MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESTUDIANTE: Carlos Alberto Casiano Inga

PROFESORA: Dra. Flor García Huamán

CURSO: Microbiología Ambiental

TEMA: Prácticas de Microbiología Ambiental

CHACHAPOYAS 2011

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

2011

MEDIOS DE CULTIVO I. INTRODUCCIÓN: Nos maravilla el conocimiento que hoy tenemos sobre la gran diversidad microbiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia. Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, pero seleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importancia de conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos. Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la cual es difícil aislarlas. Pero debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. La utilización de los medios de cultivo son necesarios para: - Separación y aislamiento de las distintas especies microbiales presentes en una muestra. - Estudio de identificación de un microorganismo problema. - Estudios macroscópicos. Visualizar las características de las colonias en medios sólidos. - Para la conservación de especies microbiales o muestras, etc.

ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA

 Medios Diferenciales: Contiene indicadores de productos derivados de la actividad microbiana.6 y 7.Según su uso:  Medios de enriquecimiento: Son medios líquidos. o por periodos mayores a 12 -15°C. o en forma sólida si se le agrega agar al caldo.. Características de los microorganismos al momento de preparar un medio de cultivo: 1. heterótrofos. con la diferencia de ser sólidos. en cuyo caso se los denomina caldos. En el laboratorio. hornos ni otra fuente de calor o vapor.Según su naturaleza:  Medios naturales o complejos: constituido por sustancias complejas de origen animal o vegetal. con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se prolonga la vida útil de los mismos. según los cuales se clasifica en autótrofos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Clasificación de los medios de cultivo: 1. diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular  Medios Selectivos: Parecidos a los de enriquecimiento.. anaerobios facultativos y microaerófilos... Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado. Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación.Temperatura óptima de Crecimiento: según el rango de temperatura al cual el microorganismo presenta su mayor crecimiento.  Medios definidos o sintéticos: Composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. (nunca por debajo de 0°C porque se destruye la estructura del gel). así como minerales y otras sustancias. 2. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Almacenamiento de los medios de cultivo: Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°). 3.. puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz. 4. Permite revelar características fisiológicas de los microorganismos..2. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves. se los clasifica en sicrófilos. Sin embargo. 2. quimiótrofos (litótrofos u organótrofos) y fotótrofos. mesófilos y termófilos. anaerobios.Rango de pH: El rango óptimo de pH para la mayoría de bacterias oscila entre 6. los medios de cultivo pueden presentarse en forma líquida.Respiratorio: Aerobios.Trófico: requerimientos de carbono y energía.

. o sustancias como las peptonas. 3. tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne. y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos.Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales. La sangre no puede ser esterilizada y debe.).. carne. de levadura. Son extraídos con agua y calor. pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . caseína. provee sustancias nitrogenadas. se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C). En el caso del extracto de carne en polvo o pasta. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo..Agar: Utilizado como agente gelificante. 7. 6. se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja. por tanto. 4. Los microorganismos más comunes son los neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad). Con la excepción de algunos microorganismos marinos.Fluidos Corporales: Sangre completa. sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. etc.Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. 1. previenen una desviación del pH. para dar solidez a los medios de cultivo. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento. de malta.Indicadores de pH: Los indicadores ácido base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. polipéptidos y aminoácidos.. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando y se le agrega agar al 3 %. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Constituyentes habituales de los medio de cultivo: Los siguientes elementos son frecuentemente utilizados en la preparación de los medios de cultivo. etc. 2. por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación.. al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo. nitrógeno y carbono. el agar no es empleado como nutriente. etc. Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos. peptonas.Agua destilada o desionizada: Libre de inhibidores del crecimiento.Extractos: Para su preparación. ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. El componente dominante en el agar es un polisacárido.).. 5. plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. semillas. Por ejemplo: extracto de carne. minerales y vitaminas. carecen de identidad química definida.. gelatina. se utilizan ciertos órganos. mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B. y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. hígado. dependiendo de su grado de pureza. Proveen proteosas.

