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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga

PROFESORA: Dra. Flor García Huamán

CURSO: Microbiología Ambiental

TEMA: Prácticas de Microbiología Ambiental

CHACHAPOYAS 2011

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

MEDIOS DE CULTIVO I. INTRODUCCIÓN: Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos. Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la cual es difícil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. La utilización de los medios de cultivo son necesarios para: - Separación y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una muestra. - Estudio de identificación de un microorganismo problema. - Estudios macroscópicos. Visualizar las características de las colonias en medios sólidos. - Para la conservación de especies microbiales o muestras, etc.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

. anaerobios. Características de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo: 1. en cuyo caso se los denomina caldos.. Permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos.Respiratorio: Aerobios.Según su naturaleza:  Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen animal o vegetal.  Medios definidos o sintéticos: Composición química definida cualitativamente y cuantitativamente.  Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la actividad microbiana. (nunca por debajo de 0°C porque se destruye la estructura del gel). heterótrofos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Clasificación de los medios de cultivo: 1.2.. anaerobios facultativos y microaerófilos. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves.. diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. quimiótrofos (litótrofos u organótrofos) y fotótrofos. Almacenamiento de los medios de cultivo: Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°). En el laboratorio. puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz.Trófico: requerimientos de carbono y energía. con la diferencia de ser sólidos. Sin embargo. 2. Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. 2.Según su uso:  Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos. se los clasifica en sicrófilos. 3.Temperatura óptima de Crecimiento: según el rango de temperatura al cual el microorganismo presenta su mayor crecimiento. o por periodos mayores a 12 -15°C. 4. así como minerales y otras sustancias. según los cuales se clasifica en autótrofos.Rango de pH: El rango óptimo de pH para la mayoría de bacterias oscila entre 6. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado.. los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida.6 y 7. o en forma sólida si se le agrega agar al caldo. hornos ni otra fuente de calor o vapor.. favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular  Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento. mesófilos y termófilos.

y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. 7. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta. semillas.Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales. minerales y vitaminas. Proveen proteosas..Extractos: Para su preparación. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento. 3..Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento. tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne. ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. o sustancias como las peptonas. caseína. etc.. previenen una desviación del pH.Fluidos Corporales: Sangre completa. carecen de identidad química definida. peptonas.Agar: Utilizado como agente gelificante.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son frecuentemente utilizados en la preparación de los medios de cultivo. Son extraídos con agua y calor. 4. se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C).). Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %..Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. hígado. el agar no es empleado como nutriente. La sangre no puede ser esterilizada y debe. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . nitrógeno y carbono. pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. carne. Por ejemplo: extracto de carne. Con la excepción de algunos microorganismos marinos. 5. dependiendo de su grado de pureza. Existe en rama o en polvo. se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja. de malta. se utilizan ciertos órganos. Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos..Indicadores de pH: Los indicadores ácido base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. para dar solidez a los medios de cultivo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. 6. etc. El componente dominante en el agar es un polisacárido.). por tanto.. al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. provee sustancias nitrogenadas. mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B. polipéptidos y aminoácidos. gelatina. y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos. Los microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad). 2. sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. 1. etc. de levadura..

aunque las más frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de diámetro. Placas Petri: Cajas de vidrio de sección circular. Se utiliza para realizar inoculaciones y diluciones.. telurito potásico. Existen de diferentes tamaños según su uso. o para el desarrollo de microorganismos en medio líquido con agitación o aireación. con la finalidad de que el operador no aspire los líquidos potencialmente contaminados. o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. Se utilizan tubos de diversos tamaños. neutro. 8.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. MATERIALES: Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico. etc. azida sódica. Pipetas graduadas: Para su uso en el laboratorio de microbiología se les coloca un tapón de algodón en el extremo superior. el laboratorio de microbiología requiere de una instrumentación básica de uso corriente en microbiología. y para la práctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientes instrumentos: Tubos de ensayo: Destinados a conservar medios de cultivo en pequeños volúmenes. sales biliares. antibióticos. Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para la preparación de los medios de cultivo.Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . transparente e inalterable a los tratamientos. El vidrio debe ser de buena calidad. con tapa. actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. por ejemplo: cristal violeta. a la concentración adecuada..

