Sie sind auf Seite 1von 37

Revue du Cercle de Mycologie de Bruxelles n4 (2004)

p. 35 71

Microscopie, mthodes dexamen, colorations


par Jean LACHAPELLE () Nous avons constat que ce que nous connaissons pour l'avoir appris de divers ouvrages et de collgues mycologues se trouve magistralement expos et rsum dans le "Manuel de microscopie" de LOCQUIN & LANGERON1, c'est pourquoi nous avons estim que le plus utile, dans un but d'initiation, consistait rsumer cet ouvrage, en suivant son ordre de prsentation. A ce condens, nous avons ajout des renseignements recueillis dans d'autres ouvrages, notamment dans des monographies, et auprs d'un prparateur de ractifs, colorants et produits chimiques divers, comme MARCEL LECOMTE2 ; enfin, nous y avons incorpor quelques commentaires inspirs par notre exprience personnelle - laquelle est axe sur les champignons agaricodes. Ce travail a un caractre compilatoire ; nous l'avons voulu pratique avant tout, et vocation initiatique.

PREMIERE PARTIE MICROSCOPIE, TECHNIQUES ET TRAITEMENTS DIVERS, COLORANTS ET AUTRES PRODUITS CHIMIQUES A DES FINS D'ANALYSE
I.- METHODES D'EXAMEN A.- Traitements prparatoires Rgnration du matriel dessch Pour regonfler les exsiccata, on peut utiliser notamment des alcalis (ammoniaque, potasse, soude) ou le lactophnol, le chloral-lactophnol, le

Ouvrage dit en 1978 chez Masson. La matire intressante pour le mycologue est assez dissmine dans cet ouvrage par ailleurs magistral.

A l'occasion de nos changes pistolaires ou de nos rencontres. Certains renseignements sont sans doute attribuables en partie Didier Baar ().

lactochloral, l'acide lactique, l'hydrate de chloral, le mlange parts gales d'eau, d'alcool et de glycrine (imprgner d'abord l'alcool), l'eau actique 50%. Le chloral-lactophnol ou le lactochloral sont des produits suprieurs au lactophnol et l'acide lactique. L'ammoniaque et l'hydrate de chloral respectent mieux le matriel observer que les autres produits. Chauffer accentue videmment l'action du milieu1. Depuis que Clmenon a dcouvert le SDS (Sodium Dodcyl Sulfate), qui est un excellent regonflant, la majorit des champignons peuvent tre examins directement dans le rouge Congo SDS, sans usage prliminaire d'une solution alcaline. Cela vaut aussi pour les exsiccata. Nanmoins, si l'on prfre examiner une prparation d'abord dans une solution alcaline et y regonfler et ramollir du matriel sec, Clmenon recommande alors d'utiliser la solution GSD mme : 5 g Glycrine, 0,2 g hydroxyde de Sodium, 5 g Dimthyl-sulfoxyde, 10 g eau distille. La glycrine vite le desschement et amliore l'indice de rfraction optique, le dimthylsulfoxyde active l'imprgnation et favorise le regonflement du matriel sec. L'utilisation du GSD permet de colorer ultrieurement la prparation dans le rouge Congo SDS (voir infra). Dshydratation du matriel frais Dposer le matriel sur une lame et le plonger dans du chloral-lactophnol ou lactochloral : les tissus aqueux qui demanderaient tre dshydrats le sont en quelques minutes, sans contraction. B.- Fixation Fixer, c'est immobiliser les structures organiques dans un tat aussi proche que possible de l'tat vivant. La fixation provoque l'insolubilisation des constituants intracellulaires et l'augmentation de l'indice de rfraction. La fixation d'une coupe dans un tissu de champignon permet de mieux le colorer en favorisant la pntration du colorant. En outre, elle facilite l'observation des pigments. Selon JOSSERAND, sur le sec, il faut plonger les coupes dans un fixateur pour insolubiliser les pigments et observer dans une solution trs concentre de chloral hydrat aprs bullition ; cette mthode est aussi recommandable sur le vivant, surtout si le pigment est trs peu abondant. Il existe des fixateurs simples et des mlanges fixateurs.

Ne pas chauffer le lactophnol.

36

L'alcool est trs hygroscopique1 : il contracte les cellules de la moiti de leur volume et rigidifie les tissus. Il n'a pas d'influence sur la plupart des colorants et n'empche gnralement pas leur diffusion. Son pH = 6 alors que celui de l'eau = 7. L'acide picrique2 (solution sature) est la fois un fixateur et un colorant ; il est trs acide. Peu pntrant, il contracte moyennement les tissus et les durcit peu. C'est un bon fixateur pour la topographie histologique, moins bon pour les dtails intracellulaires. L'acide actique ( 5% en solution aqueuse) est un acide moyen. Il peut tre mlang l'alcool. Il a une vitesse moyenne de pntration et gonfle les tissus : les tissus fixs sont extrmement mous. Le formol est un autre fixateur. Le formol commercial est assez impur (il contient de lacide formique et du mthanol) et trs acide (il doit tre neutralis avant emploi avec du carbonate de calcium par exemple). Il nous parat plus indiqu dutiliser du formol de laboratoire, nettement plus pur. Le formaldhyde durcit fortement les tissus. Il agit plus vivement s'il est additionn de sel ou de sucre. C'est un fixateur d'un emploi simple et d'un domaine d'application assez tendu quoique souvent mdiocre. La solution tait tentante videmment de combiner trois de ces produits dans une sorte de fixateur "universel" : lAFA (Alcool Formol Actique) ; ce mlange savre trs intressant et vaut la peine dtre exploit. Il existe de nombreux autres mlanges fixateurs qui ont le mrite d'utiliser d'une manire approprie les attributs des divers composants. En histologie, on utilise notamment : le picroformol de Bouin, le picroformol cuprique de Hollande, le picroformol mercurique, le fixateur de Bouin-Hollande, etc. Chaque mlange a son domaine d'application : tout fixateur, simple ou en mlange, doit tre utilis avec propos ! C.- Eclaircissement et ramollissement Dminralisation Lorsque loxalate de chaux obscurcit une prparation, faire agir notamment de lacide chlorhydrique (5 10 %), nitrique ( 6%) ou picrique (solution aqueuse sature).

Remarquer que le mthanol, produit usage mnager bon march, est beaucoup moins hygroscopique que l'thanol. Lacide picrique cristallis est trs sensible aux chocs et au feu. Ne jamais le mlanger de la glycrine car il donne un produit hautement explosif : la trinitroglycrine (dynamite) !!

37

Coupes obscurcies Lorsque les espaces interhyphiques sont remplis d'air, les coupes peuvent tre presque illisibles : on les fera bouillir entre lame et lamelle dans l'ammoniaque pour en chasser l'air. On peut aussi laver la prparation l'alcool. Ramollissement L'ammoniaque concentre a le pouvoir non seulement de regonfler les exsiccata mais aussi de ramollir les hyphes de champignons frais. La potasse et la soude ont une action plus forte que celle de l'ammoniaque. Pour rappel, l'acide actique rend les tissus extrmement mous (cf. ci-dessus). Lorsqu'on n'utilise pas le SDS ou le GSD, on peut recommander, pour ramollir les exsiccata, l'emploi du ramollisseur de Clmenon : ammoniaque concentre 20 ml, glycrine 1 g, thanol 96 % 80 ml. Sur la partie prleve laisser tomber quelques gouttes du liquide ramollir et laisser agir quelques minutes (voire quelques heures) jusqu' vaporation. Le champignon ayant acquis une consistance comparable celle de la cire, on peut alors pratiquer les coupes. Bien rincer pour liminer l'excdent de glycrine. Dpigmentation Pour certains traitements spcialiss, il est indiqu de dpigmenter, autrement dit de blanchir : on utilise notamment de l'eau oxygne, du permanganate de potassium, de l'hypochlorite de soude (dont leau de Javel qui est un driv impur peu conseill en microscopie). Attention cependant : lhypochlorite de soude a la proprit de dissoudre compltement le contenu des cellules (en pratique, on lutilise surtout en histologie vgtale lorsquon souhaite ne garder que les parois des tissus.) D.- L'observation Il est toujours courant aujourd'hui d'observer les prlvements directement entre lame et lamelle, dans une goutte d'eau, avec ventuellement une dilacration, une dissociation ou une micro-compression pour mieux en sparer les lments. Les techniques mises en uvre cette occasion continuent faire avancer la mycologie. L'examen en question n'est pas une mthode facile et n'est praticable que sur des cellules faciles isoler, des tissus aiss dissocier, des cellules assez petites pour tre montes entre lame et lamelle. Si l'examen est court, un montage dans leau entre lame et lamelle est suffisant ; pour pouvoir le prolonger, il faut viter l'vaporation : on se tournera alors vers le lactophnol ou le chloral-lactophnol par exemple.
38

Les colorations Une coloration est une exprience de physiologie cellulaire : l'oprateur travaille dans l'infinie complexit de la matire vivante et doit particulirement surveiller ses conditions opratoires pour pouvoir tirer de bons enseignements de ses rsultats. Les colorations sont utilises pour mettre en vidence des structures morphologiques intra-cellulaires, mais aussi pour tudier la permabilit de certaines interfaces, la raction cellulaire l'introduction d'un colorant, etc. Notons cependant que les colorants que nous utilisons, oprent tous, concentration normale, une action ltale sur les lments tudis, mme sans fixation pralable ; les colorants vitaux (qui laissent les cellules en vie) sont rares ; le moins nocif est le rouge neutre, utilis 1/1.000 ; citons galement le bleu de mthylne, le bleu de crsyl, le vert Janus, employs des dilutions de lordre de 1/10.000 1/30.000, voire 1/100.000. Plasmolyse1 Lors de l'examen de cellules contenant des vacuoles pigmentes, le pigment est souvent dilu et peu visible. Pour en intensifier la visibilit, les cellules sont places dans une solution sucre concentre : la diffrence de pression osmotique provoque un dpart de l'eau de la cellule, les vacuoles se contractent et se concentrent rendant alors les pigments plus visibles. Ceci ne s'applique pas aux ncropigments ni aux pigments ayant une autre localisation. Beaucoup d'auteurs proposent indiffremment le sel ou le sucre comme agent de plasmolyse ; l'eau glycrine provoque galement une plasmolyse. Recommandation de JOSSERAND : placer la pice observer dans une solution sucre 8% et attendre car l'osmose n'est pas instantane. Si, au bout de 10 ou 15 minutes, on ne dcouvre aucune hyphe dont la vacuole se soit contracte, au moins assez pour permettre le diagnostic, on fera une deuxime prparation en utilisant cette fois une solution 12 %. On attendra de nouveau. Si l'on n'obtient aucun rsultat, il sera inutile d'employer une solution plus concentre. Dissociation chimique Certains champignons, tels les polypores, ont une structure trs ferme dure ; d'autres, tels les pleurotes ont une structure glatineuse. L'observation de leurs lments, comme dans les cas frquents de champignons structure simplement ferme ou compacte, demande un traitement ramollissant pralable : celui-ci vite ou

LANGERON prfre le terme "osmodialyse".