Placas Petri: Cajas de vidrio de sección circular. azida sódica. sales biliares. transparente e inalterable a los tratamientos. Pipetas graduadas: Para su uso en el laboratorio de microbiología se les coloca un tapón de algodón en el extremo superior. a la concentración adecuada. Se utilizan tubos de diversos tamaños. etc. Existen de diferentes tamaños según su uso.. o que contamine el medio de cultivo al aspirarlo. El vidrio debe ser de buena calidad. por ejemplo: cristal violeta. 8. y para la práctica de Medios de cultivo se utilizaron los siguientes instrumentos: Tubos de ensayo: Destinados a conservar medios de cultivo en pequeños volúmenes. MATERIALES: Además de un ambiente apto para el trabajo microbiológico. o para el desarrollo de microorganismos en medio líquido con agitación o aireación. aunque las más frecuentemente utilizadas tienen 10 cm de diámetro. telurito potásico. actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos..MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Matraz de Erlenmeyer: Utilizado para la preparación de los medios de cultivo. antibióticos. con tapa. neutro.Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. el laboratorio de microbiología requiere de una instrumentación básica de uso corriente en microbiología. con la finalidad de que el operador no aspire los líquidos potencialmente contaminados. Se utiliza para realizar inoculaciones y diluciones.

Gradillas para tubos de prueba: de metal o de madera para portar los tubos de prueba durante el trabajo. Fósforo y Cucharita: para tomar muestras de ciertas sustancias.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Mechero de alcohol: Destinado a proporcionar calor por combustión. Varillas de vidrio: Llamados agitadores o baguetas. Cocinas eléctricas: utilizadas para fundir ciertas sustancias. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Balanza: Diseñados para la determinación de masas de diversas sustancias.

III. MÉTODOS: Empezaré por explicar la preparación del caldo brila. LIA: Citrato: Esta prueba es muy utilizada para la investigación de bacilos Gram -. Estos 16 g de Caldo Brila los vertimos en una fiola. ¿Qué hacemos? Mediante una regla de tres simple calculamos la cantidad de Caldo Brila a utilizar. Haciendo uso de una pipeta adicionamos agua destilada a la misma. Hay que recordar que mientras realizamos todo este trabajo. luego se hace uso de una pipeta para verter la solución a los tubos de ensayo. hacemos uso del calor de un mechero para mantener estéril nuestros instrumentos de trabajo.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TSI: Agar de tres azúcares (lactosa. el cual nos permitirá tener una idea de la elaboración de los otros medios de cultivo que ya lo teníamos preparados en diferentes matraces. aproximadamente hasta la parte superior de un tubo o “campana” Durham que se encuentran dentro de estos. Conkey: Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que varía hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Mc. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. Se deja enfriar por unos minutos. nosotros deseamos utilizar 400 ml de agua. tiosulfato de sodio. de la siguiente manera: Una vez calculada la cantidad requerida de Caldo Brila procedemos a pesarla. para el Caldo Brila utilizar 40 g. Estos microtubos deben de ser llenados. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Con leves movimientos circulatorios diluimos la solución. sacarosa y glucosa) e hierro (citrato férrico).I) Caldo Brila Leer las indicaciones del recipiente de Caldo Brila. para esto se inclina levemente los tubos de ensayos. éste nos permite manejar las cantidades apropiadas. Caldo Brila: Caldo verde brillante. Luego haciendo uso de una cocina eléctrica se calienta la solución hasta que ésta adquiera el color verde (color característico del Caldo Brila). Extracto de levadura: III. con 100 ml de agua.

Una vez que el matraz se encuentra relativamente frío se procede a depositar el TSI en los tubos de ensayo.II) TSI Ahora cogemos el TSI. el cual está contenido en un matraz y se encuentra solidificado. Al cabo de unos minutos se tendrá el TSI líquido. Para fundirlo utilizaremos una cocina eléctrica.1 atm). Se deja enfriar el matraz por unos minutos.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por último se tapan los tubos de ensayo con porciones de algodón para mantener estéril nuestro preparado de Caldo Brila. Colocamos los tubos de ensayo en un depósito forrado con papel blanco. también el mechero con alcohol. Debe tenerse en mente que la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante. Para que esta sustancia se encuentre como está ha tenido que seguir los pasos de la elaboración del Caldo Brila. el depósito contiene algodón en el interior para no causar daños. Se rotula y se coloca en la autoclave (121° x . con la finalidad de que el material no se sobrecaliente y cause prejuicios. se coloca y se retira de la cocina sin dejar de agitarlo levemente. mientras eso se prepara los tubos de ensayo en los cuales se depositará el TSI. Con la ayuda de una pinza se coge el matraz con TSI. Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. III. pero para mantener nuestros materiales esterilizados y mientras se realiza el intercambio de depósito del TSI se hace uso del calor del mechero (calor ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben tomarse en consideración en el proceso de autoclavado.

