CLASE CICLO CELULAR, CROMATINA Y CARIOTIPO NORMAL DOCENTE: PATRICIA ESCORCIA MORA TEMAS A TRATAR

CICLO CELULAR INTERFASE MITOSIS MEIOSIS LA CROMATINA NUCLEOSOMA FIBRA DE CROMATINA SOLENOIDE SUPRAEMPAQUETAMIENTO EL CARIOTIPO NORMAL LA SIEMBRA EL PROCESAMIENTO EL ANALISIS TIPOS DE BANDEO LOS POLIMORFISMOS

CICLO CELULAR
La clula como unidad de vida que es tomada desde su concepcin ms simplista, se encuentra sometida a una serie de transformaciones y cambios que suceden continua y peridicamente durante su tiempo de vida, permitindole crecer, madurar, especializarse, dividirse entre muchas otras cosas. Esta alternancia de eventos constituyen lo que se denomina ciclo celular. (4,7). Para que una clula se desarrolle, tres cosas deben ocurrir: la masa celular debe incrementarse, debe haber una duplicacin del material gentico y debe haber un proceso de divisin que asegure que cada clula hija recibe un complemento igual e idntico del material gentico para asegurar la perpetuacin de su lnea.(7). En la mayora de las clulas eucariota, por ejemplo se da un ciclo celular que evidencia dicha progresin de eventos a travs de 2 etapas fundamentales de Divisin y no divisin. La de divisin est relacionada a su vez con dos procesos el de Mitosis y el de Meiosis y la de No Divisin con el de interfase.(Ver Diapositiva 3). INTERFASE Anteriormente se crea que la interfase era dedicada solamente al crecimiento y al cumplimiento de las funciones celulares normales. Sin embargo ahora se sabe tambin que interviene en un paso bioqumico crtico y en la preparacin de la clula para que la divisin ocurra. Se han descrito entonces 4 fases:

El perodo presinttico o G1 ( GAP 1): se caracteriza por el crecimiento e incremento en la masa celular que ocurre siguiendo la divisin celular precedente, por la proliferacin de las constituyentes citoplasmticas como RNA, organelos, membranas y ribosomas y porque la informacin Gentica se observan constituida por una simple cromtida altamente descondensada (cromatina). El perodo sinttico o S: en la cual el material gentico de cada cromtida es replicado, de tal forma que se obtienen copias exactas denominadas Cromtides Hermanas. El perodo pos-sinttico o G2 (GAP 2): considerado como el segundo perodo de crecimiento celular dado que el volumen citoplasmtico de tales clulas, se iguala al de la clula que las origin; mientras que los cromosomas habiendo ya sufrido su duplicacin aparecen formados por dos cromtidas unidas por el centrmero. Cuando las clulas humanas crecen fuera del organismo en un cultivo in vitro, por ejemplo, se requieren 24 horas en promedio para que se produzca un ciclo celular completo; (los tiempos reales varan segn las lneas celulares estudiadas), y la mayor parte del tiempo se consume en la interfase, dado que la etapa de divisin tarda menos de 1 hora.(4,8). En muchos tipos celulares la longitud de S y G2 depende del tiempo empleado en la G1, puesto que en un punto tardo de sta etapa las clulas deben escoger 1 de 2 caminos posibles: Alejarse del ciclo celular para hacerse quiescentes en una fase que se llama G0 (Gap 0) donde permanecen viables y metablicamente activas aunque no son proliferativas. Algunas entran en esta etapa permanecen un tiempo y salen y otras entran pero nunca reingresan al ciclo nuevamente (como las clulas diferenciadas-Neuronas). Tambin pueden Iniciar la sntesis de DNA y dar paso a los otros procesos para continuar el ciclo celular.(4,8). MITOSIS La Mitosis fue primero descrita en 1879 por Walter Flemming como la base de la etapa de divisin del ciclo celular de clulas somticas. Es un proceso crtico para todos los organismos eucariticos, porque entre muchas otras razones, provee la base para la reproduccin asexual de muchos organismos unicelulares, es la base para el desarrollo y crecimiento de los organismos pluricelulares y es fundamental en la curacin de heridas y el reemplazamiento de clulas en ciertos tejidos.(4,2). La divisin celular comprende dos procesos: La citocinesis: o reparticin del volumen citoplasmtico en dos partes, seguido por el encerramiento de ambas clulas hijas dentro de una membrana citoplasmtica distinta, mientras que las organelas citoplasmticas se originan a partir de estructuras membranosas pre-existentes, por autorreplicacin o por sntesis de Novo.

