MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga

PROFESORA: Dra. Flor García Huamán

CURSO: Microbiología Ambiental

TEMA: Prácticas de Microbiología Ambiental

CHACHAPOYAS 2011

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

MEDIOS DE CULTIVO I. INTRODUCCIÓN: Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos. Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la cual es difícil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. La utilización de los medios de cultivo son necesarios para: - Separación y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una muestra. - Estudio de identificación de un microorganismo problema. - Estudios macroscópicos. Visualizar las características de las colonias en medios sólidos. - Para la conservación de especies microbiales o muestras, etc.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

con la diferencia de ser sólidos. almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos. diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular  Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento..Temperatura óptima de Crecimiento: según el rango de temperatura al cual el microorganismo presenta su mayor crecimiento. En el laboratorio.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Clasificación de los medios de cultivo: 1. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves. 2. (nunca por debajo de 0°C porque se destruye la estructura del gel). Almacenamiento de los medios de cultivo: Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°). Características de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo: 1. o por periodos mayores a 12 -15°C. quimiótrofos (litótrofos u organótrofos) y fotótrofos. anaerobios. Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. según los cuales se clasifica en autótrofos. se los clasifica en sicrófilos. los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida.  Medios definidos o sintéticos: Composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. mesófilos y termófilos. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado.. puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz. hornos ni otra fuente de calor o vapor. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA ..Según su uso:  Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos.Respiratorio: Aerobios.  Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la actividad microbiana.. o en forma sólida si se le agrega agar al caldo.Trófico: requerimientos de carbono y energía. heterótrofos. 2.Según su naturaleza:  Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen animal o vegetal.2.. 3. así como minerales y otras sustancias.6 y 7. anaerobios facultativos y microaerófilos. en cuyo caso se los denomina caldos. Sin embargo.. Permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. 4.Rango de pH: El rango óptimo de pH para la mayoría de bacterias oscila entre 6.

7.. nitrógeno y carbono. etc. peptonas..MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son frecuentemente utilizados en la preparación de los medios de cultivo. 4. sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Con la excepción de algunos microorganismos marinos..). carecen de identidad química definida. Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . dependiendo de su grado de pureza. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta. de levadura. Proveen proteosas. se utilizan ciertos órganos. minerales y vitaminas. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %..Fluidos Corporales: Sangre completa.. y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. carne. el agar no es empleado como nutriente.Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano.Agar: Utilizado como agente gelificante.Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento. polipéptidos y aminoácidos. Existe en rama o en polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos. ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne. para dar solidez a los medios de cultivo. pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. provee sustancias nitrogenadas. 6.. El componente dominante en el agar es un polisacárido. La sangre no puede ser esterilizada y debe. 3. Por ejemplo: extracto de carne. 2. se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja.Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales. por tanto. Los microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad). por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación.Extractos: Para su preparación. mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B. al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. caseína. hígado. plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. o sustancias como las peptonas. 1. de malta.Indicadores de pH: Los indicadores ácido base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. previenen una desviación del pH. gelatina.). Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento. semillas. 5. etc.. Son extraídos con agua y calor. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %. etc. se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C).

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. Placas Petri: Cajas de vidrio de sección circular. El vidrio debe ser de buena calidad. actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. con la finalidad de que el operador no aspire los líquidos potencialmente contaminados. con tapa. Se utilizan tubos de diversos tamaños. etc. MATERIALES: Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico. antibióticos. a la concentración adecuada. transparente e inalterable a los tratamientos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . telurito potásico. el laboratorio de microbiología requiere de una instrumentación básica de uso corriente en microbiología. azida sódica. o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. sales biliares. por ejemplo: cristal violeta. o para el desarrollo de microorganismos en medio líquido con agitación o aireación. Se utiliza para realizar inoculaciones y diluciones. y para la práctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientes instrumentos: Tubos de ensayo: Destinados a conservar medios de cultivo en pequeños volúmenes. Pipetas graduadas: Para su uso en el laboratorio de microbiología se les coloca un tapón de algodón en el extremo superior. 8. Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para la preparación de los medios de cultivo. neutro. Existen de diferentes tamaños según su uso.. aunque las más frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de diámetro..