El procedimiento es el mismo. El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. y se titulan los tubos de ensayo. conociendo su tremenda diversidad. luego se vierte en las placas Petri (1/3). Conkey y extracto de levadura. Una vez que estos se solidifican se colocan en la gradilla. se tapa y se rotula. “Los pasos realizados con el TSI también son aplicados al LIA y al Citrato” También tenemos las siguientes sustancias solidificadas en los matraces con procedimientos de preparación muy parecidos a los del caldo brila: Mc. Conkey y el extracto de levadura. se funde las sustancias Mc. Estos medios de cultivo fueron: Mc. para bacterias que serán analizadas y estudiadas en nuestro proceso de aprendizaje. se esparce de forma uniforme en toda la placa petri. Las diversas sustancias que se utilizan para la elaboración de un medio de cultivo nos permiten predecir el inmenso número de microorganismo que podemos encontrar. Hemos elaborado dos medios de cultivo según su presentación: Medios sólidos en placas Petri: estos ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. se deja enfriar. RESULTADOS: Los procedimientos anteriores nos permiten elaborar medios de cultivo. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Luego de verter el TSI en los tubos de ensayo se colocan con una leve inclinación. IV. Luego raudamente se tapan los tubos de ensayo con algodón de igual forma con el matraz.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 seco-fuego directo). Conkey (color rojizo) y Extracto de Levadura (color marrón). Para la esterilización de los materiales al verter se utiliza el calor del mechero (calor secofuego directo). pero con la única diferencia de que estos serán depositados en placas Petri.

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Medios sólidos en tubos: que corresponden a tubos con agar inclinado y solidificado con el fin de aumentar la superficie donde se va a producir el crecimiento microbiano una vez sembrado. que tenga la consistencia y el pH adecuados. Caldo Brila | Citrato TSI Mc. que sea estéril y que no contenga sustancias inhibidoras. LIA (color purpura claro). Estos fueron los siguientes: TSI (color anaranjado). DISCUSIÓN: ¿Qué es un medio de cultivo? ¿Qué tipos de cultivos se ajustan más a las condiciones naturales? Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentración adecuada. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Citrato (color verde) y Brila (verde brillante). Conkey LIA Extracto de Levadura V. cantidad necesaria de sales y agua.

su composición.. y Villaverde Peris C. 5ª. Pedrique de Aulacio. medios de cultivo y pruebas bioquímicas. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.pdf http://www. Cuadros. Así un medio de cultivo reúne los requisitos de los microorganismos y reproduce el ambiente natural en el que se desarrollan. Las bacterias sulfito-reductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica. Anahí. 2004.microinmuno. 1997: 173. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. VI. Pretice Hall. Ed. Microbiología.htm Difco y BBL. Universidad Central de Venezuela. Manual Práctico de Microbiología Ambiental.uba. 1992. Biología de los Microorganismos. Granados Pérez.qb. sacarosa y glucosa). Martinko G. Washington Square: Lippincott – Raven Publishers.uba.fcen. M. Y continuando con este ejemplo podemos citar que las bacterias cultivadas se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. httpwww. Este medio de cultivo en clases futuras nos permitirá determinar variedad de bacterias. M. elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador.arguia. citrato férrico y tiosulfato de sodio.qb. Facultad de Farmacia. Brock. Parker J. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). 8ª edición. Manual de Métodos Generales (2da edición). 2003. Ana M. ¿Por qué es importante el conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos? Es importante porque nos permite seleccionar el medio de cultivo más adecuado del mismo. junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). edición: 2007. 1998. Editorial Paraninfo. T.fcen. Madigan. etc.203 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Por ejemplo el TSI (Triple Sugar Iron) contiene tres azúcares (lactosa. Clavell. M. Koneman Elmer W. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: Manacorda. y Álvarez.España. con producción o no de gases (CO2 y H2).. Microbiología: Bacteriología. ¿Cuál es el principio del TSI? En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para atacar los hidratos de carbono glucosa. Daniela P.ar/SeminarioMedios... R. L.microinmuno. lactosa y/o sacarosa. Edición.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. proceso llamado fijación. paredes celulares. la fijación por el calor es lo más corriente. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. esporas. por el contrario. la tinción. la fucsina ácida y el rojo Congo. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células. tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. tratando después éste con el agente fijador. Para bacterias. si se añade el colorante.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 PREPARACIÓN DE TINCIONES BACTERIANAS I. tales como flagelos. Esta sustancia se denomina mordiente. un mordiente habitual es el lugol. Esos colorantes incluyen la eosina. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas. cápsulas. que no es un colorante por sí mismo. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. tales como muchas proteínas. etc. hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. son suficientes los procedimientos simples de tinción. y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. ácidos y alcoholes. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente. INTRODUCCIÓN: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente. no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. Después de la fijación. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno. de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales. y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. el cristal violeta y la safranina. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares.

