1.- Micropropagacin (clonacin) de coliflor: (Adaptado de Practical biology. National Centre for Biotechnology Education, 1995. http://134.225.167.114/NCBE/PROTOCOLS/menu.

html) INTRODUCCION Una de las plantas usadas para experimentos de micropropagacin para estudiantes de secundaria es el coliflor. Este material es ideal para cultivo de tejidos vegetales porque se encuentra fcilmente disponible, es lo suficientemente resistente para soportar su manipulacin por parte de estudiantes y crece rpidamente. El crecimiento puede observarse despus de 10 das y en 12 semanas se obtienen plantitas listas para ser transplantadas. MATERIALES: Para cada estudiante o grupo de estudiantes - El corazn de la coliflor - Agua destilada estril (100 cm3) - Etanol al 70% (50 cm3) - Hipoclorito de sodio al 2.5% (a partir de blanqueador domstico comercial dependiendo de su concentracin) con unas gotas de detergente lquido (100 cm3) - 3 Tubos de ensayo o recipientes de vidrio con 2 a 5 cm3 de medio de crecimiento vegetal descrito posteriormente. - Una caja de petri estril - Bistur y pinzas mecnicas estriles. - Algodn no absorbente (en rama) y papel de aluminio. Medio para cultivo de tejidos vegetales (para preparar un litro): - Azucar granulada (sacarosa) 20 g. - Agar de 4 a 8 g de acuerdo con la capacidad de gelificacin. - Medio comercial Murashige y Skoog (M & S) 4.7 g. Solucin Stock de kinetina 25 cm3. La solucin stock de kinetina debe contener 0.1 g de kinetina en 1 L de agua destilada. Como la kinetina no se disuelve fcilmente en agua debe disolverse en una solucin de hidrxido de sodio. La solucin debe mantenerse en la nevera a 5 C. Para preparar el medio de cultivo disuelva el azcar, el medio M & S y el agar en 725 cm3 de agua destilada, agregue la solucin de kinetina y distribuya el medio en los tubos de ensayo. Se requerirn entre 2 y 5 ml por tubo. Tapone los tubos con algodn no absorbente y cbralos con papel de aluminio. Coloque los tubos cerrados en un autoclave a 121 C por 15 min. Cuando estn fros los tubos pueden refrigerarse hasta que sea requeridos. El medio M&S y la kinetina se encuentran disponibles en representantes y distribuidores cientficos. DETALLES PRCTICOS: Limpie el rea de trabajo con etanol al 70% (mantenga el etanol alejado del fuego) Trabajando sobre una de las cubiertas de la caja petri estril corte pequeos trozos del corazn de la coliflor. Coloque los trozos de coliflor dentro de la solucin de blanqueador por 5 a 10 min. para la limpieza superficial del tejido. Desde este punto en adelante es muy importante realizar las operaciones en forma rpida y asptica con el fin de prevenir la contaminacin. Enjuague los explantes en tres beakers sucesivos con agua destilada estril, utilice pinzas flameadas y enfriadas para hacerlo la forma correcta de hacerlo es sumergir la parte inferior de ellos y pasarlos por la llama del mechero para encender el etanol. Con la combustin del etanol se caliente la superficie de los instrumentos causando la muerte de los organismos contaminantes. No caliente las pinzas ni bistures al rojo vivo y recuerde que siempre debe mantener el etanol lejos de las llamas. Los explantes pueden dejarse en el beaker final de agua estril cubiertos con una tapa estril hasta que se necesiten.