Cocinas eléctricas: utilizadas para fundir ciertas sustancias. Gradillas para tubos de prueba: de metal o de madera para portar los tubos de prueba durante el trabajo.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Mechero de alcohol: Destinado a proporcionar calor por combustión. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Varillas de vidrio: Llamados agitadores o baguetas. Balanza: Diseñados para la determinación de masas de diversas sustancias. Fósforo y Cucharita: para tomar muestras de ciertas sustancias.

para esto se inclina levemente los tubos de ensayos. sacarosa y glucosa) e hierro (citrato férrico). hacemos uso del calor de un mechero para mantener estéril nuestros instrumentos de trabajo. Caldo Brila: Caldo verde brillante. aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o “campana” Durham que se encuentran dentro de estos. Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo. ¿Qué hacemos? Mediante una regla de tres simple calculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. III. Mc. Luego haciendo uso de una cocina eléctrica se calienta la solución hasta que ésta adquiera el color verde (color característico del Caldo Brila). nosotros deseamos utilizar 400 ml de agua. éste nos permite manejar las cantidades apropiadas. el cual nos permitirá tener una idea de la elaboración de los otros medios de cultivo que ya lo teníamos preparados en diferentes matraces.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TSI: Agar de tres azúcares (lactosa. Extracto de levadura: III. para el Caldo Brila utilizar 40 g. luego se hace uso de una pipeta para verter la solución a los tubos de ensayo. Se deja enfriar por unos minutos. Estos 16 g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. LIA: Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigación de bacilos Gram -. Con leves movimientos circulatorios diluimos la solución. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que varía hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Estos microtubos deben de ser llenados. tiosulfato de sodio. MÉTODOS: Empezaré por explicar la preparación del caldo brila. de la siguiente manera: Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. con 100 ml de agua.I) Caldo Brila Leer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila. Haciendo uso de una pipeta adicionamos agua destilada a la misma.

el depósito contiene algodón en el interior para no causar daños. el cual está contenido en un matraz y se encuentra solidificado. Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras se realiza el intercambio de depósito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . con la finalidad de que el material no se sobrecaliente y cause prejuicios. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido. Para que esta sustancia se encuentre como está ha tenido que seguir los pasos de la elaboración del Caldo Brila. también el mechero con alcohol. Una vez que el matraz se encuentra relativamente frío se procede a depositar el TSI en los tubos de ensayo. Se deja enfriar el matraz por unos minutos. Se rotula y se coloca en la autoclave (121° x . Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante.II) TSI Ahora cogemos el TSI. mientras eso se prepara los tubos de ensayo en los cuales se depositará el TSI. De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso de autoclavado. Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica. Con la ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI.1 atm). III. Colocamos los tubos de ensayo en un depósito forrado con papel blanco.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por último se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodón para mantener estéril nuestro preparado de Caldo Brila. se coloca y se retira de la cocina sin dejar de agitarlo levemente.

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 seco-fuego directo). Estos medios de cultivo fueron: Mc. Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla. Para la esterilización de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor secofuego directo). “Los pasos realizados con el TSI también son aplicados al LIA y al Citrato” También tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces con procedimientos de preparación muy parecidos a los del caldo brila: Mc. Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinación. RESULTADOS: Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo. se deja enfriar. Conkey y extracto de levadura. para bacterias que serán analizadas y estudiadas en nuestro proceso de aprendizaje. El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. conociendo su tremenda diversidad. se tapa y se rotula. pero con la única diferencia de que estos serán depositados en placas Petri. Hemos elaborado dos medios de cultivo según su presentación: Medios sólidos en placas Petri: estos ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura (color marrón). Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboración de un medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso número de microorganismo que podemos encontrar. Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón de igual forma con el matraz. se esparce de forma uniforme en toda la placa petri. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . luego se vierte en las placas Petri (1/3). Conkey y el extracto de levadura. El procedimiento es el mismo. se funde las sustancias Mc. IV. y se titulan los tubos de ensayo.

