Determinacin

de Actividad de Enzima Amilasa de

Trichoderma harzianum en

Fermentaciones Sumergidas y Obtencin de Biomasa (esporas) en medios Slidos. Determination of amylase activity of Trichoderma harzianum in submerged fermentation Obtaining Biomass(spores) on solid media. Luis Jos Toro Tejada Resumen Se determin la actividad enzima amilasa de Trichoderma harzianum en cultivos sumergidos en caldo con sales minerales y almidn como nica fuente de carbono en muestras de 0, 24, 72, 96 horas de incubacin, los mayores niveles se lograron en muestras de 24h de incubacin con una concentracin de 0,180 mg/L de azcares reductores lo que conlleva a una actividad amilasa de 4,321 mg AR/mL/h. se compararon los rendimientos en las fermentaciones solidas utilizando como sustrato arroz con distinto espesor de lecho 25, 50 y 75g, en el cual se pudo observar crecimiento de micelio de color verde grisceo esporulado con mayor rendimiento a 25g de espesor en comparacin con las dems muestras, siendo esta de mejor costo beneficio con un promedio de 4,73E+10 Cel/g. Palabras clave: Trichoderma harzianum, cultivos sumergidos, actividad amilasa, fermentaciones solidas. Abstrac Enzyme activity was determined Trychoderma harzianum amylase in submerged

culture in mineral salts brothand starch as sole carbon source in samples of 0, 24, 72, 96 hours of incubation, the highest levels were achieved in 24 samples of incubation with a concentration of 0.180 mg / L of reducing sugars which leads toa 4.321 mg amylase activity of AR / mL / h. compared the yields of solid fermentation using rice as a substrate with different thickness of bed 25, 50 and 75g, in which growth was observed gray-green myceliumsporulated with higher yield to 25g thick compared to other samples , this being the most cost-effective with an average of 4.73 E +10 Cel / g. Key words: Trychoderma harzianum, submerged cultures, amylase activity, solid fermentations.

Introduccin Los hongos del gnero Trichoderma sp. Son un grupo de microorganismos que habitan importante abundante naturalmente de suelos materia en un nmero con en agrcolas, orgnica

a nivel industrial utilizado como agente biocontrolador de hongos fitopatogenos, para la obtencin de productos como enzimas y antibiticos. En la experiencia se busca la produccin de enzimas amilasas determinar los rendimientos y recuperacin de productos, a travs de fermentaciones sumergidas y solidas. Materiales y Mtodos Sustrato y medio de cultivo El Sustrato usado en la fermentacin en medio slido fue arroz blanco dispuesto a distintos espesor de lecho (25, 50 y 75g iniciales de arroz). El sustrato utilizado en la fermentacin sumergida fue un caldo con sales minerales y almidn como nica fuente de carbono, dispuesto en muestras de 0, 24, 72, 96, horas de inoculacin. Cepa y Preparacin del inoculo El microorganismo usado para la produccin de amilasa en la fermentacin sumergida fue la cepa de Trichoderma harzianum. El inoculo primario se obtuvo a partir de una suspensin de las esporas del hongo en un caldo con sales minerales y almidn como nica fuente de carbono y agitados a 80 rpm a 25C.

descomposicin y altas densidades de races. Su desarrollo se ve favorecido por la presencia de otros hongos que atacan a los cultivos. Trichoderma sp. Se encuentra ampliamente distribuido en todo el mundo en diferentes zonas, adems tambin se suelen hallar asociados a la superficie de plantas y cortezas de madera descompuesta, en diferentes hbitat (Harman, 1996). T. harzianum se caracteriza por sus conidiforos terminados en filidas, esporas lisas, hialinas, con un solo ncleo, verdosas, subglobosas u ovoides y colonias de crecimiento rpido (7-9 cm) (GAMS& BISSETT, 1998). El inters cientfico despertado por los hongos de este gnero, se debe a las caractersticas antagnicas que presentan frente a hongos fitopatgenos. Entre los mecanismos de control, est la competencia por nutrientes o espacio, el micoparasitismo y la antibiosis. Estos tres mecanismos no son excluyentes sino que actan sinrgicamente en el control de los patgenos. (Harman y Kubicek, 1998). La importancia de este hongo radica principalmente en su aprovechamiento

En las fermentaciones slidas de T harzianum se cont con arroz ya esporulado para procesos a distinto distintos espesor de lecho (25, 50 y 75g iniciales de arroz). Fermentaciones sumergidas Se dispuso de muestras de cultivo sumergido inoculado con esporas del hongo y agitado a 80rpm a 25C. Las muestras tomadas fueron de 0, 24, 72, y 96 horas de incubacin. Se realiz una filtracin para separar biomasa del sobrenadante (Filtro de jeringa acetato de celulosa DISMIC 13CP de 0,45). Se esteriliz una alcuota de 1ml en el autoclave que sirvi de control del proceso. A 150L de sobrenadante se les aadieron 50L de solucin de almidn al 0,5%; luego de mezclarlas se tomaran 100L de muestra para determinar los azcares reductores (AR) iniciales, los cuales fueron congelados a 20C/24h, los restantes 100 L se incubaron a temperatura ambiente por 24h. Determinacin que se realiz por triplicado y al pasar la 24h se descongelaron las muestras para determinar AR iniciales agregando 100L de DNSA (cido dinitrosaliclico) a cada tuvo (AR iniciales y finales). Se calentaron en bao de agua hirviendo por 5 minutos, luego de enfriar se agreg 1ml de agua destilada, a para determinar densidad ptica 540nm.

(Previamente se realiz un blanco con agua destilada) se realiz una curva de calibracin de la glucosa y se compar la actividad amilasa entre los distintos tiempos. Fermentacin en medio slido (FMS) La fermentacin en medio slido se realizo en un solo medio, en distintos espesor de lecho, se depositaron cada uno por separado en un recipiente dispuesto para ello se agreg agua corriente hasta cubrir todo el material fermentado, con una paleta se homogeneiz el material y se pas por un colador; se repiti la operacin hasta que la suspensin de lavado de esporas aclar, se agito y se determin el volumen. Se tom una alcuota de 1ml y se procedi a realizar una dilucin seriada hasta 1/100 y se determin el nmero de esporas/ml en una Cmara de Neubauer. Se compararon los rendimientos en las fermentaciones con distinto espesor de lecho y se determin cual es la condicin que tiene mejor relacin costo beneficio.

Resultados y discusin Fermentaciones sumergidas La tabla. N3. Muestra los Resultados obtenidos en las fermentaciones sumergas de Trichoderma harzianum efectuadas en caldo con sales minerales y almidn como nica fuente de carbono, Se emple el mtodo cido dinitrosaliclico (DNS) para determinar los azucares reductores obtenidos de la hidrlisis enzimtica (amilasa) de almidn, puesto que en presencia del grupo reductor de la glucosa se reduce el cido 3,5dinitrosaliclico de coloracin amarilla a cido 3-amino-5nitrosalicilico de coloracin rojo ladrillo. leda en espectrofotmetro a una longitud de 540nm y sensibilidad media, para registrar la absorbancia generada y clculos de desviacin estndar, cual se reemplaz en la ecuacin lineal arrojada por la curva patrn (Fig.1) para obtener la glucosa residual que respecto a la actividad enzimtica neta obtenida en caldo de cultivo; los mayores niveles se lograron en muestras de 24h de incubacin con una concentracin de 0,180 mg/L de azcares reductores lo que conlleva a una actividad amilasa de directamente proporcional a mayor 4,321 mg AR/mL/h. Como se observa es una relacin concentracin de azucares reductores mayor actividad amilasa, a dems de que a mayor concentracin de azucares ms intensa es la coloracin del cido 3-amino-5nitrosalicilico de coloracin rojo ladrillo. Fermentaciones slidas La Tabla. N4. Muestra los Resultados obtenidos en las fermentaciones slidas de Trichoderma harzianum efectuadas sobre arroz a distinto espesor de lecho 25, 50, y 75g; en el cual se pudo observar crecimiento micelio de color verde grisceo ya esporulado con mayor rendimiento a 25g de espesor en comparacin con las dems muestras, siendo esta de de mejor costo beneficio con un promedio de 4,73E+10 Cel/g. Esto se debe a las condiciones del medio lo que evidencia una relacin inversamente proporcional, a menor espesor de lecho mayor crecimiento.

Tabla. N1. Valores de absorbancia Tiempo 0 0 0 0 0 0 24 24 24 24 24 24 72 72 72 72 72 72 96 96 96 96 96 96 Abs inicial 0,027 0,03 0,021 0,001 0,005 0,02 0,113 0,068 0,11 0,078 0,057 0,04 0,395 0,326 0,323 0,421 0,41 0,41 0,658 0,529 0,396 0,323 0,414 0,303 Abs final 0,013 0,009 0,031 0,002 0,005 0,02 0,352 0,341 0,318 0,669 0,79 0,527 0,626 0,702 0,648 0,586 0,614 0,618 0,526 0,486 0,603 0,536 0,538 0,566 Diferencia final-inicial 0 0 0,01 0,001 0 0 0,239 0,273 0,208 0,591 0,733 0,487 0,231 0,376 0,325 0,165 0,204 0,208 0 0 0,207 0,213 0,124 0,263 0,1345 0,113332696 0,2515 0,081183126 0,421833333 0,214938518 0,001833333 0,004020779 Promedio por cada tiempo Desviacin estndar

Tabla. N2. Datos Curva Patrn concentracin mg/L 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000 Promedio de absorbancia
0,5

Curva patrn de glucosa

0,4 Absorbancia 575nm 0,3 0,2 0,1 0 0,000 -0,1 y = 0,442x - 0,0064 R = 0,9923

0 0,049 0,064 0,132 0,174 0,209 0,248 0,307 0,346 0,372 0,46

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

Concentracin (mg/L)

Fig. N1. Curva de Calibracin de la Glucosa

Disponible en: http://es.scribd.com/doc/56421369/DETERMINACIONDE-AZUCARES-REDUCTORES-POR-LA-TECNICA-DE-MILLER

Tabla.N3. Actividad Amilasa

Tabla. N4. Rendimiento en las fermentaciones con distinto espesor de lecho

Concentracin Tiempo de azucares reductores (mg/L) 24 72 96 0,180 0,105 0,053

Actividad Amilasa (mg AR/mL/h) 4,321 2,514 1,273

Espesor de lecho (g) 25 25 25 50 75 75 75

Cel/g 6,13E+10 1,76E+10 6,29E+10 7,26E+09 5,08E+09 4,07E+09 5,08E+09

Promedio Cel/g 4,73E+10

7,26E+09 4,74E+09

Conclusiones En fermentaciones sumergidas se evidenci que la mayor activada amilasa se registra a las 24h de incubacin, estableciendo una relacin directamente proporcional; a mayor concentracin de azucares reductores mayor actividad amilasa. En funcin a la produccin de enzimas este tiempo de incubacin nos da la idea de en qu momento se debe hacer la extraccin de las enzimas para su comercializacin. Al igual que en las fermentaciones slidas nos indica cual es el espesor ptimo para la produccin de esporas para el aprovechamiento en relacin costo beneficio, siendo este de 25g iniciales de arroz; estableciendo una relacin inversamente proporcional, a menor espesor de lecho mayor crecimiento.

Cuestionario 1. Cuadro comparativo entre fermentaciones slidas y sumergidas.

FERMENTACIONES SLIDAS

FERMENTACIONES SUMERGIDA

Medios simples. Requieren adicin de agua o una Medios con mayor cantidad de ingredientes, mayor solucin mineral. Sustratos variables costo. Buena reproducibilidad en medios definidos Baja Aw reduce riesgos de contaminacin Mayores riesgos de contaminacin

Medios diludos, Volmenes de fermentacin Medios concentrados. Elevada concentracin de grandes. Altas concentraciones de medio puede producto Menor volumen de reactor afectar crecimiento. Alimentacin de sustrato es comn Menor consumo de energia para aerear Transferencia G-L es generalmente limitante

Mezclado intenso. Mezclado imperfecto o casi imposible. Difusin La difusin de nutrientes es generalmente no puede limitar el proceso limitante Remocin de calor es crtica. Transferencia de Alto contenido de agua facilita control de calor por evaporacin puede ser importante Temperatura Control del proceso dificultoso. Estimacin de biomasa no es directa Amplio desarrollo en sistemas de medicin y control

Contaminacin de producto con componentes del La remocin de grandes volmenes de agua medio es alta Bajos volmenes de efluentes aumenta costos en los procesos de separacin y lquidos purificacin Cintica y fenmenos de transporte poco conocidos Modelos cinticos y difusionales

Los microorganismos utilizados son Por lo general cualquier microorganismo aunque es fundamentalmente hongos, en algunos casos ms frecuente levaduras y bacterias. pueden ser: levaduras y bacterias.