Tome uno de los tubos de ensayo con el medio de crecimiento, retire el tapn de algodn y flamee ligeramente el cuello del tubo. Utilice pinzas flameadas fras y rpidamente colquelo dentro del tubo. Vuelva a colocar las pinzas en el recipiente con etanol. Flamee nuevamente el cuello del recipiente y tpelo. Repita el paso 6 con los otros tubos. Los tubos deben mantenerse en un lugar iluminado y a temperatura media. El crecimiento debe evidenciarse en 10 das. Si hay contaminacin, esta ser evidente en poco tiempo. Ausencia de crecimiento de ningn tipo generalmente indica que el blanqueador no se enjuag en forma adecuada. SEGURIDAD Deben utilizarse guantes plsticos de seguridad al manipular la kinetina. Los estudiantes deben usar anteojos de seguridad al utilizar la solucin blanqueadora. El etanol que se utiliza para limpieza de la superficie y el material debe mantenerse siempre alejado de la llama. INFORMACION ADICIONAL Plant tissue culture by Tony Storr (1985) Experimenting with Industry No.13, Association for Science Education. ISBN: 0 86357 031 3. Department of Microbiology, University of Reading NATIONAL CENTRE FOR BIOTECHNOLOGY EDUCATION National Centre for Biotechnology Education, 1995 2. Transformacin gentica en discos de hoja de tabaco. (Adaptado de Adapted from :Trish Russell- 1993. Woodrow Wilson Biology Institute ..\..\..\AEPC/WWC/Woodrow Wilson Index ..\..\..\index.htmlActivities Exchange Index) INTRODUCCIN: Este es un experimento de transformacin de plantas relativamente simple. Los estudiantes estn trabajando material vegetal completo y no requieren medir cantidades muy pequeas aunque pueden tener evidencia de clulas vegetales transformadas (clulas vegetales que contienen genes de plsmido bacterianos). El experimento puede ampliarse para trabajos futuros con el material transgnico. Este es un experimento adecuado para estudiantes que estn familiarizados con los principios bsicos de la estructura celular vegetal, cultivo de tejidos, tcnicas estriles, y transformacin celular (infeccin bacteriana, vectores de plsmidos, genes marcadores, medio de seleccin y ensayos de actividad enzimtica). MATERIALES (para cada grupo de 2 o 3 estudiantes) Da 1: Nicotiana tabacum (hojas de tabaco) Suspensin de 16 horas (overnight) de Agrobacterium tumefaciens (A.t.) conteniendo plsmidos Ti. Los Ti plsmidos (pBIRG2) deben estar modificados con el gen de B-glucoronidasa. Tijeras y pinzas estriles. Un mechero Pinzas Un beaker conteniendo etanol del 80 al 95% para flamear las pinzas y limpiar el rea de trabajo. Un tubo de centrfuga estril de 50 ml con una tapa ajustada. 25 ml de etanol al 70% para esterilizar la hoja. 25 ml de Clorox al 10%. 150 ml de agua destilada estril. Papel de filtro estril (de 5 a 10 cm2) Papel de aluminio para envolver las cajas de petri. 1 caja de petri estril vaca 2 cajas de petri estriles conteniendo el medio de cocultivo: Sales basales Murashige & Skoog (Sigma #5519) 3 mg/L de kinetina (Sigma #K0752) 0.3 mg/L de BAP (Sigma #B9395) 1% de agar (10 g/L) Da 3: 15 minutos

Pinzas estriles Mechero y etanol para flamear las pinzas Papel de aluminio 2 cajas de petri estriles conteniendo el medio de seleccin: Sales basales de Murashige & Skoog 3 mg/L de kinetina 0.3 mg/L de BAP 400 mg/L de Karbenecilina (Sigma #C3416) 20 mg/L de benomil, 50% mojable (disponible en almacenes de jardinera) 50 mg/L de kanamicina (Sigma # K4378) 1% de agar (10g/L) Da 5: (De 15 a 30 min., espere de 1 3 horas o durante la noche, y luego 15 min.) Reactivo histoqumico X-Gluc 10 ml de buffer de fosfatos 50 mM, pH 7.0 a. Combine 39 ml de 0.2 M NaH2PO4 (31.2 g/L), 61 ml 0.2M Na2H PO4 (28.39 g/L). Esto hace 100 ml de un buffer de fosfatos 200 mM. B. Diluya el buffer de fosfatos 200 mM en una proporcin 1:4 con agua destilada. ii Colorante X-Gluc: Disuelva 5 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucoronido (X-Gluc) (Sigma # B6650) en 100 mL de dimetilformamida. Pipetas de 1 ml o pipetas de transferencia. Placas de 24 pocetas (varios grupos pueden compartir una placa). Una caja de Petri. Bistur y pinzas estriles (si desea mantener el cultivo de discos de hoja) Estereoscopio. PRECAUCIONES DE SEGURIDAD: El etanol es muy inflamable. Los estudiantes deben sumergir