39

rduit la dissociation "mcanique" par pression ou par chocs (dilacration, squash) qui souvent abme ou disperse les lments. Pour cela, on utilise, selon le cas, de l'alcool, de l'acide actique (0,2 2%) et, le plus souvent, des bases (ammoniaque, potasse, soude). La macration chimique est suivie d'une faible dissociation mcanique. Nous conseillons dailleurs deffectuer la dissociation de structures compactes entre deux lames porte-objet, car une lame couvre-objet ne rsiste pas la pression qui doit tre exerce pour raliser la dissociation ! Intensificateurs de contraste Ce sont, en fait, des intensificateurs d'indice de rfraction par fixation d'atomes lourds sur les structures observer. On peut trouver ces mtaux dans des fixateurs et des colorants. A ce sujet, il est utile de se rappeler que la glycrine prsente dans plusieurs solutions accrot l'indice de rfraction et que le ractif de Melzer (chloral iodo-iodur), grce la prsence de l'iode, amliore le contraste de la prparation. II.- TEINTURES ET IMPREGNATIONS Conseils gnraux Pour que les colorants pntrent dans les membranes (souvent impermables), il faut en gnral passer ces dernires dans l'alcool dilu et rincer aussitt. Une solution colorante aqueuse ne doit pas tre mise en contact avec un objet imprgn dalcool : celui-ci sera imprativement rinc leau au pralable afin dviter la formation dun prcipit. Les objets colors qui doivent tre lavs le sont dans le solvant du colorant (eau, alcool, etc.). Pendant la coloration, lobjet ne doit pas se desscher. Il existe cet effet de petites cuves coloration trs pratiques. Les colorants agissent progressivement : soit on surveille la coloration pour larrter au stade voulu (on parlera de coloration progressive), ou on surcolore pour dcolorer ensuite dans un milieu appropri (solvant du colorant) appel diffrenciateur (on parlera ici de coloration rgressive). On peut colorer un mme objet par diffrents colorants : ceci facilite les observations. On distingue trois groupes de colorants : - colorants neutres (Giemsa), - colorants basiques ou nuclaires (bleu de mthylne), - colorants acides ou plasmatiques (osine).
40

Basophilie et cyanophilie sont synonymes ; de mme acidophilie et osinophilie. Les affinits basophiles sont nettement renforces par la fixation, notamment par le formol. On parle aussi d'iodophilie (voir infra). Selon DONADINI, la vitesse d'une raction quelconque est fonction de trois facteurs : la concentration des constituants entrant en raction, la temprature laquelle on opre et le solvant dans lequel on effectue la raction. Observation, rfraction, contraste Les lments naturellement colors s'observent bien sous le microscope : il n'en est pas de mme des lments hyalins c'est--dire la fois clairs et transparents. Il est donc recommand de colorer puis d'observer dans un milieu clair appropri : l'eau, l'ammoniaque, le lactophnol, l'hydrate de chloral, etc. Pour une observation approfondie, il est prfrable d'observer d'abord dans un liquide non color. Ensuite on peut tre amen colorer. A ce sujet, il faut savoir que chaque champignon, chaque organe de champignon et chaque partie de cet organe peut demander une coloration spcifique en fonction de la nature de sa constitution et de ses proprits chimiques. On a intrt, particulirement lors de la photomicrographie ou pour des prparations destination dfinitive, laver dans l'ammoniaque dilue 2 fois les prparations montes dans le rouge Congo ammoniacal, dans le lactophnol pour les prparations montes dans le bleu lactique, etc. Par cette opration, le fond se dcolore et le contraste se trouve encore augment. L'ammoniaque dilue 2 fois a ici l'avantage sur l'ammoniaque concentre de ne dissoudre que le colorant non fix sur les structures fongiques. L'ammoniaque concentre, au contraire, dissout assez facilement le rouge Congo, mme fix, et fait donc plir les lments observs. L'eau convient moins bien parce que le colorant n'y est que peu soluble, et qu'elle a tendance provoquer sa cristallisation. Cette recommandation peut s'appliquer, mutatis mutandis, d'autres colorants. Mthodes de coloration Les phnomnes de teinture des cellules rsultent d'un ensemble trs complexe de phnomnes physico-chimiques. Certaines ractions colorantes sont rversibles, d'autres non, certains colorants fixs sont extractibles par un solvant appropri, certains colorent en une autre teinte que leur coloration propre, d'autres ne se fixent qu'en prsence d'un sel mtallique ; certains sont trs sensibles au pH. Il n'est pas de recette de coloration valable pour tous les objets. Le bon oprateur est celui qu'une longue exprience a dress pour lui permettre de varier les
41

temps ou les concentrations, voire de substituer un colorant un autre pour obtenir le meilleur rsultat. Ces variations sont ncessaires pour tenir compte : du fixateur utilis, de la nature de la pice, de l'paisseur des coupes, de la structure mettre en vidence, du colorant utilis, etc. LANGERON distingue diverses mthodes de coloration, parmi lesquelles on peut relever : Colorations topographiques : ce sont celles qui diffrencient le mieux les diffrents tissus constituants d'un ensemble et permettent la visibilit en gnral jusqu'aux noyaux, d'un organe. Colorations histologiques : ce sont celles qui diffrencient finement tous les lments d'un tissu y compris ses structures fines et ses excrtats ou scrtats. Une telle coloration devient histochimique si elle est spcifique de tel ou tel compos dfini. Colorations cytologiques : ce sont celles qui permettent d'analyser les dtails internes des cellules. De telles colorations peuvent tre cytochimiques si elles mettent en vidence des fonctions chimiques dtermines. Colorations lysochromes : elles se fixent directement sur les huiles, graisses et cires. Colorations progressives : elles ncessitent d'arrter la monte de la coloration au point voulu en observant celle-ci au microscope. Colorations rgressives : aprs surcoloration, on diffrencie par un ractif qui enlve progressivement l'excs de colorant, en surveillant au microscope pour arrter l'effet au moment voulu. Colorations directes : elles se fixent directement sur l'objet. Colorations indirectes avec mordanage : la fixation du colorant a lieu par l'intermdiaire d'un sel mtallique "mordant". Coloration indirecte par mordanage : mordant Le mordanage est lutilisation dun mordant, c'est--dire d'une substance qui renforce les colorations et dans certains cas, les rend possibles. On nemploie que des mordants neutres ou acides. On peut dire quun mordant est une substance qui sert dintermdiaire entre le colorant et la pice colorer : il provoque une combinaison chimique entre deux corps qui nont aucune affinit chimique au dpart ; il sensibilise le corps colorer en formant avec lui une combinaison stable. Il se forme donc entre le tissu, le mordant et le colorant, une triple combinaison
42

colore suffisamment stable pour rsister aux dcolorants (acides, alcool). On utilise frquemment le Lugol cet effet (solution forte de Nicolle). Coloration directe : mouillant Un agent mouillant est un agent qui diminue la tension superficielle ; les dtergents en font partie. Ils facilitent la pntration des colorants dans les cellules ou dans les structures de la cellule en dtruisant la couche grasse ou huileuse qui les protge : on peut donc parler ici de coloration directe. Prcisons que le mouillant ne rduit pas la tension superficielle de la solution colorante mais la tension superficielle du color (coupe ou prparation). L'Invadin suggr par CLEMENON et MOSER peut tre avantageusement remplac par un simple dtergent de mnage (utilis pour la vaisselle). Le SDS plus rcemment recommand par CLEMENON a l'avantage de la puret et de la stabilit comme composant de base. Il faut viter de dpasser la dose recommande dans les formules de colorant afin de ne pas provoquer l'apparition de mousse dans la prparation. Certains auteurs recommandent de placer le prlvement observer dans l'alcool pendant un temps non rigoureusement dtermin (5 15 minutes) pour assurer la "mouillabilit" des tissus. Il y a ici un usage inappropri du terme mouillabilit : en effet, l'alcool est le meilleur des dshydratants et un fixateur de premier ordre. Avec le risque cependant de trop dshydrater les tissus et de leur faire perdre leur taille initiale. Matires colorantes Ce sont des substances qui se fixent de faon approprie sur les objets qui sont mis en contact avec elles par l'intermdiaire d'une solution. Les principales modalits des teintures ou colorations sont : ractions chimiques entre colorant et objet, imbibition diffrentielle de l'objet, prcipitation du colorant sur l'objet, adsorption du colorant sur l'objet, liaison l'objet par un "mordant", interdiction de liaison l'objet. Certains colorants, acides par nature, se fixent diffremment sur certaines structures et conduisent ainsi des colorations signaltiques, sinon spcifiques, par imbibition des vitesses diffrentes ; de plus, le premier colorant ayant occup un "espace" affine, en interdit l'accs aux autres en comptition avec lui.

