MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga

PROFESORA: Dra. Flor García Huamán

CURSO: Microbiología Ambiental

TEMA: Prácticas de Microbiología Ambiental

CHACHAPOYAS 2011

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

MEDIOS DE CULTIVO I. INTRODUCCIÓN: Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos. Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la cual es difícil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. La utilización de los medios de cultivo son necesarios para: - Separación y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una muestra. - Estudio de identificación de un microorganismo problema. - Estudios macroscópicos. Visualizar las características de las colonias en medios sólidos. - Para la conservación de especies microbiales o muestras, etc.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

Según su naturaleza:  Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen animal o vegetal.. los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida.6 y 7..  Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la actividad microbiana. puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz. hornos ni otra fuente de calor o vapor. se los clasifica en sicrófilos..Rango de pH: El rango óptimo de pH para la mayoría de bacterias oscila entre 6. quimiótrofos (litótrofos u organótrofos) y fotótrofos.Trófico: requerimientos de carbono y energía. (nunca por debajo de 0°C porque se destruye la estructura del gel). o por periodos mayores a 12 -15°C. Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. 2. En el laboratorio. Permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. 2. Sin embargo. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado. en cuyo caso se los denomina caldos. Características de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo: 1.Según su uso:  Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos. con la diferencia de ser sólidos. 4..Temperatura óptima de Crecimiento: según el rango de temperatura al cual el microorganismo presenta su mayor crecimiento..  Medios definidos o sintéticos: Composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. así como minerales y otras sustancias. anaerobios.. Almacenamiento de los medios de cultivo: Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°). diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . heterótrofos. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves. almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos. o en forma sólida si se le agrega agar al caldo. según los cuales se clasifica en autótrofos. anaerobios facultativos y microaerófilos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Clasificación de los medios de cultivo: 1.2. mesófilos y termófilos. 3.Respiratorio: Aerobios. con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular  Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento.

tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne.Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento. mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B. dependiendo de su grado de pureza. se utilizan ciertos órganos. Existe en rama o en polvo. 4. Por ejemplo: extracto de carne. se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja. El componente dominante en el agar es un polisacárido.).Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales. carne. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo.Indicadores de pH: Los indicadores ácido base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. 3.. etc. de malta.. hígado. provee sustancias nitrogenadas.Agar: Utilizado como agente gelificante.Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. previenen una desviación del pH. de levadura. para dar solidez a los medios de cultivo. Proveen proteosas. se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C). el agar no es empleado como nutriente. sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. o sustancias como las peptonas. semillas.. carecen de identidad química definida. plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. 2. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento. La sangre no puede ser esterilizada y debe. ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano.Extractos: Para su preparación. 5. y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo.Fluidos Corporales: Sangre completa.. gelatina. 7. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %. polipéptidos y aminoácidos. etc. etc. peptonas... En el caso del extracto de carne en polvo o pasta. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . nitrógeno y carbono. Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son frecuentemente utilizados en la preparación de los medios de cultivo. Son extraídos con agua y calor. por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. minerales y vitaminas.. caseína.). pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. 1. y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos. Con la excepción de algunos microorganismos marinos. 6. Los microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad). por tanto.

con la finalidad de que el operador no aspire los líquidos potencialmente contaminados. transparente e inalterable a los tratamientos. Existen de diferentes tamaños según su uso. azida sódica. MATERIALES: Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico. a la concentración adecuada. por ejemplo: cristal violeta. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . 8.. Se utiliza para realizar inoculaciones y diluciones. Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para la preparación de los medios de cultivo. telurito potásico. o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. el laboratorio de microbiología requiere de una instrumentación básica de uso corriente en microbiología. y para la práctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientes instrumentos: Tubos de ensayo: Destinados a conservar medios de cultivo en pequeños volúmenes. o para el desarrollo de microorganismos en medio líquido con agitación o aireación. antibióticos. El vidrio debe ser de buena calidad. actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II.. sales biliares.Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. neutro. Se utilizan tubos de diversos tamaños. etc. Pipetas graduadas: Para su uso en el laboratorio de microbiología se les coloca un tapón de algodón en el extremo superior. Placas Petri: Cajas de vidrio de sección circular. con tapa. aunque las más frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de diámetro.