el extremo de sus pinzas en el etanol y luego pasarlas ligera y cuidadosamente por la llama del mechero. Las mesas de trabajo deben estar libres de papeles y cuadernos de apuntes con el fin de reducir el riesgo de un incendio. Se recomienda utilizar anteojos de seguridad. NOTAS PARA EL PROFESOR: Clulas lesionadas en la periferia de cada disco de hoja pueden liberar citolasma. Algunos de los compuestos de este citoplasma liberado pueden estimular la transformacin de otras clulas. El mecanismo exacto de la transformacin (debilitamiento de la pared/membrana etc.) no se encuentra claramente establecido. Despus de que se finalice el ensayo de B-Glucoronidasa, los estudiantes pueden dejar los discos de hoja estriles remanentes en medio de cultivo hasta que aparezcan en la hoja pequeos callos de tejido indiferenciado. Estas clulas pueden cultivarse en medio de crecimiento para futuros experimentos. INSTRUCCIONES/RECOMENDACIONES PARA LOS ESTUDIANTES. INTRODUCCIN En el experimento de transformacin vegetal descrito aqu, puede observar un buen modelo para el movimiento de genes hacia clulas vegetales. Mediante la incubacin de porciones de hoja de tabaco junto con clulas bacterianas (Agrobacterium tumefaciens) bajo condiciones controladas, las clulas bacterianas infectarn el tejido vegetal, y ciertos genes plasmdicos se movern de las clulas bacterianas al ncleo de las clulas vegetales. Parte del DNA el plsmido se volver parte del DNA de las clulas vegetales. Cuando esto ocurre, y las clulas vegetales regeneran en una planta completa, la planta se conoce como una planta transgnica. La bacteria A. Tumefaciens se utiliza en este tipo de transformacin gentica en razn de sus propiedades naturales de transformacin gentica. En condiciones naturales, esta bacteria causa una enfermedad tumorignica en las plantas conocida como agalla de corona. Esta enfermedad se caracteriza por la produccin de tumores en las plantas despus de la infeccin por parte de la bacteria a sitios con heridas. Al ser infectadas, se producen masas de tejido indiferenciado que forman el tumor de la agalla de corona. Este tumor es el resultado de la expresin de genes responsables de la

produccin de hormonas vegetales que son insertados (introducidos) a las clulas de la planta por los plsmidos bacterianos. Estas hormonas de crecimiento se producen en las clulas infectadas transformadas en cantidades que solamente se encuentran normalmente en tejido embrionario vegetal. El plsmido inductor de la agalla de corona es un plsmido de 200 kilobases, denominado el plsmido Ti (inductor de tumor). El segmento especfico del plsmido responsable por la transformacin (transferencia de genes) es el T-DNA (DNA de transferencia) de unas 13 kilobases, el cual transporta genes para las hormonas de crecimiento de las plantas (auxinas y citoquininas). Cuando el T-DNA es transferido a una planta, las clulas comienzan a producir las hormonas de crecimiento. Una seccin adicional del DNA plasmdico controla el proceso de transformacin; los genes de virulencia (vir) regulan la transferencia del T-DNA desde el plsmido hasta el DNA de la planta. Una vez que este mecanismo modelo de transformacin vegetal fue conocido y comprendido, el Agrobacterium empez a ser utilizado para la obtencin de diferentes tipos de plantas transgnicas. Si un cientfico desea producir una planta transgnica con un gen dado, adiciona ese gen a la secuencia contenida dentro del DNA del plsmido Ti, y empleando el mecanismo de infeccin natural del Agrobacterium, puede obtener plantas transgnicas. En la bacteria que se utiliza para el presente experimento, el plsmido Ti (pBIRG2) ha sido modificado y contiene un gen que codifica para una enzima denominada la B-Glucoronidasa, tambin llamado el gen GUS. En este experimento, el estudiante estar buscando evidenciar que el gen GUS, y por consiguiente, el DNA del plsmido conteniendo el gen GUS, ha sido transferido a sus clulas vegetales. Mediante la adicin a las placas que contienen las clulas transformadas de un sustrato (X-Gluc) para la B-Glucoronidasa, el estudiante podr identificar aquellas que efectivamente contienen la enzima y por consiguiente deben contener el DNA del plsmido. En los sitios donde