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BOLETN ESCUELA DE MEDICINA U.C.

, PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

VOL. 33 N1 2008

LA FISIOPATOLOGA DE LA HEMOSTASIA: ALGUNOS ASPECTOS SOBRE LA VIDA Y MUERTE DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACION
Dr. Jaime Pereira G. (1)

RESUMEN En las ltimas dos dcadas se ha progresado notablemente en el conocimiento de la fisiologa de las plaquetas. Esta nueva informacin no solamente ha significado cambiar una serie de paradigmas, sino que tambin ha contribuido a un mejor entendimiento del papel de estas clulas en enfermedades hemorrgicas y trombticas. Entre otros aspectos, han surgido nuevos hallazgos con respecto a los procesos de envejecimiento de las plaquetas en la circulacin y la descripcin de marcadores de edad plaquetaria; mecanismos de remocin desde la circulacin y la demostracin de que las plaquetas experimentan apoptosis durante su envejecimiento en la sangre. En cuanto a su participacin en procesos patolgicos, se describi el papel que juegan en la patogenia de los estados de hipercoagulabilidad adquiridos, como los que se observan en pacientes portadores de lupus eritematoso sistmico y en el uso crnico de cocana. Finalmente, la demostracin de que las plaquetas son capaces de sintetizar y expresar factor tisular funcional, nos lleva a proponer un nuevo modelo de hemostasia basado en clulas. En ste, las plaquetas constituiran el punto de unin entre hemostasia primaria y secundaria y permitiran formular un modelo ms racional para explicar los mecanismos hemostticos en salud y enfermedad.

INTRODUCCIN Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de hemostasia primaria. Adems, aunque las plaquetas carecen de ncleo y podran ser definidas como trozos de citoplasma de los megacariocitos, estas clulas contienen muchos componentes estructurales, metablicos y de sealizacin propios de las clulas nucleadas. Incluso debido a su participacin en diversos procesos fisiolgicos y su accesibilidad, han servido como modelo de estudio en biologa celular. Las plaquetas, que circulan normalmente en forma inactiva, se adhieren a la pared del vaso daado, secretan el contenido de sus grnulos e interactan con otras plaquetas, formando la base del tapn hemosttico. Adems, las plaquetas participan en la activacin del sistema de la coagulacin, proveyendo la superficie sobre la cual se ensamblan los complejos de este sistema (1). A la luz de nuestro trabajo experimental y clnico en torno a la fisiopatologa plaquetaria, en el presente artculo haremos un recorrido por aquellos aportes ms relevantes de nuestro grupo.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACION Las plaquetas humanas despus de ser liberadas por los megacariocitos de la mdula sea, permanecen en la circulacin

durante 8 a 10 das, antes de su remocin por parte de los macrfagos del sistema reticuloendotelial (SRE) (2). Estudios de cintica de plaquetas demostraron que stas son removidas de la sangre en funcin de su edad. Durante su envejecimiento en la circulacin, las plaquetas sufren una serie de cambios fsicos, bioqumicos y funcionales, que determinan en gran parte su heterogeneidad. Este fenmeno fue el primero en ser abordado por nuestro laboratorio, enfocndonos principalmente en aquellos cambios que pudieran constituir marcadores de edad de las plaquetas (35) (figura 1). Una vez demostrado que las plaquetas circulantes envejecen, la siguiente interrogante que surgi fue: Qu determina, en condiciones fisiolgicas, su remocin desde la circulacin al cabo de 8 a 10 das?. Debido a que las plaquetas normales son retiradas de la circulacin en funcin de su edad, era lgico suponer que durante el proceso de envejecimiento se verificaban alteraciones estructurales y/o bioqumicas que finalmente determinaran la remocin al final de su vida til. Con el fin de contestar esta pregunta, iniciamos estudios tendientes a investigar los cambios plaquetarios durante su envejecimiento in vivo que pudieran promover su retiro de la circulacin. En este sentido, la investigacin se enfoc en la prdida de la asimetra de los fosfolpidos de membrana, como un mecanismo fundamental. 5

(1) Profesor Titular, Departamento de Hematologa y Oncologa. Financiamiento: Fondecyt 1971024, 1990131, 1011010, 8010002, DIPUC 2006/10 Correspondencia: jpereira@med.puc.cl Fax: 354 3772

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Figura 1. En A se observa un aumento progresivo en el contenido de serotonina intraplaquetaria (5-HT) luego de esplenectoma efectuada a pacientes portadores de PTI. El panel B muestra el recuento de plaquetas y el contenido de 5-HT determinados secuencialmente despus de la inyeccin de estradiol en perros. En el C, se demuestra que las plaquetas de alta densidad (enriquecidas con plaquetas de mayor edad) expresan signicativamente menor nmero de molculas de HLA, mientras que un antgeno plaquetario especco (PLA1) no cambia.

LA ASIMETRA DE LOS FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA DE LAS PLAQUETAS En las clulas eucariticas, las dos caras de la membrana plasmtica tienen una distinta composicin fosfolpidica; esta distribucin asimtrica se encuentra tambin presente en la membrana plaquetaria. En las plaquetas, los lpidos son primariamente componentes de las membranas y estn integralmente involucrados en actividades biolgicas plaquetarias tales como mantencin de la fluidez de la membrana, produccin de eicosanoides y actividad procoagulante. Los fosfolpidos constituyen cerca del 80% de los lpidos plaquetarios. En las plaquetas humanas se han identificado cinco fosfolpidos mayores: fosfatidilcolina (FC), que constituye alrededor del 38% del total de fosfolpidos, fosfatidiletanolamina (FE) 27%, esfingomielina (EM) 17%, fosfatidilserina (FS) 10% y fosfatidilinositol (FI) 5% (6). Es de inters sealar que en las plaquetas humanas, los lpidos de la membrana plasmtica tienen una distribucin asimtrica: el 93% de la EM y 45% de la FC se encuentran en la mitad externa de la bicapa, mientras que un 80% de la FE y 92% de la FS se encuentran en la mitad interna; siendo imposible descartar que cantidades menores de FS se expresen en la mitad externa de la membrana. Esta distribucin preferencial de los aminofosfolpidos en la capa interna 6

de la membrana se encuentra tambin en los glbulos rojos (7). La asimetra de los fosfolpidos de membrana se mantiene por tres actividades diferentes: Translocasa de aminofosfolpidos. La actividad de translocasa de aminofosfolpidos dependiente de ATP, fue originalmente descrita en glbulos y requiere la accin concertada con otra protena de 32 Kd, como ha sido descrito para transportadores ABC (ATP-Binding Cassette). Esta actividad adems de plaquetas y eritrocitos se ha descrito en varias clulas incluyendo las clulas endoteliales (7). Flopasa dependiente de ATP. Esta actividad tambin fue descubierta en eritrocitos y transporta principalmente colinofosfolpidos (neutros) a la cara externa y en menor medida aminofosfolpidos. Su actividad concertada con aqulla descrita para la translocasa provee a la clula de un efectivo mecanismo que corrige las alteraciones en la distribucin de fosfolpidos, evitando posibles consecuencias patolgicas. Escramblasa de lpidos. La membrana plasmtica dispone de un mecanismo dependiente de Ca++ que rpidamente mueve fosfolpidos hacia adentro y afuera, llevando en minutos a prdida de la asimetra de los fosfolpidos de membrana

(8), la clonacin del gen de la escramblasa, permiti obtener una estructura deducida de la una protena de 37 Kd con un nico segmento de transmembrana (9).

En resumen, la generacin y mantencin de la asimetra de los fosfolpidos de la membrana celular es producto de la accin sincrnica y cooperativa de la aminofosfolpido translocasa y flopasa inspecfica, mientras que la actividad de la escramblasa resulta en su colapso. La prdida de esta distribucin asimtrica de los fosfolpidos se produce por dao celular, activacin o muerte celular programada (apoptosis). Estos mecanismos generales pueden explicar una gran variedad de situaciones en las que se produce prdida en la asimetra de fosfolpidos: eritrocitos y plaquetas almacenadas (10, 11), clulas falciformes (12), clulas sanguneas en diabticos (13), glbulos rojos envejecidos (14) y clulas tumorales indiferenciadas (15). La biognesis y mantencin de la asimetra de fosfolpdos es de gran importancia en la homeostasis del organismo, debido a que la exposicin de fosfolpidos aninicos en la cara externa de las membranas celulares se asocia a dao celular, lo que se traducira en: 1) Aumento de la actividad procoagulante, ya que los fosfolpidos aninicos, en particular FS, proveen sitios

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de unin y ensamblaje de los complejos tenasa y protrombinasa, requeridos para la activacin del factor X y protrombina respectivamente (7); 2) activacin de complemento a travs de la va alterna (16) 3) reconocimiento y remocin de las plaquetas por parte de los macrfagos del SER, que poseen receptores para FS (17, 18). En ese momento propusimos como hiptesis de trabajo que durante el envejecimiento de las plaquetas en la circulacin se producira prdida de la asimetra de los fosofolpidos de membrana, lo que determinara la remocin de las plaquetas de la circulacin.
Figura 2. Recuento de plaquetas y proporcin de plaquetas que expresan fosfatidilserina (FS) determinados secuencialmente despus de la inyeccin de estradiol en perros. El porcentaje de plaquetas que expresan FS a los diferentes tiempos fue determinada mediante citometra de flujo. Los datos representan el promedio error estndar. La exposicin de FS alcanz una diferencia significativa al da 9 cuando se compar con los das 0 y 3 post-inyeccin de estradiol.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACIN SE ASOCIA A PRDIDA DE LA ASIMETRA DE LOS FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA Este fenmeno lo estudiamos en dos tipos de condiciones experimentales 1) en subpoblaciones de plaquetas de diferente densidad, aprovechando el hecho que las plaquetas humanas aumentan de densidad con la edad (3, 4 y 2) en un modelo canino de supresin de la trombopoyesis in vivo (19). Estudios previos haban demostrado que perros expuestos a altas dosis de estradiol desarrollaban trombocitopenia por supresin de la megacariopoyesis; este modelo haba sido caracterizado y validado en el laboratorio, para obtener plaquetas de diferente edad (5). La exposicin de fosfatidilserina (FS) sobre la membrana plaquetaria se demostr mediante citometra de flujo usando anexina V marcada con fluorescena. Utilizando este modelo experimental, demostramos que la expresin de fosfatidilserina aumentaba con la edad de las plaquetas En efecto, la proporcin de plaquetas que expresaban FS sobre la cara externa de la membrana aumentaba significativamente con la edad, desde 3.10.4% antes a 17.712.3%, diez das despus de la exposicin a estradiol (19)

(figura 2). Estos resultados demostraron que el envejecimiento de las plaquetas en la circulacin se asocia a prdida de la asimetra de fosfolpidos, lo cual podra jugar un papel en el reconocimiento y posterior remocin de las plaquetas de la circulacin.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS PLAQUETAS SE ASOCIA A CAMBIOS PROPIOS DE LA APOPTOSIS Como continuacin de esta lnea de investigacin, nos interes conocer los posibles mecanismos de esta prdida de la distribucin asimtrica de fosfolipidos durante el envejecimiento plaquetario in vivo e in vitro. La prdida de la asimetra de fosfolpidos es comn a todas las clulas eucariticas y en muchos sistemas celulares estudiados hasta ahora parece ser el fenmeno universal que acompaa a la muerte celular programada o apoptosis (20). Debido a que inicialmente se dio mucha importancia al ncleo en la ejecucin de la apoptosis, la idea que las plaquetas como clulas anucleadas pudieran

presentar este fenmeno pareca altamente improbable. Sin embargo, experimentos in vitro demostraron que las plaquetas podan experimentar cambios propios de la muerte celular programada (21), en que la mitocondria actuara como ejecutora del proceso. Con el fin de investigar si durante su envejecimiento en la circulacin, las plaquetas sufran apoptosis, utilizamos nuevamente el modelo canino de supresin de la trombopoyesis. Como marcador de apoptosis se determin el colapso del potencial de membrana de la mitocondria (m) (22). El envejecimiento de las plaquetas en la circulacin se acompa de prdida del potencial de membrana mitocondrial y exposicin de FS (figura 3). As, por primera vez se demostraba que la senescencia de las plaquetas se asociaba a cambios propios de la apoptosis, que podran ser determinantes de su remocin desde la circulacin. Esta sugerencia fue confirmada recientemente por Mason y colaboradores(23), quienes demostraron que las plaquetas poseen un programa intrnseco para la apoptosis, centrado en la mitocondria, que controla su supervivencia y determina su permanencia en la circulacin. 7

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especficos puedan ser los responsables de la destruccin de las plaquetas. En un estudio realizado en nuestro laboratorio en pacientes portadores de LES, encontramos una prevalencia de anticuerpos antiplaquetarios especficos de solamente 17%, en contraste con un 44% que presentaba aAFL, cuya presencia se asoci a recuentos de plaquetas significativamente ms bajos (25, 26). En ese mismo estudio, encontramos que era posible absorber/eluir aAFL purificados a/desde plaquetas intactas, sugiriendo exposicin de FL aninicos sobre la membrana de las plaquetas. De acuerdo con estos resultados, planteamos en esa oportunidad que en el LES la prdida de asimetra de los fosfolpidos de membrana podra jugar un papel central en la remocin acelerada de las plaquetas de la circulacin. En esa lnea, postulamos que en el LES las plaquetas experimentaran cambios anlogos a los desarrollados durante su envejecimiento fisiolgico, aunque de mayor intensidad, lo que se traducira en prdida precoz de la distribucin asimtrica de los FL de la membrana. Propusimos esa hiptesis de trabajo sobre la base de estudios que demostraban que en el LES existira una alteracin en los mecanismos de muerte celular programada, tanto en la patogenia de la enfermedad (27) como en la gnesis de algunas de sus manifestaciones (28). Especficamente, se haba encontrado que aAFL obtenidos de pacientes con LES inducan apoptosis en clulas endoteliales, a travs de su interaccin con anexina V (28). Esta actividad inductora de apoptosis en pacientes con LES y la presencia de anexina V en las plaquetas normales (en forma similar a las clulas endoteliales), nos indujo a estudiar este fenmeno en las plaquetas de estos pacientes. Se postul que los eventos procoagulantes y la generacin de aAFL en el LES seran consecuencia del mismo fenmeno fisiopatolgico: exposicin de FL aninicos en distribucin distinta a la encontrada en la bicapa normal. En este

Figura 3. En A se observa el colapso del potencial de transmembrana mitocondrial (m) durante la cada del recuento de plaquetas despus de la supresin de la trombopoyesis en perros. m fue determinado por incubacin de las plaquetas con DIOC6 y analizadas mediante citometra de flujo. La intensidad media de fluorescencia (MFI) se presenta como el promedio error estndar de 11 determinaciones. Se observ una cada significativa de la MFI al da 8 despus de la inyeccin de estradiol *p<0.05. En B, se muestra el colapso de m determinado por la incubacin de las plaquetas con JC-1 y medicin de la fluorescencia en canales FL1 y FL2 del citmetro de flujo. Los resultados se expresan como la razn FL1/FL2. Los datos representan el promedio error estndar (n:13). El aumento en la razn FL1/FL2 es estadsticamente significativa al da 8 post-inyeccin de estradiol, comparada con los das 0, 3 y 5 *p<0.05.

Esta nueva informacin sobre los fenmenos que participaban en la remocin fisiolgica de las plaquetas de la circulacin, especialmente la prdida de la asimetra de fosfolpidos, nos movi a relacionarlos con fenmenos patolgicos, en los cuales las plaquetas son removidas prematuramente de la circulacin. En este sentido, consideramos que en la fisiopatologa de la trombocitopenia encontrada en algunas enfermedades, se haban descrito elementos y mecanismos propios de aquellos que participan en la remocin fisiolgica de las plaquetas. 8

LA REMOCIN PATOLGICA DE LAS PLAQUETAS EN EL LES En el lupus eritematoso sistmico (LES), la trombocitopenia es una complicacin que se presenta en alrededor del 30% de los pacientes (24). En la mayora de los casos se asocia a un aumento de la IgG asociada a las plaquetas (PAIgG), lo cual ha sugerido que la destruccin plaquetaria sera de tipo inmune. Debido a que el LES es una enfermedad autoinmune caracterizada por la existencia de mltiples autoanticuerpos, es posible que autoanticuerpos plaquetarios

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Tabla 1. Marcadores de apoptosis en plaquetas de pacientes portadores de lupus eritematoso sistmico (LES).

Palquetas Anexina V (+) (%) 6.2 + 1.7 2.7 + 0.6 1.9 + 0.3 < 0.03

MP (nM FS)*

(FL1/FL2)

LES activo LES inactivo Controles 30 p ***

16 14 30

0.48 + 0.13 0.23 + 0.06 0.19 + 0.04 < 0.02

1.1+ 0.2 0.9 + 0.2 0.96 + 0.1 < 0.05

los pacientes (figura 5) y se correlacionaba en forma directa con las MPs circulantes (figura 6). El aumento en el nmero de MPs derivadas de plaquetas y su asociacin con un aumento del ETP, sugieren que estas MPs pueden jugar un papel importante en el estado protrombtico en esta patologa (44). De acuerdo a los resultados anteriores, parece evidente que las alteraciones plaquetarias en los pacientes con LES no se asocian a trombocitopenia sino ms bien a un estado de hipercoagulabilidad adquirido. En este sentido, es importante considerar que los pacientes portadores de LES muestran un riesgo aumentado de presentar trombosis venosas y arteriales (45). Con respecto a las trombosis arteriales, los pacientes con LES tienen mayor predisposicin para desarrollar arterioesclerosis acelerada y

*Micropartculas cuantificadas en plasma mediante actividad procoagulante **Prdida de potencial de transmembrana mitocondrial determionado por citometra de flujo *** Diferencia entre LES activos y controlespor analisis de variango

sentido, una de las alteraciones celulares que es propia de la apoptosis y que ha sido demostrada en plaquetas, es la generacin de micropartculas desde la membrana, probablemente por escisin proteoltica de protenas del citoesqueleto (21). En las plaquetas circulantes de pacientes con LES activo, se demostr cambios propios de la apoptosis tales como prdida de la asimetra de FL, colapso del potencial de membrana de la mitocondria y aumento en la generacin de micropartculas (MPs) (29) (Tabla 1). La prdida de asimetra de FL y la generacin de MPs son fenmenos caractersticos de las clulas que experimentan apoptosis; sin embargo, en las plaquetas tambin pueden presentarse como consecuencia de la activacin inducida por distintos agonistas (30). Estas MPs expresan FL cargados negativamente, los cuales proveen una superficie procoagulante para el ensamblaje de los complejos enzimticos de la coagulacin (31, 32); adems, existen datos recientes que identifican a las MPs como fuente de factor tisular (FT) funcionalmente activo, el principal iniciador de la coagulacin in vivo (33, 34). Desde un punto de vista clnico, las MPs constituyen marcadores patognicos,

ya que varias condiciones protrombticas estn asociadas a un aumento en el nmero de MPs circulantes (35-38). En el LES y otras enfermedades del tejido conectivo se ha descrito circulacin de plaquetas activadas y aumento en el nmero de MPs (39-43). Debido a que la mayora de los estudios incluy pacientes con sndrome antifosfolpidos primario o secundario, y con el fin de excluir el efecto de los anticuerpos antifosfolpidos sobre el estado procoagulante, investigamos en pacientes portadores de LES el nmero y caractersticas antignicas de las MPs circulantes y su capacidad para aumentar la generacin de trombina (44). Se cuantific el nmero y origen celular de los MPs circulantes y tambin la generacin de trombina (GT) del plasma, medida como el Potencial Endgeno de Trombina (ETP), sin la adicin de FL o factor tisular; bajo estas condiciones, la GT depende directamente del nmero de MPs presentes en el plasma de los pacientes. En la figura 4 se muestran los resultados de la cuantificacin de MPs en pacientes y controles. Con respecto al origen celular de las MPs, encontramos que el 76% se originaba en las plaquetas. El ETP fue significativamente mayor en

Figura 4. Enumeracin mediante citometria de flujo de las micropartculas circulantes (MP) en pacientes con LES inactivo o activo (MEXSLEDAI >0). La enumeracin de las MP totales (A) fue realizada usando anexina V-FITC; las MP derivadas de plaquetas (B) se cuantificaron usando doble marca con anexina V-FITC y antiCD61-PE. Las lneas horizontales muestran la mediana; los cuadrados los rangos intercuartiles y las lneas verticales los valores altos y bajos. Las diferencias entre los grupos se analizaron mediante la prueba de Kruskall-Wallis.

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Figura 5. Potencial endgeno de trombina (ETP) en pacientes con LES y controles. La generacin de trombina se inici sin la adicin exgena de fosfolpidos ni factor tisular. La diferencia entre pacientes y controles se analiz con prueba de t de Mann Whitney.

embargo, los mecanismos que participan en el desarrollo de ateroesclerosis prematura en los pacientes con LES, son mayormente desconocidos. En la sangre de pacientes aterosclerticos con angina inestable o enfermedad coronaria, se han detectado plaquetas activadas (49, 50), sugiriendo que la activacin de las plaquetas podra participar en la aterotrombosis. En efecto, se ha demostrado que la infusin de plaquetas activadas exacerba la formacin de lesiones ateroesclerticas en ratones deficientes en apolipoprotena E (51), los cuales desarrollan lesiones AE prematuras secundarias a la dislipidemia. Estas observaciones establecieron las bases para una serie de investigaciones, especialmente in vitro y en modelos animales, que demostraran el papel que juegan las plaquetas en la gnesis y progresin de la aterosclerosis.

dependiente de la glicoprotena (GP) IIb/ IIIa, utilizando como protenas puente el fibringeno, fibronectina y FvW (54). Evidencia adicional ha mostrado tambin la participacin de receptores de las clulas endoteliales tales como ICAM-1 y v3. Estudios in vivo demuestran que bajo condiciones de fuerza de cizalla alta, las plaquetas son capaces de adherirse al endotelio intacto en un proceso que comprende varias etapas. El contacto inicial laxo entre las plaquetas y las clulas endoteliales est mediado por selectinas presentes en ambas clulas. La P-selectina es rpidamente expresada por las CE frente a una variedad de estmulos. El contrarreceptor de la P-selectina en las plaquetas sera la glicoproteina GPIb-VIX, que posteriormente se complementa con la PSGL-1. La unin definitiva de las plaquetas al endotelio se completa por la interaccin entre protenas adhesivas (por ej., fibringeno) y la GPIIb/IIIa (Figura 7).

EL PAPEL DE LAS PLAQUETAS EN LA ATEROESCLEROSIS Aparte de sus conocidas funciones en los procesos de hemostasia y trombosis, las plaquetas participan directamente en la patogenia de la aterosclerosis y representan un punto de unin entre inflamacin y aterognesis (52, 53).

LAS PLAQUETAS UNIDAS AL ENDOTELIO ESTIMULAN LA INFLAMACIN Durante el proceso de adhesin, las plaquetas se activan y liberan numerosas sustancias proinflamatorias y mitognicas al micromedioambiente local. Entre las ms importantes se destaca a las protenas adhesivas (fibringeno, FvW, trombospondina, P-selectina); factores de crecimiento (PDGF, TGF-, EGF); quimioquinas (RANTES, FP4); citoquinas (IL-1, CD40L, -tromboglobulina) y factores de la coagulacin (Factor V Factor , XI, PAI) (55). La accin concertada y regulada de todas estas protenas promueve una serie de funciones biolgicas tales como adhesin celular, quimiotaxis, proliferacin celular, coagulacin y proteolisis. La IL1- y el marcador CD40L sobre la superficie de las plaquetas han demostrado ser potentes activadores de las clulas endoteliales, promoviendo la expresin de molculas de adhesin (ICAM-1, v3) y la secrecin

Figura 6. Correlacin entre la capacidad de generar trombina del plasma libre de plaquetas y las MP totales (A) y aqullas derivadas de plaquetas (B). El anlisis se hizo mediante prueba de correlacin por intervalos segn Spearman.

LA ADHESIN DE LAS PLAQUETAS AL ENDOTELIO Evidencia reciente ha demostrado que la denudacin endotelial no es un requisito nico para permitir la unin de las plaquetas a la pared arterial. El endotelio previene la reactividad de las plaquetas a travs de mecanismos de inhibicin tales como la liberacin de prostaciclina, xido ntrico (NO) y expresin de una ectoADPasa (CD39). Sin embargo, las clulas endoteliales daadas y/o activadas son adhesivas para las plaquetas. Estudios in vitro han demostrado que la unin de las plaquetas al endotelio activado es

enfermedad cardiovascular prematura (45, 46). De hecho, en estos pacientes el riesgo de presentar infarto de miocardio es 50 veces mayor que una poblacin pareada por edad y sexo (47); este mayor riesgo es slo parcialmente explicado por factores de riesgo clsicos como hipertensin, dislipidemia y diabetes (48). El LES es una enfermedad inflamatoria crnica y la inflamacin actualmente se considera que juega un papel fundamental en la patogenia de la ateroesclerosis. Sin 10

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Figura 7. Adhesin de las plaquetas al endotelio. Las clulas endoteliales activadas expresan p-selectina que constituye un ligando para la GPIb y su receptor (PSGL-1) presentes sobre la superficie de las plaquetas. La interaccin inicial es posteriormente reforzada en las plaquetas activadas por la participacin de las integrinas (GPIIb/IIIa y v3).

de MCP-1, que juega un papel clave en el reclutamiento de monocitos. La accin conjunta de las quimioquinas liberadas por las plaquetas, la presencia de plaquetas activadas y la expresin de molculas de adhesin sobre las clulas endoteliales, se traduce finalmente en reclutamiento de neutrfilos y monocitos sobre la superficie endotelial, uno de los fenmenos claves en la iniciacin del proceso ateroesclertico (55). De acuerdo con las observaciones anteriores, parece evidente que las plaquetas son cruciales en la iniciacin, desarrollo y extensin total de las lesiones ateroesclerticas. Sin embargo, gran parte de la evidencia disponible proviene de estudios in vitro o en modelos animales. En este sentido, fue importante encontrar un modelo humano en el que exista dao vascular y ateroesclerosis acelerada, en ausencia de factores de riesgo clsico: es la situacin que se observa en los usuarios de cocana.

defectos regionales de perfusin cerebral. La patogenia de las lesiones vasculares isqumicas asociadas al uso crnico de cocana no se ha dilucidado completamente, existiendo varios mecanismos posibles, entre los que destacan: 1) vasoconstriccin 2) aumento del consumo de oxgeno y 3) trombognesis. Los efectos sobre el tono vasomotor se relacionan a las propiedades simpaticomimticas de la cocana; sin embargo, varios estudios concluyen que este efecto no explica completamente la isquemia cerebral y cardaca. En este sentido, existe evidencia que muestra que la activacin de la hemostasia y la trombognesis asociada participan en la patogenia de estas complicaciones. La demostracin de activacin de las plaquetas y la evidencia morfolgica de formacin de trombos arteriales, apoyan el concepto de que en el abuso de cocana una activacin del sistema hemosttico, especialmente de sus componentes celulares, juega un papel importante en la isquemia inducida por esta droga. Prcticamente todos estos trabajos estudiaron los efectos de la exposicin in vitro de plaquetas a la droga o a infusin e.v. aguda en voluntarios sanos y no se haba abordado el sistema hemosttico en forma global, considerando sus elementos

celulares, humorales y la interaccin entre ellos. En esta lnea, en el modelo celular actual de hemostasia se establece que la activacin de las plaquetas y la coagulacin sangunea son procesos interactivos y dependientes, que determinan en conjunto la generacin de trombina.

LA TROMBOGNESIS Y ATEROSCLEROSIS ACELERADA ASOCIADAS AL USO DE COCANA Diferentes estudios y casos reportados han demostrado claramente un aumento en la formacin de trombos arteriales en usuarios de cocana (56-58); sin embargo, los estudios in vitro e in vivo sobre sus mecanismos han entregado resultados controvertidos (56, 59-61, 62-64). Minor y cols. (56) en un estudio en pacientes con infarto agudo del miocardio asociado al uso de cocana, encontraron que un 38% presentaba coronarias sanas, pero en alrededor del 80% haba evidencia angiogrfica de trombos intracoronarios. A continuacin, se discute la evidencia disponible en cuanto al efecto de la cocana sobre las plaquetas y los vasos sanguneos, que permite sostener un papel patognico de la activacin del sistema hemosttico en la aterotrombosis inducida por cocana. 11

EL USO DE COCANA Y DAO VASCULAR Los usuarios crnicos de cocana tienen un riesgo aumentado de presentar infarto de miocardio, angina, muerte sbita, y accidentes cerebrovasculares, as como

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EL EFECTO DE LA COCANA SOBRE LAS PLAQUETAS Uno de los primeros estudios que abord el problema fue el de Eichhorn y cols. (64) que demostr que segmentos de aorta de conejo expuestos in vitro a cocana presentaban aumento en la produccin de tromboxano A2, el cual es un potente agregante plaquetario. La incubacin directa de las plaquetas in vitro con cocana ha mostrado resultados muy variados. Se ha encontrado aumento significativo de la respuesta plaquetaria a cido araquidnico (62), ausencia de efecto significativo sobre su funcin o incluso, inhibicin de la agregacin a diferentes concentraciones de ADP y cido araquidnico (59). La expresin de p-selectina (CD62-P), protena integral de la membrana de los grnulos alfa que se trasloca a la superficie en las plaquetas activadas, se ha utilizado ms recientemente como marcador del efecto de la cocana sobre las plaquetas. Rinder y cols. (61) estudiando voluntarios sanos, demostraron que slo la exposicin crnica -pero no la aguda- a cocana aumentaba significativamente la expresin de p-selectina sobre la membrana plaquetaria. Usando una aproximacin experimental similar, Kugelmass (60) demostr que la incubacin in vitro de

plaquetas lavadas con cocana aumentaba la expresin de p-selectina, el cual no era inhibible por aspirina. Ms recientemente, Heesch (65) usando un modelo de administracin aguda de cocana en voluntarios sanos, observ un aumento en la expresin de p-selectina, aumento en la liberacin de factor plaquetario 4 y tromboglobulina (protenas de grnulos ) y presencia de microagregados de plaquetas en la circulacin. En esta misma lnea, Siegel report un aumento en el nmero de eritrocitos y del factor von Willebrand despus de exposicin a una dosis nica de cocana en usuarios crnicos (66). Zurbano en un modelo en cerdos, demostr que la exposicin aguda a cocana se asociaba a un aumento significativo de la interaccin de las plaquetas con estructuras subendoteliales (67). Algunos estudios que sugieren que la cocana, bajo ciertas condiciones, puede afectar la funcin de las plaquetas en forma negativa. En este sentido, Jennings observ que la cocana produca una inhibicin de la agregacin plaquetaria inducida por araquidonato, ADP y colgeno, (68); un efecto similar fue reportado por Heesch (65). Por lo tanto, usando diferentes modelos experimentales y formas de exposicin a la droga, es evidente que la cocana se

asocia a una activacin de las plaquetas, especialmente en los estudios de administracin a droga in vivo. Debido a la falta de informacin sobre el estado de activacin de las plaquetas en usuarios crnicos de cocana, sus mecanismos de produccin y especialmente su relacin con los otros componentes del sistema hemosttico, se inici en nuestro laboratorio un estudio con el fin de abordar estos objetivos. En usuarios crnicos de cocana se observ un aumento en el nmero de micropartculas circulantes, de los agregados monocitoplaquetas y de la expresin de p-selectina plaquetaria (figura 8) (69, 70). El aumento en la expresin de estos tres marcadores demuestra activacin de las plaquetas in vivo, lo cual podra jugar un papel en el dao vascular prematuro observado en usuarios de cocana. Por otra parte, la presencia de plaquetas activadas en la circulacin no solamente puede ser importante en la generacin y progresin del dao vascular sino tambin en la generacin de un estado protrombtico (figura 9). Esta condicin de hipercoagulabilidad es clave en la patogenia de las complicaciones vasculares propias de estos pacientes, tales como infarto de miocardio o defectos de perfusin cerebral

Figura 8. En los pacientes usuarios de cocana se encontr una activacin significativa de las plaquetas circulantes, evidenciada por un aumento de los agregados monocito-plaquetas (A) y de la p-selectina de superficie (B). Las determinaciones se hicieron mediante citometra de flujo de sangre perifrica de los pacientes y controles.

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Figura 9. Generacin de trombina (ETP) (A) y correlacin con el nmero de MP circulantes (B) en usuarios crnicos de cocana. La generacin de trombina se inici sin la adicin exgena de fosfolpidos ni factor tisular.

(70). La actividad procoagulante de las plaquetas ha cobrado gran importancia en el ltimo tiempo, especialmente a la luz del nuevo modelo de la hemostasia basado en clulas (71).

LA SNTESIS Y EXPRESIN DEL FACTOR TISULAR (FT) EN PLAQUETAS ACTIVADAS La funcin mejor conocida del FT es la de iniciacin de la coagulacin. El FT une factor VII/VIIa y el complejo FT-VIIa activa los factores X y IX. El FT expresa su actividad procoagulante mxima cuando est incorporado a membrana fosfolipdicas. La presencia de FT circulante funcional ha sido motivo de mucha controversia. Algunos autores consideran que el FT circulante es insuficiente para generar un tapn hemosttico oportunamente y que la coagulacin debe ser gatillada por el FT de la pared vascular (88). Sin embargo, varios estudios han descrito la existencia de un FT circulante asociado a clulas o micropartculas, capaz de iniciar la coagulacin sangunea (89-93). Los monocitos constituyen una fuente mayor de FT, demostrado en experimentos de activacin con lipopolisacrido y por el papel que juegan en la patogenia de la coagulacin intravascular en la sepsis. (94, 95). Las plaquetas aparentemente exportan FT preformado desde los grnulos alfa a la membrana plasmtica (96). El origen y funcionalidad del FT no est por completo dilucidado, existiendo reportes que muestran que es transferido a las plaquetas

por micropartculas de monocitos (97), en contraste con otros que muestran que el FT es transferido por las plaquetas a los monocitos (98). En resumen, el origen y localizacin del FT circulante ha sido origen de controversia. Al estudiar el defecto hemosttico en la uremia, observamos que las plaquetas humanas expresaban FT y que ste pareca ser funcionalmente activo. De ser esto cierto, el modelo actual de la hemostasia celular debera necesariamente ser redefinido. De acuerdo con esto, se disearon estudios con el fin de probar la hiptesis que las plaquetas humanas sintetizan FT de novo. Primero, se detect mARN de FT en las plaquetas humanas, el cual aument despus de activarlas, lo que confirm dos observaciones recientes (85, 99),(Figura 10). Este fenmeno se ha explicado por la existencia de pre-mARN que sujeto a seales tipo afuera-adentro se transforma en mARN maduro (100). Las plaquetas en reposo exhiben una actividad procoagulante muy baja, la cual aumenta alrededor de 3 veces despus de la activacin, lo que demuestra que este FT es funcional. (Figura 10). Con la marcacin metablica de las plaquetas con 35Smetionina se observ que la activacin de 13

LA RELACIN DE LAS PLAQUETAS CON EL SISTEMA DE LA COAGULACIN: UN NUEVO MODELO DE HEMOSTASIA CELULAR La activacin de las plaquetas y la coagulacin sangunea son dos procesos interactivos y mutuamente dependientes, que determinan en conjunto la generacin de trombina (72). La conexin entre las plaquetas y el sistema de la coagulacin es multifactica y necesaria para lograr una formacin eficiente del trombo. Basado en el anlisis de reacciones individuales en cascada de la coagulacin, se ha estimado que las plaquetas aceleran la generacin de trombina en 5 a 6 rdenes de magnitud (73, 74). De los mltiples mecanismos propuestos para explicar el efecto de las plaquetas en la formacin de trombina (75-82), analizaremos en mayor detalle el posible papel de la sntesis y expresin de factor tisular por parte de las plaquetas activadas (83-87).

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Figura 10. mARN de factor tisular en plaquetas humanas. RNA de plaquetas se extrajo antes y despus de estimular con 5M de TRAP por 15 minutos. En A, amplificacin de los transcritos de RNA en plaquetas. En este experimento se detect mRNA de FT slo despus de la estimulacin de las plaquetas (lnea 6). En B se muestra la actividad procoagulante de las plaquetas (PCA) despus de la estimulacin con TRAP. Las plaquetas en reposo y activadas, se incubaron con FX y FVIIa, la generacin de FXa se determin mediante sustrato cromognico. Se observa ausencia de efecto de la puromicina (inhibidor de la traduccin).

las plaquetas se acompa de sntesis de novo de factor tisular (figura 11). La sntesis de protenas por las plaquetas anucleadas fue sugerida desde hace dos dcadas (101), pero slo recientemente se document la sntesis de novo de Bcl-3, interleuquina-1 y PAI-1 (102-104).

Figura 11. Plaquetas con o sin pretratamiento con puromicina se incubaron con [35S]-metionina, y se activaron con TRAP. Las membranas de las plaquetas se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-FT policlonal. Se observa un aumento significativo de la banda de FT despus de activar las plaquetas (lnea 3), la cual es reducida por la puromicina (lnea 4).

El paradigma actual del sistema hemosttico basado en clulas asigna a las plaquetas un papel central en el ensamblaje 14

de los complejos de la coagulacin sobre su membrana, pero le demanda una fuente adicional de FT tisular para gatillar las reacciones (81). Las plaquetas humanas, como clulas sintetizadoras de FT, podran constituir estas clulas portadoras de FT asegurando la localizacin del FT en el lugar correcto y en el momento apropiado. Esta exposicin rpida, localizacin espacial precisa y depsito progresivo y ordenado de FT sobre la membrana plaquetaria, configura un modelo ms racional para explicar los mecanismos hemostticos en salud y enfermedad (figura 12). Este concepto resalta el papel nico de las plaquetas para unificar la hemostasia primaria y secundaria, enfatizando la autosuficiencia de los componentes intravasculares para satisfacer todas las necesidades hemostticas (87). Por otra parte, esta nueva concepcin de la hemostasia podra ampliar las posibilidades de estudio en enfermedades hemorrgicas y trombticas, en las que en alrededor del 50% de los casos no es posible demostrar alteraciones de laboratorio con las pruebas actualmente disponibles (105).

AGRADECIMIENTOS A Diego Mezzano, mentor, colaborador y amigo, que me contagi su vocacin por la investigacin. A los estudiantes Ivn Palomo, Mnica Soto, Lindi Marie Cotzee y Gino Alfaro que con sus trabajos de tesis generaron muchos de los datos mostrados. A Isabel Pizarro, Patricia Hidalgo, Eduardo Aranda, bioqumicos y tecnlogos mdicos del Laboratorio de Hemostasia.

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Figura 12. Nuevo modelo de la hemostasia basado en clulas. Se propone que la TF bearing cell presente en el subendotelio es fundamental en el inicio de la hemostasia. Sin embargo, el crecimiento y progresin del proceso hemosttico, depende de la expresin de FT sobre la superficie de las plaquetas activadas. De esta forma, el proceso modulado en la generacin de trombina y el depsito de fibrina sobre la membrana plaquetaria, semejante a la accin de cemento sobre los ladrillos, podra construir un tapn hemosttico o un trombo.

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LA FISIOPATOLOGA DE LA HEMOSTASIA: ALGUNOS ASPECTOS SOBRE LA VIDA Y LA MUERTE DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACIN - DR. JAIME PEREIRA G.

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