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Mechero de alcohol: Destinado a proporcionar calor por combustión. Balanza: Diseñados para la determinación de masas de diversas sustancias. Gradillas para tubos de prueba: de metal o de madera para portar los tubos de prueba durante el trabajo. Fósforo y Cucharita: para tomar muestras de ciertas sustancias. Varillas de vidrio: Llamados agitadores o baguetas. Cocinas eléctricas: utilizadas para fundir ciertas sustancias.

aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o “campana” Durham que se encuentran dentro de estos. MÉTODOS: Empezaré por explicar la preparación del caldo brila. Haciendo uso de una pipeta adicionamos agua destilada a la misma. Con leves movimientos circulatorios diluimos la solución.I) Caldo Brila Leer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila. el cual nos permitirá tener una idea de la elaboración de los otros medios de cultivo que ya lo teníamos preparados en diferentes matraces. LIA: Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigación de bacilos Gram -. Extracto de levadura: III. sacarosa y glucosa) e hierro (citrato férrico). III. Mc. Luego haciendo uso de una cocina eléctrica se calienta la solución hasta que ésta adquiera el color verde (color característico del Caldo Brila). Estos 16 g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. para esto se inclina levemente los tubos de ensayos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TSI: Agar de tres azúcares (lactosa. Se deja enfriar por unos minutos. ¿Qué hacemos? Mediante una regla de tres simple calculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar. tiosulfato de sodio. nosotros deseamos utilizar 400 ml de agua. hacemos uso del calor de un mechero para mantener estéril nuestros instrumentos de trabajo. Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo. Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que varía hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. de la siguiente manera: Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. éste nos permite manejar las cantidades apropiadas. Estos microtubos deben de ser llenados. Caldo Brila: Caldo verde brillante. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. con 100 ml de agua. para el Caldo Brila utilizar 40 g. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . luego se hace uso de una pipeta para verter la solución a los tubos de ensayo.

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por último se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodón para mantener estéril nuestro preparado de Caldo Brila. Colocamos los tubos de ensayo en un depósito forrado con papel blanco. Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. se coloca y se retira de la cocina sin dejar de agitarlo levemente. mientras eso se prepara los tubos de ensayo en los cuales se depositará el TSI. también el mechero con alcohol. Con la ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI. III. el cual está contenido en un matraz y se encuentra solidificado. con la finalidad de que el material no se sobrecaliente y cause prejuicios.1 atm).II) TSI Ahora cogemos el TSI. Se deja enfriar el matraz por unos minutos. Se rotula y se coloca en la autoclave (121° x . Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica. pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras se realiza el intercambio de depósito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso de autoclavado. Una vez que el matraz se encuentra relativamente frío se procede a depositar el TSI en los tubos de ensayo. Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido. el depósito contiene algodón en el interior para no causar daños. Para que esta sustancia se encuentre como está ha tenido que seguir los pasos de la elaboración del Caldo Brila.

se esparce de forma uniforme en toda la placa petri. luego se vierte en las placas Petri (1/3). Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinación. y se titulan los tubos de ensayo. se tapa y se rotula. Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura (color marrón). ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . “Los pasos realizados con el TSI también son aplicados al LIA y al Citrato” También tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces con procedimientos de preparación muy parecidos a los del caldo brila: Mc. se funde las sustancias Mc. Conkey y extracto de levadura. El procedimiento es el mismo. Hemos elaborado dos medios de cultivo según su presentación: Medios sólidos en placas Petri: estos ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. IV. Estos medios de cultivo fueron: Mc. Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón de igual forma con el matraz. Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboración de un medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso número de microorganismo que podemos encontrar. Conkey y el extracto de levadura. conociendo su tremenda diversidad. pero con la única diferencia de que estos serán depositados en placas Petri. Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 seco-fuego directo). se deja enfriar. para bacterias que serán analizadas y estudiadas en nuestro proceso de aprendizaje. Para la esterilización de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor secofuego directo). El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. RESULTADOS: Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Conkey LIA Extracto de Levadura V. LIA (color purpura claro). que tenga la consistencia y el pH adecuados. DISCUSIÓN: ¿Qué es un medio de cultivo? ¿Qué tipos de cultivos se ajustan más a las condiciones naturales? Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentración adecuada. Estos fueron los siguientes: TSI (color anaranjado). cantidad necesaria de sales y agua. Caldo Brila | Citrato TSI Mc. Citrato (color verde) y Brila (verde brillante).MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Medios sólidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. que sea estéril y que no contenga sustancias inhibidoras.