La cariocinesis o reparticin del material gentico que est dentro del ncleo entre 2 clulas hijas. (Ver Diapositiva 7). La cariocinesis es ms compleja y requiere una mayor precisin, ya que los cromosomas deben ser primero exactamente replicados y luego apropiadamente distribuidos para que al final cada una de las clulas hijas, presente una composicin cromosmica idntica a la clula parental. Por tal motivo la mitosis se describe formada por varias fases consecutivas definidas por las caractersticas morfolgicas, estructurales y de comportamiento que van presentando los cromosomas a lo largo del ciclo. (Ver Diapositiva 13). (3,4). Estas son:

Profase: ( 35 minutos)
Al rededor de la mitad del proceso mittico se emplea en esta etapa ya que significativos eventos tienen lugar en ella. En sta etapa los cromosomas que ya se haban duplicado en el periodo S de la interfase, inician un progresivo empaquetamiento, de tal forma que al finalizar la etapa pueden ser visualizados como unidades discretas con apariencia de bastones conformados por 2 cromtidas unidas por un centrmero. As mismo, la membrana nuclear y el nucleolo dejan de hacerse visibles, mientras que los centrolos migran por la periferia del ncleo hacia los polos opuestos de la clula para dar paso entre s al huso acromtico. (Ver Diapositiva 9). En una etapa tarda de la profase se ha definido una subetapa por las caractersticas de descondensacin y definicin de estructura que presentan los cromosomas. La prometafase, nombre como se conoce sta subetapa, es muy utilizada para estudios de alta resolucin, dado que los cromosomas estn lo suficientemente descondensados como para evidenciar perfectamente su morfologa y un mayor nmero de bandas en comparacin con los mtodos convencionales que utilizan cromosomas metafsicos.

Metafase: ( 3 minutos )
Se caracteriza por la migracin de los cromosomas al plano ecuatorial de la clula y su unin por el centrmero a las fibras del huso acromtico por un punto especfico el cinetocoro. Las cromtidas del cromosoma metafsico estn fuertemente enrolladas y permiten visualizarlo como una entidad discreta que facilita el exacto conteo y anlisis estructural. (Ver Diapositiva 10).

Anafase: ( 3 minutos )
Ocurre la divisin longitudinal del centrmero lo que permite que cada cromtida hermana se separe y unida por su centrmero al huso acromtico por un punto especfico denominado Cinetocoro, migre hacia el polo opuesto de la clula, como resultado del acortamiento de los microtbulos. Posteriormente aparece un anillo contrctil debajo de la membrana para iniciar la divisin. (Ver Diapositiva 11).

Telofase: ( 17 minutos )
Ocurre cuando se completa el movimiento de las cromtidas hacia los polos y los microtbulos se desensamblan. Luego el nucleolo comienza a reaparecer y las cromtidas se desenrollan y extienden totalmente hacindose menos visibles. Se forman dos ncleos hijos cuando una membrana nuclear es reconstruida alrededor de cada

grupo de cromtidas (por el proceso de la cariocinesis). El citoplasma tambin completa su divisin (por el proceso de citocinesis) mediante el plegamiento total de la membrana por su parte media hasta obtener 2 clulas hijas con igual dotacin cromosmica y de citoplasma que la clula parental, aunque el tamao que presenta es ligeramente inferior. (Ver Diapositiva 12). (2,3,4).

LA MEIOSIS
En 1883, cuatro aos despus de que la mitosis fuera inicialmente descrita, Edouard Van Beneden descubri el proceso de Meiosis (del griego que significa disminucin) al observar en los huevos de los gusanos redondos (scaris), que contenan la mitad de cromosomas de las clulas somticas y que el nmero caracterstico de la especie era reestablecido en la fertilizacin. Adems que la capacidad de los organismos sexuados de adquirir combinaciones gnicas favorables se deba precisamente a una caracterstica esencial de la meiosis, la recombinacin, que reordena todo el genoma en cada generacin, de modo que los gametos producidos llevan nuevas combinaciones gnicas diferentes de las propias del organismo en donde ocurre la meiosis. (1,6). La meiosis, otro de los procesos que permiten la divisin celular, se produce exclusivamente en clulas de tipo sexual y presentan una serie de variaciones con respecto a la mitosis, que le confieren una gran importancia, por ejemplo, aporta el mecanismo que mantiene constante el nmero de cromosomas de generacin en generacin en las especies que presentan reproduccin sexual y fomenta la diversidad gentica gracias a la recombinacin de los cromosomas, generado por el fenmeno de entrecruzamiento o mezcla de porciones maternas y paternas de los cromosomas homlogos (pareja de cromosomas que comparten la codificacin de las mismas caractersticas, son similares en forma y tamao y que provienen uno del padre y otro de la madre).(2,4). A diferencia de la mitosis, la meiosis permite la reduccin del nmero de cromosomas por medio de dos sucesivas divisiones celulares, denominadas primera y segunda divisin meitica en donde solo una de ellas, la primera, ha sido precedida de la duplicacin de los cromosomas. PRIMERA DIVISIN MEITICA: Es denominada tambin como Divisin Reduccional, y comparada con la mitosis la meiosis I es ms complicada y de mayor extensin, dado que la profase I se encuentra dividida en 5 subetapas consecutivas: Leptoteno, Zigoteno, Paquiteno, Diploteno y Diacinsis.