DISCUSIÓN: ¿Qué es un medio de cultivo? ¿Qué tipos de cultivos se ajustan más a las condiciones naturales? Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentración adecuada. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Estos fueron los siguientes: TSI (color anaranjado). cantidad necesaria de sales y agua.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Medios sólidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. que tenga la consistencia y el pH adecuados. LIA (color purpura claro). Citrato (color verde) y Brila (verde brillante). Caldo Brila | Citrato TSI Mc. que sea estéril y que no contenga sustancias inhibidoras. Conkey LIA Extracto de Levadura V.

M. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology.pdf http://www. Koneman Elmer W. Microbiología: Bacteriología. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. sacarosa y glucosa). Cuadros. medios de cultivo y pruebas bioquímicas. 2003. Pedrique de Aulacio. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: Manacorda. 5ª. 8ª edición. Universidad Central de Venezuela. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Manual Práctico de Microbiología Ambiental. Biología de los Microorganismos. R. Brock. su composición. M. 1998.microinmuno. VI. Las bacterias sulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica.uba. M. T.arguia. edición: 2007. Martinko G..203 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Manual de Métodos Generales (2da edición).. Granados Pérez. Así un medio de cultivo reúne los requisitos de los microorganismos y reproduce el ambiente natural en el que se desarrollan. Clavell. con producción o no de gases (CO2 y H2).España.ar/SeminarioMedios.fcen. Anahí. lactosa y/o sacarosa. etc.. y Villaverde Peris C. ¿Por qué es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos? Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo más adecuado del mismo. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.qb. Washington Square: Lippincott – Raven Publishers. 2004. Ed. Pretice Hall. 1997: 173. y Álvarez.htm Difco y BBL. Edición. ¿Cuál es el principio del TSI? En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono glucosa. Daniela P. httpwww. Y continuando con este ejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. Editorial Paraninfo. Ana M. Madigan.microinmuno. Parker J.qb. 1992.uba.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azúcares (lactosa.fcen.. citrato férrico y tiosulfato de sodio. junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). L. Microbiología. Facultad de Farmacia. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitirá determinar variedad de bacterias.

y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. Después de la fijación. la fijación por el calor es lo más corriente. Esos colorantes incluyen la eosina. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía. cápsulas. aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido. la fucsina ácida y el rojo Congo. tales como muchas proteínas. esporas. proceso llamado fijación. paredes celulares. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. tratando después éste con el agente fijador. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. por el contrario. y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. Esta sustancia se denomina mordiente. son suficientes los procedimientos simples de tinción. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. si se añade el colorante. Para bacterias. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales. de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. INTRODUCCIÓN: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno. el cristal violeta y la safranina. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares. no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. un mordiente habitual es el lugol. que no es un colorante por sí mismo. puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 PREPARACIÓN DE TINCIONES BACTERIANAS I. tales como flagelos. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas. la tinción. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química. etc. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. ácidos y alcoholes.

por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china.Asa bacteriológica .Muestra de agua con bacterias .Alcohol Cetona (Descolorante) . MATERIALES Y MÉTODOS .Cristal Violeta . y nuestra coloración simple está lista para observar al microscopio a un aumento de 100x.Azul de Metileno . mientras mantenemos un mechero para mantener esterilizado la muestra y los materiales.Lamina portaobjetos . Luego se agrega el colorante azul de metileno. Azul Metileno de Loeffler. Luego se deja secar. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. Azul de lactofenol).Lugol (Mordiente) .Mechero con alcohol . se lava para quitar el exceso de colorante de modo. Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriológica extendemos y fijamos la muestra a un portaobjetos.Safranina (Colorante de contraste) En la preparación de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloración simple y las de coloración Gram. que el agua no golpee directamente la muestra y se lave todo. Coloración Simple: Se utiliza un solo colorante.

