UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE AGRONOMA LABORATORIOS PRACTICA N2 Profesor INTRODUCCIN Esta tincin es una prueba de diagnstico para

diferenciar bacterias dentro de dos grupos: Gram,-positivas y Gramnegativas. Las bacterias Gram-positivas retienen el colorante primario, dando una apariencia prpura a azul-negro. Las bacterias Gram-negativas toman el color de la contra-tincin. MATERIALES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Portaobjetos Violeta de Gram Lugol de Gram Alcohol de Gram Fucsina de Gram Asa bacteriolgica Agua destilada esterilizada Mechero Esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo Con ayuda del asa bacteriolgica, se coloca una gota de agua destilada en cada extremo del portaobjetos previamente limpiado con alcohol al 70% Acercando ligeramente la caja de petri al mechero se toma una pequea cantidad de la colonia bacteriana con ayuda del asa esterilizada Se mezcla esta bacteria con cada gota de agua extendindola en forma circular Se pasa el portaobjetos 4 o ms veces a travs de la flama (hasta que el agua se seque) para fijar la bacteria al portaobjetos Despus del enfriamiento, cubra el portaobjetos durante 60 segundos con una solucin acuosa de cristal violeta Lavar con agua destilada y escurrir Cubrir con lugol de Gram por 60 segundos Lavar con agua destilada y escurrir MICROBIOLOGA TINCIN DE GRAM Jairo L. Cuervo Andrade

PROCEDIMIENTO

10. Decolorar con alcohol de Gram por 20 segundos 11. Lavar con agua destilada y escurrir 12. Contrateir con fucsina de Gram durante 60 segundos 13. Lavar con agua destilada 14. Escurrir el exceso de agua y observar al microscopio compuesto con el objetivo de inmersin. Gram positivas (+) toman un color violeta oscuro Gram negativas (-) toman un color rojo claro

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

PRACTICA Tomar muestras de dos colonias de bacterias y realizar la tincin de Gram por medio de dos extendidos por colonia CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Haga una breve ficha de seguridad de cada uno de los reactivos empleados en la tincin de Gram, en la cual se incluyan; su descripcin general, las propiedades fsicas y qumicas de los reactivos, equipos de proteccin personal, riesgo de reactividad, disposicin de residuos e identificacin de riesgos. Explique a nivel celular el fundamento de la coloracin de Gram y qu papel desempea cada reactivo en mencionado procedimiento. Cul es la importancia de la prueba tincin de Gram en clnica de plantas? Qu otras tcnicas de tincin se utilizan en microbiologa y cul es su aplicabilidad? METODO ALTERNATIVO TEST DE KOH Otra alternativa de fcil realizacin para diferenciar entre microorganismos Gram negativos y Gram positivos es el denominado test del KOH, descrito por Gregersen 1978), Halebian y col. (1981) y Bourgault y col. (1988). Este mtodo est basado en la rotura de la pared celular de las bacterias al ponerlas en contacto con soluciones alcalinas diluidas. Una suspensin de clulas bacterianas en KOH al 3% toma un aspecto viscoso debido a la liberacin del DNA cuando se trata de una bacteria Gram negativa. Sin embargo, Blachmann y col. (1980) y Bourgault y col. (1988) demostraron que el mtodo del KOH no tiene una correlacin muy precisa con la tincin de Gram1. MATERIALES Portaobjetos Asa bacteriolgica KOH 3%

METODOLOGIA 1. 2. 4. 5. Esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo Poner una gota de KOH al 3% Mezclar el KOH con la muestra bacteriana Levantar el asa levemente del portaobjetos

3. Con ayuda del asa tomar una pequea muestra de la colonia bacteriana

6. Observar si se forma o no un hilo viscoso entre el asa y el portaobjetos. BIBLIOGRAFA 1. Estudio taxonmico polifsico de bacterias procedentes de ambientes antrticos: descripcin de cuatro nuevas especies. http://www.tesisenxarxa.net/TDX/TDX_UB/TESIS/AVAILABLE/TDX-0511105112609//4.METODOLOG%CDA.pdf. -Salgado M. T. 2007. Manual de laboratorio microbiologa general. Universidad de Caldas. Manizales -Iriarte. S. 1960. Microbiologa; Prcticas de laboratorio. Talleres genora. Barcelona -Senez J. 1976. Microbiologa general.Alhambra.Madrid -Brock. 2004. Microbiologa de loa microorganismos.

2. 3. 4. 5.