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W I S S ENS CHAFT S PECIA L : A N T IK RP E RDE SIGN

IgY-Technologie

Was sind und was knnen polyklonale avire Antikrper?


LARS NIEDERSTADT 1 , RDIGER SCHADE 2 1 ROBERT-KOCH-INSTITUT BERLIN 2 INSTITUT FR PHARMAKOLOGIE, CHARIT-UNIVERSITTSMEDIZIN BERLIN

waren. Seit 1996 ist der Begriff IgY-Technologie (1995 eingefhrt durch Dr. Claus Staak, [4]) ein international anerkannter Terminus technicus.

The IgY-technology includes all aspects of the production of specific antibodies (Ab) in laying hens as for example animal keeping, immunisation as well as IgY-extraction procedures. IgY-Ab can be used for all immunological techniques similar to the use of IgG-antibodies and, despite of the aspect of animal welfare, offers several advantages. For example, from one laying hen ca. 20 g total IgY can be obtained within one year. So, IgY-Ab are suited for therapeutic/prophylactic purposes which needs relatively large quantities of Ab.
DOI: 10.1007/s12268-012-0162-3 Springer-Verlag 2012

Struktur des IgY-Antikrpers im Vergleich mit IgG


Obwohl das IgY funktionell eher dem IgG entspricht, hnelt es seiner Struktur nach mehr dem IgE bzw. IgA und ist mit diesen nher verwandt als mit IgG. IgY besteht aus zwei schweren und zwei leichten Ketten, wobei die schwere Kette eine variable und vier konstanten Domnen und die leichte Kette eine variable und eine konstante Domne besitzt (Abb. 2). Das Molekulargewicht von IgY betrgt 168.000 Dalton (leichte Kette: rund 19.000 Dalton; schwere Kette: rund 65.000 Dalton). Damit ist IgY deutlich schwerer als IgG (rund 160.000 Dalton). Wie beim IgG ist der Fc-Teil Trger verschiedener biologischer Funktionen. Der isoelektrische Punkt (IP) der IgY-Ak liegt zwischen 5,7 und 7,6, derjenige der IgG-Ak zwischen 6,1 und 8,5. Damit ist das IgY-Molekl hydrophober als IgG [5]. Eine Besonderheit im Unterschied zum IgG ist die stark reduzierte sogenannte hinge region (Gelenkregion), die normalerweise fr eine gewisse Flexibilitt des Fab-Teils sorgt. Es wird angenommen, dass dies zu Antikrpern mit unterschiedlicher Spezifitt fhren kann, wenn Kaninchen und Hhner mit demselben Antigen immunisiert werden. Fr den rezeptorabhngigen IgY-Transport vom Blut in das Eidotter ist ein Aminosuremotiv wichtig, das aus HistidinGlutaminsureAlaninLeucin (HEAL) besteht und sich zwischen der zweiten und dritten konstanten Domne befindet (Positionen 429432) [6].

IgY historischer Abriss


Inspiriert durch die Arbeit von Paul Ehrlich Ueber Immunitt durch Vererbung und Sugung im Jahr 1892 [1] untersuchte Felix Klemperer im selben Jahr, ob sich bei Hhnern Immunitt gegen Tetanusbazillen erreichen lsst und ob sich diese Immunitt auch im Ei wiederfindet (Abb. 1). Er fand heraus, dass tatschlich die Immunitt auf das Ei derartig immunisierter Hhner bertragen wird, und zwar ausschlielich auf das Eidotter, nicht aber auf das Eiwei [2]. Damit war bewiesen, dass durch Immunisierung erzeugte Antitoxine aus dem Blut der immunisierten Hhner in das Eidotter gelangen. Mehr als ein halbes Jahrhundert fanden die Ergeb-

nisse von Klemperer kaum Beachtung. In der zweiten Hlfte des letzten Jahrhunderts nderte sich die Situation, zurckzufhren auf das Erstarken des Tierschutzgedankens. Initiiert wurde diese Bewegung insbesondere durch das Buch von Russell und Burch (1959), The Principles of Human Experimental Technique [3]. In den folgenden 20 Jahren fanden die Studien von Klemperer mehr und mehr Beachtung, da sich spezifische Immunglobulin-Y-Antikrper (IgY-Ak) unblutig aus dem Eidotter immunisierter Hennen isolieren lieen. Seit den 1980er-Jahren fand die Anwendung von IgY-Ak breitere Akzeptanz, zumal Sekundrreagenzien, wie z. B. AntiIgY-Ak, nun auch kommerziell verfgbar

Abb. 1: Originalprotokoll des richtungweisenden Tetanusversuches von Felix Klemperer im Jahre 1893 [2]. Man beachte den minimalen Tiereinsatz.