Leptoteno
En sta subetapa la cromatina nuclear comienza a condensarse rpidamente pero los cromosomas no son lo suficientemente evidentes y su naturaleza doble no puede ser discernida. El microscopio electrnico muestra que ambos extremos de cada cromosoma (telmeros) estn an unidos a la envoltura nuclear.

Zigoteno Los cromosomas homlogos realizan la sinapsis, un fenmeno celular que consiste en el alineamiento y apareamiento especfico de los dos miembros de cada pareja de cromosomas homlogos, de modo que todas las parejas (salvo la de los cromosomas sexuales en el varn) aparecen conformando un bivalente o ttrada (as llamadas porque cada cromosoma est constituido por dos cromtidas hermanas, cuatro en total). El mecanismo subyacente de esta sinapsis es la construccin de un aparato protenico, llamado complejo sinaptonmico que ejecuta el apareamiento. Durante el zigoteno el nucleolo est an visible y est asociado estrechamente con algunos de los bivalentes. Paquiteno
Los bivalentes realizan el proceso de entrecruzamiento (crossing over) facilitado por la ntima relacin en que se encuentran, de tal forma que dos cromtidas no hermanas ( una de cada cromosoma homlogo) intercambian su material gentico.

Una evidencia visual del entrecruzamiento son puntos especficos a lo largo del cromosoma con figura de X llamados Quiasmas. La recombinacin meitica consiste en un proceso de ruptura de dos molculas de ADN homlogas, seguido de un intercambio de fragmentos entre ellas y una reconstitucin de las dos molculas que contienen partes intercambiadas. Diploteno Los bivalentes parecen repelerse ya que el centrmero de los cromosomas homlogos se apartan y aunque siguen enfrentados solo quedan unidos por los quiasmas formados.
El diploteno en algunos animales es una subetapa extremadamente larga, por ejemplo en los humanos de sexo femenino los vulos inmaduros permanecen suspendidos en ste estado hasta que se el perodo de la pubertad, cuando en cada ciclo menstrual un huevo contina su proceso de meiosis y se madura en las trompas de Falopio, sin embargo la meiosis nunca es completada a menos que la fertilizacin ocurra.

Diacinsis
Los quiasmas parecen desplazarse hacia los extremos del cromosoma hasta desaparecer, el nucleolo y la envoltura nuclear se dispersan y los microtbulos emanan de los centrosomas ubicados en los polos opuestos de la clula. (6,7,8). Posteriormente en la metafase I los pares homlogos se ubican en el plano ecuatorial de la clula, los microtbulos se unen al cinetocoro en la regin centromrica y en la anafase I se da una separacin cromosmica longitudinal conformando Dadas las cuales se dirigen a los polos opuestos celulares para conformar las dos primeras clulas del proceso durante la telofase I. (Ver Diapositiva 15). SEGUNDA DIVISIN MEITICA:

Despus de un breve perodo intercintico en el que por supuesto no ocurre sntesis de ADN, se pasa inmediatamente a la segunda divisin meitica descrita como Divisin Ecuacional en la cual, los cromosomas o Dadas se colocan en el plano ecuatorial para sufrir una divisin longitudinal del centrmero (divisin cromatdica) conformando mnadas que se dirigen a los polos opuestos de cada una de las clulas obtenidas en la primera divisin. Por consiguiente se originan cuatro en total cada una de ellas con un nmero simple o haploide de cromosomas. (Ver Diapositiva 16). (4,6,7). Aunque la citocinesis tanto en meiosis como en mitosis puede ser algo imprecisa sin dejar de ser operativa, la divisin y la reparticin de los cromosomas debe hacerse de un modo exacto y sin errores para que la clula pueda funcionar. Dada que toda la maquinaria que las mueve est contenida en la informacin gentica que albergan.(2,3). El ciclo celular est altamente coordinado y regulado por seales qumicas internas y externas en puntos muy especficos conocidos como puntos de chequeo o de restriccin los cuales son regulados por miembros de una familia de protenas llamadas ciclinas, que forman complejos con protenas kinasas dependientes de ciclinas y los complejos formados son como el motor que dirige el ciclo celular. La funcin de los puntos de chequeo es hacer que la clula espere a que los daos del ADN sean reparados o se disparen los mecanismos de muerte celular segn el grado de dao, por ejemplo en G1 se detectan los defectos del ADN, de disponibilidad de nutrientes, y de contactos clula a clula; en G2 se detectan problemas en la replicacin de los cromosomas y en la metafase las aberraciones en la formacin del huso mittico que impiden la apropiada segregacin de los cromosomas a las clulas hijas. La transicin de cada fase del ciclo, requiere la integracin de seales qumicas especficas y de respuestas precisas a esas seales. Si las seales estn incorrectamente sensibilizadas o si la clula no est apropiadamente preparada a responder, sta puede ser eliminada o transformada en una clula maligna. (Ver Diapositiva 17). (7,8)