Facultad de Farmacia. Pretice Hall.pdf http://www. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. citrato férrico y tiosulfato de sodio. junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). ¿Cuál es el principio del TSI? En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono glucosa. Anahí.España. etc. sacarosa y glucosa). Las bacterias sulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica. Brock. edición: 2007. Martinko G. Ed. y Villaverde Peris C. Madigan. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: Manacorda. Washington Square: Lippincott – Raven Publishers. Koneman Elmer W. Cuadros. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). httpwww.ar/SeminarioMedios.. Clavell. M. Microbiología: Bacteriología.. Universidad Central de Venezuela. Biología de los Microorganismos.microinmuno. Así un medio de cultivo reúne los requisitos de los microorganismos y reproduce el ambiente natural en el que se desarrollan. 5ª. R.fcen. Microbiología.203 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . M. Manual de Métodos Generales (2da edición). 1997: 173.qb. Y continuando con este ejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial.htm Difco y BBL. medios de cultivo y pruebas bioquímicas. ¿Por qué es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos? Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo más adecuado del mismo. 1992. 8ª edición. Granados Pérez. L.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azúcares (lactosa. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitirá determinar variedad de bacterias. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology.microinmuno.uba.fcen.arguia.qb. VI.uba. 2004.. lactosa y/o sacarosa. Ana M. Pedrique de Aulacio. M. Parker J. su composición. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos. T. 1998. y Álvarez.. Editorial Paraninfo. con producción o no de gases (CO2 y H2). Manual Práctico de Microbiología Ambiental. Edición. Daniela P.

tales como muchas proteínas.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 PREPARACIÓN DE TINCIONES BACTERIANAS I. tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química. tratando después éste con el agente fijador. paredes celulares. Después de la fijación. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. etc. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. son suficientes los procedimientos simples de tinción. si se añade el colorante. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. ácidos y alcoholes. Para bacterias. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares. por el contrario. que no es un colorante por sí mismo. la tinción. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales. esporas. cápsulas. Esta sustancia se denomina mordiente. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía. un mordiente habitual es el lugol. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células. proceso llamado fijación. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno. INTRODUCCIÓN: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. tales como flagelos. aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido. hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. la fucsina ácida y el rojo Congo. puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. la fijación por el calor es lo más corriente. el cristal violeta y la safranina. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas. Esos colorantes incluyen la eosina.

Mechero con alcohol . por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china.Lugol (Mordiente) .Azul de Metileno .Alcohol Cetona (Descolorante) . y nuestra coloración simple está lista para observar al microscopio a un aumento de 100x. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriológica extendemos y fijamos la muestra a un portaobjetos. Coloración Simple: Se utiliza un solo colorante.Safranina (Colorante de contraste) En la preparación de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloración simple y las de coloración Gram.Lamina portaobjetos . Luego se agrega el colorante azul de metileno.Asa bacteriológica . Azul Metileno de Loeffler.Muestra de agua con bacterias .Cristal Violeta . que el agua no golpee directamente la muestra y se lave todo. mientras mantenemos un mechero para mantener esterilizado la muestra y los materiales. se lava para quitar el exceso de colorante de modo.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. Azul de lactofenol). MATERIALES Y MÉTODOS . Luego se deja secar.