ocurre la reaccin enzimtica se forma un precipitado azul. Esta coloracin azul indica la presencia de clulas transformadas. METODOS. DIA 1. Limpie su mesa de trabajo con etanol antes de colocar ningn material o equipo. Obtenga una hoja madura. Esterilice la superficie de la hoja de la siguiente manera: Tome la hoja y colquela en un recipiente de vidrio. Agregue alrededor de 25 ml de etanol 70% al recipiente. Asegrese de que el etanol cubra completamente la hoja y djelo actuar por 2-4 minutos. De este punto en adelante, debe utilizar pinzas para todas las transferencias de la hoja. Previo a cada transferencia que realice, debe sumergir el extremo de las pinzas en etanol y pasarlo por la llama del mechero. NO mantenga las pinzas en la llama: simplemente sumrjalas en el etanol y pselas a travs del mechero. Cuando la llama de las pinzas se apague, djelas enfriar un poco y utilcelas. Descarte el etanol y reemplcelo por clorox 10%. Deje actuar por 2-5 min. Si observa blanqueamiento de los mrgenes de las hojas, remueva el blanqueador. Descarte la solucin de clorox y agregue agua destilada estril, dejndola por 2-3 minutos. Repita el enjuague con agua destilada estril tres veces. A partir de las hojas desinfestadas, y utilizando pinzas y bistur estriles, corte individualmente unos 40 segmentos (discos de hoja) de un tamao aproximado de 1-1.5 cm2. Este procedimiento debe realizarlo sobre una superficie estril, la cual puede ser una de las cubiertas de una caja de Petri. Conserve los discos de hoja obtenidos en una caja de Petri estril. Utilizando pinzas flameadas, retire alrededor de 15-20 (uno por uno) y vaya colocndolos en una de las cajas de Petri que contienen medio de cocultivo. Realcelo muy cuidadosamente, con el fin de mantener la esterilidad del recipiente de cultivo. Debe mantener la caja de cultivo cubierta y solamente destaparla brevemente para colocar cada uno de los discos, teniendo la precaucin de no contaminar la tapa. Agregue a la caja de Petri (sin medio) que contiene los discos sobrantes 1.5 ml del cultivo de Agrobacterium (del cultivo desarrollado durante la noche). Incube durante 5-10 min, agitando la caja con mucha suavidad a intervalos de 2 minutos y teniendo extrema precaucin para no derramar el medio.

Utilizando pinzas flameadas, remueva uno a uno los discos de la caja con la solucin bacteriana, y remueva el exceso de lquido mediante un ligero toque en un papel de filtro estril (colocado en otra caja de Petri estril). Coloque los discos en otra de las cajas de Petri que contienen medio de cocultivo. Asegrese de que sus cajas de cocultivo queden muy claramente identificadas de tal manera que distinga cul contiene los discos expuestos a la bacteria y cul es el control no expuesto a la bacteria. Envuelva las cajas completamente en papel aluminio e incbelas durante 48 horas a temperatura ambiente. DIA 3 Utilizando pinzas estriles, transfiera los discos de las dos cajas de Petri con medio de cocultivo a dos cajas de Petri que contengan medio selectivo. Coloque los discos con la parte inferior de la hoja hacia arriba. Mantenga condiciones de esterilidad para realizar el proceso, y nuevamente marque cuidadosamente las cajas. Envuelva las cajas en papel aluminio e incube a temperatura ambiente durante otras 48 horas. DIA 5 Agregue a cada poceta de la placa 0.5 ml del reactivo histoqumico X-Gluc. (Varios grupos pueden compartir la placa). Utilizando pinzas estriles (si desea conservar los cultivos), tome dos discos de hoja de una de las cajas de discos en medio selectivo y colquelos en una caja de Petri. Segmente los discos en cuatro. Coloque un segmento de hoja en cada una de 4-6 pocetas (le sobrarn segmentos de hoja). Repita el procedimiento con dos discos de la otra caja con discos en medio selectivo. Descarte los segmentos sobrantes preferiblemente en un recipiente para llevar a esterilizar antes de botarlos. No descarte sus discos en cultivo. Incube sus segmentos de hoja con el X-Gluc a 37 C durante 1-3 horas (o durante la noche si es ms conveniente). Examine los segmentos de hoja en busca de alguna coloracin azul con la ayuda del estereoscopio. Tome nota del nmero de manchas azules localizadas, y del nmero de hojas con respuesta de coloracin para cada uno de los dos tratamientos. Envuelva nuevamente sus cajas de cultivo en papel de aluminio y obsrvelas nuevamente en 3-7 das. Si empiezan a aparecer como pequeas burbujas el la superficie de la hoja, habr obtenido tejido productor de callos (pequeas masa de clulas indiferenciadas). Utilizando procedimientos en condiciones de esterilidad, puede transferir los callos y cultivarlos en nuevo medio selectivo o en otro medio de crecimiento especializado para observaciones y experimentos futuros con tejido vegetal transgnico. PREGUNTAS: La principal diferencia entre el medio de cocultivo y el selectivo es la presencia de agentes antibiticos y antifngicos (carbenicilina, kanamicina y benomil) en el medio selectivo. Por qu es este medio crucial para el experimento? Qu problemas prevera usted si no se utiliza el medio selectivo? Cules son todos los controles utilizados en este experimento y por qu es necesario cada uno? Qu sugiere la presencia de la coloracin azul en los discos de hoja? Basado en sus resultados del ensayo GUS con los discos de hoja, cuntos de los otros discos podra predecir que tienen clulas transformadas? Explique su respuesta y presente sus clculos. Cmo se lograra la obtencin de plantas transgnicas a partir de las clulas transformadas en este experimento? Observe diariamente los dos cultivos de discos de hoja durante un par de semanas adicionales, despus del experimento de transformacin. Registre sus observaciones para ambos cultivos. Qu evidencia hay, si la hay, de que efectivamente ocurri la transformacin en aquellas clulas expuestas al cultivo bacteriano? 3. Ms jugo de manzanas. Informacin Adicional: Madden, D. (1991). In a jam and out of juice NCBE Newsletter, Winter 1991, pp. 1-5. (Adaptado de Practical biology. National Centre for Biotechnology Education, 1995.http://134.225.167.114/NCBE/PROTOCOLS/menu.html)

La extraccin enzimtica del jugo de manzanas fue introducida hace unos 30 aos, y actualmente se procesan anualmente en el mundo, alrededor de 3-5 millones de toneladas. El proceso de produccin comercial se describe a continuacin. Despus de que las manzanas han sido trituradas, se dejan durante 20-30 minutos con el fin de que los inhibidores enzimticos de la pulpa se oxiden. Posteriormente la pulpa se calienta a 30 C previo a la adicin de las pectinasas (esto puede compararse con la temperatura requerida de 50-60 C cuando no se utiliza enzima). El tratamiento enzimtico puede tomar entre 15 minutos y 2 horas, dependiendo de la naturaleza exacta de la enzima, de la dosis, la temperatura de reaccin y la variedad de manzana utilizada. Algunas variedades como la Golden Delicious, son especialmente difciles de degradar. Durante la incubacin, las pectinasas degradan la pectina soluble de la pulpa, permitiendo que el jugo fluya ms fcilmente. Luego, las manzanas son prensadas. Los rendimientos de jugo pueden incrementarse hasta en un 20% por el tratamiento enzimtico, dependiendo de la edad y la variedad de manzana utilizada, as como de la utilizacin de pre-oxidacin. El tratamiento con pectinasa es particularmente efectivo con manzanas maduras y con aquellas provenientes de almacenamiento en fro. Generalmente no se obtienen aumentos significativos en rendimiento cuando se utilizan manzanas frescas del inicio de la estacin. Materiales. Manzanas enteras o pulpa de manzana (esta puede prepararse previamente o comprarse). Enzima pectinasa comercial, la cual se diluye en agua inmediatamente antes de su uso. Filtros de papel para caf, 2. Cuchillo (si no se va a utilizar pulpa ya lista). Varillas de vidrio, 2. Jeringas de 2 cm3, o pipetas, 2 (para medir el agua y la enzima). Embudos, 2. Probetas de 100 cm3, 2. Beakers de 100 cm3, 2. Bao Mara a 40 C Reloj alarma de laboratorio. Procedimiento. Corte una manzana mediana en pedazos pequeos. Coloque la mitad en un beaker y la otra mitad en el otro. Agregue 2 cm3 de la solucin diluida de pectinasa a uno de los beakers y 2 cm3 de agua al otro. Mezcle el contenido de cada beaker utilizando una varilla de vidrio limpia. Incube los beakers en el bao mara a 40 C durante 15-20 minutos. Filtre separadamente el jugo de manzana de cada uno de los beakers, utilizando filtros de caf y embudos colocados en las probetas. Registre el volumen de jugo obtenido de los dos lotes de pulpa de manzana, a intervalos de 5 minutos. SEGURIDAD. El jugo de manzana obtenido por este procedimiento NO DEBE CONSUMIRSE. La proporcin de enzima que se utiliza en este experimento es considerablemente ms alta que la utilizada en la produccin comercial de jugos, en la cual, normalmente se agregan 130 cm3 de solucin enzimtica por cada tonelada de manzanas. Los estudiantes deben ser extremadamente cuidadosos al manejar los cuchillos para cortar la manzana. Cualquier material que se derrame en la superficie de trabajo debe limpiarse inmediatamente y lavar bien el rea. ACTIVIDADES FUTURAS. Compare el rendimiento en jugo de diferentes variedades de manzana (u otras frutas). Investigue los efectos de la dosis de enzima y de la temperatura de incubacin sobre el rendimiento del jugo. Compare el rendimiento de jugo de la pulpa que ha sido, o no, sometida a preoxidacin. La adicin de celulasa puede incrementar la produccin de jugo? Al combinar pectinasa y celulasa, se presentar un incremento en el rendimiento del jugo?

4. Aislamiento de DNA de plantas. De: Henry, R.J. 1997. Useful routine protocols in plant molecular biology. En: Practical Applications of Plant Molecular Biology. Chapman & Hall, London, UK. pp. 178-180. PROCEDIMIENTO. Utilizando un mortero, pulverice la muestra vegetal (hojas, tallos, etc.) con nitrgeno lquido. Transfiera el tejido molido a un tubo de un tamao adecuado, y agregue 1 ml de buffer de extraccin [2% (p/v) bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA] por cada gramo de tejido vegetal. Mezcle invirtiendo el tubo suavemente y caliente a 55 C durante 20 min. Centrifugue a 15 000 x g durante 5 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio y agregue un volumen de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1). Mezcle invirtiendo el tubo suavemente durante 2 min., y centrifugue a 15 000 x g por 20 segundos. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo limpio y agregue 1/10 de volumen de acetato de amonio 7.5 M y dos volmenes de etanol enfriado en hielo. Mezcle invirtiendo el tubo suavemente y colquelo en el congelador a 20 C durante 60 min. Centrifugue a 15 000 x g durante 1 min. y descarte el sobrenadante. Lave el precipitado (pellet) dos veces sucesivas con etanol 70% (v/v), mezclando cada vez con suavidad. Seque el DNA en un desecador. El DNA obtenido puede ser resuspendido en un volumen adecuado de TE buffer (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) o en una solucin adecuada para la aplicacin que se requiera. 4.1 Sitios en Internet de protocolos en biotecnologa: http://www.nal.usda.gov/bic/Education_res/ http://www.biotech.iastate.edu/publications/ed_resources/Web_sites.html http://www.biotech.iastate.edu/Educational_resources.html http://www.bio.com/resedu/educate.html http://www.nal.usda.gov/bic/Education_res/protocols/ http://chroma.mbt.washington.edu/outreach/outreach.html http://www4.nas.edu/beyond/beyonddiscovery.nsf/web/seeds?OpenDocument http://sunsite.berkeley.edu/pcr/ http://biotech.icmb.utexas.edu/pages/scitools.html http://134.225.167.114/NCBE/PROTOCOLS/menu.html Agrobacterium: Una bacteria natural del suelo que puede ser utilizada para transferir genes a las clulas vegetales. Callo: Masa de clulas indiferenciadas (tejido vegetal). Explante: Porcin de tejido vegetal utilizado para iniciar procesos de cultivo de tejidos o micropropagacin. Kanamicina. Un antibitico de la familia de los aminoglicsidos que puede interferir con los procesos celulares de traduccin mediante enlace con los ribosomas. Resistencia especfica a este antibitico es un sistema de marcador de seleccin usado frecuentemente en clulas transgnicas. Plsmido Ti ( inductor de tumor): Un plsmido de Agrobacterium tumefaciens que es responsable de la formacin de tumores en las plantas infectadas. Plsmidos Ti, modificados genticamente, se utilizan como vectores para introducir DNA forneo a clulas vegetales. Plsmido: Un elemento gentico extracromosmico presente en muchos cepas bacterianas. Los plsmidos son pequeas molculas circulares de DNA utilizados como vectores para la transferencia de genes de un organismo a otro.