LA CROMATINA
Despus de haber analizado cada una de los eventos del ciclo celular podemos destacar el papel que en cada uno de ellos desempean los cromosomas no solo como simples portadores de informacin gentica si no tambin como estructuras organizacionales que permiten sistematizar dicha informacin. Todo ser vivo, procaritico y eucaritico posee una cierta cantidad de ADN organizado en mayor a menor grado dentro de estructuras celulares denominadas cromosomas los cuales poseen una constitucin y un comportamiento variable dado el tipo de clula y el estado del ciclo celular en el cual se estudien. Un cromosoma metafsico, por ejemplo, est constituido por dos Cromtides hermanas altamente empaquetadas, unidas por el centrmero y con una apariencia de X que es posible visualizar al microscopio durante la divisin celular. En un cromosoma el ADN tiene un grado de compactacin de 10.000 veces con respecto a la longitud del cromosoma ( 10 m, en el cromosoma 1 que es el ms grande y de casi 2 m en el cromosoma de menor tamao). Vale decir que un cromosoma humano de 5 m de longitud posee en cada cromtida una cadena de ADN de 50.000

m = 5 cm. de largo. Este enorme grado de empaquetamiento se alcanza mediante sucesivos rdenes de empaquetamiento. (Ver Diapositiva 27). (6). Por lo comn las clulas eucariotas concentran dichas estructuras en el ncleo celular y estn compuestos por fibras de cromatina altamente condensadas. A su vez la cromatina es un complejo constituido por ADN, protenas, ARN y ciertos polisacridos. Las protenas cromosmicas asociadas son molculas caracterizadas por su pH bsico con carga altamente positiva como son las Histonas y otras tambin positivas pero en menor grado y con pH de tendencia cida llamadas No Histonas. De stas dos las Histonas juegan un papel fundamental en la estructura cromosmica, dado que stas poseen grandes cantidades de aminocidos positivos como son la lisina y la Arginina, los cuales permiten uniones electroestticas fuertes con los grupos fosfato de los nucletidos del ADN cargados negativamente. Hay 5 clases de Histonas : las H1, ricas en lisina; las H2A y H2B, ligeramente ricas en lisina; H3 y H4, ricas en arginina y la H5, una histona especial que reemplaza la H1 en eritrocitos nucleados. La proporcin de Histonas en relacin con el ADN en la cromatina es de 1:1 por peso. (1). Por otra parte las protenas No Histnicas son muchos cientos con diferentes funciones estructurales, enzimticas y regulatorias; stas son ms variables aunque ellas hacen mucho menos de la masa de la cromatina. Las protenas No Histnicas estn involucradas en el metabolismo cromosomal, en la estructura cromosmica y en la expresin gnica, en la regulacin de la cromatina activa, ya que su asociacin con genes nicos le permiten cambiar la configuracin de la cromatina para regular su transcripcin. (1). La cromatina est organizada en varios rdenes sucesivos de empaquetamiento que pueden ser identificados en 4 niveles (Ver Diapositiva 19): NUCLEOSOMA El nucleosoma parece ser la unidad bsica de la cromatina eucaritica, ya que est presente en cromatina condensada o dispersada, en reas repetitivas o de secuencias nicas y en estado interfsico o metafsico. Est constituido por una serie de unidades repetitivas dispuestas sobre un eje que recuerda las perlas de un collar. Estas unidades se llaman Nucleosomas y estn compuestas por porciones de ADN de 146 pb que se enrollan en espiral dando una vuelta y , alrededor de octmeros proteicos de 10 nm de dimetro, que luego se continan con un segmento internucleosmico que es ms variables en longitud (de 50 a 60 pb). Los octmeros estn conformados por 2 tetrmeros de protenas Histnicas; un tetrmero interno constituido por 2 molculas de H2A y 2 molculas de H2B y un tetrmero externo constituido por 2 molculas de H3 y 2 molculas de H4. De sta forma se logra empaquetar 6 veces ms el ADN. (Ver Diapositiva 20). FIBRA DE CROMATINA El quinto tipo de Histona, la H1 est involucrada en la unin y compactacin de los nucleosomas al intercalarse entre ellos y cerrar los espacios internucleosmicos. La H1