en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien se despintan. en este proceso unas se fijan con mayor intensidad. Se procede a agregar lugol (mordiente). Por último agregamos safranina (colorante de contraste) que es la que tiñe a las bacterias que no se han fijado en el procedimiento anterior. la extendemos y la fijamos a una lámina portaobjetos con ayuda de un asa bacteriológica. Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul. Luego se lava como se muestra en el dibujo. se deja reposar de 3-5 minutos. se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego observar al microscopio con un aumento de 100x. Se agrega el alcohol cetona (descolorante). ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Coloración Gram: Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. Contamos con nuestra muestra. quien la desarrolló en 1844. las bacterias pueden dividirse en dos grupos. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram. los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico. siempre contando con nuestro mechero para la esterilización. grampositivas y gramnegativas (en este caso. se deja reposar de 3-5 minutos y se lava.

se lava con agua el exceso de lugol) Alcohol-acetona (luego de unos minutos lavar con agua para eliminar el resto de disolvente) Fucsina o Safranina (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión. RESULTADOS Coloración Simple: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una solución colorante (azul de metileno). Coloración gram: ETAPAS EN LA TINCIÓN Pasos Método Gram positivas Gram negativas Colorante Básico Cristal Violeta (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta Mordiente Lugol (pasado unos min. Permanece violeta Permanece violeta Descoloración Permanece violeta Se descolora Contraste Permanece violeta Se tiñe de rosa Observar al microscopio Violeta Rosa ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III.

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Bailey y Scott. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. A. Se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. F. 1999  Forbes. Editorial Médico Panamericana. taxonómicas. 2004 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Diagnóstico Microbiológico. V.Sahm D. etc. después de fijado. Díaz. 11ª Edición. Masson. ¿Cómo debe de ser la descoloración de una muestra? La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas.. y colaboradores. B. que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. diferenciarlas por sus características morfológicas. Barcelona. ¿Qué se hace en la coloración simple? Se cubre el frotis.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 IV. R. Ed. – Weissfeld A. DISCUSIÓN ¿Por qué teñir una muestra? Porque nos permite distinguir a cada una de ellas. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. 2a edición. ¿Se puede agregar un álcali a la solución de azul de metileno de uso? ¿Por qué si? ¿Por qué no? Si se puede agregar un álcali (KOH) como intensificante. S.

alcohol resistentes”. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de agrupaciones. es importante conocer su adecuado manejo. INTRODUCCIÓN: Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano. Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales. y para observarlos es esencial el microscopio. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias “ácido. La tinción diferencial más utilizada es la tinción de Gram.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 OBSERVACIÓN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS I. así como su reacción a diferentes colorantes. lo cual junto con otros criterios. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . permitirá su identificación. MATERIALES Y MÉTODOS  Aceite de inmersión  Microscopio  Muestra de lactobacilos II. Estas técnicas tienen un gran interés en la identificación y clasificación de las bacterias. por lo tanto. las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tinción negativa de cápsulas. morfología y estructura de los microorganismos.

c) Platina. un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. Lo primero en esta práctica fue contar con una muestra (preparada en una lámina portaobjetos). A continuación algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos. III. x100). pueden permanecer unidas unas con otras.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 A continuación damos algunos detalles de un microscopio compuesto. 1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Cuando las células microbianas como los cocos se dividen. se procede a enfocar las láminas con objetivo de 100x y se pone una gotita de aceite de inmersión para visualizar. Sus principales partes son: a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación. Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. en determinados modelos incorpora además. estafilococos y estreptococos. Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . RESULTADOS Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación. crecen individuales y aisladas. En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la preparación). 2) SISTEMA ÓPTICO: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. en la parte inferior se muestra las partes de un microscopio. El primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menos 18 de aumento (x10). formando arreglos característicos. mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40. d) El Macrométrico y el Micrométrico: Ambos permiten enfocar la preparación. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación. con la finalidad de conocer mejor los instrumentos a utilizar. bacilos y de estos algunas agrupaciones como diplococos. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan. b) Brazo: Soporta todo el sistema óptico. el cabezal porta oculares y el revólver porta objetivos. Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable conocer las partes de un microscopio y su manejo. Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo.

BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. Ed.mx/cbi/quimica/microbiologia  http://www. MICROBIOLOGIA APLICADA. Pero también podemos encontrar espirilos y agrupaciones de sarcinas. etc. y colaboradores. Universidad Autónoma Metropolitana.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Forma Agrupación Representación Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical. se separan y conservan su individualidad. DISCUSIÓN ¿Por qué es importante un microscopio en la observación de microorganismos? Porque es la única manera en que las puedes observar a través de un instrumento con lentes de aumento y así identificarlas.uam. Bacilos En forma de bastón IV.htm ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Barcelona. V.edu.unad.azc. R. Diplococo cuando las células hijas se presentan en parejas Coco (esférico) Estreptococo en cadena Cuando las células hijas forman cadenas Estafilococo las células permanecen unidas pero después de una división celular en dos o más planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas. Díaz. www. ¿Qué tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra tomada de un agua contaminada? Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de diplococos. tétradas. 2a edición. Masson. estreptococos y estafilococos.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac t_clasif. 1999  Manual de Laboratorio.

3). Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido. a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta. INTRODUCCIÓN: En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. Para ello existen técnicas de siembra. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado. si se incuba en condiciones adecuadas. 1.En superficie: a). lo que permite su desarrollo y multiplicación. conservación y mantenimiento de los cultivos microbianos. Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja. la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento. se puede sembrar en superficie. en profundidad o en profundidad y superficie. Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. En profundidad y superficie: a). Por puntura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. La punción se realiza en el centro del medio o excéntricamente. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que se requiera. 2. Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte. se punza el fondo. luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.En profundidad: a). elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .. Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros. un tiempo conveniente.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS I..

Este tipo de siembra se utiliza para un aislamiento primario... muestras de: agua estancada y leche contaminada. luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula.. se retira por el mismo lugar y se estría en el pico de flauta. entonces se funde y se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL.1 mL) y se hace la extensión de la muestra. Se deja enfriar nuevamente. 4. 3.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. 2. se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18 mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la muestra como el agar.Por incorporación: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estéril vacía. con esta misma se toma una porción de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI. MATERIALES Y MÉTODOS  Mechero  Placas Petri  Mac Conkey  TSI  CITRATO  LIA  Asa bacteriológica  Muestra de leche contaminada  Espátula o hisopo Técnicas de siembra: 1. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro trabajo se utiliza un mechero. pero esta vez en la placa Petri. LIA y CITRATO). se protege y se rotula. se agrega la muestra (0.Por diseminación: se cuenta con el agar nutritivo solidificado. se necesita una placa Petri con medio de cultivo Mac Conkey. Este tipo de técnica de siembra nos permite estudiar la bioquímica de los microorganismos.Por puntura: se esteriliza el asa bacteriológica. aproximadamente hasta los ¾.Por estría: para la elaboración de esta técnica de siembra se utilizó agar Mac Conkey. Con un asa bacteriológica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos. se funde el agar. se protege la siembra y se rotula.. se protege el material y se rotula. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .

Es muy importante la distribución de las bacterias. los pasos a seguir nos lo demuestran.. El aislamiento. ¿Cuál es la finalidad de siembra por incorporación? La principal función es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo para el recuento bacteriano. C. en cambio.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III.uba. RESULTADOS IV. Masson. ¿Cuál es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra? Todos los tipos de siembra son muy diferentes. BIBLIOGRAFÍA  http://www. V. López-Goñi. DISCUSIÓN ¿Cuál es la finalidad de una siembra? Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. 2005. se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros. S. Díaz. por ejemplo en la técnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con pico de flauta. I. o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. la finalidad de esta inclinación es la utilización de la densidad de las sustancias nutritivas que componen el agar utilizado. Ed.A.htm  Gamazo.microinmuno. Manual práctico de microbiología.ar/SeminarioTinciones. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana)..fcen. ¿Cuál es la finalidad de la técnica de siembra por diseminación? Con este tipo de siembra lo que se obtendrá es la biomasa de los microorganismos cultivados. y R. Barcelona.qb. España ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie.

Se encuentran en todos los ambientes. constituidos por una masa de protoplasma. II. INTRODUCCIÓN: La parasitología es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. algunos poseen estructura relativamente compleja. De estos. viven exclusivamente de modo parasitario. Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados (cestodos). En aguas estancadas (naturales. en su mayoría microscópicos. que suelen provocar inflamaciones de mucosas. otros parásitos y soprofitas. Helmintos: Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados. El termino parásito es aplicado a los protozoos. sistemas de calefacción y refrigeración. Taenia solium. Giardia lamblia. Trichiuris trichiura. Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigación en aguas de consumo y agua utilizada en diferentes actividades. protozoarios como: Entamoeba histolytica. diez son transmitidos por insectos y el resto (Giardia lamblia y Entamoeba histolítica) pueden ser transmitidos por moscas o por el agua. etc. pueden vivir facultativamente en forma parásita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. El phylum protozoarios incluye más de 30 especies que pueden atacar al hombre. cuyo grupo originario está constituido por los turbelarios. MATERIALES Y MÉTODOS  Microscopio  Muestras de agua  Algunas variedades de helmintos  Aceite de inmersión ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS I. Las técnicas de investigación de protozoos parásitos intestinales están basadas en la detección del parásito tras la filtración de volúmenes de agua. etc. piscinas. Protozoarios: Son seres unicelulares.). y Naegleria sp. unos de vida libre. Estos son excretados por las heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a través del agua y suelo. Cryptosporidium spp. doce son patógenos verdaderos. platelmintos y nematelmintos. Enterobius vermicularis.

Estas infecciones pueden ser provocadas por nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascaris lumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura). que también usan para capturar alimentos (a través del proceso llamado fagocitosis). RESULTADOS Protozoarios: Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. y por su movimiento ameboide a base de seudópodos (prolongación del citoplasma). Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre o de los animales. depositan huevos y obtienen nutrición del huésped. que se caracterizan por su forma cambiante. puesto que carecen de pared celular. mansoni. Son células eucariotas. La infección por helmintos es el resultado de la penetración de un gusano al interior del cuerpo donde maduran.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. la tenia y especies que habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S. Helmintos: El término "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan el intestino del ser humano. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Sólo si la infección es masiva se produce (6) : diarrea. Como la mayoría de las enteroparasitosis. La profilaxis consiste en no ingerir agua y principalmente verduras crudas. El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud y se presenta en forma de %átigo%la hembra parasitaria estáenrollada en un extremo en forma de mazo de reloj. de localización intestinal baja (intestino grueso) y ciego. se produce el '1elescopaje" rectal. muco-sanguinolenta. con viviendas precarias. de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Trichuris trichiura: Es un parásito que puede ser considerado cosmopolita. generalmente es asintomática en el adulto. pobreza e ignorancia.  Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo que produce una de las parasitoide mayor difusión en el mundo: la ascariasis. la ascariasis prevalece y es endémica en áreas desprovistas de infraestructura sanitaria. inclusive apreciándose los gusanos adultos adheridos a la mucosa. que debilitan los músculos elevadores del ano. La infección se produce por ingerir las larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses. al igual que el Ascarislumbricoides. Esta enfermedad cursa con una sintomatología muy variable. anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal. y es en el niño donde vemos la más florida signo sintomatología y las complicaciones de esta enfermedad.

DISCUSION La mayor parte de estos helmintos actúan como parásitos por no decir todos.uam. Gerhard. Algunos de ellos causan la muerte o lesiones graves.azc. V. Parasitología.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Fasciola  Huevo de heminolepsis nana IV.mx/cbi/quimica/microbiologia/p24. Editorial sombra.pdf  Villegas. Los citados en la parte inferior tienen síntomas muy variables. Es muy importante su estudio porque le causan daño a los seres humanos. 2005. Madrid. su estudio sería una de las llaves para conocer más acerca de este mundo y prevenir ciertas acciones. Elsi. estos viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan. Guadalajara. 1959 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Mexico.  PIEKKARSKI. Aguilar. Tratado de parasitología. BIBLIOGRAFIA  http://www.