparece en la capa superficial del alcohol amlico constituye una prueba positiva. Si se observa. Una coloracin anaranjada puede ser indicativa de la presencia del escatol y la reaccin se considera como . Si persiste el color original del reactivo (amarillo) la prueba se considera como negativa. 2. Prueba del rojo de metileno Material: Tubos con 10 ml de caldo MR-VP, solucin indicadora de rojo de metilo. Tcnica: a) Sembrar de alguna de las colonias tpicas de los medios de Endo-oeosina-azul de metileno, al tubo con caldo MR-VP utilizando el alambre recto. b) Incubar 5 das a 35 C c) Aadir 10 gotas de indicador Interpretacin: Si aparece un color rojo la prueba se considera positiva, si el color es amarillo la prueba es negativa. 3. Prueba de Voges-Proskauer Material: Cajas de petri de la prueba confirmativa, tubos de 10 ml con caldo MR-VP, solucin de alfa naftol, solucin de hidrxido de potasio, tubos de hemlisis, pipetas graduadas de 1 ml. Tcnica: a) Inocular el tubo con caldo MR-VP con alguna de las colonias tpicas
65

seleccionadas en las cajas de Endo o eosina-azul de metileno, utilizando el alambre recto. b) Incubar a 35 C durante 48 horas. c) Tomar 1 ml de cultivo y aadirle 0.6 ml de solucin de alfa-naftol y 0.2 ml de solucin de KOH.

66

Interpretacin Si aparece una coloracin rosa o rojiza en los tubos al cabo de 2 a 4 horas la prueba se considera positiva. La lectura debe hacerse precisamente a este lapso, pues los resultados ledos despus de las 4 horas no tiene validez. 4. Prueba de citrato de sodio Material: Cajas de petri con colonias tpicas o atpicas en los medios de Endo o eosina-azul de metileno; tubos con medio citrato de Simmons, alambre recto para siembras. Tcnica: a) Inocule sobre la superficie del tubo con medio de citrato, una pequesima cantidad del cultivo. b) Incube a 35 C durante 72 a 96 horas. Interpretacin: El crecimiento, aunado al vire del indicador, constituye una prueba positiva. Si no se ve que haya cambiado el color del medio la prueba se toma como negativa.

67

E. Tablas Tabla del nmero ms probable (NMP), de organismos coliformes.

Error! Marcador no definido.Nm. de tubos que dieron reaccin positiva 5 de 10 ml 1 de 1 ml 1 de 0.1 ml 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 2 0 0 2 1 0 3 0 0 3 1 0 4 0 1 4 0 0 4 1 0 5 0 0 5 0 1 5 1 0 Nm. ms probables en 100 ml 0 2 2.2 4.4 5 7.6 8.8 12 15 20 21 38 96 240 Inferior 0 0.05 0.05 0.52 0.54 1.5 1.6 3.1 3.3 5.9 6.0 6.4 12 12 Lmites del NMP Superior 5.9 13 13 14 19 19 29 30 46 48 53 330 370 3,700

Tabla con la interpretacin de las reacciones IMVIC Error! Marcador no definido.Bacteria Escherichia Coli Variedad zI Variedad II Escherichia freundil (intermedia) Variedad I Variedad II Aerobacter aerogenes Variedad I Variedad II Indol Rojo de Metileno + + VogesProskauer Citrato