se une al ADN en una proporcin de 1 molcula por nucleosoma (1:1). (Ver Diapositiva 21). SOLENOIDE El solenoide est conformado por seis unidades nucleosmicas que interactan entre s, arrollndose sobre s mismas, girando helicoidalmente hacia la izquierda y formando estructuras ms condensadas de un mayor dimetro (30 nm.), logrando empaquetar 40 veces ms el ADN. (Ver Diapositiva 24). SUPRAEMPAQUETAMIENTO Poco a poco el cromosoma va tomando forma y el supraempaquetamiento al que finalmente llega es gracias al otro tipo de protenas mencionadas, las No Histonas. Estas protenas forman loops de diferentes longitudes (entre 75 y 100 kb), por afinidad qumica entre los solenoides, los cuales son atados o anclados en sus bases para formar lo que es conocido como scaffold. El scaffold presumiblemente forma un esqueleto de protena No histnica que es responsable del mantenimiento de la figura bsica del cromosoma y que sirve como un ancla para los loops de ADN que se forman hacia adentro y hacia afuera del cromosoma. El cromosoma finalmente logra un empaquetamiento del ADN de hasta 10.000 veces, evidenciado en un cromosoma metafsico de 1.400 nm de dimetro. (Ver Diapositiva 26). (1,4,6,8). Con base en ste modelo de organizacin se esperara que los cromosomas demostraran una uniformidad estructural y funcional a lo largo de su longitud. Sin embargo se ha observado que la estructura y funcin de la cromatina vara a lo largo de la longitud del cromosoma reflejando el grado de empaquetamiento, la composicin de bases y el tiempo de replicacin del ADN. Subsecuentes investigaciones han conducido a la caracterizacin de tres tipos de cromatina que basan su funcionalidad dependiendo el tipo de ADN que las est constituyendo. (Ver Diapositiva 30). La eucromatina est constituida por ADN nico rico en Guanina-Citosina, se descondensa durante la interfase para que pueda darse la transcripcin gnica, ya que est activa y se replica tempranamente durante la etapa de sntesis. La heterocromatina constitutiva est altamente empaquetada, nunca se elonga o descondensa durante el ciclo celular, presenta secuencias altamente repetitivas ricas en Adenina-Timina, transcripcionalmente inactivas y se tien diferencialmente de la eucromatina bajo tcnicas de bandeo. La heterocromatina facultativa se comporta en forma similar a la heterocromatina constitutiva pero controlada de acuerdo a las exigencias del desarrollo, siendo transcripcionalmente inactiva o activa, de replicacin tarda o temprana y condensada o descondensada durante la interfase, dadas las condiciones. El cromosoma X en las clulas somticas de mamferos femeninos es un claro ejemplo de la heterocromatina facultativa.(1,4,5,6).

EL CARIOTIPO NORMAL
Siendo los cromosomas los portadores de la informacin gentica de mayor y mejor visualizacin, stos han sido objeto de constante estudio, dado que cualquier anormalidad a nivel funcional de las clulas y del organismo en general dependera en ltimas de alteraciones localizadas en la informacin que llevan. Los cromosomas aportan una gran ayuda ya que no solamente revela informacin valiosa acerca de la constitucin gentica de las personas sino que adems tienen un nmero constante en todas las clulas somticas de una especie y presentan una tamao, estructura y morfologa definidas.(6). La citogentica se encarga entonces de estudiar todo comportamiento celular basada en la informacin gnica contenida en los cromosomas, su funcin, su comportamiento, su relacin con patologas y sus consecuencias a nivel fsico, orgnico y poblacional. Esta disciplina es ms reciente que la gentica ya que solo en 1956 fue determinado el nmero de cromosomas humanos (46), sin embargo ya desde 1875 se tiene registro de las primeras observaciones de cromosomas en plantas por Eduard Strasburger y en 1879 1889 en animales por Walter Flemming. En 1959 se describi la primera anormalidad cromosmica humana, la trisoma 21 en el sndrome de Down y a partir de all se constituy en un campo propio de estudio dentro de la Gentica Mdica. Algunos problemas tcnicos hicieron el anlisis cromosmico muy difcil, dado que la coloracin solo permita agrupar los cromosomas por tamao y figura, pero no podan ser identificados individualmente. En 1968 Caspersson y colaboradores idearon un mtodo de coloracin que permiti identificar un patrn de regiones claras y oscuras llamadas bandas, nico para cada cromosoma, lo cual permiti la deteccin y caracterizacin de muchas mas anormalidades citogenticas que la tincin regular. En la dcada de los 80 el desarrollo de la citogentica molecular revolucion el campo al permitir la identificacin de rearreglos nicamente visibles en el nivel molecular mediante la utilizacin de sondas incluso en etapas del ciclo poco convencionales.(1). Los cromosomas son mejor estudiados en la metafase o la profase meitica o mittica, aunque algunos estudios tales como los mtodos de hibridacin in situ por fluorescencia pueden utilizar clulas interfsicas. Es posible realizar un anlisis cromosmico en una variedad de tejidos, dividindose espontneamente como en mdula sea, nodos linfticos, testculos, algunas sangres leucmicas, tumores slidos, algunos fluidos pleurales y frecuentemente en sangre fetal o de recin nacido; pero tambin en clulas que han sido estimuladas en cultivo para entrar en activa divisin como linfocitos sanguneos , fluido amnitico, piel y otros tejidos conteniendo fibroblastos.(1). Los procedimientos ms empleados en el anlisis cromosmico, recurren a tcnicas de cultivo celular in vitro para analizar cromosomas durante la profase tarda o la metafase, estados en los cuales como ya se record estn ms condensados y con una morfologa ms definida que permita ordenarlos, compararlos y analizarlos.(8). Para el estudio de los cromosomas se han desarrollado diversos procedimientos que comprenden tres pasos fundamentales: Siembra, Procesamiento y Anlisis. (Ver Diapositiva 32).

LA SIEMBRA Aunque el estudio puede llevarse a cabo en forma directa sobre cualquier tipo de clula de multiplicacin activa, las clulas vivas ms fcilmente accesibles son las obtenidas mediante puncin venosa de sangre perifrica, a la cual se aade heparina para evitar su coagulacin. El trmino sembrar hace referencia a la incorporacin de ms o menos 1ml de sangre en un medio apropiado para su crecimiento bajo estrictas condiciones de esterilidad. Como las clulas que se estudian son los linfocitos dado que los eritrocitos y las plaquetas han perdido su ncleo y por lo mismo no tienen cromosomas. El medio contiene los siguientes reactivos: RPMI 1640 es un medio bufferizado a base de bicarbonato, enriquecido con protenas, carbohidratos, aminocidos, vitaminas, minerales y otros suplementos en proporciones adecuadas para mantener el crecimiento celular. Suero Fetal Bovino (SFB) es un suplemento del medio que entre muchos otros componentes posee factores de crecimiento que estimulan el cultivo y es determinante para la adaptacin de las clulas al nuevo ambiente artificial. Fitohemaglutinina (PHA) es una glucoprotena vegetal (lectina) la cual se acopla a las protenas de la membrana de los linfocitos en las primeras 24 horas de crecimiento del cultivo para actuar como un agente mitgeno que induce la transformacin blstica de los linfocitos. Posteriormente los propios linfocitos segregan interleuquina 2 para continuar el estmulo. Solucin penicilina estreptomicina para evitar cualquier tipo de proliferacin bacteriana o mictica durante las 72 horas que estarn en crecimiento a 37 C.(1,6).

EL PROCESAMIENTO
Como se deben obtener cromosomas en metafase es necesario detener las clulas que estn en divisin activa, en dicho estado. Esto se logra con el empleo de la colchicina o el colcemid, una sustancia que impide la formacin del huso acromtico, evitando la polimerizacin de las fibras del uso, de tal forma que no se puede avanzar en las etapas de mitosis. El colcemid tambin afecta la cantidad de mitosis y la condensacin del cromosoma, ya que el proceso de supraempaquetamiento es acentuado por el incremento en el tiempo de exposicin y concentracin de la colchicina. As mismo los cromosomas deben presentar una adecuada dispersin que permita visualizarlos en toda su extensin. Por tanto, el uso de soluciones hipotnicas es importante, ya que incrementan el volumen celular y los cromosomas encuentran el espacio suficiente para dispersarse. El precalentamiento de la solucin hipotnica a 37C puede incrementar la efectividad por la rapidez con que el agua se transporta a travs de la membrana Finalmente stos deben ser fijados y limpiados de cualquier resto celular que impida su visualizacin, de tal forma que se utiliza una solucin de Carnoy preparada con Metanol absoluto (Deshidrata y fija los cromosomas) y cido actico glacial (degrada la membrana citoplasmtica) en una proporcin 3:1 antes de extender en una placa 2 o 3 gotas de la preparacin cromosmica procesada.(1).

EL ANALISIS Para ser observados bajo el microscopio de luz los cromosomas se deben teir con un colorante que resalte su morfologa. Despus se cuenta un nmero significativo de metafases entre 25 y 100 segn sean normales o no, se escogen las mejores en cuanto a morfologa y dispersin de cromosomas y se les toma una fotografa se recortan los cromosomas homlogos y se elabora as un cariotipo, objetivo final de todo este procedimiento. El cariotipo es una forma de anlisis cromosmico que se basa en el ordenamiento estndar de los cromosomas contenidos en una clula, de acuerdo con su tamao, localizacin del centrmero y patrn de bandeo.(8). Con base en el criterio de tamao y posicin del centrmero los cromosomas pueden ser de cuatro tipos (Ver Diapositiva 40): Metacntricos: Si el centrmero est localizado en la parte media del cromosoma designando dos brazos sensiblemente iguales. Submetacntrico: Si el centrmero est mas cerca de uno de los extremos del cromosoma, determinando claramente un brazo corto o p (petit) y uno largo o q ( por ser la letra del alfabeto que le sigue a la p). Acrocntrico: Si el centrmero est situado hacia uno de los extremos quedando un brazo p muy reducido poco observable. En el caso de los humanos se observan dos pequeas estructuras similares a palillos de tambor denominados Satlites. Telocntricos: Si carece totalmente de brazo corto. En el caso de los humanos no existe este tipo de cromosomas.(1,3,5). La precisin del ordenamiento propuesto por los procedimientos de anlisis para la elaboracin del cariotipo, se ha logrado establecer a travs del desarrollo de las tcnicas de bandeo, es decir, el tratamiento de una placa para obtener una secuencia de segmentos claros y oscuros o fluorescente y no fluorescentes que aparecen a lo largo del cromosoma, tindolo en forma no uniforme cuando se le aplican colorantes, que permiten establecer correlaciones ms precisas entre los sndromes clnicos y las alteraciones cromosmicas que los ocasionaron. (Ver Diapositiva 42). Estas tcnicas permiten visualizar un patrn estable y caracterstico para cada cromosoma, de gran utilidad prctica porque permite la identificacin precisa de cada cromosoma y la caracterizacin de regiones particulares dentro de cada brazo cromosmico, haciendo posible comparar los cromosomas individualmente con ideogramas estndar (esquema que representa la distribucin normal de las bandas cromosmicas obtenidas bajo una tcnica particular) y el patrn de bandeado entre los miembros de un par homlogo. (Ver Diapositiva 43). (1,5). El patrn de bandas vara segn el estado de elongacin de los cromosomas, por ejemplo en cromosomas metafsicos, acortados por mayor tiempo de exposicin a la colchicina, el nmero total de bandas detectables en todo el cariotipo humano no pasa