por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china.Lamina portaobjetos .Asa bacteriológica . que el agua no golpee directamente la muestra y se lave todo.Safranina (Colorante de contraste) En la preparación de tinciones bacterianas hemos trabajado las de coloración simple y las de coloración Gram. Cogemos nuestra muestra y con ayuda de un asa bacteriológica extendemos y fijamos la muestra a un portaobjetos.Lugol (Mordiente) . y nuestra coloración simple está lista para observar al microscopio a un aumento de 100x. se lava para quitar el exceso de colorante de modo.Alcohol Cetona (Descolorante) . ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Azul de lactofenol). mientras mantenemos un mechero para mantener esterilizado la muestra y los materiales.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. Luego se agrega el colorante azul de metileno.Muestra de agua con bacterias . Coloración Simple: Se utiliza un solo colorante. Azul Metileno de Loeffler.Azul de Metileno .Cristal Violeta . Luego se deja secar. MATERIALES Y MÉTODOS .Mechero con alcohol .

en este procedimiento las bacterias que no se han fijado bien se despintan. sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). se deja reposar de 3-5 minutos y se lava. se lava y se deja secar a temperatura ambiente para luego observar al microscopio con un aumento de 100x. Se agrega el alcohol cetona (descolorante). Se procede a agregar lugol (mordiente). grampositivas y gramnegativas (en este caso. en este proceso unas se fijan con mayor intensidad. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Se agrega Cristal violeta por lo tanto nuestra muestra se colorea de azul. la extendemos y la fijamos a una lámina portaobjetos con ayuda de un asa bacteriológica. se deja reposar de 3-5 minutos. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram. las bacterias pueden dividirse en dos grupos. Luego se lava como se muestra en el dibujo. Por último agregamos safranina (colorante de contraste) que es la que tiñe a las bacterias que no se han fijado en el procedimiento anterior. los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Coloración Gram: Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. quien la desarrolló en 1844. se deja reposar de 3-5 minutos y se lava nuevamente. Contamos con nuestra muestra. siempre contando con nuestro mechero para la esterilización.

Coloración gram: ETAPAS EN LA TINCIÓN Pasos Método Gram positivas Gram negativas Colorante Básico Cristal Violeta (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta Mordiente Lugol (pasado unos min. Permanece violeta Permanece violeta Descoloración Permanece violeta Se descolora Contraste Permanece violeta Se tiñe de rosa Observar al microscopio Violeta Rosa ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . se lava con agua el exceso de lugol) Alcohol-acetona (luego de unos minutos lavar con agua para eliminar el resto de disolvente) Fucsina o Safranina (luego de unos minutos se lava con agua el exceso de colorante) Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersión. RESULTADOS Coloración Simple: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una solución colorante (azul de metileno).MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III.

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Editorial Médico Panamericana.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 IV. etc. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. 11ª Edición. 1999  Forbes.. que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. B. Diagnóstico Microbiológico. Bailey y Scott. y colaboradores. V. Barcelona. – Weissfeld A. R. Díaz. taxonómicas. 2a edición. Se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. ¿Cómo debe de ser la descoloración de una muestra? La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. después de fijado. A. con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. F. S. DISCUSIÓN ¿Por qué teñir una muestra? Porque nos permite distinguir a cada una de ellas. ¿Qué se hace en la coloración simple? Se cubre el frotis. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 2004 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .Sahm D. ¿Se puede agregar un álcali a la solución de azul de metileno de uso? ¿Por qué si? ¿Por qué no? Si se puede agregar un álcali (KOH) como intensificante. Ed. diferenciarlas por sus características morfológicas. Masson.

