Objectivo: Separar uma protena das restantes no extracto celular

Estratgia: Existem in meras tcnicas de purificao disponveis. O

procedimento exacto e a ordem dos mtodos a aplicar dependem do tipo de protena
e empregam-se de acordo com as caractersticas da mesma
No Incio de uma Purificao...
Temos clulas animais, de plantas, ou microbianas
Torna-se necessrio:
-Partir as Clulas: Fraccionamento Celular
-Separar o Extracto: Centrifugao
-Obter a Fraco Solvel (onde se encontram as protenas)
Mtodos /
Tcnicas
aplicadas
Suaves Moderados Vigorosos Exemplos
Qumicos
Detergentes
Culturas de
clulas
Bioqumicos
Lise enzimtica
Tecidos Vegetais
Cl. bacterianas
Fungos
Fsicos /
Mecnicos
1 - Choque osmtico
2 - Arrefecimento /
Aquecimento
3 - Potter - Elvjehem
Homogeneizao
por lminas
1 - French - Press
2 - Ultra-sons
3 - Moinho de
esferas
4 - Homogeneizador
de Manton-Gaulin
1 - Lise de clulas
sanguneas e culturas
de clulas
3 - Fgado
Clulas e tecidos
animais e vegetais
Suspenses
celulares e
microorganismos
com parede celular
Exemplos
Dependendo do tipo de tecido ou clula temos :
Alguns exemplos de tcnicas de desintegrao:
Centrifugao Diferencial :
Centrifugao do material a separar a velocidades
crescentes.
1-fraco: Nuclear
2- fraco: Mitocondrial
3- fraco: Microssomal / Sobrenadante
Citoslica
Centrifugao em
Gradiente de Densidade :
(meio suporte em gradiente
de densidade)
Centrifugao de Fluxo Contnuo :
Isopicnca -
Por Zonas de Velocidade -
gradiente de densidade abrange as densidades
das partculas a separar. Amostra adicionada a
gradiente formado ou a formar.
gradiente de densidade
menos denso que partcula
menos densa. Amostra
adicionada no topo de
gradiente formado.
mistura de partculas introduzida continuamente no rotor
em movimento. Partculas slidas depositam-se na
parede do rotor e lquido livre de resduos abandona o
rotor.
Separao pelo Tamanho: Dilise
usada para remover o excesso de sal
ou mudar o tampo de uma protena.
Ateno.
No separa protenas !
Molculas grandes
no atravessam a
membrana
Membrana semipermevel
Molculas pequenas
atravessam
membrana
Princpio da Cromatografia: Separao de molculas baseada
nas suas mobilidades relativas atravs de uma matriz.
diferentes i interac es s com a matriz.
Interac es com base em propriedades fsico/qumicas das protenas
Tamanho Filtrao em Gel
Carga Troca Inica
Hidrofobicidade Interaco Hidrofbica
Especificidade para uma biomolcula Cromatografia de Afinidade
Separao pelo Tamanho: Filtrao em Gel
Esferas da resina com poros
nas quais partculas
pequenas podem entrar e as
grandes no podem entrar.
A coluna
dever
possuir a
distncia
necessria
para uma
boa
separao
Protenas eludas por ordem
decrescente de tamanho
Separao pela Carga: Cromatografia de Troca Inica
pH > pI protena carregada negativamente Protena Desprotonada
pH < pI protena carregada positivamente Protena Protonada
A Matriz da Coluna A Matriz da Coluna (resina)
um polmero contendo grupos ligados carregados
Questes a Colocar antes da Separao por Carga
Qual o Ponto Isoelctrico da Protena ?
Qual o pH do Tamp o ?
Se se pretende agarrar uma protena a uma resina Se se pretende agarrar uma protena a uma resina
de troca de troca inica inica, esta deve possuir sinal contrrio , esta deve possuir sinal contrrio
carga global da protena alvo mas grupos ligados carga global da protena alvo mas grupos ligados - -
contra contra- -ies ies- - do mesmo sinal do mesmo sinal
resinas apresentam cargas positivas e ligam protenas com carga global
negativa.
Protenas eludas da coluna de troca inica por por alterao da
afinidade por:
1 Aumento du Foru Inicu {= uumento du concentruo de i es de um
suI} E: i es Nu
+
competem com os grupos du protenu curregudos
positivumente puru u Iiguo nu resinu
2 AIterundo o pH {provocu u vuriuo du curgu gIobuI du protenu}
resinas apresentam cargas negativas e ligam protenas com carga global
positiva.
Troca Catinica
Troca Aninica
Separao pela Carga: Cromatografia de Troca Inica
Separao pela Carga: Cromatografia de Troca Inica
Protenas buiu ufinidude para a
resina movem-se rupidumente,
atravs da coluna.
Protenas eIevudu ufinidude para a
resina eludas lavando a coluna
com um tumpo de muior foru
inicu ou com um pH ,
Separao por Afinidade: Cromatografia de Afinidade
No tem em conta propriedades fsicas ou qumicas
especificidade biolgica
Permite num spasso purificar uma protena/enzima
de uma mistura complexa.
Princpio da Separao:
Ligando imobilizado na
matriz/resina ao qual se liga a
protena de que o ligando
substrato.
Ligando
Brao
espaador
Matrix
Princpio da Electroforese: Estudo do movimento de partculas
carregadas sob aco de um campo elctrico
Partcula migra na direco do elctrodo de carga oposta
Migrao depende: Carga, Tamanho e forma
Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE)
Condies nativas: Protenu puru?
Condies desnaturantes: MM? sub-unidudes?
sepuruo s peIo tumunho {ruzo curgu/mussu cte} devido uo SDS
utribui curgu gIobuI negutivu constunte
mobilidade molculas
pequenas > molculas
grandes
Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE)
C IcuIo du mussu
moIecuIur
Padres Amostra
Focagem Isoelctrica ou Isoelectrofocagem
Mobilidade de compostos em funo do pH
Carga da protena depende : Ponto isoelctrico (pI), pH meio
pH meio
Abaixo pI Carga +move-se para Ctodo (-)
Acima pI Carga - move-se para nodo (+)
Igual pI Carga global Zero
Separa protenas e determina pI numa s
corrida
Gradiente de pH : anflitos