Unterschiede zwischen IgY- und IgG-Antikrpern


In Tabelle 1 sind einige unterschiedliche Charakteristika von IgY- und IgG-Ak aufgefhrt. Abgesehen davon lassen sich aufgrund der phylogenetischen Distanz zwischen der Klasse der Aves und der Mammalia im Huhn spezifische Antikrper gegen in der Phylogenese der Suger hochkonservierte Proteine

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erzeugen. Immunisierungen von Kaninchen mit derartigen Antigenen bleiben in der Regel erfolglos, weil das Immunsystem des Kaninchens das Antigen nicht als fremd erkennt.

Haltung und Immunisierung von Hhnern (klassische versus genegun-Immunisierung)


Die Haltung von Hhnern ist unproblematisch. Eine artgerechte Haltung ist in speziell fr diese Zwecke entwickelten Kfigen mglich, von den fr Tierversuchsgenehmigungen zustndigen Landesbehrden wird inzwischen aber eine Bodenhaltung bevorzugt. Dies ist mglich in Boxen, die mit Legenestern und Sitzstangen ausgerstet sind. Es ist sinnvoll, jeweils ein braunes und ein weies Huhn zusammen in einer Box zu halten, um die Eier zweifelsfrei zuordnen zu knnen. Die Immunisierung der Hhner erfolgt intramuskulr in den Musculus pectoralis, jeweils rechts und links. Ein Injektionsvolumen von insgesamt einem Milliliter sollte nicht berschritten werden (siehe bersichten in [7]). Da im Huhn Gedchtniszellen nicht vor drei Wochen nach Grundimmunisierung nachzuweisen sind, erfolgen Boost-Immunisierungen nach ca. vier Wochen. In der Regel wird die Antigenlsung 1:1 mit einem Adjuvans gemischt zur Herstellung einer stabilen Emulsion. Obwohl kontrovers diskutiert (Gewebeunvertrglichkeit), gilt das Freundsche Adjuvans (Freunds complete/incomplete adjuvans, FCA/FIA) nach wie vor als der GoldStandard, da es zuverlssige Ergebnisse gewhrleistet. Abhngig vom Antigen (Ag) ist eine Menge von 100Mikrogramm ausreichend zur Erreichung eines guten AkTiters, z.B. bei Proteinen. Bei Peptiden kann es sinnvoll sein, die Ag-Konzentration auf 200 bis 300 Mikrogramm zu erhhen, hervorragende Ak-Titer knnen auch mit einer Ag-Menge zwischen zehn und 20 Mikrogramm erreicht werden, allerdings erst nach mehrfacher Immunisierung [8]. Eine Alternative zur klassischen Immunisierung ist die genegun-Immunisierung (Abb. 3). Bei dieser Form der ballistischen Immunisierung wird das Antigen mittels Plasmidvektoren in die Versuchstiere eingebracht. Durch die Beschichtung von kolloidalen Goldpartikeln (Durchmesser: ein Mikrometer) mit rekombinanten Nukleinsuren wird ein physiologisch unbedenkliches Trgermaterial erzeugt, welches mittels

Gasimpuls in die oberen Schichten der Epidermis appliziert werden kann. Beim Durchdringen der behandelten Hautschichten verbleibt Antigen-codierendes Erbgut in den durchschlagenen Zellen, wodurch eine Transfektion der Zellen mit den verwendeten Expressionsvektoren erreicht werden kann. Die durch die Expression der Immunisierungsvektoren gebildeten Antigene gelangen in der Folge, je nach Beschaffenheit des Antigens, ber sekretorische Stoffwechselwege oder durch Apoptose der Zelle in den extrazellulren Raum, wodurch eine effektive Immunreaktion mglich wird [9]. In Abhngigkeit der Krpergre und Spezies des Versuchstieres sind schon geringe DNA-Mengen fr die Anwendung zur Immunisierung ausreichend (Dosis: vier Mikrogramm pro Huhn; zwei Mikrogramm pro Maus).

IgY-Extraktion
IgY kann aus dem Eidotter mit unterschiedlich aufwendigen Methoden (hinsichtlich Zeit, Kosten) extrahiert werden [7]. Wir verwenden ein Przipitationsverfahren nach Polson [10] auf der Basis von Polyethylenglykol 6.000. Dieses Verfahren bentigt eine nur geringe Laborkapazitt sowie einen geringen Einsatz von Chemikalien. Ein genaues Protokoll sowie ein entsprechendes Video findet sich bei Pauly et al. [11]. Mit diesem Protokoll kann eine gebte Laborkraft IgY aus 86 Eiern pro Woche separat isolieren, wobei die IgY-Ausbeute ca. 80Prozent und die Reinheit zwischen 70 und 80Prozent liegt. Bei dieser Methode betrgt der Gesamt-IgY-Gehalt ca. 60Milligramm pro Ei. Bei jngeren Tieren ist dieser Wert etwas geringer, bei lteren Hennen hher und kann bis 100Milligramm pro Dotter erreichen. Im Dotter ist nur IgY vorhanden. Die IgY-Konzentration im Serum verglichen mit der im Eidotter wird kontrovers diskutiert: Es wird einerseits beschrieben, dass die IgY-Konzentration im Serum hher ist als im Dotter, andererseits, dass das Gegenteil der Fall ist, oder auch, dass sich beide Konzentrationen nicht unterscheiden. Die einfache Erklrung fr diese Diskrepanz scheint ein signifikanter IgY-Biorhythmus zu sein [8]. Da das Serum-IgY mit einer Verzgerung von etwa drei bis fnf Tagen im Dotter erscheint, unterscheiden sich auch die aktuellen Rhythmen und damit die IgYKonzentration zwischen Serum-IgY und Dotter-IgY.

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Abb. 2: Vergleich der Struktur von IgG und IgY. VL, variable Domne der leichten Kette; VH, variable Domne der schweren Kette; CL, konstante Domne der leichten Kette; CH, konstante Domne der schweren Kette; Fab, Antigen-bindender Teil; Fc, fragment cristalline; HR, hinge region. Die schwarzen Punkte bedeuten Kohlehydratketten.

Tab. 1: Vergleich einiger Charakteristika von IgG- und IgY-Antikrpern (AK). IgG (Kaninchen)
AK-Gewinnung AK-Ausbeute invasiv 200 mg/40 ml Blut

IgY (Huhn)
nicht-invasiv 50100 mg/Ei 57 Eier/Woche ca. 1.0002.800 mg nein nein nein nein

AK-Ausbeute/Monat Interferenz mit Suger-IgG (Rheumafaktoren) Interferenz mit HAMA (human anti mouse antibody) Interferenz mit Suger-Komplementfaktoren Protein-A/G-Bindung

200 mg ja ja ja ja

kontinuierlich fnf bis sieben Eier pro Woche bis etwa zur 72. Lebenswoche. Danach sinkt die Legeleistung. Nach unseren Erfahrungen ist die reduzierte Legeleistung durch den AkTiter der Eier aus dieser Periode mit Ak-Titern von teilweise 1:1.000.000 mehr als kompensiert [8]. In dieser Studie konnten innerhalb von zwei Jahren IgY-Mengen pro Huhn zwischen 33 und 38Gramm erreicht werden. Das erffnet Perspektiven fr eine prophylaktische, therapeutische Anwendung von IgY-Ak. Es gibt eine Vielzahl von Studien, die derartige Anwendungen sowohl in der Human- als auch in der Veterinrmedizin beschreiben. So z.B. als Karies-Prophylaxe durch Splen des Mundraumes mit IgY-Ak gegen Streptococcus mutans oder mit IgY-Ak gegen Pseudomonas aeruginosa zur Verhinderung einer Sekundrinfektion bei Mukoviszidose-Patienten (bersicht in [12]). Ein wesentlicher Bereich der Anwendung spezifischer IgY-Ak knnte zuknftig in der Behandlung von Durchfallerkrankungen bei neugeborenen Ferkeln und Klbern liegen, indem artifizieller Nahrung spezifische Antikrper z. B. gegen Rotaviren und E.coli beigemischt werden. Entsprechende Studien sind in Deutschland schon in den 1980er-Jahren durchgefhrt worden. Angesichts zunehmender Resistenzen gegen verschiedene Antibiotika knnte der Einsatz von spezifischen IgY-Ak an Bedeutung gewinnen.

Danksagung
Einige der hier vorgestellten Ergebnisse sind im Rahmen eines vom BMBF gefrderten Projekts entstanden (Biologische Gefahrenlagen: Risikobewertung, ultraschnelle Detektion und Identifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, BiGRUDI).