Varillas de vidrio: Llamados agitadores o baguetas. Cocinas eléctricas: utilizadas para fundir ciertas sustancias. Fósforo y Cucharita: para tomar muestras de ciertas sustancias. Balanza: Diseñados para la determinación de masas de diversas sustancias. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Gradillas para tubos de prueba: de metal o de madera para portar los tubos de prueba durante el trabajo.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Mechero de alcohol: Destinado a proporcionar calor por combustión.

para el Caldo Brila utilizar 40 g.I) Caldo Brila Leer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila. luego se hace uso de una pipeta para verter la solución a los tubos de ensayo. Extracto de levadura: III. MÉTODOS: Empezaré por explicar la preparación del caldo brila. éste nos permite manejar las cantidades apropiadas. Haciendo uso de una pipeta adicionamos agua destilada a la misma.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TSI: Agar de tres azúcares (lactosa. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. tiosulfato de sodio. Luego haciendo uso de una cocina eléctrica se calienta la solución hasta que ésta adquiera el color verde (color característico del Caldo Brila). Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo. de la siguiente manera: Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. III. Se deja enfriar por unos minutos. para esto se inclina levemente los tubos de ensayos. con 100 ml de agua. LIA: Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigación de bacilos Gram -. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Con leves movimientos circulatorios diluimos la solución. el cual nos permitirá tener una idea de la elaboración de los otros medios de cultivo que ya lo teníamos preparados en diferentes matraces. Mc. Caldo Brila: Caldo verde brillante. ¿Qué hacemos? Mediante una regla de tres simple calculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar. Estos microtubos deben de ser llenados. nosotros deseamos utilizar 400 ml de agua. hacemos uso del calor de un mechero para mantener estéril nuestros instrumentos de trabajo. Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que varía hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. sacarosa y glucosa) e hierro (citrato férrico). Estos 16 g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o “campana” Durham que se encuentran dentro de estos.

Colocamos los tubos de ensayo en un depósito forrado con papel blanco. Con la ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI. pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras se realiza el intercambio de depósito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Se deja enfriar el matraz por unos minutos. el cual está contenido en un matraz y se encuentra solidificado. también el mechero con alcohol.II) TSI Ahora cogemos el TSI. con la finalidad de que el material no se sobrecaliente y cause prejuicios. se coloca y se retira de la cocina sin dejar de agitarlo levemente. Una vez que el matraz se encuentra relativamente frío se procede a depositar el TSI en los tubos de ensayo. De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso de autoclavado. Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante.1 atm).MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por último se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodón para mantener estéril nuestro preparado de Caldo Brila. III. Se rotula y se coloca en la autoclave (121° x . el depósito contiene algodón en el interior para no causar daños. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido. Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica. Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. mientras eso se prepara los tubos de ensayo en los cuales se depositará el TSI. Para que esta sustancia se encuentre como está ha tenido que seguir los pasos de la elaboración del Caldo Brila.

Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla. El procedimiento es el mismo. para bacterias que serán analizadas y estudiadas en nuestro proceso de aprendizaje. se funde las sustancias Mc. Para la esterilización de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor secofuego directo). se tapa y se rotula. pero con la única diferencia de que estos serán depositados en placas Petri. se deja enfriar. Hemos elaborado dos medios de cultivo según su presentación: Medios sólidos en placas Petri: estos ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. conociendo su tremenda diversidad.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 seco-fuego directo). Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinación. IV. Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura (color marrón). luego se vierte en las placas Petri (1/3). se esparce de forma uniforme en toda la placa petri. RESULTADOS: Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo. Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón de igual forma con el matraz. Estos medios de cultivo fueron: Mc. y se titulan los tubos de ensayo. Conkey y extracto de levadura. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . “Los pasos realizados con el TSI también son aplicados al LIA y al Citrato” También tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces con procedimientos de preparación muy parecidos a los del caldo brila: Mc. Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboración de un medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso número de microorganismo que podemos encontrar. Conkey y el extracto de levadura.

que sea estéril y que no contenga sustancias inhibidoras. cantidad necesaria de sales y agua. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . que tenga la consistencia y el pH adecuados. Estos fueron los siguientes: TSI (color anaranjado). Conkey LIA Extracto de Levadura V.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Medios sólidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. DISCUSIÓN: ¿Qué es un medio de cultivo? ¿Qué tipos de cultivos se ajustan más a las condiciones naturales? Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentración adecuada. Caldo Brila | Citrato TSI Mc. Citrato (color verde) y Brila (verde brillante). LIA (color purpura claro).

5ª. Koneman Elmer W. M.ar/SeminarioMedios. edición: 2007.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azúcares (lactosa. Pedrique de Aulacio. M. su composición.htm Difco y BBL. Universidad Central de Venezuela. Brock. citrato férrico y tiosulfato de sodio. Martinko G. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitirá determinar variedad de bacterias. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. y Villaverde Peris C. etc.fcen. VI.fcen. Daniela P. 1998. Biología de los Microorganismos. ¿Cuál es el principio del TSI? En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono glucosa.qb. Cuadros. Pretice Hall. lactosa y/o sacarosa. M. Y continuando con este ejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. 2003. y Álvarez. junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). Editorial Paraninfo. con producción o no de gases (CO2 y H2).. T..pdf http://www. ¿Por qué es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos? Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo más adecuado del mismo. 2004. Anahí.203 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Facultad de Farmacia. Ana M. Así un medio de cultivo reúne los requisitos de los microorganismos y reproduce el ambiente natural en el que se desarrollan.qb. L. Microbiología. Madigan. R.microinmuno. Ed. Edición.microinmuno. Clavell.uba. httpwww.. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: Manacorda. 1997: 173.España. medios de cultivo y pruebas bioquímicas. Manual Práctico de Microbiología Ambiental. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Parker J.. 1992.uba. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos. Washington Square: Lippincott – Raven Publishers. 8ª edición. Manual de Métodos Generales (2da edición). Microbiología: Bacteriología. sacarosa y glucosa). elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. Las bacterias sulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica. Granados Pérez.arguia.

y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 PREPARACIÓN DE TINCIONES BACTERIANAS I. tales como flagelos. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. un mordiente habitual es el lugol. ácidos y alcoholes. Para bacterias. por el contrario. tales como muchas proteínas. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas. la fucsina ácida y el rojo Congo. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. INTRODUCCIÓN: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. Esta sustancia se denomina mordiente. la fijación por el calor es lo más corriente. el cristal violeta y la safranina. Esos colorantes incluyen la eosina. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. proceso llamado fijación. que no es un colorante por sí mismo. esporas. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno. aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido. etc. no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química. de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. tratando después éste con el agente fijador. paredes celulares. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Después de la fijación. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. si se añade el colorante. son suficientes los procedimientos simples de tinción. la tinción. cápsulas. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . y nuestra coloración simple está lista para observar al microscopio a un aumento de 100x.Muestra de agua con bacterias . Luego se deja secar.Lugol (Mordiente) .Safranina (Colorante de contraste) En la preparación de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloración simple y las de coloración Gram.Azul de Metileno .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. mientras mantenemos un mechero para mantener esterilizado la muestra y los materiales. se lava para quitar el exceso de colorante de modo.Asa bacteriológica .Lamina portaobjetos .Alcohol Cetona (Descolorante) . Azul Metileno de Loeffler. Coloración Simple: Se utiliza un solo colorante. MATERIALES Y MÉTODOS . Luego se agrega el colorante azul de metileno.Cristal Violeta . que el agua no golpee directamente la muestra y se lave todo. Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriológica extendemos y fijamos la muestra a un portaobjetos. por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china. Azul de lactofenol).Mechero con alcohol .

se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego observar al microscopio con un aumento de 100x. Por último agregamos safranina (colorante de contraste) que es la que tiñe a las bacterias que no se han fijado en el procedimiento anterior. quien la desarrolló en 1844. se deja reposar de 3-5 minutos y se lava. las bacterias pueden dividirse en dos grupos. Luego se lava como se muestra en el dibujo. en este proceso unas se fijan con mayor intensidad. Se procede a agregar lugol (mordiente). se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. siempre contando con nuestro mechero para la esterilización. Contamos con nuestra muestra. se deja reposar de 3-5 minutos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Coloración Gram: Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien se despintan. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . grampositivas y gramnegativas (en este caso. Se agrega el alcohol cetona (descolorante). la extendemos y la fijamos a una lámina portaobjetos con ayuda de un asa bacteriológica. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram. Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul. los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico. sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).

Permanece violeta Permanece violeta Descoloración Permanece violeta Se descolora Contraste Permanece violeta Se tiñe de rosa Observar al microscopio Violeta Rosa ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. RESULTADOS Coloración Simple: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una solución colorante (azul de metileno). se lava con agua el exceso de lugol) Alcohol-acetona (luego de unos minutos lavar con agua para eliminar el resto de disolvente) Fucsina o Safranina (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión. Coloración gram: ETAPAS EN LA TINCIÓN Pasos Método Gram positivas Gram negativas Colorante Básico Cristal Violeta (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta Mordiente Lugol (pasado unos min.

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Sahm D. que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. diferenciarlas por sus características morfológicas. con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Editorial Médico Panamericana. 2004 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . ¿Se puede agregar un álcali a la solución de azul de metileno de uso? ¿Por qué si? ¿Por qué no? Si se puede agregar un álcali (KOH) como intensificante. Masson.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 IV. ¿Qué se hace en la coloración simple? Se cubre el frotis. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. Se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. Diagnóstico Microbiológico. Díaz. 2a edición.. después de fijado. y colaboradores. 11ª Edición. B. etc. – Weissfeld A. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. taxonómicas. ¿Cómo debe de ser la descoloración de una muestra? La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. Barcelona. DISCUSIÓN ¿Por qué teñir una muestra? Porque nos permite distinguir a cada una de ellas. V. A. R. S. F. Bailey y Scott. 1999  Forbes. Ed.

las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tinción negativa de cápsulas. es importante conocer su adecuado manejo. MATERIALES Y MÉTODOS  Aceite de inmersión  Microscopio  Muestra de lactobacilos II. por lo tanto. morfología y estructura de los microorganismos. INTRODUCCIÓN: Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano. La tinción diferencial más utilizada es la tinción de Gram. y para observarlos es esencial el microscopio. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias “ácido. Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales. lo cual junto con otros criterios.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 OBSERVACIÓN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS I.alcohol resistentes”. permitirá su identificación. Estas técnicas tienen un gran interés en la identificación y clasificación de las bacterias. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de agrupaciones. así como su reacción a diferentes colorantes. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .

Cuando las células microbianas como los cocos se dividen. estafilococos y estreptococos. crecen individuales y aisladas. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 A continuación damos algunos detalles de un microscopio compuesto. c) Platina. d) El Macrométrico y el Micrométrico: Ambos permiten enfocar la preparación. con la finalidad de conocer mejor los instrumentos a utilizar. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación. Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable conocer las partes de un microscopio y su manejo. III. pueden permanecer unidas unas con otras. mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40. un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. Lo primero en esta práctica fue contar con una muestra (preparada en una lámina portaobjetos). Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico. 1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. El primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menos 18 de aumento (x10). 2) SISTEMA ÓPTICO: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. b) Brazo: Soporta todo el sistema óptico. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan. x100). Sus principales partes son: a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación. el cabezal porta oculares y el revólver porta objetivos. en la parte inferior se muestra las partes de un microscopio. A continuación algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos. Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. formando arreglos característicos. en determinados modelos incorpora además. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la preparación). bacilos y de estos algunas agrupaciones como diplococos. se procede a enfocar las láminas con objetivo de 100x y se pone una gotita de aceite de inmersión para visualizar. RESULTADOS Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación.

Barcelona.mx/cbi/quimica/microbiologia  http://www. tétradas.unad. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. Díaz. y colaboradores. etc. estreptococos y estafilococos.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac t_clasif.uam. Universidad Autónoma Metropolitana. V. Masson. www. DISCUSIÓN ¿Por qué es importante un microscopio en la observación de microorganismos? Porque es la única manera en que las puedes observar a través de un instrumento con lentes de aumento y así identificarlas. Pero también podemos encontrar espirilos y agrupaciones de sarcinas. ¿Qué tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra tomada de un agua contaminada? Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de diplococos. Ed. Bacilos En forma de bastón IV. 2a edición. 1999  Manual de Laboratorio. R.htm ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Forma Agrupación Representación Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical. se separan y conservan su individualidad.azc.edu. MICROBIOLOGIA APLICADA. Diplococo cuando las células hijas se presentan en parejas Coco (esférico) Estreptococo en cadena Cuando las células hijas forman cadenas Estafilococo las células permanecen unidas pero después de una división celular en dos o más planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas.

Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo.En superficie: a). se punza el fondo. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento. 1. si se incuba en condiciones adecuadas. Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja. Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado. un tiempo conveniente. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Para ello existen técnicas de siembra.En profundidad: a).. En profundidad y superficie: a). Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido. conservación y mantenimiento de los cultivos microbianos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS I. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que se requiera. Por puntura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. La punción se realiza en el centro del medio o excéntricamente.. se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta. lo que permite su desarrollo y multiplicación. 3). la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. en profundidad o en profundidad y superficie. 2. luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio. INTRODUCCIÓN: En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo. Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros. se puede sembrar en superficie. Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte. a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos.

se protege y se rotula. aproximadamente hasta los ¾. se protege el material y se rotula. se agrega la muestra (0. se protege la siembra y se rotula. MATERIALES Y MÉTODOS  Mechero  Placas Petri  Mac Conkey  TSI  CITRATO  LIA  Asa bacteriológica  Muestra de leche contaminada  Espátula o hisopo Técnicas de siembra: 1. entonces se funde y se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL. Con un asa bacteriológica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .1 mL) y se hace la extensión de la muestra. muestras de: agua estancada y leche contaminada. LIA y CITRATO). se necesita una placa Petri con medio de cultivo Mac Conkey. se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18 mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la muestra como el agar.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. pero esta vez en la placa Petri. 3.Por estría: para la elaboración de esta técnica de siembra se utilizó agar Mac Conkey.. 4. Este tipo de siembra se utiliza para un aislamiento primario. Se deja enfriar nuevamente.Por incorporación: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estéril vacía. Este tipo de técnica de siembra nos permite estudiar la bioquímica de los microorganismos.Por diseminación: se cuenta con el agar nutritivo solidificado. se funde el agar.. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro trabajo se utiliza un mechero.. se retira por el mismo lugar y se estría en el pico de flauta. con esta misma se toma una porción de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI. luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula. 2..Por puntura: se esteriliza el asa bacteriológica.

¿Cuál es la finalidad de la técnica de siembra por diseminación? Con este tipo de siembra lo que se obtendrá es la biomasa de los microorganismos cultivados. la finalidad de esta inclinación es la utilización de la densidad de las sustancias nutritivas que componen el agar utilizado. Díaz. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana).htm  Gamazo. Masson. y R. V.uba. Es muy importante la distribución de las bacterias. Ed.qb. 2005. por ejemplo en la técnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con pico de flauta. I.A. C. ¿Cuál es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra? Todos los tipos de siembra son muy diferentes. ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie.fcen. los pasos a seguir nos lo demuestran. López-Goñi. ¿Cuál es la finalidad de siembra por incorporación? La principal función es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo para el recuento bacteriano. Manual práctico de microbiología. España ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . BIBLIOGRAFÍA  http://www. RESULTADOS IV.. se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. El aislamiento. Barcelona. DISCUSIÓN ¿Cuál es la finalidad de una siembra? Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento.. o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas.microinmuno. en cambio. S.ar/SeminarioTinciones.

etc. Taenia solium. en su mayoría microscópicos. Cryptosporidium spp. Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides. De estos. platelmintos y nematelmintos. INTRODUCCIÓN: La parasitología es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. otros parásitos y soprofitas. Las técnicas de investigación de protozoos parásitos intestinales están basadas en la detección del parásito tras la filtración de volúmenes de agua. II. cuyo grupo originario está constituido por los turbelarios. sistemas de calefacción y refrigeración. Se encuentran en todos los ambientes. constituidos por una masa de protoplasma. etc. diez son transmitidos por insectos y el resto (Giardia lamblia y Entamoeba histolítica) pueden ser transmitidos por moscas o por el agua. y Naegleria sp. piscinas. Protozoarios: Son seres unicelulares. protozoarios como: Entamoeba histolytica. algunos poseen estructura relativamente compleja. que suelen provocar inflamaciones de mucosas.). pueden vivir facultativamente en forma parásita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados (cestodos). El termino parásito es aplicado a los protozoos. Helmintos: Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados. viven exclusivamente de modo parasitario. Trichiuris trichiura. Giardia lamblia. Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigación en aguas de consumo y agua utilizada en diferentes actividades. Enterobius vermicularis. MATERIALES Y MÉTODOS  Microscopio  Muestras de agua  Algunas variedades de helmintos  Aceite de inmersión ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . doce son patógenos verdaderos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS I. Estos son excretados por las heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a través del agua y suelo. unos de vida libre. En aguas estancadas (naturales. El phylum protozoarios incluye más de 30 especies que pueden atacar al hombre.

RESULTADOS Protozoarios: Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. que también usan para capturar alimentos (a través del proceso llamado fagocitosis). puesto que carecen de pared celular. Helmintos: El término "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan el intestino del ser humano. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . depositan huevos y obtienen nutrición del huésped. La infección por helmintos es el resultado de la penetración de un gusano al interior del cuerpo donde maduran. y por su movimiento ameboide a base de seudópodos (prolongación del citoplasma). mansoni.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. que se caracterizan por su forma cambiante. Son células eucariotas. la tenia y especies que habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S. Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre o de los animales. Estas infecciones pueden ser provocadas por nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascaris lumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura).

El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud y se presenta en forma de %átigo%la hembra parasitaria estáenrollada en un extremo en forma de mazo de reloj. que debilitan los músculos elevadores del ano. generalmente es asintomática en el adulto.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Trichuris trichiura: Es un parásito que puede ser considerado cosmopolita. de localización intestinal baja (intestino grueso) y ciego. pobreza e ignorancia. Esta enfermedad cursa con una sintomatología muy variable. inclusive apreciándose los gusanos adultos adheridos a la mucosa. Sólo si la infección es masiva se produce (6) : diarrea. con viviendas precarias. La infección se produce por ingerir las larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses. la ascariasis prevalece y es endémica en áreas desprovistas de infraestructura sanitaria.  Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo que produce una de las parasitoide mayor difusión en el mundo: la ascariasis. La profilaxis consiste en no ingerir agua y principalmente verduras crudas. y es en el niño donde vemos la más florida signo sintomatología y las complicaciones de esta enfermedad. muco-sanguinolenta. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . se produce el '1elescopaje" rectal. de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera. Como la mayoría de las enteroparasitosis. anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal. al igual que el Ascarislumbricoides.

V. Mexico. su estudio sería una de las llaves para conocer más acerca de este mundo y prevenir ciertas acciones.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Fasciola  Huevo de heminolepsis nana IV. estos viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan. Guadalajara. Gerhard. Tratado de parasitología. BIBLIOGRAFIA  http://www. Es muy importante su estudio porque le causan daño a los seres humanos. Madrid. 1959 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .uam. Editorial sombra. 2005.  PIEKKARSKI.azc. Los citados en la parte inferior tienen síntomas muy variables. Elsi. Algunos de ellos causan la muerte o lesiones graves.mx/cbi/quimica/microbiologia/p24. Aguilar. DISCUSION La mayor parte de estos helmintos actúan como parásitos por no decir todos. Parasitología.pdf  Villegas.

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