en este proceso unas se fijan con mayor intensidad. Se agrega el alcohol cetona (descolorante). Por último agregamos safranina (colorante de contraste) que es la que tiñe a las bacterias que no se han fijado en el procedimiento anterior. las bacterias pueden dividirse en dos grupos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Se procede a agregar lugol (mordiente). sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego observar al microscopio con un aumento de 100x. siempre contando con nuestro mechero para la esterilización. en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien se despintan. quien la desarrolló en 1844. se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico. la extendemos y la fijamos a una lámina portaobjetos con ayuda de un asa bacteriológica. grampositivas y gramnegativas (en este caso. se deja reposar de 3-5 minutos. se deja reposar de 3-5 minutos y se lava. Luego se lava como se muestra en el dibujo. Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Coloración Gram: Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. Contamos con nuestra muestra.

Permanece violeta Permanece violeta Descoloración Permanece violeta Se descolora Contraste Permanece violeta Se tiñe de rosa Observar al microscopio Violeta Rosa ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . se lava con agua el exceso de lugol) Alcohol-acetona (luego de unos minutos lavar con agua para eliminar el resto de disolvente) Fucsina o Safranina (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. RESULTADOS Coloración Simple: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una solución colorante (azul de metileno). Coloración gram: ETAPAS EN LA TINCIÓN Pasos Método Gram positivas Gram negativas Colorante Básico Cristal Violeta (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta Mordiente Lugol (pasado unos min.

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A. etc. taxonómicas. diferenciarlas por sus características morfológicas. Díaz. Barcelona. y colaboradores. B. Diagnóstico Microbiológico.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 IV. Bailey y Scott. V. Se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. S. Ed. Editorial Médico Panamericana. F. – Weissfeld A. DISCUSIÓN ¿Por qué teñir una muestra? Porque nos permite distinguir a cada una de ellas. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. 11ª Edición. 2004 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .. 2a edición. que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. ¿Se puede agregar un álcali a la solución de azul de metileno de uso? ¿Por qué si? ¿Por qué no? Si se puede agregar un álcali (KOH) como intensificante. Masson. R. ¿Qué se hace en la coloración simple? Se cubre el frotis. después de fijado. 1999  Forbes. con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. ¿Cómo debe de ser la descoloración de una muestra? La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas.Sahm D.

por lo tanto. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de agrupaciones. y para observarlos es esencial el microscopio. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias “ácido. MATERIALES Y MÉTODOS  Aceite de inmersión  Microscopio  Muestra de lactobacilos II. INTRODUCCIÓN: Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano. así como su reacción a diferentes colorantes. Estas técnicas tienen un gran interés en la identificación y clasificación de las bacterias.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 OBSERVACIÓN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS I. morfología y estructura de los microorganismos.alcohol resistentes”. las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tinción negativa de cápsulas. permitirá su identificación. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales. es importante conocer su adecuado manejo. lo cual junto con otros criterios. La tinción diferencial más utilizada es la tinción de Gram.

c) Platina. el cabezal porta oculares y el revólver porta objetivos. III. A continuación algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos. d) El Macrométrico y el Micrométrico: Ambos permiten enfocar la preparación. mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40. en la parte inferior se muestra las partes de un microscopio. se procede a enfocar las láminas con objetivo de 100x y se pone una gotita de aceite de inmersión para visualizar. x100). Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable conocer las partes de un microscopio y su manejo. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la preparación). Lo primero en esta práctica fue contar con una muestra (preparada en una lámina portaobjetos). estafilococos y estreptococos. un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. formando arreglos característicos. El primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menos 18 de aumento (x10). ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . RESULTADOS Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan. 1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. 2) SISTEMA ÓPTICO: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. crecen individuales y aisladas. Sus principales partes son: a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación. Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación. con la finalidad de conocer mejor los instrumentos a utilizar.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 A continuación damos algunos detalles de un microscopio compuesto. pueden permanecer unidas unas con otras. Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. b) Brazo: Soporta todo el sistema óptico. en determinados modelos incorpora además. Cuando las células microbianas como los cocos se dividen. bacilos y de estos algunas agrupaciones como diplococos.