permitirá su identificación. las que diferencian estructuras significativas como las esporas o la tinción negativa de cápsulas. lo cual junto con otros criterios. INTRODUCCIÓN: Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano. y para observarlos es esencial el microscopio. morfología y estructura de los microorganismos.alcohol resistentes”. Estas técnicas tienen un gran interés en la identificación y clasificación de las bacterias. El uso de este dispositivo es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de agrupaciones. La tinción diferencial más utilizada es la tinción de Gram.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 OBSERVACIÓN DE LA DIFERENTES FORMAS Y AGRUPACCIONES BACTERIANAS I. MATERIALES Y MÉTODOS  Aceite de inmersión  Microscopio  Muestra de lactobacilos II. Para contrastar o realzar de forma específica distintas características morfológicas o estructurales se emplean tinciones diferenciales. Otras tinciones de gran importancia son las que diferencian bacterias “ácido. así como su reacción a diferentes colorantes. por lo tanto. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . es importante conocer su adecuado manejo.

En él se dispone también un sistema de anclaje de la platina (movimiento de enfocado de la preparación). A continuación algunas de nuestras observaciones como: estructuras de cocos. en determinados modelos incorpora además. 1) SOPORTE: Es la pieza fija en la que sólo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Un microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o más lentes de aumento. RESULTADOS Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son característicos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificación. Es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su observación. mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40. pueden permanecer unidas unas con otras. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 A continuación damos algunos detalles de un microscopio compuesto. estafilococos y estreptococos. Lo primero en esta práctica fue contar con una muestra (preparada en una lámina portaobjetos). Para poder realizar las observaciones y agrupaciones bacterianas es indispensable conocer las partes de un microscopio y su manejo. Los bacilos se dividen únicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden encontrarse células unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. un sistema porta filtros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. Cuando las células microbianas como los cocos se dividen. formando arreglos característicos. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan. b) Brazo: Soporta todo el sistema óptico. 2) SISTEMA ÓPTICO: Está formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. III. crecen individuales y aisladas. c) Platina. en la parte inferior se muestra las partes de un microscopio. Sus principales partes son: a) Base: Normalmente alberga la fuente de iluminación. x100). Un microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema óptico. bacilos y de estos algunas agrupaciones como diplococos. se procede a enfocar las láminas con objetivo de 100x y se pone una gotita de aceite de inmersión para visualizar. el cabezal porta oculares y el revólver porta objetivos. El primero se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con objetivo de menos 18 de aumento (x10). d) El Macrométrico y el Micrométrico: Ambos permiten enfocar la preparación. con la finalidad de conocer mejor los instrumentos a utilizar.

DISCUSIÓN ¿Por qué es importante un microscopio en la observación de microorganismos? Porque es la única manera en que las puedes observar a través de un instrumento con lentes de aumento y así identificarlas. etc. 2a edición. 1999  Manual de Laboratorio.uam. Diplococo cuando las células hijas se presentan en parejas Coco (esférico) Estreptococo en cadena Cuando las células hijas forman cadenas Estafilococo las células permanecen unidas pero después de una división celular en dos o más planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 Forma Agrupación Representación Coco único o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical. tétradas. Díaz. estreptococos y estafilococos.azc. y colaboradores.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/bac t_clasif. MICROBIOLOGIA APLICADA. V. se separan y conservan su individualidad. www. Bacilos En forma de bastón IV. BIBLIOGRAFÍA  Manual Práctico de Microbiología. Masson. Ed.mx/cbi/quimica/microbiologia  http://www. Pero también podemos encontrar espirilos y agrupaciones de sarcinas.edu. R. Universidad Autónoma Metropolitana. Barcelona.htm ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . ¿Qué tipo de formas y agrupaciones bacterianas podemos encontrar en una muestra tomada de un agua contaminada? Para la muestra que hemos tomado encontramos: Cocos y bacilos y agrupaciones de diplococos.unad.

luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . La punción se realiza en el centro del medio o excéntricamente. se puede sembrar en superficie. 1. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependerán del tipo de microorganismo y del período de tiempo de conservación que se requiera. se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.En superficie: a). Sembrar: una bacteria es colocarla en un medio de cultivo. INTRODUCCIÓN: En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. 2. conservación y mantenimiento de los cultivos microbianos. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado. Por Puntura: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja.. Por puntura y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Para ello existen técnicas de siembra.. En profundidad y superficie: a). elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS I. en profundidad o en profundidad y superficie. 3). Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. se punza el fondo. un tiempo conveniente. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las técnicas conocidas como aislamiento. lo que permite su desarrollo y multiplicación. Técnicas para medio sólido: Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido. si se incuba en condiciones adecuadas. la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. Por estría: Introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte. Una técnica esencial en Microbiología es la de obtención de cultivos puros.En profundidad: a).