43

Coloration des diffrents types de tissus Tissus contenant des lipides a) Coloration par les lysochromes Parmi les colorants lysochromes on trouve le bleu de crsyl ammoniacal. La coloration par le bleu de crsyl se fait ainsi : on fait agir une solution aqueuse 1 ou 2%, on lave l'eau puis par de l'ammoniaque dilue 50% ; les lipides apparaissent jaune d'or, les parois des tissus fongiques tant incolores ou vineux ple. On peut mettre ainsi en vidence les chrysocystides des strophaires et des hypholomes. b) Coloration par les bleus mtachromatiques La coloration mtachromatique consiste en un virage du colorant dans une teinte autre que la sienne propre lorsqu'il est fix par l'objet. Parmi les bleus les plus utiliss on trouve le bleu de toluidine et le bleu de crsyl. Cette coloration met en vidence non seulement les lipides acides mais aussi tous les autres constituants mtachromatiques. c) Ractions des carotnodes On rattache habituellement les carotnodes aux lipides en raison de leurs caractres de solubilit. Ils se colorent directement en violet, bleu ou vert dans les acides forts et en violet dans les liquides iods (lugol, Melzer). d) Raction des chromolipodes Ce sont en gnral des pigments jaunes bruns, basophiles et acido-rsistants. On les rencontre notamment chez les russules et rhodophylles. ROMAGNESI a tir un grand parti systmatique de leur prsence. Leur acido-rsistance est mise en vidence par la technique de Ziehl-Nielsen (fuchsine de Ziehl). Tissus contenant des polyosides Ces polyosides sont des sucres polymriss. a) coloration mtachromatique : voir ci-dessus. b) coloration au rouge de ruthnium : en solution aqueuse 0,1%. Colorants des oxydases En injectant dans un tissu un mlange de solutions d'alpha-naphtol et de dimthylparaphnylne-diamine, on provoque une raction (dite "Nadiraction") permettant de localiser les oxydases. La raction donne, par oxydation, un produit de
44

condensation color en bleu. Aucune fixation pralable n'est possible, le colorant form diffuse facilement et est un lysochrome. Si on se contente d'une mise en vidence topologique compare, on peut faire appel la prsence in situ, spcialement en ce qui concerne les composs des tissus fongiques, d'un des deux composants fondamentaux de la Nadiraction. C'est ce qu'on fait en colorant certains tissus de russules ou de bolets l'aide d'un phnol. On fait encore appel la mme raction lorsqu'on utilise la paraphnylne-diamine ou la teinture de Gaac. Iodophilie - coloration l'iode Suivant le mode opratoire et la coloration obtenue, l'iode permet de dceler : le glycogne, la cellulose, l'amidon, la chitine non sclrifie ni fossilise, et certains autres polyosides dextrinodes. Voici les principaux ractifs utilisables : - le lugol, fort ou faible suivant sa concentration : iode 1 g + iodure de potassium 2 g + eau 100 400 ml suivant la "force" dsire. - le Melzer ou chloral iodo-iodur : iode 1,5 g + iodure de potassium 5 g + hydrate de chloral 100 g + eau 100 ml. La couleur et l'intensit doivent tre soigneusement notes. On peut avoir suivant les cas : une coloration noir pur, violet fonc, bleu fonc, bleu ciel, brun acajou, vineux, jaune bruntre, jaune d'or, jaune clair. On n'attache en gnral pas de signification ces trois derniers termes. - Si les objets prennent une teinte brun acajou brun vineux on les dit "dextrinodes" ou pseudo-amylodes. Ils peuvent contenir soit du glycogne, soit des dextrines. - L'amidon et lamylode se colorent directement en bleu dans le lugol ou le Melzer ; la raction est dite amylode. La coloration l'iode est une vritable coloration mtachromatique par opposition aux couleurs jaunes orthochromatiques que prennent la plupart des substances plonges dans l'iode. La raction de l'iode s'observe bien sur les lments ples. Il n'en est pas de mme des lments fortement pigments : ici, l'action de l'iode peut tre beaucoup moins apparente et d'une interprtation dlicate.

45

Sensibilit au fer - sidrophilie - carminophilie JOSSERAND rappelle que KHNER est le premier avoir constat la prsence, dans les basides de la tribu des Lyophylleae, de granulations dites carminophiles. Ces grains se prsentent sous la forme de trs nombreuses sphrules entasses les unes contre les autres. La carminophilie ou sidrophilie exprime l'affinit pour le carmin actique en prsence de fer. Extrait de la fiche technique de LECOMTE : Le carmin actique commercialis est une combinaison dacide carminique avec de lalumine, de la chaux et des albuminodes. Par sa double action de fixateur et de colorant, le carmin actique est utilis pour lobservation des noyaux qui sont fortement mais finement colors. Lactate de fer rend la coloration rouge intense noirtre. Il faut savoir que les verrues, granulations, parois et ornementations amylodes ne se colorent pas par le carmin. Manire de procder : - placer une grosse goutte de ractif sur une lame de verre et y placer les coupes ; - chauffer durant quelques secondes quasi jusqu bullition ; - agiter le carmin actique avec une aiguille en acier (ce qui provoque la formation dactate de fer) ; - alternative : y dposer quelques grains de sulfate de fer ou une solution de chlorure de fer III ; - ds que le carmin actique vire au rouge bleutre, voire noirtre, et perd sa transparence, refroidir avant la formation dune pellicule de surface ; - placer les pices colores dans une nouvelle goutte de carmin actique, dissocier et observer. Dans une prparation russie, le protoplasme est faiblement et uniformment color, tandis que les noyaux sont vivement teints de rouge ou de pourpre noirtre. CLEMENON procde comme suit pour mettre en vidence la carminophilie des basides : - prlever un fragment de lame (sil sagit dun exsiccatum, hydrater dabord lammoniaque et tamponner au papier buvard) ;

46

- mordancer dans une solution de sulfate de fer 10% durant 5 10 minutes ; - tamponner le fragment puis le plonger dans le carmin actique et faire bouillir durant 1 2 minutes ; des prcipits noirs se forment dans la solution rouge ; - observer ensuite dans une goutte de chloral hydrat. III.- COLORATIONS TOPOLOGIQUES Les pigments On peut les envisager du point de vue : 1/ de leur localisation dans les tissus et cellules, 2/ de leur constitution chimique, 3/ de leur mtabolisation, 4/ enfin de leur liaison avec les autres constituants cellulaires. Mthodes spciales en histologie mycologique a) Spores Les spores prsentent une certaine diffrenciation des membranes et une assez grande impermabilit de celles-ci. Pour que les colorants pntrent travers elles, il faut en gnral les placer dans l'alcool dilu ou dans l'eau sulfurique 0,01% et rincer aussitt. b) Techniques vgtales applicables la mycologie La cellule vgtale a un squelette rigide et rfringent form de parois cellulaires soudes les unes aux autres en forme de tissu ou de faux tissu. La destruction du cytoplasme, en ne laissant subsister que le squelette cellulosique, permet de mieux observer les parois ainsi que l'anatomie des lments soumis l'examen. A cet effet, on baigne la prparation de quelques secondes 5-10 minutes, dans une solution 50% dhypochlorite de soude (l'eau de Javel est rejeter, cause de ses impurets). Laver ensuite l'eau acidule par l'acide actique. L'hydrolyse basique se fait la potasse. Il s'agit d'une technique spciale utilise par KHNER dans l'tude des spores (cf. son ouvrage Hymnomyctes agaricodes). KHNER parle frquemment de ce traitement qu'il appelle le "traitement potassique" ; il l'utilise notamment pour liminer la couche externe (myxosporium) des spores.
47

Si l'on prouve des difficults reconnatre la prsence des boucles au pied des basides des entolomes, KHNER recommande de colorer au rouge Congo aprs un traitement potassique suffisant pour lyser le contenu cellulaire. Les protides ne donnent pas de raction absolument caractristique, aussi fautil essayer plusieurs ractifs pour les reconnatre srement. Il est bon de fixer d'abord le tissu l'alcool qui le durcit et dissout un certain nombre de substances qui pourraient troubler les ractions. L'osine en solution aqueuse trs faible est un de ces ractifs ; elle donne une coloration rouge non lective. Les ractions de la cellulose sont quelques fois difficiles obtenir : elles ne se manifestent qu'aprs transformation notamment par des alcalis caustiques. La cellulose des champignons est gnralement mlange une grande quantit de chitine. La callose se colore par les bleus d'aniline solubles l'eau (bleu de mthyle employ en solution 1% acidule par 3% d'acide actique). Les membranes cutinises1 : sont acido-rsistantes et se colorent lectivement par la mthode de Ziehl-Nielsen. Les composs pectiques se comportent comme des acides et prennent les colorants basiques (de prfrence en solution acidule 0,05% d'acide actique) mais non les colorants acides, comme la cellulose. Le meilleur ractif de ces composs est le rouge de ruthnium ; en revanche, ils ne prennent pas le rouge Congo ammoniacal. Les mucilages. Les mucilages cellulosiques (rares) ragissent comme la cellulose. Les mucilages pectiques (frquents) se gonflent, se colorent par les colorants basiques et par le rouge de ruthnium. Les mucilages callosiques (qui se dissolvent sans se gonfler) se colorent par le bleu d'aniline en solution actifie mais non par les colorants basiques. Ces mucilages se mlangent entre eux et avec les gommes : il n'est donc pas facile de les identifier. Les lipides. Le ractif le plus commode est le Soudan III en solution alcoolique qui les colore en rouge vif. Ce colorant colore aussi les cires, rsines, cutine, subrine et latex mais ne colore pas la cellulose, la lignine, les mucilages.

La paroi cellulaire des plantes comprend des substances lipophiles d'incrustation, telles que cutine, cires, subrine. La cutine est un compos lipidique hydrophobe, alors que la pectine est une substance hydrophile.

48

c) Techniques mycologiques Milieu alcalin ou acide Si un milieu alcalin dissout ou dforme les cellules, pigments, etc., il faut essayer alors leau ventuellement colore au rouge Congo, losine ou lacide lactique concentr ventuellement color par le bleu coton. Le rouge de ruthnium Colorant remarquable ; il est coteux. Il est soluble dans l'eau mais non dans l'alcool et la glycrine : on le prpare extemporanment (traces de poudre dans un peu d'eau pour obtenir un rouge fonc). Ce colorant colore uniquement les lments basophiles, c'est par excellence le ractif des composs pectiques. Bleu de mthyle au lactophnol ou bleu coton Le bleu de mthyle est un bleu d'aniline habituellement appel bleu coton. Il est un colorant spcifique de la callose. Il colore les membranes callosiques ainsi que le contenu cytoplasmique des hyphes. Ractif iod de Melzer Ce ractif a t cr pour distinguer les parois amylodes, les parois non amylodes et les parois dextrinodes. Ce ractif possde en outre un grand pouvoir claircissant, ce qui le rend pratique pour l'examen des plectenchymes. Le liquide de lugol Ce ractif est excellent pour les champignons filamenteux. Peu rfringent, il claircit peu mais donne des images contours extrmement nets. Il colore lectivement le glycogne en brun acajou qui tranche sur la teinte jaune brun que prennent les membranes et parties non glycogniques du cytoplasme. Le Soudan III au lactophnol Est utilis pour la recherche et la coloration des lipides. le Giemsa et le carmin actique Ils sont recommands par KHNER pour la coloration des noyaux. Voir aussi les travaux de DONADINI et de BERTHET, sur les Discomyctes.