+ -

+ + -

+ +

+ +

Consigne todos los resultados y obtenga el NMP en 100 ml

68

DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES Se han utilizado en muchas partes del mundo y empleado diversas modificaciones, pruebas a temperaturas elevadas para la separacin de los organismos del grupo Coliforme en aquellos que tienen origen fecal de aquellos que no proceden de las heces. La prueba a temperatura elevada constituye un procedimiento confirmativo que indica el origen fecal o no fecal de las cepas. Se aplican a las pruebas presuntivas positivas y no directamente a la muestra en estudio. En la prueba, que constituye un procedimiento abreviado, sirve para evaluar la contaminacin de una agua cruda para determinar los procedimientos de tratamiento. OBJETIVO Demostrar el origen fecal de un agua cuya prueba presuntiva ha resultado positiva. MATERIAL Tubos presuntivos de la prueba positiva Tubos con caldo EC Bao mara a 44.5 C +/- 0.5 C Asa para siembra PROCEDIMIENTO 1. Inocular por cada tubo positivo uno con caldo EC, utilizando una asa 2. Incubar a 44.5 C durante 24 horas. No dejar pasar ms de media hora entre la inoculacin y la incubacin. INTERPRETACION Se considera una reaccin positiva, que indica origen fecal, la produccin de gas en el tubo de fermentacin a las 24 horas o antes de ese lapso. RESULTADOS Consigne tabulando los resultados en la tabla para NMP
69

CUESTIONARIO 1. Por qu es importante determinar la calidad bacteriolgica de una agua potable? 2. Describa los principales indicadores bacteriolgicos de contaminacin de un agua. 3. Qu significado sanitario representa la presencia de E. Coli en un agua potable? 4. Cmo define al grupo Coliforme? 5. Por qu es importante determinar la presencia o ausencia del Vibrio cholerae en un agua para consumo humano? 6. Investigue la tcnica de filtros Millipore para determinar Coliformes 7. Explique si Salmonella puede estar presente en el agua como contaminante 8. Investigue las normas de calidad bacteriolgica para un agua potable

70

REPORTE PRACTICA N 11 ANALISIS BACTERIOLOGICO DEL AGUA FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

71

DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

72

BIBLIOGRAFIA AMADOR/MOTA DE LA GARZA/AVILES (1990). Manual de laboratorio de Microbiologa Sanitaria. Editorial I.P.N., Mxico. BURDON, KENNETH (1982). Microbiologa. Editorial Publicaciones Culturales, Mxico. CARPENTER, PHILLIP (1979). Microbiologa. Editorial McGraw-Hill, Mxico. COLLINS, C. (1989). Mtodos microbiolgicos. Editorial Acribia, Mxico. DELAAT, ADRIAN (1983). Microbiologa. Editorial Interamericana, Mxico. FRIMAN, BOB (1989). Microbiologa de Burrows. Editorial Interamericana, Mxico. FROBISHER/FUERST (1976). Microbiologa. Editorial Interamericana, Mxico. MADIGAN, MICHAEL (1991). Microbiologa. Editorial Prentice-Hall, Mxico. MARQUEZ, ORALIA (1977). Manual de Prcticas de Microbiologa. Editorial Nacional, Mxico. MERCK (1995). Manual de medios de cultivo. Editorial Merck, Mxico. PELCZAR/REID/CHAN (1993). Microbiologa. Editorial McGraw-Hill, Mxico. WALTER/MCBEE/TEMPLE (1980). Introduccin a la Microbiologa. Editorial Cecsa, Mxico.

73

Instituto Tecnolgico de Sonora 5 de febrero No. 818 sur Telfono (64) 17-04-91 Apdo. 541 85000 Ciudad Obregn, Sonora, Mxico

Direccin de Investigacin y Estudios de Posgrado Tel/Fax (64) 17-03-76/17-50-45

COORDINACION DE LABORATORIOS 17 de junio de 1996

Q. Rosa Amelia Beltrn E. Jefe del Depto. de Qumica e Ing. Qumica

Por este conducto le envo el borrador del Manual de Prcticas de Microbiologa I, esperando que las dudas que tenga me las haga saber para aclarrselas. Sin otro particular por el momento, quedo a sus rdenes y aprovecho la ocasin para enviarle un cordial saludo.

A t e n t a m e n t e,

Ing. Anacleto Flix Fuentes Coord. de los Laboratorios de la DIEP

Miembro de la Asociacin Nacional de Universidades e Institutos de Enseanza Superior