de 400. Sin embargo, cuando se observan cromosomas prometafsicos, como son ms elongados, el nmero de bandas puede llegar a sobrepasar las 1000 y es llamado bandeo de alta resolucin y difiere del anterior en el desdoblamiento de bandas metafsicas en subbandas.(5,6). Algunas de las tcnicas de bandeo ms utilizadas son (Ver Diapositiva 41):

BANDEO G
Esta tcnica ha llegado a ser la ms utilizada para la tincin de rutina de placas de cromosomas, dado que los procedimientos son muy simples y pueden ser mantenidas por muchos aos sin deteriorarse. Aunque hay una variedad de metodologas descritas en trminos generales, sta tcnica involucra la desnaturalizacin por calor a 60C en un buffer 2XSSC de la placa extendida, para que las protenas que empaquetan el cromosoma se suelten un poco. Luego la digestin con la enzima proteoltica Tripsina, elimina aquellas que estn en las zonas menos empaquetadas, de tal forma que el colorante Giemsa se pega solo a aquellas zonas que an conservan protenas. Es decir que la heterocromatina por ser de replicacin tarda va a quedar intensamente coloreada, mientras las zonas de eucromatina quedan claras por la prdida ms fcil de sus protenas. Al compararlas con el ideograma se puede determinar qu genes se han perdido y por consiguiente, qu protenas no se estn sintetizando, para as asociarlas a patologas especficas. Especialmente las asociadas a los cromosomas autosmicos y a las anomalas numricas. (Ver Diapositiva 53-56). (1,5).

BANDEO R
Es contraria a las bandas G, ya que evidencian las zonas de replicacin tarda como zonas claras. Para tal fin se utilizan reactivos afines a la Timina como la Bromodesoxiuridina y el Hechst. La Bromodesoxiuridina es un reactivo anlogo de la timina que desplaza dicha base en la sntesis del ADN y el Hechst es un fotoltico que presenta gran afinidad por la bromodesoxiuridina y provoca la ruptura y prdida de las zonas ricas en A-T . Por lo tanto el giemsa se une a las protenas de la eucromatina que se conservan . Este bandeo es til para identificar cualquier anomala estructural por pequea que sea, especialmente, las relacionados con los cromosomas sexuales. (Ver Diapositiva 57). (1,5).

BANDEO C
Solo evidencia las zonas de replicacin tarda mas empaquetadas, es decir, la heterocromatina constitutiva ( correspondiente a las regiones satlite, centromricas y telomricas). Con un tratamiento con cido clorhdrico (HCl), Hidrxido de Bario (Ba(OH)2) y desnaturalizacin al calor se sueltan todas las protenas asociadas al ADN excepto las ms empaquetadas. Este bandeo es muy til cuando se sospechan daos en las zonas centromricas como inversiones pericntricas y para la bsqueda de polimorfismos de heterocromatina de los cromosomas autosmicos 1, 9,16 y la parte distal del brazo largo del cromosoma Y. (Ver Diapositiva 58). (1,5).

BANDEO Q
Utilizando mostaza de quinacrina (un tinte de acridina que se une al ADN por intercalacin o por unin inica externa) y estimulando los cromosomas con una luz ultravioleta, se ponen de manifiesto bandas fluorescentes de idntico patrn al de las

bandas G excepto en las zonas heterocromticas de los cromosomas 1, 9 y 16,en los satlites de los acrocntricos y en la porcin distal del cromosoma Y, que dan una tincin variable. (Ver Diapositiva 59). (1,5).

FISH
Actualmente la citogentica mdica usa metodologas derivadas de la gentica molecular para complementar, verificar y ampliar sus posibilidades diagnsticas. La Citogentica Molecular como una de las ms recientes aplicaciones a los estudios clnicos de aberraciones cromosmicas es la visualizacin de loci utilizando la tcnica bioqumica dinmica de Hibridacin In Situ. El uso de sta tecnologa empez a finales de los aos sesenta cuando Gall y Pardeu reportaron la hibridacin de sondas radioactivas de ADN para secuencias repetitivas de cromosomas de ratn y de Drosophila. Mtodos para hibridaciones in situ no isotpicas fueron pronto desarrolladas, dada la dificultad y los costos que conlleva el uso de sondas radioactivas. La tcnica de Hibridacin In Situ por fluorescencia (FISH) ha progresado en la actualidad hasta tal punto, que incluso ms de 27 sondas coloreadas de ADN, pueden ser hibridadas simultneamente y detectadas con un set de filtros especializados y un software acoplado a un analizador de imgenes (1,3,4,5). Al aplicar conjuntamente los criterios de organizacin aportados por el cariotipo y el patrn de bandas ha sido ms fcil la ubicacin de los pares homlogos en grupos morfolgicos que en el caso de los humanos comprende 7 grupos designados con letras as (Ver Diapositiva 44-51).: Grupo A: Son los Metacntricos Grandes, que incluyen los pares homlogos 1, 2 y 3, aunque el 2 tiende a ser submetacntrico Grupo B: Son los Submetacntricos Grandes, que incluyen los pares homlogos 3 y 4. Grupo C: Son los Submetacntricos Medianos, que incluyen los pares autosmicos del 6 al 12 y el gonosoma X, que por su tamao y morfologa puede ser ubicado entre el 7 y el 8. Grupo D: Son los Acrocntricos Grandes, que incluyen los pares homlogos 13, 14 y 15 caracterizados por presentar satlites en sus brazos cortos. Grupo E: Son los Submetacntricos pequeos, que incluyen los pares homlogos 16, 17 y 18, aunque el par 16 tiende a ser metacntrico. Grupo F: Son los Metacntricos Pequeos, que incluyen los pares homlogos 19 y 20. Grupo G: Son los Acrocntricos Pequeos, que incluyen los pares homlogos 21 y 22 que presentan satlites en sus brazos cortos y el gonosoma Y, que aunque es morfolgicamente acrocntrico carece de satlites y constituye junto con el X el par 23, nico del cariotipo no homlogo estructuralmente.(1,5,6). Aunque los pares cromosmicos establecidos a travs del cariotipo deben corresponderse en tamao, estructura y forma, existen variaciones en algunos segmentos cromosmicos que no implican ningn tipo de patologa especfica o anormalidad cromosmica. Los Polimorfismos se definen entonces como variantes cromosmicas cuya frecuencia en la poblacin, es ms elevada de lo que se esperara en una tasa normal de mutacin recurrente (es decir que es mucho ms habitual que una mutacin comn). (Ver Diapositiva 52).

Algunos de los polimorfismos ms habituales son los relacionados con:

Tamao: (Longitud del cromosoma) ocasionado por artefactos adicionados por las tcnicas de preparacin de los cromosomas o por cambios reales en la longitud de algunos segmentos cromosmicos. Satlites: Los brazos cortos, los tallos o los satlites en s pueden aparecer duplicados, en tandem o separados. El brazo corto puede aparecer notablemente aumentado (p+) o con aparente delecin (p-), pueden presentar variacin en la intensidad de tincin o fluorescencia o en su funcionalidad. Constricciones secundarias o Zonas Heterocromticas: Corresponden a aquellas regiones que revelan la localizacin de la heterocromatina constitutiva, regiones ampliamente polimrficas en la poblacin humana, asiento de los distintos tipos de ADN satlite o altamente repetitivo, que se tie plidamente con las tcnicas usuales. Se encuentra en las regiones proximales de los brazos largos de los cromosomas 1,9 y 16, la porcin distal del brazo largo del cromosoma Y y los brazos cortos y satlites de los acrocntricos. Polimorfismos con las tcnicas de Bandas: Generalmente corresponden a la heterocromatina constitutiva o en el caso de las bandas Q pueden ponerse de manifiesto polimorfismos en la intensidad de fluorescencia de zonas Heterocromticas. En general, dichos polimorfismos resultan tiles para identificar el origen paterno o materno de las anormalidades cromosmicas.(5,6). Se ha establecido un Sistema Internacional de Nomenclatura para la Citogentica Humana (ISCN) por medio del cual la descripcin del cariotipo normal y patolgico est estandarizado. La denominacin de un cariotipo comienza con el nmero cromosmico, contina con la frmula sexual y despus se inscriben las diferentes anormalidades cromosmicas encontradas designadas por sus respectivas abreviaturas en letra minscula y especificando los cromosomas, regiones, bandas y subbandas implicadas ( 46, XX o 46,XY ). Los centrmeros, los telmeros y las zonas intermedias se usan como hitos, para definir regiones principales en el cromosoma y se expresan como un primer dgito despus de la designacin del cromosoma y del brazo, empezando siempre desde el centrmero. Luego se designa un segundo dgito que corresponde a las bandas de cada regin de proximal a distal (alejada del centrmero), y en cromosomas ms elongados, de alta resolucin se usa un tercer dgito separado de los dos anteriores por un punto para denotar las subbandas (46,XX,del(1)(q18); 46,XY,t(1;8)(p21;q32); 47,XXY). (5,8).

BIBLIOGRAFA
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