49

Les ractifs sulfoaldhydiques Ils colorent les substances phnoliques (coloration des polypeptides) contenues dans certaines cystides et hyphes. Invents par MAIRE et largement utiliss par ROMAGNESI, ils trouvent leur application dans les russules. En dfinitive, c'est la sulfovanilline qui est prfre, dans un premier temps, bien que moins sensible que d'autres aldhydes : elle a en effet un grand pouvoir de pntration et permet toutes les observations structurelles que l'on souhaite. La prparation est extemporane. Le sulfobenzaldhyde savre galement trs intressant, car il dpasse les limites de la sulfovanilline ! L'acido-rsistance MELZER a appliqu la mthode de la coloration de Ziehl aux incrustations prihyphiques des russules ; ce procd a t largement utilis par ROMAGNESI. Le bleu de crsyl ammoniaco-actique Imagin par LOCQUIN, il met en vidence la mtachromasie, les lipides et le gonflement de certaines strates membranaires.

DEUXIEME PARTIE
LES PRODUITS CHIMIQUES ET LEURS USAGES

(cette partie a t rdige avec le concours de Marcel LECOMTE et des fiches techniques qu'il a publies sur son site Internet) L'objet de ce chapitre est de prsenter, dans l'ordre alphabtique, des notices sur les produits chimiques (colorants, ractifs, milieux d'observation, etc.) de toute nature utiliss en microscopie des champignons, mme les produits les plus simples. Nous nous limitons ici aux produits courants en exposant surtout leurs aspects utilitaires. Ces notices comportent des renseignements recueillis de divers cts : elles ne sont pas tablies selon un schma prconu ; elles peuvent faire en partie double emploi avec les renseignements dj donns ci-dessus. Pour en savoir plus sur les divers produits, il est conseill de prendre connaissance des fiches techniques trs compltes disponibles sur le site Internet de LECOMTE. LECOMTE considre qu'en chimie, il n'y a pas de place pour l'approximation dans le dosage des produits. C'est peut-tre le seul paramtre quil est possible de matriser parfaitement car tous les autres sont sujets caution : le champignon peut tre jeune ou vieux, sec ou imbu et ragir avec d'inconstance, alors il faut lui
50

appliquer des produits et ractifs prpars de manire rigoureuse et constante. Si l'auteur d'une formule annonce des doses prcises, on peut supposer qu'il a expriment et qu'il considre que c'est la meilleure solution. Ka (constante d'acidit) de divers milieux Afin d'avoir une bonne perception du caractre acide ou basique d'un produit ou d'un milieu, il est utile de connatre le facteur Ka de quelques produits classiques. acides faibles : phosphorique : 2 ; lactique : 3,86 ; actique : 4,75 acides forts : chlorhydrique : - 7 ; acide sulfurique : - 3 base faible : ammoniaque : 9,2 bases fortes : potasse et soude : 15,7 En termes de pH, 1 indique un acide fort et 14 une base forte, l'eau tant neutre 7. Acide actique L'acide actique ( 5% en solution aqueuse) est un fixateur non coagulant. C'est un acide faible au pH de 2,4. Il peut tre mlang l'alcool. Il a une vitesse moyenne de pntration et gonfle les tissus qui, fixs, sont extrmement mous. Le cytoplasme imprgn d'acide actique est rendu trs acidophile mais peut prendre aussi les colorants basiques. Le pH optimum pour une bonne fixation est de 4. Les autres acides, notamment lactiques, lui sont trs comparables en tant que fixateurs. En 1976, KHNER a nonc une rgle essentielle, quil considre comme valable pour tous les Hymnomyctes lames : "Les spores dont au moins une couche de la paroi gonfle fortement par le procd ammoniaco-actique (traiter les spores lammoniaque, milieu basique, et ensuite par lacide actique, milieu acide), sont toujours fortement dextrinodes jusqu maturit et puissamment cyanophiles." Acide chlorhydrique (HCl) Lacide chlorhydrique 5% est surtout utilis en microscopie pour la recherche des incrustations acido-rsistantes chez les russules, par la mthode diffrentielle de MELZER. Les incrustations apparaissent comme des petites masses bleu mauve rparties rarement autour des dermatocystides du pileipellis et essentiellement sur les hyphes primordiales. Dans une prparation bien faite, les incrustations sont les seuls lments non dcolors par lacide. Ne pas confondre les incrustations acido-rsistantes qui se trouvent lextrieur des cystides, avec des
51

granulations internes des cystides qui sont parfois aussi vivement colores (il sagit alors souvent de contenus vacuolaires) ! Acide lactique L'acide lactique est un acide faible. Concentr, il est un regonflant trs nergique des exsiccata. Son indice de rfraction assez lev (n = 1,439) en fait un bon milieu d'observation. Si sa viscosit prsente l'inconvnient de rendre la dissociation difficile, elle offre l'avantage de permettre la ralisation de prparations semi-permanentes. Seul, il est relativement peu utilis, mais il entre dans la composition de plusieurs milieux d'observation de trs grande valeur, tels le lactophnol et mieux, le chloral-lactophnol. C'est d'autre part le solvant du bleu de mthyle (ou bleu coton) dans le colorant dit "bleu lactique". Acide nitrique (HNO3) Voir la rubrique aniline. Acide sulfurique (H2SO4) Lacide sulfurique est notamment utilis en combinaison avec la vanilline, pour donner un ractif aussi bien macrochimique que microscopique. La sulfovanilline fait partie des ractifs sulfoaldhydiques, au mme titre que notamment le sulfobenzaldhyde ; elle est le plus utilis de ceux-ci. On la prpare de la manire suivante : dissoudre extemporanment quelques cristaux de vanilline dans une grosse goutte dacide sulfurique 50% en mlangeant avec une baguette en verre. La solution obtenue est jaune clair et saltre rapidement. La sulfovanilline colore en gris ardoise le contenu des laticifres et des cystides (on parle alors de glocystides) de nombreuses russules, ce qui permet de les dceler et de les tudier. Ce ractif est trs prcieux, notamment pour la recherche des dermatocystides, qui passent facilement inaperues dans les autres liquides dobservation. On nutilise pas lacide sulfurique seul comme milieu de montage parce quil dtruit les hyphes et donne de trs mauvaises prparations. Lacide sulfurique est un ractif extrmement dangereux car, tant trs corrosif, trs oxydant et fortement dshydratant, il dtruit la plupart des matires organiques. Il existe une rgle dor quil faut observer lors de la dilution de lacide sulfurique : verser lacide dans leau (et par petites quantits, en agitant) et non pas linverse ; on risquerait de voir leau bouillir et lacide jaillir de tous cts. Enfin, il faut viter de mlanger lacide sulfurique avec des bases (ammoniaque, soude, potasse), car la raction pourrait tre assez violente.

52

Alcool L'alcool est trs hygroscopique1. Miscible l'eau en toutes proportions, il contracte les cellules de la moiti de leur volume. Son association l'acide actique en tant que fixateur est connue depuis longtemps. Il ne fixe pas les lipides mais les dissout gnralement. Il rigidifie les tissus. Il ne fixe pas les hydrates de carbone, sauf le glycogne. Il pntre assez rapidement les tissus. En coagulant, l'alcool dtruit les organites intracellulaires et dforme les noyaux et nucloles. Il n'a pas d'influence notable sur la plupart des colorants et n'empche gnralement pas leur diffusion. Les auteurs recommandent gnralement l'emploi d'thanol. LACHAPELLE emploie avec succs le mthanol usage domestique qui est bien meilleur march. Ammoniaque L'ammoniaque est une solution aqueuse concentre de gaz ammoniac (NH3), qui est un gaz l'odeur extrmement irritante. Les solutions commerciales contiennent gnralement entre 20 et 30% de ce gaz. On peut, pour son utilisation en macrochimie, dposer une petite goutte d'ammoniaque sur la partie du champignon tester, ou bien exposer celle-ci aux vapeurs qui se dgagent du flacon. L'ammoniaque concentre a le pouvoir de ramollir les hyphes de champignons frais et de regonfler les exsiccata. C'est, de plus, le solvant de colorants tels que le rouge Congo. Certains auteurs prfrent diluer deux fois l'ammoniaque, car son action sur les hyphes est alors moins drastique : elle peut ds lors tre applique au montage d'objets plus dlicats. L'ammoniaque est trs volatile, aussi faut-il en ajouter souvent lors de l'observation d'une prparation microscopique. C'est en gnral un trs bon milieu de montage, mais il faut savoir qu'il dissout certains lments comme les incrustations acido-rsistantes de la cuticule des russules et qu'il altre quelquefois la couleur des pigments. On l'utilise notamment pour l'tude 1/ des chrysocystides (cystides dont le contenu vire au jaune sous l'action des bases dans des genres comme Hypholoma ou Stropharia, notamment) ; 2/ des cystides de certains Inocybe qui jaunissent dans l'ammoniaque des degrs divers, ce qui est intressant pour leur identification ;
1

Remarquer que le mthanol est beaucoup moins hygroscopique que l'thanol.