Bibliografa Aramendis R.H. (Ed.) 1999. Bioseguridad. Un nuevo escenario de confrontacin internacional entre las consideraciones comerciales, medioambientales y socioeconmicas. Organizacin de Estados Americanos/Colciencias. Tercer Mundo Editores S.A., Bogot, Colombia. 93 p. Cohen J.I. 1994. Biotechnology priorities, planning and policies: a framework for decision making. A Biotechnology Research Management Study. ISNAR Report No. 6. The Hague International Service for National Agricultural Research. The Hague, The Netherlands. 49 p. Geneve, R.L., J.E. Preece & S.A. Merkle. 1997. Biotechnology of ornamental plants. CAB International. University Press, Cambridge 402 Gil L.H. e Irarrzabal C.M. (Eds.) 1999. Biotecnologa en Chile: oportunidades de innovacin tecnolgica. CamBioTec: Iniciativa Canad-Latinoamrica en Biotecnologa para el Desarrollo Sustentable. Impresos Universitaria S.A., Santiago, Chile. 137 p. Hall, R.D. 1999. Methods in molecular biology: Plant cell culture protocols. Volumen III. Humana Press Inc. New Jersey.421 p. Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies, Jr & R. L. Geneve. 1997. Plant propagation. Principles and Practices. Prentice Hall. 770. Johnston, A. & A. Sasson. 1986.New technologies and development. Unesco.Paris.281 p. Kendall H.W., Beachy R., Eisner T., Gould F., Herdt R., Raven P.H., Schell J.S. and Swaminathan M.S. 1997. Bioengineering of Crops. Report of the World Bank Panel on Transgenic Crops. Environmentally and socially sustainable development studies and monographs series, 23. The World Bank, Washington, USA. 31 p. Komen J. and Persley G. 1993. Agricultural biotechnology in developing countries: a crosscountry review. ISNAR Research Report No. 2. The Hague International Service for National Agricultural Research. The Hague, The Netherlands. 45 p. National Science and Technology Council USA. 1995. Biotechnology for the 21st Century: New horizons. A report from the Biotechnology Research Subcommittee. U.S. Government Printing Office, Washington, USA. 87 p. National Science and Technology Council. 1995. Biotechnology for the 21st Century: New Horizons. A report from the Biotechnology Research subcommittee. 89 p. OECD. 1994. Biotechnology for the clean environment. Organisation for economic co-operation and development. Paris. . 202 p. Persley G.J., L.V. Giddings & C. Juma. 1993. Biosafety: The safe application of biotechnology in agriculture and the environment. Research Report No. 5. The Hague: International Service for National Agricultural Research. ISNAR. 39 p. Sasson A. 1993. Biotechnologies in developing countries: present and future. Vol 1: Regional and national survey. UNESCO Publishing. Imprimerie des Presses Universitaires, Vendme, France. 764 p. Sasson, A. 1998. Plant Biotechnology derived products: Market-value estimates and public acceptance. Kluwer Academic Publishers, London van Dommelen A. 1999. Scientific requirements for the assessment of food safety. Biotechnology and Development Monitor. No. 38, 2-7. Vasil, I.K. 1999. Plant biotechnology: Achievements and opportunities at the threshold of the 21st. In: Plant Biotechnology and in vitro biology in the 21st century. Altman, A., M. Ziv, S. Izhar, Eds. Kluwer Academic Publishers, London. 9-16

http://www.robertexto.com/archivo7/protocolos.htm