se funde el agar.Por diseminación: se cuenta con el agar nutritivo solidificado. Se deja enfriar nuevamente. Este tipo de siembra se utiliza para un aislamiento primario.Por incorporación: se agrega 1 mL de muestra en la placa Petri estéril vacía..1 mL) y se hace la extensión de la muestra. se protege y se rotula.. se protege la siembra y se rotula. muestras de: agua estancada y leche contaminada. aproximadamente hasta los ¾. se agrega la muestra (0. se deja enfriar y se agrega sobre la muestra aproximadamente 15 a 18 mL y se realiza movimientos giratorios arriba y abajo para homogenizar tanto la muestra como el agar. 2.Por puntura: se esteriliza el asa bacteriológica.Por estría: para la elaboración de esta técnica de siembra se utilizó agar Mac Conkey.. luego se tapa el tubo de ensayo y se rotula. con esta misma se toma una porción de nuestra muestra a utilizar y se somete en los tubos de ensayo (TSI. No hay que olvidar que para la esterilidad de nuestro trabajo se utiliza un mechero. Este tipo de técnica de siembra nos permite estudiar la bioquímica de los microorganismos. pero esta vez en la placa Petri. MATERIALES Y MÉTODOS  Mechero  Placas Petri  Mac Conkey  TSI  CITRATO  LIA  Asa bacteriológica  Muestra de leche contaminada  Espátula o hisopo Técnicas de siembra: 1. 4. entonces se funde y se agrega en una placa Petri entre unos 15 y 18 mL. se necesita una placa Petri con medio de cultivo Mac Conkey. 3. Con un asa bacteriológica cogemos la muestra a utilizar y la estriamos. se protege el material y se rotula. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA .MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 II. LIA y CITRATO). se retira por el mismo lugar y se estría en el pico de flauta..

los pasos a seguir nos lo demuestran.uba. Masson. se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros. S. 2005. RESULTADOS IV. ¿Cuál es la diferencia entre los diferentes tipos de siembra? Todos los tipos de siembra son muy diferentes.ar/SeminarioTinciones. Ed. I.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. y R. ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie. DISCUSIÓN ¿Cuál es la finalidad de una siembra? Puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. España ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Díaz. por ejemplo en la técnica de siembra por puntura tenemos los tubos de ensayo con pico de flauta. V.. Es muy importante la distribución de las bacterias..A.microinmuno. C. o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioquímicas. la finalidad de esta inclinación es la utilización de la densidad de las sustancias nutritivas que componen el agar utilizado. El aislamiento. en cambio.qb. López-Goñi. ¿Cuál es la finalidad de siembra por incorporación? La principal función es la de homogenizar tanto la muestra como el medio de cultivo para el recuento bacteriano. BIBLIOGRAFÍA  http://www.htm  Gamazo. Barcelona. Manual práctico de microbiología.fcen. La primera se efectúa con cultivos puros (una sola especie bacteriana). ¿Cuál es la finalidad de la técnica de siembra por diseminación? Con este tipo de siembra lo que se obtendrá es la biomasa de los microorganismos cultivados.

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 RECONOCIMIENTO DE PROTOZOARIOS Y HELMINTOS I. viven exclusivamente de modo parasitario.). sistemas de calefacción y refrigeración. doce son patógenos verdaderos. Algunos parasitarios pueden ser objeto de investigación en aguas de consumo y agua utilizada en diferentes actividades. y Naegleria sp. INTRODUCCIÓN: La parasitología es una ciencia que comprende aquellos seres vivos que de manera permanente o temporal viven a expensas de otros organismos. otros parásitos y soprofitas. Giardia lamblia. que suelen provocar inflamaciones de mucosas. etc. Trichiuris trichiura. Cryptosporidium spp. unos de vida libre. Las técnicas de investigación de protozoos parásitos intestinales están basadas en la detección del parásito tras la filtración de volúmenes de agua. En aguas estancadas (naturales. protozoarios como: Entamoeba histolytica. constituidos por una masa de protoplasma. etc. cuyo grupo originario está constituido por los turbelarios. platelmintos y nematelmintos. MATERIALES Y MÉTODOS  Microscopio  Muestras de agua  Algunas variedades de helmintos  Aceite de inmersión ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Se encuentran en todos los ambientes. El termino parásito es aplicado a los protozoos. Enterobius vermicularis. Protozoarios: Son seres unicelulares. pueden vivir facultativamente en forma parásita: Amibas de vida libre como Acanthamoeba sp. diez son transmitidos por insectos y el resto (Giardia lamblia y Entamoeba histolítica) pueden ser transmitidos por moscas o por el agua. en su mayoría microscópicos. Los gusanos chupadores (trematodos) y los acintados (cestodos). Taenia solium. Helmintos: Los platelmintos se caracterizan por ser gusanos aplanados. El phylum protozoarios incluye más de 30 especies que pueden atacar al hombre. piscinas. Y algunos Helmintos como: Ascaris lumbricoides. II. algunos poseen estructura relativamente compleja. De estos. Estos son excretados por las heces de modo que pueden ser transmitidos al hombre a través del agua y suelo.