53

3/ des ornements sporiques. Par ailleurs, l'ammoniaque est utile pour liminer l'air dans les espaces interhyphiques : pour cela chauffer la prparation. Dans le cas des spores d'ochrospors (Pholiota, Cortinarius, Alnicola, etc.), l'ammoniaque est un milieu d'observation doublement indiqu : outre son mrite de regonflant, elle possde encore celui de foncer l'ensemble de la spore mais plus vivement les ornements que le reste de la paroi. Le contraste est donc accus et la diffrenciation renforce. Il est bon de savoir que l'ammoniaque, au contact de l'iode, et dans des conditions trs prcises, peut provoquer des ractions caractre explosif. Mais il ny a pas lieu de saffoler ! Aniline Julius SCHFFER a conu en 1933 une raction dite "raction croise" de l'aniline avec l'acide nitrique pour sparer deux groupes d'Agaricus. Cette raction est obtenue en traant sur le revtement du chapeau un premier trait avec une baguette de verre trempe dans l'huile d'aniline, puis un deuxime trait, croisant le premier, avec une autre baguette de verre trempe dans l'acide nitrique. Les constatations au point de rencontre sont les suivantes : - teinte rouge orang = raction positive (ex. A. arvensis). - pas de teinte rouge orang = raction ngative (ex. A. xanthoderma). H.M. FRANK a publi un article dans la revue ZfM (ZfM 51 : 103-108, 1988) o il propose de remplacer la raction de Schffer par le dpt d'une goutte d'un mlange parts gales d'aniline et d'acide actique n'importe quel endroit du champignon. D'un emploi trs facile, ce ractif se conserve malheureusement durant trs peu de temps : il polymrise trs vite ! Bleu coton : voir bleu de mthyle. Bleu de crsyl La solution alcoolique est d'un bleu pur tandis que la solution aqueuse est violace. On peut le faire agir sur des exsiccata ou sur du matriel frais. Le bleu de crsyl est d'abord un colorant gnral des parois. C'est aussi un colorant basique des vacuoles, qui affichent une coloration uniforme ou montrent une inclusion importante de granulations fortement teintes. En solution aqueuse concentre, il colore le protoplasme des cellules en bleu fonc.
54

Sur le plan de la systmatique, il faut accorder beaucoup d'importance la coloration prise par la paroi cellulaire qui peut ragir de diffrentes manires :

soit elle ne se colore pas ; soit elle se colore en bleu ou violet : on parle alors de coloration orthochromatique ; soit elle se colore en pourpre ou rouge (couleurs diffrentes du bleu de crsyl) : on parle alors de mtachromasie.

Le bleu de crsyl permet notamment de mettre remarquablement en vidence l'endospore de la paroi sporique des lpiotes, qui se colore de manire lective en rouge pourpre. Selon KHNER, le bleu de crsyl colore galement de manire caractristique les enclaves ou exsudats lipidiques :

colorer la prparation dans une solution aqueuse de bleu de crsyl ; placer ensuite la prparation dans une goutte d'ammoniaque et observer ; les lipides libres se colorent en jaune dor caractristique tandis que la prparation se dcolore et se salit.

Toujours selon KHNER, les hyphes laticifres et olifres sont observer dans le bleu de crsyl, la sulfovanilline, le bleu coton ou le bleu de toluidine. Les glocystides souvent se colorent slectivement dans le bleu coton ou la SV (aussi le sulfoformol, le sulfobenzaldhyde) mais le bleu de crsyl en colore l'intrieur en bleu profond. En solution alcoolique, il est devenu pour BUYCK un ractif de routine, permettant souvent une observation de qualit suprieure celle ralise dans le rouge Congo ou d'autres ractifs pour pas mal de russules. Le bleu de crsyl est un milieu d'observation rvlant les caractres des dermatocystides et des laticifres : le contenu des cystides prend une coloration bleu verdtre et les hyphes olifres ainsi que les hyphes axiales des cordons de sphrocystes, une coloration bleu fonc dense qui tranchent l'une et l'autre sur le reste de la prparation. Enfin et surtout il rvle de manire prcieuse les incrustations des hyphes primordiales et d'autres cellules. Selon EYSSARTIER, le bleu de crsyl fait apparatre une gangue mtachromatique chez certains plutes. Les effets de ce colorant sont amplement analyss par SINGER. Selon lui, la mtachromasie concerne les parois des spores, des hyphes, le contenu des
55

glocystides, les parois des cystides, des basides et la trame des lames ; elle concerne aussi l'ornementation des spores dans certains genres. Il prcise que l'action sur les hyphes du stipe doit s'observer sur les hyphes intrieures et non les hyphes corticales. Toujours selon cet auteur, plusieurs colorants provoquent des ractions mtachromatiques : bleu diamine, bleu de mthylne alcalin, diffrents violets ou carmins. Il fait remarquer que le bleu de toluidine1 convient souvent mieux que le bleu de crsyl pour mettre en vidence la mtachromasie. HEINEMANN suggre d'utiliser le bleu de crsyl pour l'examen des cystides, celles-ci tant pour la plupart mtachromatiques. L'observation dans le bleu de crsyl demande des coupes extrmement fines. Ce bleu peut se prparer selon la formule de CLEMENON : elle est une alternative commode la solution extemporane qui, elle, se prpare comme suit : sur la lame porte-objet dposer une goutte d'eau et, dans celle-ci, une infime quantit de poudre sur la pointe d'une aiguille lancole, dilacrer fond la coupe (de prfrence sur exsiccata car sur le frais le contenu gne parfois l'observation), laisser se colorer (quelques minutes), dposer la lame couvre-objet, laver l'eau (dposer une goutte d'eau sur le ct du couvre-objet, aspirer le colorant de l'autre ct l'aide d'un buvard) de manire rduire l'intensit de la coloration et observer. Que ce soit pour la mtachromasie, l'amylodie ou la cyanophilie, selon JOSSERAND, il convient d'observer les hyphes par leur section, donc selon le cas, de procder une coupe parallle l'arte, perpendiculaire au rayon du chapeau ou la longueur de stipe de manire voir des hyphes trononnes transversalement et prsentant l'il leur orifice sectionn : de cette faon, on nest pas gn par le contenu de l'hyphe. Aprs un sjour dans le colorant, la coupe est transporte dans le solvant. Le bleu de crsyl donne des rsultats spectaculaires dans la mise en vidence des pigments qu'ils soient vacuolaires ou qu'ils se prsentent sous forme d'incrustations paritales. Ce colorant est particulirement prcieux car l'observation des pigments, s'avrant un exercice difficile, est souvent nglige. La solution alcoolique recommande par CLEMENON donne d'excellents rsultats et se conserve bien : eau distille 55,5 ml, thanol 27 ml (= 21,6 g), glycrine 17 ml (= 21,4 g), Invadin 0,5 ml (mouillant que l'on peut remplacer par un dtergent mnager), bleu de crsyl 0,2-0,5 g.

C'est aussi l'avis et la recommandation de LANGERON.

56

Bleu de mthyle Le bleu de mthyle fait partie d'une famille de colorants bleus acides. Il s'utilise : en solution aqueuse : eau bidistille 100 ml + bleu de mthyle 1 g + agent mouillant 1 cc. en solution aqueuse acidifie l'acide actique : eau bidistille 100 ml + bleu de mthyle 1 g + acide actique glacial 2 cc + agent mouillant 1 cc. en solution alcoolique : alcool thylique 90 100 ml + bleu mthyle 2 g + agent mouillant 1 ml + eau bidistille 100 ml. Bleu de mthyle au lactophnol ou bleu coton - cyanophilie Le bleu de mthyle, aujourd'hui composant courant du bleu coton, peut se mlanger l'eau, l'acide lactique, au lactophnol, au phnol, etc. Selon plusieurs auteurs, la meilleure solution consiste le dissoudre dans le lactophnol raison de 0,5%1. Le lactophnol convient mieux que l'acide lactique, ce dernier tant considr comme trop regonflant et donc ne respectant pas les dimensions des lments. Le bleu de mthyle est un colorant plasmatique et spcifique du collagne : il colore soit la membrane si elle est callosique, soit le contenu cytoplasmique des hyphes. Comme le rouge Congo, le bleu coton colore donc de faon spcifique les parois des hyphes, les cloisons, les boucles, etc. Il colore spcialement bien les ornements non amylodes des spores et les inclusions rfringentes des chrysocystides (aprs un passage dans l'ammoniaque). Il permet surtout d'observer la cyanophilie et prsente, cet gard, une valeur importante dans la spcification de certains genres, crant une diffrenciation rsultant du fait qu'il est absorb ou non selon le genre par les spores, les hyphes, les chrysocystides, certains poils du revtement. La solution ne doit pas tre opaque. Selon SINGER, le bon procd consiste plonger la coupe dans l'ammoniaque ou la potasse, rincer pour liminer ces milieux, colorer ensuite dans la solution de bleu coton. Pour observer la cyanophilie : chauffer et attendre quelques instants (voire quelques heures). La cyanophilie se traduisant par l'aptitude des parois se colorer en bleu, ce qui cre un contraste avec l'intrieur de la cellule, JOSSERAND recommande

Affirmation conteste par certains auteurs qui prfrent l'acide lactique sans phnol.

57

d'observer les hyphes par leur section. Selon le cas, procder une coupe parallle l'arte, perpendiculaire au rayon du chapeau ou la longueur du stipe de manire voir des hyphes trononnes transversalement et prsentant l'il leur orifice sectionn : de cette faon, on nest pas gn par le contenu de l'hyphe. Aprs un sjour dans le colorant, la coupe est transporte dans le solvant. JOSSERAND fait encore remarquer que quels que soient les mrites de ce colorant, il est gnralement d'une slectivit trs faible, parfois mme nulle (avis que nous partageons) : tous les lments se colorent en bleu et si les cystides paraissent d'un bleu incontestablement plus sombre que le tissu alentour, c'est surtout parce que, plus volumineuses que les autres cellules (hymniales ou tramaires), elles fixent le colorant sur une masse plus considrable. Selon SINGER, l'ornementation des spores s'observe bien dans le bleu coton chez les Discomyctes mais galement dans plusieurs genres de Basidiomyctes (Crepidotus, Lepista, Porpoloma, etc.). LACHAPELLE recommande d'essayer d'observer dans le rouge Congo SDS qui donne d'excellents rsultats (il ne l'a toutefois pas encore essay dans de nombreux cas). DONADINI signale que la paroi sporique est constitue de 4 couches : l'endospore, l'exospore, la prispore et l'ectospore ; cette structure n'est pas lisible au microscope photonique. C'est la prispore surtout, et dans une moindre proportion l'exospore, qui sont colores par le bleu lactique1. La prispore est en effet constitue de polyosides du type callose et de composs pectiques. Cet auteur rappelle qu'une bonne observation des ornements de spores doit tre "mobile" pour que l'impression rtinienne soit "volumique", sinon on ne voit qu'un plan. En jouant ainsi sur la profondeur de champ, on observe de plus l'ornementation aux antipodes de la spore, donc l'envers, ce qui donne souvent de prcieuses indications. KHNER a nonc une rgle essentielle, quil considre comme valable pour tous les Hymnomyctes lames : "Les spores dont au moins une couche de la paroi gonfle fortement par le procd ammoniaco-actique sont toujours puissamment cyanophiles". Bleu de mthylne A ne pas confondre avec le bleu de mthyle ! Colorant basique, trs soluble dans leau et lalcool raison de 1%. MOSER recommande, lui, la composition suivante : 0,5 g de bleu de mthylne dissous dans 23 ml d'alcool ; y ajouter 77 ml d'eau et 0,8 g de potasse.