htm ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . DISCUSIÓN ¿Por qué es importante un microscopio en la observación de microorganismos? Porque es la única manera en que las puedes observar a través de un instrumento con lentes de aumento y así identificarlas.azc. Díaz. www. estreptococos y estafilococos. 2a edición. Pero también podemos encontrar espirilos y agrupaciones de sarcinas. tétradas. R. Diplococo cuando las células hijas se presentan en parejas Coco (esférico) Estreptococo en cadena Cuando las células hijas forman cadenas Estafilococo las células permanecen unidas pero después de una división celular en dos o más planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas. Universidad Autónoma Metropolitana.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac t_clasif.edu. 1999  Manual de Laboratorio. Ed. V. MICROBIOLOGIA APLICADA. ¿Qué tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra tomada de un agua contaminada? Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de diplococos. etc.unad. se separan y conservan su individualidad. y colaboradores. Masson.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Forma Agrupación Representación Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical.uam. Bacilos En forma de bastón IV. Barcelona. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología.mx/cbi/quimica/microbiologia  http://www.

Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros. Por puntura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento. lo que permite su desarrollo y multiplicación. INTRODUCCIÓN: En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . 2. la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. si se incuba en condiciones adecuadas. conservación y mantenimiento de los cultivos microbianos. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que se requiera. se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta. Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo. En profundidad y superficie: a). se puede sembrar en superficie. en profundidad o en profundidad y superficie. elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado. Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido. Para ello existen técnicas de siembra. un tiempo conveniente. 1.En superficie: a). se punza el fondo. a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja..En profundidad: a).MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS I. Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte.. 3). La punción se realiza en el centro del medio o excéntricamente.

Con un asa bacteriológica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos. se funde el agar.. muestras de: agua estancada y leche contaminada. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro trabajo se utiliza un mechero. pero esta vez en la placa Petri. se protege y se rotula.Por puntura: se esteriliza el asa bacteriológica. 4.1 mL) y se hace la extensión de la muestra. se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18 mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la muestra como el agar.. entonces se funde y se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL.Por diseminación: se cuenta con el agar nutritivo solidificado. 3. se agrega la muestra (0. 2. Este tipo de siembra se utiliza para un aislamiento primario. se protege la siembra y se rotula. Este tipo de técnica de siembra nos permite estudiar la bioquímica de los microorganismos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .Por estría: para la elaboración de esta técnica de siembra se utilizó agar Mac Conkey. MATERIALES Y MÉTODOS  Mechero  Placas Petri  Mac Conkey  TSI  CITRATO  LIA  Asa bacteriológica  Muestra de leche contaminada  Espátula o hisopo Técnicas de siembra: 1. aproximadamente hasta los ¾. LIA y CITRATO). con esta misma se toma una porción de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI. se protege el material y se rotula. Se deja enfriar nuevamente. se retira por el mismo lugar y se estría en el pico de flauta. se necesita una placa Petri con medio de cultivo Mac Conkey.Por incorporación: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estéril vacía..MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II.. luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula.

Barcelona.htm  Gamazo. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana).fcen.ar/SeminarioTinciones. C. RESULTADOS IV. Díaz.uba. I.microinmuno. por ejemplo en la técnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con pico de flauta. Manual práctico de microbiología. Ed. BIBLIOGRAFÍA  http://www. López-Goñi. S. se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros. ¿Cuál es la finalidad de la técnica de siembra por diseminación? Con este tipo de siembra lo que se obtendrá es la biomasa de los microorganismos cultivados. Masson. DISCUSIÓN ¿Cuál es la finalidad de una siembra? Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. los pasos a seguir nos lo demuestran. ¿Cuál es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra? Todos los tipos de siembra son muy diferentes. España ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . 2005. Es muy importante la distribución de las bacterias. El aislamiento.A.. en cambio. ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie. o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. ¿Cuál es la finalidad de siembra por incorporación? La principal función es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo para el recuento bacteriano. V. la finalidad de esta inclinación es la utilización de la densidad de las sustancias nutritivas que componen el agar utilizado..MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III.qb. y R.