Helmintos: El término "helminto" se utiliza en referencia a una variedad de gusanos que parasitan el intestino del ser humano. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . puesto que carecen de pared celular. que también usan para capturar alimentos (a través del proceso llamado fagocitosis). depositan huevos y obtienen nutrición del huésped. Estas infecciones pueden ser provocadas por nematodos intestinales presentes en el suelo tales como la lombriz intestinal (Ascaris lumbricoides) el gusano flageliforme (Trichuris trichiura). Las amebas pueden vivir libres en agua o tierra o parasitando el intestino del hombre o de los animales. La infección por helmintos es el resultado de la penetración de un gusano al interior del cuerpo donde maduran. que se caracterizan por su forma cambiante.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011 III. RESULTADOS Protozoarios: Se observaron amebas (Las amebas son protistas unicelulares. la tenia y especies que habitan en el agua como el Schistosomahaematobiumy S. Son células eucariotas. y por su movimiento ameboide a base de seudópodos (prolongación del citoplasma). mansoni.

inclusive apreciándose los gusanos adultos adheridos a la mucosa. Esta enfermedad cursa con una sintomatología muy variable. pobreza e ignorancia. La profilaxis consiste en no ingerir agua y principalmente verduras crudas. de localización intestinal baja (intestino grueso) y ciego. de tal manera que la mucosa rectal protuyehacia fuera.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Trichuris trichiura: Es un parásito que puede ser considerado cosmopolita. y es en el niño donde vemos la más florida signo sintomatología y las complicaciones de esta enfermedad. la ascariasis prevalece y es endémica en áreas desprovistas de infraestructura sanitaria. se produce el '1elescopaje" rectal.  Ascaris Lumbricoides (las lombrices): El Ascaris lumbricoides es un nematodo que produce una de las parasitoide mayor difusión en el mundo: la ascariasis. al igual que el Ascarislumbricoides. Como la mayoría de las enteroparasitosis. ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . con viviendas precarias. La infección se produce por ingerir las larvas contenidas en el huevo y cuyo desarrollo se produce entre 1 a 3 meses. anemia y en casos extremos por el continuo pujo y tenesmo rectal. generalmente es asintomática en el adulto. muco-sanguinolenta. que debilitan los músculos elevadores del ano. Sólo si la infección es masiva se produce (6) : diarrea. El gusano adulto sexualmente maduro mide 5 cinsde longitud y se presenta en forma de %átigo%la hembra parasitaria estáenrollada en un extremo en forma de mazo de reloj.

estos viven parasitando los diversos medios donde se desarrollan.  PIEKKARSKI. BIBLIOGRAFIA  http://www. Algunos de ellos causan la muerte o lesiones graves. su estudio sería una de las llaves para conocer más acerca de este mundo y prevenir ciertas acciones. Madrid. Aguilar. Tratado de parasitología.MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2011  Fasciola  Huevo de heminolepsis nana IV.azc. Gerhard. Guadalajara. Mexico. 2005. Los citados en la parte inferior tienen síntomas muy variables. 1959 ALUMNO: CARLOS ALBERTO CASIANO INGA . Parasitología.mx/cbi/quimica/microbiologia/p24. DISCUSION La mayor parte de estos helmintos actúan como parásitos por no decir todos.uam. Elsi. Editorial sombra. V.pdf  Villegas. Es muy importante su estudio porque le causan daño a los seres humanos.