Que l'auteur prfre au bleu au lactophnol.

58

Ce bleu est une solution alternative pour colorer les parois peu visibles de spores incolores. Bleu de toluidine - mtachromasie - structures glifies SINGER prcise que plusieurs colorants provoquent des ractions mtachromatiques : bleu diamine, bleu de mthylne alcalin, diffrents violets ou carmins mais, fait-il remarquer, le bleu de toluidine1 convient souvent mieux que le bleu de crsyl pour mettre en vidence la mtachromasie. Les affinits basophiles du bleu de toluidine, comme du bleu de crsyl, sont nettement renforces par la fixation, notamment par le formol. Pour l'observation des hyphes glifies, JOSSERAND recommande de les observer comme il l'expose pour les phnomnes d'amylodie, de mtachromasie et de cyanophilie, ensuite de voir si l'action de la potasse ne favorise pas l'observation et si le bleu de toluidine ne provoque pas une coloration contrastante utile. A propos des hyphes laticifres et olifres, KHNER2 crit qu'elles sont observer dans le bleu de crsyl, la SV (ou SVB, SF), le bleu coton ou le bleu de toluidine. LACHAPELLE s'inspirant de la formule de CLEMENON pour la prparation du bleu de crsyl en solution alcoolique, a compos une solution de bleu de toluidine comme suit3 : 25 cc de glycrine + 50 cc d'alcool + 100 cc d'eau + 0,5 g de bleu de toluidine4. Cette solution, qui s'avre stable, lui a donn de trs bons rsultats pour l'observation, dans les parties glifies de champignons5, des hyphes cuticulaires, des cloisons, des boucles, des pigments (vacuolaires, intracellulaires, intercellulaires) et, bien entendu, de la mtachromasie. LACHAPELLE considre le bleu de toluidine comme un colorant de base aussi important en microscopie que le rouge Congo, le bleu de crsyl, le bleu coton, etc.

1 2 3 4

C'est aussi l'avis et la recommandation de Langeron. Hymnomyctes agaricodes, p. 903. A noter que l'adjonction de SDS provoque une floculation du colorant qui, ainsi dnatur, devient inutilisable.

La combinaison parts gales de glycrine, d'eau et d'alcool constitue un bon fixateur. Ceci devait conduire normalement bien rvler les pigments et c'est ce que nous avons effectivement pu observer. Exemple le plus significatif : le pileipellis en trichoderme clavul et noduleux de Oudemansiella mucida.

59

Bleu trypan CLMENON, qui recommande le bleu trypan, fait remarquer qu'il donne une coloration trs claire des parois, qu'il ne masque pas les pigments et qu'il laisse le cytoplasme incolore. Le bleu trypan est un colorant acide de la mme famille chimique que le rouge Congo ; il se fixe sur l'amylode. LACHAPELLE a prpar une solution L41 comme suit : eau 80%, KOH 0,8%, NaCl 0,8%, mouillant (1 goutte de Dreft2), 0,1% de phnol, 0,5% de bleu trypan (une petite pointe de cutter !), 20% de glycrine. Mlanger dans cet ordre et laisser reposer 2 heures. On peut aussi prparer un bleu trypan aqueux 1% de la mme manire que le rouge Congo SDS. Quoique LACHAPELLE n'ait pas une trs longue pratique de ce bleu, il confirme l'intrt de ce colorant, au moins comme alternative au rouge Congo lorsque celui-ci ne donne pas satisfaction. Il recommande d'observer la fois dans le rouge Congo et le bleu trypan dans le cas o on se livre une tude approfondie ou de dcouverte d'un champignon. La coloration est d'un joli bleu ple alors mme que la solution est d'un bleu intense ; quoique le contraste ne soit pas trs fort la lisibilit est excellente, grce notamment une trs bonne rfringence. Le cytoplasme n'est quasiment pas color tandis que les parois des hyphes, les cloisons et les boucles sont bien apparentes ; les pigments sont remarquablement mis en vidence. L'agencement des articles au niveau des cloisons, notamment les boucles sont d'une remarquable lisibilit. Mme les granulations sidrophiles de Lyophyllum georgii, par exemple, ressortent bien. En revanche, lorsque les cellules plus particulirement de l'hymnium (basides, cystides) ont un contenu granuleux, le bleu trypan tend se fixer en trop grande quantit et les opacifie. Chloral : voir hydrate de chloral Chloral-lactophnol Formule : hydrate de chloral 20 g + phnol 10 g + acide lactique 10 g. Miscible l'eau. Voir aussi hydrate de chloral.

1 2

Il faut veiller un dosage prcis du KOH et du NaCl selon Clmenon ! Mais pas de SDS en raison de la prsence du KOH.

60

Eau - eau glycrine - "L4" L'eau est un milieu neutre qui respecte (assez) bien ( peu prs) toutes les parties des champignons, en particulier les pigments et la couleur des spores. Toutefois, elle : 1/ ne ramollit pas les coupes, 2/ est volatile, 3/ a un faible indice de rfraction (1,333), 4/ migre progressivement dans les articles provoquant un gonflement qui fausse leur taille. Selon DONADINI, l'eau est un solvant polaire1 qui dissout les composs ioniques tels KOH (potasse) et NaOH (soude) ou des composs polaires tels NH3 ou encore le glucose ou les acides actique et lactique. Elle dissout peu des corps non polaires tels l'iode ou le bleu coton et la plupart des composs organiques. L'eau n'est pas le solvant idal, car elle n'est pas isotonique2 au liquide intracellulaire ; si l'on veut faire des observations in vivo, il faut ajouter l'eau du glucose, raison de 2 5 %. On peut employer de l'eau distille ou bidistille ; LACHAPELLE utilise l'eau de Spa qui est trs peu minralise. Pour remplacer l'eau qui n'est pas un milieu idal, CLEMENON recommande une formule dite L4 l'appui d'arguments chimiques srieux. LACHAPELLE trouve la formule excellente en tant que solution pour la prparation de colorants. Il l'a prpare d'une manire approximative et en remplaant le mouillant Invadin par du SDS3 ou, selon le cas, par un dtergent courant (Dreft, par exemple). L'eau glycrine que recommande IZARRA est proche de la formule du L4 de CLEMENON, la seule diffrence tant l'adjonction de phnol : eau distille 80 g + KOH 0,8 g + NaCl 0,8 g + phnol 0,5 g + Invadin (mouillant) 0,5 g + glycrine 20 g. Le phnol empche la formation d'organismes susceptibles de polluer une

Une substance est dite polaire si sa molcule est caractrise par un champ magntique induit par sa structure propre.

Si deux substances spares par une paroi semi-permable sont isotoniques, il ne se produit pas de phnomne osmotique ni dans un sens ni dans l'autre. Si par exemple un liquide est isotonique au contenu cellulaire d'une spore, celle-ci ne se collapse pas ni ne grossit par changes transmembranaires. Rappel : le SDS n'est pas compatible avec le KOH qu'il faut remplacer par le NaOH.

61

prparation. LACHAPELLE emploie la formule de IZARRA la place de l'eau lorsqu'il souhaite un milieu non color et non volatil : cette eau glycrine donne pleinement satisfaction. Eosine L'osine est un colorant acide qui se dilue dans leau et dans l'alcool et peut se mlanger l'ammoniaque et KOH. Elle colore les plasmas et quelquefois les membranes, elle rend les contours trs nets. La solution aqueuse s'altre facilement et doit tre renouvele. LECOMTE pense que la meilleure manire d'utiliser l'osine consiste pratiquer la coloration rgressive, c'est--dire surcolorer (dans une solution 1% dans H2O) et puis dcolorer l'eau d'abord puis l'alcool 70. Dans la recherche de la formule des trames de polypores (mono-, bi- ou trimitiques), l'osine met particulirement en vidence les hyphes gnratrices. Le rouge Congo quant lui rvle les hyphes squelettiques : c'est pour cette raison que les polyporologues ont imagin une solution mlangeant osine et rouge Congo. Fuchsine phnique de Ziehl - Acido-rsistance La fuchsine est un colorant acide, donc plasmatique. Elle a la particularit d'tre trs sensible aux alcalis, mme faibles. L'picutis de certaines russules prsente des hyphes dites "primordiales" qui se distinguent des hyphes cuticulaires notamment par la prsence de cristaux sur leurs parois. Traites dans la fuchsine phnole, les incrustations de l'hyphe primordiale prennent une coloration rouge ; en revanche, ces incrustations se dissolvent dans plusieurs ractifs dont NH4OH et le Melzer. MELZER a appliqu la mthode de coloration de Ziehl aux incrustations prihyphiques des russules. ROMAGNESI a largement exploit cette particularit. Procd : colorer 10 minutes dans la fuchsine phnique (ou phnole), plonger 1 minute dans l'acide chlorhydrique aqueux 2%. Les structures qui rsistent l'action de l'acide sont dites acido-rsistantes : elles sont mises en vidence par leur coloration en un beau rouge pourpre. Gaac (rsine de gaac) La teinture de gaac a le mrite de rvler la prsence dans la chair de certains champignons de phnoloxydases : mise en contact avec la chair, elle provoque une
62