Enterobius vermicularis. algunos poseen estructura relativamente compleja. cuyo grupo originario está constituido por los turbelarios. y Naegleria sp. piscinas. Las técnicas de investigación de protozoos parásitos intestinales están basadas en la detección del parásito tras la filtración de volúmenes de agua. Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides. doce son patógenos verdaderos. Estos son excretados por las heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a través del agua y suelo. platelmintos y nematelmintos. etc. protozoarios como: Entamoeba histolytica. Trichiuris trichiura.). El phylum protozoarios incluye más de 30 especies que pueden atacar al hombre. Cryptosporidium spp. II. pueden vivir facultativamente en forma parásita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. unos de vida libre. Taenia solium. sistemas de calefacción y refrigeración. en su mayoría microscópicos. diez son transmitidos por insectos y el resto (Giardia lamblia y Entamoeba histolítica) pueden ser transmitidos por moscas o por el agua.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS I. Se encuentran en todos los ambientes. De estos. Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigación en aguas de consumo y agua utilizada en diferentes actividades. Giardia lamblia. En aguas estancadas (naturales. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados (cestodos). constituidos por una masa de protoplasma. que suelen provocar inflamaciones de mucosas. otros parásitos y soprofitas. MATERIALES Y MÉTODOS  Microscopio  Muestras de agua  Algunas variedades de helmintos  Aceite de inmersión ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Protozoarios: Son seres unicelulares. INTRODUCCIÓN: La parasitología es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. viven exclusivamente de modo parasitario. Helmintos: Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados. etc. El termino parásito es aplicado a los protozoos.

Estas infecciones pueden ser provocadas por nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascaris lumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura). que se caracterizan por su forma cambiante.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. la tenia y especies que habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S. La infección por helmintos es el resultado de la penetración de un gusano al interior del cuerpo donde maduran. que también usan para capturar alimentos (a través del proceso llamado fagocitosis). ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . RESULTADOS Protozoarios: Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. mansoni. puesto que carecen de pared celular. y por su movimiento ameboide a base de seudópodos (prolongación del citoplasma). Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre o de los animales. Helmintos: El término "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan el intestino del ser humano. Son células eucariotas. depositan huevos y obtienen nutrición del huésped.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . generalmente es asintomática en el adulto. La profilaxis consiste en no ingerir agua y principalmente verduras crudas. El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud y se presenta en forma de %átigo%la hembra parasitaria estáenrollada en un extremo en forma de mazo de reloj. pobreza e ignorancia. anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Trichuris trichiura: Es un parásito que puede ser considerado cosmopolita. la ascariasis prevalece y es endémica en áreas desprovistas de infraestructura sanitaria. de localización intestinal baja (intestino grueso) y ciego. Sólo si la infección es masiva se produce (6) : diarrea. La infección se produce por ingerir las larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses. se produce el '1elescopaje" rectal. Esta enfermedad cursa con una sintomatología muy variable. inclusive apreciándose los gusanos adultos adheridos a la mucosa. y es en el niño donde vemos la más florida signo sintomatología y las complicaciones de esta enfermedad. muco-sanguinolenta.  Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo que produce una de las parasitoide mayor difusión en el mundo: la ascariasis. Como la mayoría de las enteroparasitosis. de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera. al igual que el Ascarislumbricoides. que debilitan los músculos elevadores del ano. con viviendas precarias.

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Fasciola  Huevo de heminolepsis nana IV. Elsi. Algunos de ellos causan la muerte o lesiones graves. Editorial sombra. su estudio sería una de las llaves para conocer más acerca de este mundo y prevenir ciertas acciones. estos viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan.azc. Madrid. Tratado de parasitología. DISCUSION La mayor parte de estos helmintos actúan como parásitos por no decir todos. Guadalajara.pdf  Villegas. Los citados en la parte inferior tienen síntomas muy variables. BIBLIOGRAFIA  http://www. V.  PIEKKARSKI. Es muy importante su estudio porque le causan daño a los seres humanos.uam. Gerhard.mx/cbi/quimica/microbiologia/p24. Parasitología. 2005. Mexico. Aguilar. 1959 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .