MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga

PROFESORA: Dra. Flor García Huamán

CURSO: Microbiología Ambiental

TEMA: Prácticas de Microbiología Ambiental

CHACHAPOYAS 2011

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

MEDIOS DE CULTIVO I. INTRODUCCIÓN: Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos. Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la cual es difícil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. La utilización de los medios de cultivo son necesarios para: - Separación y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una muestra. - Estudio de identificación de un microorganismo problema. - Estudios macroscópicos. Visualizar las características de las colonias en medios sólidos. - Para la conservación de especies microbiales o muestras, etc.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

Trófico: requerimientos de carbono y energía. anaerobios facultativos y microaerófilos. anaerobios.Rango de pH: El rango óptimo de pH para la mayoría de bacterias oscila entre 6. mesófilos y termófilos. Sin embargo... 2. hornos ni otra fuente de calor o vapor. favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular  Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento.Según su uso:  Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos.2. o por periodos mayores a 12 -15°C. 4... con la diferencia de ser sólidos.6 y 7. quimiótrofos (litótrofos u organótrofos) y fotótrofos. 3.. Características de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo: 1. Permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. heterótrofos. según los cuales se clasifica en autótrofos. en cuyo caso se los denomina caldos. así como minerales y otras sustancias. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Clasificación de los medios de cultivo: 1. En el laboratorio. (nunca por debajo de 0°C porque se destruye la estructura del gel). se los clasifica en sicrófilos.. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves. los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida.  Medios definidos o sintéticos: Composición química definida cualitativamente y cuantitativamente.Respiratorio: Aerobios. Almacenamiento de los medios de cultivo: Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación.  Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la actividad microbiana. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado. puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz. almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos. 2. o en forma sólida si se le agrega agar al caldo. con poca humedad y protegidos de la luz solar directa.Temperatura óptima de Crecimiento: según el rango de temperatura al cual el microorganismo presenta su mayor crecimiento.Según su naturaleza:  Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen animal o vegetal.

pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos.. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. para dar solidez a los medios de cultivo. plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. el agar no es empleado como nutriente. carecen de identidad química definida. dependiendo de su grado de pureza. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta. nitrógeno y carbono. 7. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento. peptonas. Existe en rama o en polvo.). ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. de levadura.Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %. o sustancias como las peptonas...Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento. El componente dominante en el agar es un polisacárido. previenen una desviación del pH.. se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja. Son extraídos con agua y calor.). 5. 1.Fluidos Corporales: Sangre completa. etc.Agar: Utilizado como agente gelificante. Con la excepción de algunos microorganismos marinos. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Los microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad). carne. polipéptidos y aminoácidos. y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos. caseína. y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. etc.Extractos: Para su preparación. etc.. 4. se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C). se utilizan ciertos órganos. Proveen proteosas. 2. de malta.Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son frecuentemente utilizados en la preparación de los medios de cultivo.Indicadores de pH: Los indicadores ácido base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. 3.. gelatina. al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. hígado. por tanto. provee sustancias nitrogenadas. por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación.. minerales y vitaminas. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne. semillas. 6. Por ejemplo: extracto de carne. La sangre no puede ser esterilizada y debe. sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.

el laboratorio de microbiología requiere de una instrumentación básica de uso corriente en microbiología. con tapa.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. transparente e inalterable a los tratamientos. aunque las más frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de diámetro. o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. y para la práctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientes instrumentos: Tubos de ensayo: Destinados a conservar medios de cultivo en pequeños volúmenes. Se utiliza para realizar inoculaciones y diluciones. etc. neutro. antibióticos.. por ejemplo: cristal violeta. Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para la preparación de los medios de cultivo. actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. telurito potásico. azida sódica. 8. sales biliares. Pipetas graduadas: Para su uso en el laboratorio de microbiología se les coloca un tapón de algodón en el extremo superior. Existen de diferentes tamaños según su uso.Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. a la concentración adecuada. o para el desarrollo de microorganismos en medio líquido con agitación o aireación. El vidrio debe ser de buena calidad. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Placas Petri: Cajas de vidrio de sección circular. MATERIALES: Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico. con la finalidad de que el operador no aspire los líquidos potencialmente contaminados.. Se utilizan tubos de diversos tamaños.

Fósforo y Cucharita: para tomar muestras de ciertas sustancias. Cocinas eléctricas: utilizadas para fundir ciertas sustancias. Varillas de vidrio: Llamados agitadores o baguetas.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Mechero de alcohol: Destinado a proporcionar calor por combustión. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Gradillas para tubos de prueba: de metal o de madera para portar los tubos de prueba durante el trabajo. Balanza: Diseñados para la determinación de masas de diversas sustancias.

para esto se inclina levemente los tubos de ensayos. Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que varía hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo. MÉTODOS: Empezaré por explicar la preparación del caldo brila. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TSI: Agar de tres azúcares (lactosa. luego se hace uso de una pipeta para verter la solución a los tubos de ensayo. hacemos uso del calor de un mechero para mantener estéril nuestros instrumentos de trabajo. III. Se deja enfriar por unos minutos. Mc. sacarosa y glucosa) e hierro (citrato férrico). el cual nos permitirá tener una idea de la elaboración de los otros medios de cultivo que ya lo teníamos preparados en diferentes matraces. éste nos permite manejar las cantidades apropiadas. con 100 ml de agua. Estos microtubos deben de ser llenados. para el Caldo Brila utilizar 40 g. de la siguiente manera: Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. Con leves movimientos circulatorios diluimos la solución. Estos 16 g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. Caldo Brila: Caldo verde brillante. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . nosotros deseamos utilizar 400 ml de agua.I) Caldo Brila Leer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila. LIA: Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigación de bacilos Gram -. Haciendo uso de una pipeta adicionamos agua destilada a la misma. ¿Qué hacemos? Mediante una regla de tres simple calculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar. tiosulfato de sodio. Extracto de levadura: III. aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o “campana” Durham que se encuentran dentro de estos. Luego haciendo uso de una cocina eléctrica se calienta la solución hasta que ésta adquiera el color verde (color característico del Caldo Brila).

Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante. Con la ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI. Para que esta sustancia se encuentre como está ha tenido que seguir los pasos de la elaboración del Caldo Brila. pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras se realiza el intercambio de depósito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . también el mechero con alcohol. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido. Se deja enfriar el matraz por unos minutos. el cual está contenido en un matraz y se encuentra solidificado.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por último se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodón para mantener estéril nuestro preparado de Caldo Brila. Una vez que el matraz se encuentra relativamente frío se procede a depositar el TSI en los tubos de ensayo. Colocamos los tubos de ensayo en un depósito forrado con papel blanco. el depósito contiene algodón en el interior para no causar daños. Se rotula y se coloca en la autoclave (121° x . III.II) TSI Ahora cogemos el TSI.1 atm). se coloca y se retira de la cocina sin dejar de agitarlo levemente. mientras eso se prepara los tubos de ensayo en los cuales se depositará el TSI. con la finalidad de que el material no se sobrecaliente y cause prejuicios. Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica. De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso de autoclavado.

El procedimiento es el mismo. se tapa y se rotula. para bacterias que serán analizadas y estudiadas en nuestro proceso de aprendizaje. “Los pasos realizados con el TSI también son aplicados al LIA y al Citrato” También tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces con procedimientos de preparación muy parecidos a los del caldo brila: Mc.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 seco-fuego directo). se esparce de forma uniforme en toda la placa petri. pero con la única diferencia de que estos serán depositados en placas Petri. Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinación. Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboración de un medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso número de microorganismo que podemos encontrar. Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura (color marrón). RESULTADOS: Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo. Para la esterilización de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor secofuego directo). Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . y se titulan los tubos de ensayo. Estos medios de cultivo fueron: Mc. Conkey y extracto de levadura. luego se vierte en las placas Petri (1/3). IV. se funde las sustancias Mc. Conkey y el extracto de levadura. Hemos elaborado dos medios de cultivo según su presentación: Medios sólidos en placas Petri: estos ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. conociendo su tremenda diversidad. se deja enfriar. Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón de igual forma con el matraz.

Citrato (color verde) y Brila (verde brillante). Conkey LIA Extracto de Levadura V. cantidad necesaria de sales y agua.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Medios sólidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. LIA (color purpura claro). que tenga la consistencia y el pH adecuados. que sea estéril y que no contenga sustancias inhibidoras. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Estos fueron los siguientes: TSI (color anaranjado). Caldo Brila | Citrato TSI Mc. DISCUSIÓN: ¿Qué es un medio de cultivo? ¿Qué tipos de cultivos se ajustan más a las condiciones naturales? Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentración adecuada.

uba.. ¿Por qué es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos? Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo más adecuado del mismo. Facultad de Farmacia. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. Koneman Elmer W. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitirá determinar variedad de bacterias. M.pdf http://www. M. Cuadros. con producción o no de gases (CO2 y H2). Daniela P. Así un medio de cultivo reúne los requisitos de los microorganismos y reproduce el ambiente natural en el que se desarrollan. su composición. y Álvarez. Washington Square: Lippincott – Raven Publishers. R. 2004.htm Difco y BBL. citrato férrico y tiosulfato de sodio. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: Manacorda. Edición. L.qb.microinmuno.. junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). Clavell.uba.fcen.ar/SeminarioMedios. Anahí.arguia. Microbiología. Granados Pérez. 8ª edición. medios de cultivo y pruebas bioquímicas. Manual de Métodos Generales (2da edición). Las bacterias sulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica. httpwww. Parker J.España. Pedrique de Aulacio. Y continuando con este ejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. 1997: 173. lactosa y/o sacarosa. Madigan.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azúcares (lactosa. Universidad Central de Venezuela.. Editorial Paraninfo. 1992. Microbiología: Bacteriología.microinmuno. ¿Cuál es el principio del TSI? En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono glucosa. 5ª. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos. Manual Práctico de Microbiología Ambiental.qb. Pretice Hall. Brock. Martinko G. edición: 2007.fcen. 1998. Ana M. T.203 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . M. sacarosa y glucosa).. etc. VI. Ed. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. y Villaverde Peris C. Biología de los Microorganismos. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación).

el cristal violeta y la safranina. un mordiente habitual es el lugol. no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. ácidos y alcoholes. Para bacterias. hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. etc. paredes celulares.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 PREPARACIÓN DE TINCIONES BACTERIANAS I. tales como muchas proteínas. cápsulas. son suficientes los procedimientos simples de tinción. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Después de la fijación. la fijación por el calor es lo más corriente. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. Esos colorantes incluyen la eosina. que no es un colorante por sí mismo. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. proceso llamado fijación. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno. tales como flagelos. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. esporas. Esta sustancia se denomina mordiente. tratando después éste con el agente fijador. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células. tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales. aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido. y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química. por el contrario. la fucsina ácida y el rojo Congo. INTRODUCCIÓN: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. la tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares. si se añade el colorante. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

MATERIALES Y MÉTODOS .Safranina (Colorante de contraste) En la preparación de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloración simple y las de coloración Gram.Muestra de agua con bacterias . Azul de lactofenol).Lamina portaobjetos .Alcohol Cetona (Descolorante) .Asa bacteriológica . y nuestra coloración simple está lista para observar al microscopio a un aumento de 100x. Coloración Simple: Se utiliza un solo colorante. Azul Metileno de Loeffler. por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china. Luego se deja secar. mientras mantenemos un mechero para mantener esterilizado la muestra y los materiales.Lugol (Mordiente) . Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriológica extendemos y fijamos la muestra a un portaobjetos. Luego se agrega el colorante azul de metileno. se lava para quitar el exceso de colorante de modo.Azul de Metileno .Cristal Violeta . que el agua no golpee directamente la muestra y se lave todo. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II.Mechero con alcohol .

se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego observar al microscopio con un aumento de 100x. la extendemos y la fijamos a una lámina portaobjetos con ayuda de un asa bacteriológica. Se agrega el alcohol cetona (descolorante). en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien se despintan. se deja reposar de 3-5 minutos. quien la desarrolló en 1844. se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. grampositivas y gramnegativas (en este caso. Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul. Luego se lava como se muestra en el dibujo. Contamos con nuestra muestra. los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Coloración Gram: Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. en este proceso unas se fijan con mayor intensidad. Se procede a agregar lugol (mordiente). las bacterias pueden dividirse en dos grupos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Por último agregamos safranina (colorante de contraste) que es la que tiñe a las bacterias que no se han fijado en el procedimiento anterior. sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). se deja reposar de 3-5 minutos y se lava. siempre contando con nuestro mechero para la esterilización.

se lava con agua el exceso de lugol) Alcohol-acetona (luego de unos minutos lavar con agua para eliminar el resto de disolvente) Fucsina o Safranina (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión. Coloración gram: ETAPAS EN LA TINCIÓN Pasos Método Gram positivas Gram negativas Colorante Básico Cristal Violeta (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta Mordiente Lugol (pasado unos min.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. RESULTADOS Coloración Simple: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una solución colorante (azul de metileno). Permanece violeta Permanece violeta Descoloración Permanece violeta Se descolora Contraste Permanece violeta Se tiñe de rosa Observar al microscopio Violeta Rosa ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .

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¿Cómo debe de ser la descoloración de una muestra? La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. taxonómicas. 11ª Edición. etc. después de fijado. Editorial Médico Panamericana. R. Ed. ¿Qué se hace en la coloración simple? Se cubre el frotis. B. y colaboradores. Se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. Masson. 2004 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Barcelona. ¿Se puede agregar un álcali a la solución de azul de metileno de uso? ¿Por qué si? ¿Por qué no? Si se puede agregar un álcali (KOH) como intensificante.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 IV. S. – Weissfeld A. Diagnóstico Microbiológico.. con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. 1999  Forbes. V. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología.Sahm D. Bailey y Scott. A. diferenciarlas por sus características morfológicas. DISCUSIÓN ¿Por qué teñir una muestra? Porque nos permite distinguir a cada una de ellas. Díaz. 2a edición. F.

Estas técnicas tienen un gran interés en la identificación y clasificación de las bacterias. por lo tanto. las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tinción negativa de cápsulas. es importante conocer su adecuado manejo. MATERIALES Y MÉTODOS  Aceite de inmersión  Microscopio  Muestra de lactobacilos II. morfología y estructura de los microorganismos. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de agrupaciones. así como su reacción a diferentes colorantes. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias “ácido. INTRODUCCIÓN: Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano. Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales.alcohol resistentes”. La tinción diferencial más utilizada es la tinción de Gram. lo cual junto con otros criterios. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . permitirá su identificación.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 OBSERVACIÓN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS I. y para observarlos es esencial el microscopio.

b) Brazo: Soporta todo el sistema óptico. con la finalidad de conocer mejor los instrumentos a utilizar. en determinados modelos incorpora además. El primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menos 18 de aumento (x10). Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. III. estafilococos y estreptococos. crecen individuales y aisladas. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan. Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico. Cuando las células microbianas como los cocos se dividen. c) Platina. pueden permanecer unidas unas con otras. Sus principales partes son: a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación. Lo primero en esta práctica fue contar con una muestra (preparada en una lámina portaobjetos). En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la preparación). 2) SISTEMA ÓPTICO: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. RESULTADOS Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación. en la parte inferior se muestra las partes de un microscopio. x100). un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 A continuación damos algunos detalles de un microscopio compuesto. formando arreglos característicos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . bacilos y de estos algunas agrupaciones como diplococos. el cabezal porta oculares y el revólver porta objetivos. 1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. se procede a enfocar las láminas con objetivo de 100x y se pone una gotita de aceite de inmersión para visualizar. Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable conocer las partes de un microscopio y su manejo. mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40. A continuación algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación. d) El Macrométrico y el Micrométrico: Ambos permiten enfocar la preparación. Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento.

tétradas. Diplococo cuando las células hijas se presentan en parejas Coco (esférico) Estreptococo en cadena Cuando las células hijas forman cadenas Estafilococo las células permanecen unidas pero después de una división celular en dos o más planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas. y colaboradores.unad. 2a edición. Pero también podemos encontrar espirilos y agrupaciones de sarcinas. Masson. se separan y conservan su individualidad. 1999  Manual de Laboratorio. Díaz.mx/cbi/quimica/microbiologia  http://www. Barcelona.edu.htm ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .uam.azc. www. estreptococos y estafilococos. R. MICROBIOLOGIA APLICADA. Universidad Autónoma Metropolitana. etc. ¿Qué tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra tomada de un agua contaminada? Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de diplococos. V.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac t_clasif. DISCUSIÓN ¿Por qué es importante un microscopio en la observación de microorganismos? Porque es la única manera en que las puedes observar a través de un instrumento con lentes de aumento y así identificarlas.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Forma Agrupación Representación Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical. Bacilos En forma de bastón IV. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. Ed.

en profundidad o en profundidad y superficie. 2. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para ello existen técnicas de siembra. Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo. conservación y mantenimiento de los cultivos microbianos. se punza el fondo. se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.. luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS I. un tiempo conveniente. a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que se requiera. la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. se puede sembrar en superficie.En profundidad: a). 1. La punción se realiza en el centro del medio o excéntricamente. Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros. Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado.. si se incuba en condiciones adecuadas. 3). Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido. INTRODUCCIÓN: En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento. En profundidad y superficie: a). lo que permite su desarrollo y multiplicación. Por puntura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo.En superficie: a). elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo. Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .

se funde el agar.Por diseminación: se cuenta con el agar nutritivo solidificado. se protege y se rotula. se protege la siembra y se rotula. entonces se funde y se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL.1 mL) y se hace la extensión de la muestra. Con un asa bacteriológica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos. se retira por el mismo lugar y se estría en el pico de flauta. luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro trabajo se utiliza un mechero..MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. muestras de: agua estancada y leche contaminada. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . 3. aproximadamente hasta los ¾.Por puntura: se esteriliza el asa bacteriológica. con esta misma se toma una porción de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI. Se deja enfriar nuevamente. se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18 mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la muestra como el agar. MATERIALES Y MÉTODOS  Mechero  Placas Petri  Mac Conkey  TSI  CITRATO  LIA  Asa bacteriológica  Muestra de leche contaminada  Espátula o hisopo Técnicas de siembra: 1. se necesita una placa Petri con medio de cultivo Mac Conkey.. 2. Este tipo de técnica de siembra nos permite estudiar la bioquímica de los microorganismos.Por estría: para la elaboración de esta técnica de siembra se utilizó agar Mac Conkey.Por incorporación: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estéril vacía. 4. LIA y CITRATO). se agrega la muestra (0.. se protege el material y se rotula. pero esta vez en la placa Petri. Este tipo de siembra se utiliza para un aislamiento primario..

Ed. Barcelona. López-Goñi. España ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . ¿Cuál es la finalidad de la técnica de siembra por diseminación? Con este tipo de siembra lo que se obtendrá es la biomasa de los microorganismos cultivados.qb. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana). la finalidad de esta inclinación es la utilización de la densidad de las sustancias nutritivas que componen el agar utilizado. DISCUSIÓN ¿Cuál es la finalidad de una siembra? Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. S. BIBLIOGRAFÍA  http://www. V. en cambio. los pasos a seguir nos lo demuestran.uba.htm  Gamazo..ar/SeminarioTinciones. I. ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie. Es muy importante la distribución de las bacterias. 2005. por ejemplo en la técnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con pico de flauta. ¿Cuál es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra? Todos los tipos de siembra son muy diferentes.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. ¿Cuál es la finalidad de siembra por incorporación? La principal función es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo para el recuento bacteriano.fcen. Manual práctico de microbiología. o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. C.A.. se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros. Masson.microinmuno. Díaz. El aislamiento. y R. RESULTADOS IV.

otros parásitos y soprofitas. etc. Las técnicas de investigación de protozoos parásitos intestinales están basadas en la detección del parásito tras la filtración de volúmenes de agua. MATERIALES Y MÉTODOS  Microscopio  Muestras de agua  Algunas variedades de helmintos  Aceite de inmersión ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . El termino parásito es aplicado a los protozoos. diez son transmitidos por insectos y el resto (Giardia lamblia y Entamoeba histolítica) pueden ser transmitidos por moscas o por el agua. El phylum protozoarios incluye más de 30 especies que pueden atacar al hombre. piscinas. en su mayoría microscópicos. sistemas de calefacción y refrigeración. Estos son excretados por las heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a través del agua y suelo. Enterobius vermicularis. cuyo grupo originario está constituido por los turbelarios. INTRODUCCIÓN: La parasitología es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. algunos poseen estructura relativamente compleja. En aguas estancadas (naturales. Giardia lamblia. Cryptosporidium spp. Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigación en aguas de consumo y agua utilizada en diferentes actividades. etc.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS I. Se encuentran en todos los ambientes. constituidos por una masa de protoplasma. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados (cestodos). viven exclusivamente de modo parasitario. unos de vida libre. protozoarios como: Entamoeba histolytica. doce son patógenos verdaderos. Taenia solium. Protozoarios: Son seres unicelulares. De estos.). Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides. y Naegleria sp. platelmintos y nematelmintos. II. Helmintos: Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados. pueden vivir facultativamente en forma parásita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. que suelen provocar inflamaciones de mucosas. Trichiuris trichiura.

y por su movimiento ameboide a base de seudópodos (prolongación del citoplasma). Estas infecciones pueden ser provocadas por nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascaris lumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura).MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. depositan huevos y obtienen nutrición del huésped. Helmintos: El término "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan el intestino del ser humano. RESULTADOS Protozoarios: Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. La infección por helmintos es el resultado de la penetración de un gusano al interior del cuerpo donde maduran. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre o de los animales. que se caracterizan por su forma cambiante. Son células eucariotas. puesto que carecen de pared celular. que también usan para capturar alimentos (a través del proceso llamado fagocitosis). mansoni. la tenia y especies que habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S.

Como la mayoría de las enteroparasitosis. que debilitan los músculos elevadores del ano. la ascariasis prevalece y es endémica en áreas desprovistas de infraestructura sanitaria. generalmente es asintomática en el adulto. con viviendas precarias. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . de localización intestinal baja (intestino grueso) y ciego. inclusive apreciándose los gusanos adultos adheridos a la mucosa. pobreza e ignorancia. La profilaxis consiste en no ingerir agua y principalmente verduras crudas. Sólo si la infección es masiva se produce (6) : diarrea. de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Trichuris trichiura: Es un parásito que puede ser considerado cosmopolita. anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal. La infección se produce por ingerir las larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses. muco-sanguinolenta. Esta enfermedad cursa con una sintomatología muy variable. El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud y se presenta en forma de %átigo%la hembra parasitaria estáenrollada en un extremo en forma de mazo de reloj.  Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo que produce una de las parasitoide mayor difusión en el mundo: la ascariasis. se produce el '1elescopaje" rectal. al igual que el Ascarislumbricoides. y es en el niño donde vemos la más florida signo sintomatología y las complicaciones de esta enfermedad.

Gerhard. V. Editorial sombra. Es muy importante su estudio porque le causan daño a los seres humanos. su estudio sería una de las llaves para conocer más acerca de este mundo y prevenir ciertas acciones. DISCUSION La mayor parte de estos helmintos actúan como parásitos por no decir todos. Mexico. Algunos de ellos causan la muerte o lesiones graves. Guadalajara. Tratado de parasitología. Aguilar.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Fasciola  Huevo de heminolepsis nana IV. estos viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan. 1959 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .mx/cbi/quimica/microbiologia/p24. Elsi. Parasitología.azc. Madrid. 2005. BIBLIOGRAFIA  http://www. Los citados en la parte inferior tienen síntomas muy variables.  PIEKKARSKI.pdf  Villegas.uam.

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