raction enzymatique qui fait ventuellement apparatre une tache bleue. Cette raction est trs utilise pour l'identification des russules (sur le haut du pied). Soit on utilise une solution alcoolique qu'il faut renouveler une fois l'an, soit on procde extemporanment. LACHAPELLE a toujours procd comme suit (mme si la mthode peut paratre trs approximative) : faire une petite salissure sur la chair avec un grain de gaac (pointe d'aiguille lancole), dposer dessus une goutte d'alcool : observer la vitesse et l'intensit de la coloration. Glycrine Ayant un indice de rfraction entre 1,460 et 1,473, elle peut tre employe comme huile d'immersion. Etant hygroscopique, elle peut servir raliser une plasmolyse de cellules en vue de contracter les vacuoles. La glycrine entre dans la composition de beaucoup de solutions colorantes ou non (souvent raison de 20%). Elle amliore en effet l'efficacit de beaucoup de prparations car elle est ramollissante et peu volatile, elle permet d'liminer facilement les bulles d'air, elle amliore l'indice de rfraction et, en crant un milieu plus visqueux, permet de mieux respecter les lments d'un ventuel dilacrat. Huile pour immersion L'huile pour immersion normalise est synthtique : elle a des qualits dont on peut difficilement se passer si l'on pratique une microscopie exigeante. Son indice de rfraction est de 1,515. On peut aussi utiliser des produits plus "biologiques", comme l'huile de ricin, l'huile de cdre... de qualit extra pure videmment ! Hydrate de chloral L'hydrate de chloral, le chloral-lactophnol, l'acide lactique, le lactophnol sont des milieux de montage trs proches, stables, visqueux et non volatils et ils conviennent la ralisation de prparations semi-permanentes. On peut les qualifier de milieux inertes car ils ne participent aucune raction chimique : il n'est donc pas question de les utiliser comme milieux de dissolution. Ils ont cette qualit de prsenter un indice de rfraction lev, ce qui rend les prparations trs claires et le contour des objets particulirement net. Le chlorallactophnol est de loin le meilleur puisque son indice de rfraction (n) est de 1,49 alors que l'eau distille prsente un n = 1,33...

63

L'hydrate de chloral est un bon regonflant qui convient pour ramollir les exsiccata. Son indice de rfraction est lev, il claircit bien mais en rendant trs transparent, il ne cre pas de contraste. A ce sujet, il ne faut pas perdre de vue que plus l'indice de rfraction est lev, moins le contraste est marqu : cela implique donc d'observer des objets colors naturellement ou d'utiliser des colorants. A cet gard, ne pas oublier que le chloral iod (le "Melzer", utilis pour rvler les structures amylodes et que l'on doit toujours avoir sous la main), grce la prsence d'iode amliore le contraste de la prparation. Lactochloral Formule : eau 10 g + glycrine 10 g + acide lactique 20 g + formol 5 g + acide actique 2 g + hydrate de chloral 5 g. Lactophnol Formule : phnol 20 g + acide lactique 20 g + glycrine 40 g + eau 20 ml. Le lactophnol est un liquide visqueux et incolore. Il est reconnu comme un trs bon milieu d'observation. Son indice de rfraction est assez lev (n = 1,44) : il permet donc la ralisation de prparations trs lisibles. Si sa viscosit importante facilite la conservation des prparations pendant quelque temps, en revanche elle rend la dissociation difficile, quoiqu'elle ait le mrite d'amortir et de diffuser les chocs lors de la dissociation mcanique. Le chloral-lactophnol est suprieur au lactophnol parce que son indice de rfraction est encore meilleur et que la dissociation y est plus facile grce la prsence d'hydrate de chloral, qui ramollit les structures. Cependant, ces deux milieux, s'ils rendent les prparations trs lisibles, ne leur donnent qu'un assez faible contraste (cf. rubrique Hydrate de chloral). Le lactophnol est aussi un bon regonflant qui permet chaud de regonfler les exsiccata. Le lactophnol est intressant, notamment, pour laver les prparations ralises dans le bleu de mthyle au lactophnol (bleu coton). Le fond tant ainsi dcolor, le contraste s'en trouve amlior. Un fond incolore est toujours intressant pour la photomicrographie ; en outre, la viscosit du lactophnol limite le mouvement des objets au cours de l'exposition. Lugol Formule : eau distille 100 ml + iodure de potassium 2 g + iode cristallis 1 g. Le lugol est la base du Melzer. Il est la fois un colorant et un liquide de mordanage (voir supra). Il est un excellent ractif pour l'examen extemporan des champignons filamenteux (espces fibreuses). Etant peu rfringent, il claircit peu,
64

mais donne des images contours extrmement nets. En outre, il colore lectivement le glycogne en brun acajou (raction dextrinode) qui tranche sur la teinte jaune brun que prennent la membrane et la partie non glycognique du cytoplasme. LOCQUIN a dmontr que si on soumet des spores de lpiotes prsentant un pore germinatif de l'acide actique conjugu du lugol faible aprs traitement l'ammoniaque, on distingue alors facilement l'endospore et l'exospore constituant la paroi sporique paisse chez certaines espces de ce genre ; la premire (couche interne), tant beaucoup plus affine pour l'iode, se colore en brun rostre nettement plus tt que la couche externe. Melzer ou chloral iod de Melzer - amylodie, dextrinodie Le ractif de Melzer est un des milieux de montage les plus utiles pour la microscopie. Il met en vidence l'amylodit des lments hyalins ou faiblement colors. C'est un ractif vis--vis duquel les lments observs peuvent avoir trois comportements diffrents : ou bien ils sont iodo-ngatifs (ou achromatiques), ou bien ils sont soit amylodes, soit dextrinodes. L'iodo-ngativit correspond l'absence apparente de raction : les cellules se teintent de jaune bruntre, qui est la couleur du ractif. Des lments amylodes prendront une coloration gris bleu ardoise, voire noire, tandis que les cellules dextrinodes (ou pseudoamylodes) se teinteront de brun rouge fonc. La coloration par liode est une vritable coloration mtachromatique, qui soppose la raction orthochromatique banale, qui est jaune. La raction amylode signale gnralement la prsence d'amidon, tandis que la raction dextrinode rvle le plus souvent les dextrines. HEINEMANN considrant le Melzer comme une teinture (les auteurs le considrent gnralement aujourd'hui comme un ractif), qualifie d"amylode" une raction mtachromatique, de "pseudoamylode", une raction orthochromatique et d"inamylode", une raction achromatique. KHNER a nonc une rgle essentielle, quil considre comme valable pour tous les Hymnomyctes lames : "Les spores dont au moins une couche de la paroi gonfle fortement par le procd ammoniaco-actique sont toujours fortement dextrinodes jusqu maturit ". Le ractif de Melzer est utilis dans de nombreux genres, aussi bien chez les Basidiomyctes que chez les Ascomyctes. Il se rvle particulirement prcieux pour l'observation de l'ornementation des spores des genres Lactarius et Russula. HEINEMANN et THOEN dans leur tude du genre Cystoderma font remarquer qu'il n'est pas ais de distinguer les spores qui sont amylodes de celles qui ne le sont
65

pas. En effet, l'amylodit se voit mal sur matriel frais et mme sur matriel sec regonfl l'ammoniaque, la raction est parfois trs faible. Il y a lieu dans ce cas, aprs regonflement l'ammoniaque, d'utiliser un minimum de ractif de Melzer et de faire l'examen dans l'hydrate de chloral. La plus grosse difficult provient du fait que le sige de la raction est gnralement la prispore et que des spores ayant perdu cette membrane peuvent ne plus tre amylodes. Dans une prparation, il peut arriver que l'on ne trouve que quelques prispores amylodes, parmi de nombreuses spores non amylodes. L'amylodit, lorsqu'elle existe, n'est cependant pas toujours limite la prispore. Certaines espces semblent prsenter une pispore amylode, au moins partiellement hauteur de la plage supra-apiculaire. Pour observer l'amylodie des spores, amener une spore sur une lame reposant sur du papier blanc, dposer une goutte de Melzer et observer la lumire du jour : amylodes, les spores deviennent presque noires (parfois la raction amylode d'une cellule autre que la spore peut tre gris ple avec une teinte violace) sinon elles prennent la couleur jaune brun du Melzer ou deviennent rouge vineux. A propos de l'amylodie des hyphes, rappelons encore une fois que selon JOSSERAND : Que ce soit pour la mtachromasie, l'amylodie ou la cyanophilie, il faut observer les hyphes par leur section, donc selon le cas, procder une coupe parallle l'arte, perpendiculaire au rayon du chapeau ou la longueur du stipe de manire voir des hyphes trononnes transversalement et prsentant l'il leur orifice sectionn : de cette faon, on nest pas gn par le contenu de l'hyphe . Selon KHNER, l'hyphe amylode prend une teinte pourpre ou rougetre alors que la paroi sporique amylode se colore en gris bleu. KHNER propose de prparer le Melzer et d'observer comme suit. Prparer d'abord la solution suivante : iodure de potassium 1,5 g + iode 0,5 g + eau 20 g. Puis mlanger 1 partie de cette solution (par ex. : 5 cm3) et 1 partie (5 g) de chloral hydrat. Laisser agir quelques minutes (la raction est peu prs instantane). Avec la pointe d'une aiguille, transporter la coupe dans une goutte de solution aqueuse concentre d'hydrate de chloral, dpose sur la mme lame. Changer le chloral (en l'absorbant l'aide d'un papier filtre) jusqu' ce que des nuages bruns ou jaunes cessent de s'chapper des pices tudier. Observer dans une goutte de chloral. Le Melzer est soluble dans l'eau et se mlange assez bien NH4OH : rincer l'lment imprgn de NH4OH dans une petite quantit de Melzer que l'on carte ensuite. Phloxine La phloxine fait partie de la mme famille chimique que l'osine ; comme cette dernire, la phloxine est un colorant acide, donc plasmatique, c'est--dire qui peut tre utilis pour colorer le contenu des cellules.
66