2. Principales medidas de cuidado que se deben considerar al instalar e iniciar un proceso en un fermentador sumergido. Esterilidad; llevar a cabo la instalacin e iniciar un proceso fermentativo de este tipo, en ausencia de contaminacin es un requisito fundamental. El diseo de tomas de muestras y sellos mecnicos, el acabado de la superficie del tanque, as como la conexin de vlvulas y aditamentos, juega un rol importante en un diseo exitoso. La homogeneizacin, la transferencia de oxigeno y la agitacin mecnica. La remocin de calor; en vista de que las temperaturas de fermentacin son moderadas (25 a 40 C) y el cultivo de clulas es un proceso exotrmico.

3. Composicin particular del medio en la fermentacin sumergida de esta experiencia. La utilizacin de un caldo con sales minerales y almidn como nica fuente de carbono en la experiencia, se debe por la actividad amilasa, puesto que las amilasas son enzimas las cuales hidrolizan molculas de almidn dando como productos dextrinas y polmeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa. Esta familia de enzimas hidroliticas esta compuesta por protenas catalticas: alfa-amilasa, beta-amilasa, glucoamilasa, isoamilasa. Como bien es conocido las cadenas de almidon estn compuestas por dos grandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La alfa-amilasa se caracteriza por atacar los enlaces 1,4-alfa-glicosidicos en el centro de la cadena de los polisacridos, por lo que se conoce como endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligosacridos. Por ello la importancia del almidn en el medio de cultivo para tener una alta actividad amilasa y poder determinarla. 4. Mecanismo qumico por el cual se determina la cantidad de azucares reductores con acido dinitrosaliclico (DNS) Este mtodo analtico, para la determinacin de azcares reductores, se fundamenta en el hecho de que una unidad de celulasa (IU) genera un micromol de azcares reductores, expresados como glucosa, en 1 minuto, bajo las condiciones del mtodo. El reactivo consiste en una disolucin formada por los siguientes compuestos: cido dinitrosaliclico (cido 2-hidroxi-3,5dinitrobenzico), que acta como oxidante; sal de Rochelle (tartrato sdico-potsico), que impide la disolucin de oxgeno en el reactivo y hidrxido sdico, que aporta el medio requerido para que se produzca la reaccin redox. De esta forma, el cido 2-hidroxi-3,5dinitrobenzico se reduce, en presencia del grupo reductor

de la glucosa, formando el acido 3-amino-5-dinitrosaliclico, mientras que el grupo aldehdo reductor se oxida, para formar un grupo carboxlico. En este mtodo analtico el DNS est en exceso frente a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores concentraciones de azcares reductores provocan una mayor coloracin de la muestra. Estas diferencias de coloracin pueden determinarse por espectrofotometra visible, a la longitud de onda de mxima absorbancia de 540nm. 5. Espesor de lecho y densidad aparente en una fermentacin slida. El espesor de lecho se refiere a la cantidad de sustrato disponible para una fermentacin slida, ms especficamente al grosor en se ha dispuesto para la fermentacin. Y la densidad aparente es la relacin entre el volumen de aire contenido en el sustrato y el volumen total del sustrato. La porosidad en el sustrato est determinada por la geometra y tamao, por lo que una eventual compactacin modifica el volumen y porosidad hasta alcanzar un equilibrio. Bsicamente una desidad aparente y espesor de lecho altos van a incidir en la fermentacin slida dependiendo del tipo de sustrato y microorganismo con que se trabaje, pero se ha observado un mejor crecimiento en fermentaciones con menor espesor de lecho, por consiguiente que a menor espesor de lecho mayor crecimiento se obtendr, al igual que a una densidad aparente alta favorecer el crecimiento debido al oxigeno que favorece segn sea el caso de crecimiento microbiano. 6. Birreactores para fermentacin en estado slido Biorreactor Biocon: Biocon dise, desarroll y patent un nuevo biorreactor llamado PlaFactor TM para llevar a cabo fermentaciones usando matrices slidas. El sistema fue higinicamente diseado y automatizado para un proceso de cultivo en charola, el cual ya es utilizado para un proceso de cultivo eficientemente en plantas industriales en Biocon, en el desarrollo de productos de uso alimenticio. La fermentacin se lleva a cabo en un biorreactor controlado por computadora. Todas las operaciones del proceso fermentativo, como esterilizacin, enfriamiento, inoculacin, control, recuperacin, de producto y post-esterilizacin, se realiza en un solo equipo. El equipo consta de charolas selladas colocadas una sobre la otra formando dos torres unidas por un eje central. Cada mdulo cuenta con un brazo de mezclado, el cual rota alrededor axialmente, y con canales de remocin de calor metablico, control de humedad, aireacin y vapor para la esterilizacin. Este equipo fue diseado con el objetivo de reemplazar los cuartos de incubacin por un equipo ms compacto. El equipo PlaFactorTM es un sistema que cuenta con estudios del uso cultivos slidos para la produccin de agentes de biocontrol y productos farmacuticos a nivel industrial, los cuales requieren altas condiciones de asepsia y condiciones de alta precisin (Suryanayan, 2000).

Biorreactor de lecho fluidizados: Sistema de operacin en modo continuo el cual puede ser operado por altos periodos de tiempo a un alto valor de productividad, Los primeros biorreactores constaban de un cilindro de vidrio, con o sin chaqueta, llenado por una carga completa de lecho o sustrato, sin embargo causaba problemas de compactacin. Las variaciones en el lecho han permitido un mejor funcionamiento de este sistema ya que se utilizan pedazos de esponjas, troncos naturales, polmeros sintticos, as como tambin canastas o cajas delgadas de acero inoxidable, que cuenten con perforaciones que permiten tener una eficiente inmovilizacin de las clulas en el soporte con el medio de cultivo (Ogbonna, 2001; rivela, 2000). Dichos soportes son llenados por el medio slido a fermentar, los cuales fueron previamente colocados a lo largo del contenedor. El principio del diseo se basa de proveer agitacin y aireacin por flujo forzado de aire proveyndolo por la parte del cilindroa travs de una bomba. El sistema provee un incremento en la transferencia de oxigeno a la cama de sustrato, sin embargo, se presenta dao al inoculo por causa del gran esfuerzo de corte generado, adems de que se forman gradientes de temperaturas a travs de la columna que puede afectar el producto deseado.

Referencias Bibliogrficas Determinacin de azcares reductores por la tcnica de miller (dns). Dispinible: http://es.scribd.com/doc/56421369/DETERMINACION-DE-AZUCARES-REDUCTORES-PORLA-TECNICA-DE-MILLER GAMS, W & BISSETT, J. (1998). Morphology and identification of Trichoderma. In:Trichoderma and Gliocladium. Vol. 1. 3-34 pp. Eds. Taylor & Francis. London. HARMAN, G. E., LATORRE, B., AGOSIN, E., SAN MARTN, R., RIEGEL, D. G., NIELSEN, P. A., TRONSMO, A. & PEARSON, R. C. 1996. Biological and integrated control of Botrytis bunch rot of grape using Trichoderma spp. Biol. Control, 7: 259-266. Harman, G .; Kubicek, C . 1998 . Trichoderma and Gliocladium . London: Taylor and Francis Vol . 1, pp . 25-40 Ogbonna. J. C., Mashima, H.,Tanaka, H. (2001). Scale up of fuel etanol production from gar beet juice using loofa sponge immobilized bioreactor. Bioresource Technology 76, 1-8 Rivela. I., Rodrguez Couto, S., Sanromn, A. (2000). Extracellular ligninollytic enzyme productin by Phanetrochaete Chysosporium in new solid-state bioreactor. Biotechnology Letters 22, 14431447. Suryanarayan, S. (2000), Current industrial practice in solid state fermentation: the biocon india esperience. Biochermical Engineering Journal. 13, 189-195