Literatur
Abb. 3: A, Gene gun-Immunisierung einer Legehenne. Das Huhn wird auf dem Rcken fixiert, und die beladenen Goldkugeln werden in den Musculus pectoralis geschossen. B, schematische Darstellung des Prinzips der Plasmid-Immunisierung (Schema nach [13]). C, Immunfluoreszensfrbung transfizierter Zellen mit Immunseren nach Gene Gun-Immunisierung (1. Bild: Negativkontrolle, folgende Bilder: Positivkontrollen). AG: Antigen; MHC: Haupthistokompatibilittskomplex. Weitere Erklrungen im Text.
[1] Ehrlich P (1892) Ueber Immunitt durch Vererbung und Sugung. Zeitschrift fr Hygiene und Infektionskrankheiten 12:183203 [2] Klemperer F (1893) Ueber natrliche Immunitt und ihre Verwerthung fr die Immunisierungstherapie. Arch Exp Pathol Pharmakol 31:356382 [3] Russel WMS, Burch RL (1959) The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen, London [4] Schade R, Hlinak A (1996) Egg yolk antibodies, state of the art and future prospects. ALTEX 13 (Suppl): 59 [5] Davalos-Pantoja L, Ortega-Vinuesa JL, Bastos-Gonzalez D et al. (2000) A comparative study between the adsorption of IgY and IgG on latex particles. J Biomater Sci Polym Ed 11:657673 [6] Morrison SL, Mohammed SM, Wims LA et al. (2001) Sequences in antibody molecules important for receptor-mediated transport into the chicken egg yolk. Mol Immunol 38:619625 [7] Schade R, Calzado EG, Sarmiento R et al. (2005) Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinari medicine. Altern Lab Anim 33:129154

Anwendung avirer Antikrper aktuelle und zuknftige Bereiche


IgY-Ak werden in vielen analytischen und diagnostischen Plattformen eingesetzt. Es gibt inzwischen weltweit kommerzielle Anbieter, die sich auf die Produktion von IgY-Ak spezialisiert haben. Insofern muss heute die Wer-

tigkeit der IgY-Ak nicht mehr besonders hervorgehoben werden. Abgesehen von der Bedeutung der IgY-Ak als diagnostisch/analytisches Werkzeug, soll ein Aspekt der IgYTechnologie betont werden: Man kann von einer Legehenne enorme Mengen von Gesamt-IgY erhalten. Ein Huhn legt relativ

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HERSTEL L ERNACH WE I S SP E CIAL: ANTI K RP E RDE SIG N

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[8] Pauly D, Dorner M, Zhang X et al. (2009) Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poult Sci 88:281290 [9] Witkowski PT, Bourquain DR, Hohn O et al. (2009) Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specific IgY antibodies. J Immunol Methods 341:146153 [10] Polson A, von Wechmar MB, van Regenmortel MH (1980) Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol Commun 9:475493

[11] Pauly D, Chacana PA, Calzado EG et al. (2011) IgY technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. JoVE 51, DOI: 10.3791/3084 [12] Schade R, Zhang X-Y, Terzolo HR (2007) Use of IgY antibodies in human and veterinary medicine. In: Huopalahti R, Lpez-Fandino R, Anton M, Schade R (Hrsg) Bioactive Egg Compounds. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. 213222 [13] Bolhassani A, Yazdi SR (2009) DNA immunization as an efficient strategy for vaccination. Avicenna J Med Biotechnol 1:7188

Korrespondenzadresse: Prof. Dr. Rdiger Schade Charit Universittsmedizin Berlin CC 4: Therapieforschung Dorotheenstrae 94 D-10117 Berlin Tel.: 030-48331112 ruediger.schade@charite.de

AUTOREN
Lars Niederstadt
Jahrgang 1980. 2008 Biologie-Diplom an der FU Berlin. 20082012 Promotion am Robert-Koch-Institut (RKI), Berlin. Seit 2008 Mitarbeiter am RKI, Fachgebiet Virale Infektionen.

Rdiger Schade
Jahrgang 1945. 1974 Promotion zum Dr. rer. nat. (Tierphysiologie), HU Berlin. 19762011 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut fr Pharmakologie und Toxikologie der HU Berlin. 1982 Facultas docendi fr Immunologie. 1983 Habilitation zum Dr. sc. nat. (Immunologie). 1986 Anerkennung als Fachbiologe in der Medizin (Immunologie). 2002 Ernennung zum auerplanmigen Professor.

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