En colorant l'intrieur des hyphes, la phloxine, comme l'osine, met l'paisseur de leur paroi en vidence, par diffrenciation de coloration. Lorsque la paroi est mince, elle n'est gure visible (ce qui est gnralement sans inconvnient) ; en revanche, la forme de l'lment ressort ainsi trs bien. Cette facult peut tre mise profit, notamment dans les cas suivants : pour distinguer les terminaisons des poils piliques de Lactarius vellereus et ceux de L. bertillonii ; pour rvler la forme des hyphes des mycnes revtement dit "en brosse" ou la forme des hyphes des marasmes ou collybies structure dite "ramealis" (hyphes bourgeonnantes ou en puzzle) ; pour l'observation de l'paisseur de la paroi des cystides des inocybes ; pour analyser les trames comportant plusieurs types d'hyphes (notamment chez les polypores et dans divers genres). Ici, c'est la prise diffrencie de colorant par chaque type d'hyphe qui aide dmler la formule de la trame. A cet effet, les polyporologues font un usage courant de la phloxine ou de l'osine seules, ou en mlange avec le rouge Congo. Potasse (ou soude) Les proprits de la potasse (KOH) et de la soude (NaOH) sont pratiquement identiques. Il en est de mme de leurs utilisations macro- et microchimiques. Le facteur Ka (constante d'acidit) de ces bases fortes est d'ailleurs identique 15,7. En microscopie, la solution de potasse la plus utilise est de 5% voire de 2 ou 3% dans l'eau. La solution 5% convient bien pour la plupart des observations : elle a des effets semblables l'ammoniaque concentre mais prsente l'avantage d'tre sensiblement moins volatile et d'tre inodore. On peut donc, au lieu d'ammoniaque concentre, employer de la potasse 5% pour toutes les observations courantes. A 10%, on utilise la potasse pour l'tude des champignons trs durs, tels que les polypores et les crotes qui peuvent rsister trs longtemps la dissociation dans la potasse 5%. Plus concentre, la solution 10% ( fortiori 20 ou 40%) exerce une action beaucoup plus rapide mais elle prsente le dsavantage d'tre trs agressive et de dissoudre certains lments. La solution 10% peut galement tre intressante lors de l'observation des champignons glatineux (Auricularia, Tremella) parce qu'elle liqufie les mucilages, ce qui est d'un grand secours lors de la dissociation. Comme l'ammoniaque, la potasse regonfle les exsiccata. La potasse convient bien lorsqu'on souhaite observer la disposition des lments entre eux car elle les met en vidence et vite une dissociation, par pression
67

ou chocs, qui disperse les lments. Lorsque l'on veut observer de fines structures, il faut prfrer une faible concentration (2-3%) ou l'ammoniaque, base plus douce. Une prparation contenant du SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) induit une prcipitation de la potasse qu'il faut remplacer par de la soude. Une coupe teinte au rouge Congo, l'osine ou la phloxine peut tre observe ensuite dans la potasse ou la soude ; en revanche, il ne faut pas prparer ces colorants dans une solution aqueuse de potasse ou de soude car la base dtruit la longue le colorant. Rouge Congo ammoniacal Le rouge Congo est un colorant acide, c'est--dire qu'il a tendance se fixer prfrentiellement sur les structures basiques. Il colore particulirement bien les parois des cellules de champignons ; c'est pour cela qu'il est un des colorants les plus utiliss en mycologie gnrale. Le rouge Congo ammoniacal 1% est un excellent milieu pour toutes les observations courantes, ralises au dpart dexsiccata, grce aux remarquables qualits regonflantes et ramollissantes de l'ammoniaque et a l'avantage supplmentaire de colorer la paroi de la plupart des hyphes, ce qui augmente le contraste et facilite ainsi l'observation et l'interprtation. Le rouge Congo ammoniacal doit tre chauff puis refroidi brusquement pour chasser les bulles de gaz. Il est recommand d'ajouter de la glycrine dans la solution raison de 20%, ce qui la rend franchement moins volatile, vite les bulles d'air et permet une dilacration qui respecte mieux les cellules. Le rouge Congo peut se diluer dans l'eau (trs peu efficace), l'ammoniaque ou la potasse : c'est la solution ammoniacale qui tait la plus employe jusqu' ce que CLEMENON propose une solution aqueuse au SDS (voir infra). Mis en prsence dacide lactique (le PVA lactophnol par exemple, qui est un milieu de montage dfinitif), il devient noir instantanment ; on restitue la couleur originale avec une goutte dammoniaque. Rouge Congo aqueux SDS : une nouveaut essentielle pour la mycologie ! CLEMENON ayant dcouvert le mouillant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) en dit normment de bien. Voici son avis : "Lorsque j'ai essay ce ractif (solution aqueuse 1% de rouge Congo avec 1% de SDS) sur des basidiomyctes, j'ai t surpris par la clart de la coloration. Contrairement aux solutions aqueuse et ammoniacale de rouge Congo, les parois des hyphes, les cloisons et les parois des basides taient slectivement et intensment colores dans le rouge Congo SDS, le
68

cytoplasme demeurant absolument incolore. Mais la surprise essentielle concerne le dolipore trs tnu et cercl par un paississement parital en forme de bourrelet, le dolipore est souvent obstru par une masse cytoplasmique. Alors que le bourrelet parital a parfois l'aspect d'un petit bouton au centre de la cloison, le dolipore luimme n'est gure visible sous le microscope optique. Par contre, dans le rouge Congo SDS, non seulement le bourrelet parital est trs lisible, mais aussi parfois le dolipore lui-mme, parce que la masse cytoplasmique obturante n'est pas colore." "Le SDS tant un excellent regonflant, la majorit des champignons peuvent tre examins directement dans le rouge Congo SDS, sans usage prliminaire d'une solution alcaline. Mais si l'on prfre examiner une prparation d'abord dans une solution alcaline et y regonfler et ramollir du matriel sec, il faut alors viter de le faire dans KOH, car le potassium induit des prcipits en prsence de SDS". Il faut remplacer le KOH par le NaOH. L'usage du rouge Congo aqueux au SDS s'avre un conseil particulirement judicieux. Il assure une trs belle coloration, la prparation tant souvent remarquablement claire et lisible. Il cre une bonne diffrenciation entre les types de cellules observes. Il met particulirement bien en vidence les parois des hyphes, des basides et des cystides ; des lments souvent difficiles observer tels que les cloisons, les boucles et les hyphes glifies sont bien mis en vidence. Cette solution peut rvler de petits dtails qui souvent passent inaperus. L'observation de l'picutis des russules, par exemple, donne des rsultats d'une interprtation souvent lumineuse ! La facult de diffrenciation de ce rouge Congo SDS est telle qu'il peut rendre inutile l'emploi d'autres colorants ou ractifs spciaux. SDS : voir rouge Congo SDS Soude : voir potasse. Sulfate de fer Le sulfate ferreux se prsente sous forme de petits cristaux verts l'tat hydrat et de poudre blanchtre l'tat anhydre. Pour l'utilisation, il suffit de frotter le cristal sur la partie du champignon tester. Certains auteurs conseillent l'utilisation d'une solution aqueuse 30% de sulfate de fer ; c'est l'alternative qui s'impose lorsquon ne dispose pas de cristaux mais de sulfate en poudre. Les ractions que provoque cette solution sont gnralement beaucoup plus rapides et plus vives que celles que provoque le cristal. La solution telle quelle "rouille" en quelques heures : on en prolonge considrablement la vie en ajoutant quelques gouttes d'acide sulfurique. D'une manire gnrale, le cristal est prfr la solution, par mconnaissance de celle-ci
69

et du moyen de la stabiliser. Le sulfate de fer est surtout employ lors de la dtermination des russules. Sulfovanilline (SV) Le contenu des cystides ainsi que celui des laticifres des russules prennent gnralement une remarquable couleur dans divers colorants, tel le bleu de crsyl, ou ractifs, (sulfovanilline, sulfobenzaldhydique (SBA), sulfopipronal (SP)). Si la raction de la SV est moins forte, elle prsente, selon ROMAGNESI, l'avantage de confrer aux coupes ou dilacrats une plus grande lisibilit : on peut y faire toutes les observations structurelles, mesurer les basides et cystides. Lutilisation du benzaldhyde est particulirement intressante pour mettre en vidence les pilocystides de la cuticule des russules, qui seront annonces SBA + ou SBA : ce test est considr comme un critre de dtermination majeur !

Choix du milieu d'observation (orientation pour les observations gnrales)


1 structure glatineuse.................................................................... bleu de toluidine 1' autres cas ................................................................................................................ 2 2 observation des parois et des lments du revtement rouge Congo, bleu trypan 2' autres observations................................................................................................. 3 3 observation des pigments ou des granulations localiss dans les revtements ou la trame............................................................... bleu de crsyl, bleu de toluidine 3' observation du contenu des cellules ...................................................................... 4 4 lments non lipodes....................................................................osine, phloxine 4' lments lipodes.............................................................. bleu de crsyl, fuchsine Rappelons que l'ouvrage de MOSER M. (1978), Kleine Kryptogamenflora, Die Rhrlinge und Bltterpilze, 4e d. donne des conseils prcis sur les colorants et ractifs employer dans la plupart des cas.

70

Matires colorantes : en guise de rsum et d'orientation


Produit code bleu de crsyl 51010 bleu de mthyle (bleu coton) 1 42780 basique acide Famille chimique oxazines Utilisations coloration des membranes mtachromatiques, des lipodes, du protoplasme

triarylmthanes colore soit la membrane si elle est callosique, soit le contenu cytoplasmique des hyphes colore les tissus cyanophiles (chrysocystides, ornements non amylodes des spores) coloration du contenu des hyphes gnratrices et squelettiques - coloration des glocystides thyazines coloration mtachromatique - colorant nuclaire, des corps chromophiles - convient pour les structures glatineuses colore les membranes, pas le cytoplasme, l'amylode

bleu de toluidine 52040 bleu trypan carmin actique chloral iod de Melzer osine 45380 fuchsine

basique

acide

polyazoques

colorant naturel colorant des noyaux (granules carminophiles des Lyophylles : sidrophilie) colorant minral acide basique xanthnes coloration iodophile colorant du plasma - phloxines, rythrosines et osines intensifient les contrastes

triarylmthanes si identique la no-fuchsine : colorant nuclaire, de certains lipides, du glycogne, de la cytologie vgtale - incrustations acidorsistantes (coloration rgressive) polyazoques coloration des parois, de la cellulose, l'amylode

rouge Congo 22120

acide

Le bleu de mthyle est le bleu employ aujourd'hui dans la solution du bleu coton. Ses autres noms : Baumwollblau, Anilinblau, Methylblau, Chinablau, Wasserblau, Tintenblau, Color Index 42755 selon Moser et 42780 selon Lecomte.

71