Sie sind auf Seite 1von 15

Chromatographic prosedures using columns and liquid-liquid systems There are two types of chromatographic techniques, planar and

column system. In the first of these the separation is usually terminated after a fixedtime and the different distance moved by each zone are measured. In column techniques the path length for each compound in a mixture is the same (i.e the full length of the column) and its the time taken to travel this distance (or the volume eluted under constant flow conditions) which is measured. However, it should be noted that when preparative chromatography is employed the elution of fixed-volume fractions in numerical sequence is most often used and little attention is paid the actual time involved. 6.1 Column chromatography Column chromatography is the oldest from of chromatography technique. A tube is packed with a solid stationary phase, the sample mixture applied to the top of the column and the mobile phase is allowed to move down through the column under gravity. The constituents of the mixture move at different rates through the columns as bands. Eventually they reach the end of the column and elute in solution in the mobile phase (Figure 6.1). practical details for packing and running columns are given in section 9.3 and the steps involved in setting up a column are describe in section 9.3.1. 6.1.1 Conventional column chromatography Conventionally, the stationery phases in column chromatography were adsorbents of high polarity, e.g. silica gel. However, recent years have been the introduction of many other forms of stationary phase, e.g. reverse-phase silica, ion-exchange resins, exclusion chromatography stationary phases. Figure 6.1 separation on a chromatography column. 1, Elution commences with mobile phase A. 2, Elution continues with mobile phase A. 3, Elution continues with mobile phase A, first compounds elute. 4, Elution commences with mobile phase B, baseline materials start to move through column. 5, Elution continues with mobile phase B, eventually all bands elute from the column. The mobile phase passes through the column under the force of gravity and, due to the resistance of the stationary phase packed in the column, the flow rate is not very high. Elution with the mobile phase can be isocratic, where mobile phase of only one composition is used, or gradient. Gradient elution consist of a sequence of different compositions of the mobile phase, most commonly as a gradient of increasing (or, in the case of reverse-phase, systems, decreasing) polarity. The gradient is achieved most commonly as a series of steps consisting of aliquots of mobile phase of fixed composition. More sophisticated system are now available where a linear gradient is established by means of a mixing pump which uses two separate reservoirs to deliver a constantly increasing concentration of one component in the eluting solvent.

The bands of compunds which eventually elute from the column cannot be seen unless coloured substance are being separated. The usual method of detecting the zones of eluted compounds is to collect the eluate from the column, usually performed automatically using a fraction collector, as consecutive fractions measure by a fixed time or volume. These fractions can then be analysed either biologically (by a bioassay), chemically (for the presence of compounds of interest by further chromatography, particular TLC) or physically, e.g. absorbance. These topics are dealt with in greater detail in Chapter 8. 6.1.2 Practical steps in conventional column chromatography Choice of stationary and mobile phases The stationary phase to be used is largely dependent on the types of molecules that are present, as discussed in section 8.2. The choice of mobile phase for adsorption and partition column chromatography can be made by TLC analysis. The metods of selecting a TLC system which gives good resolution are describe in section 7.1.1 Adsorption chromatography When an adsorption process is exploited in a column, it must be realized that TLC is carried out using layers that have been dried well, but, in contrast, the same substance used as a stationary phase in a colimn very often contains appreciablymore water. The water present occupies a number of the absoption sites and so reduces the efficiency of the adsorbent and decreases the retention of compounds, leading to decreased elution times. To overcome this effect, its a useful practice to reduce the polarity of the mobile phase mixture for normal phase separation giving best results on TLC by increasing the proportion of the least polar component by a factor of about two, e.g. if TLC on silica gel gave good resolution of a mixture with chloroform : methanol 6 : 1, then the initial mobile phase used in the column should be chloroform : methanol 12 : 1. Its usual to apply gradient elution to a column so, for the example given, the initial eluant would be chloroform : methanol 12 : 1 followed by chlorofrm : methanol 9 : 1, 6 : 1, 3 : 1, etc. Partition column Chromatography The general method for determining a suitable system based on partition is much the same as that described above for adsorption, although the nature of the two major types stationary phase used influences the range of mobile phase tested. The stationary phases used in partition Chromatography consist of two types, the polar ones, such as water, held within a matrix such as cellulose, and the non-polar monomolecular layer reverse-phase type, such as octadecyl chains bound to silica gel (section 5.3.2). Thin layer Chromatographic plates are available that contain these type as the stationary phase and so can be used to test the suitability of mobile phase for use in a column using the

same material as the stationary phase. In the cast of the first type, Chromatographic paper can be used instead of cellulose thin layer. The mixture is applied and run in a series of mobile phases of different polarities. Where water held by cellulose is the stationary phase, the mobile phases are normally quite polar and should consist of water mixed with less polar but miscible substances, such as acetic acid, butanol or phenol. In the case of reverse-phase layers the range of mobile phase ranges in polarity from water to acetone. Alteration of the pH of the mobile phase can have a great effect on the separation. If ionization of the mixture components may occur, a small amount off a salt such as ammonium nitrate may be added to the water to help in the formation of ion pairs which function as less-polar entities than the unpaired ions. Since partition separations are less sensitive to the presence of small quantities of water, no adjustment normally needs to be made when the system is adapted from layer to column separation.

Ion-exchange Chromatography Aqueous solutions are usually employed as mobile phases in ion-exchange Chromatography. The choice of stationary phase depends on the type of ions to be separated as the phase should bear the opposite charge to these components. There is no easy way to test a system, although ion-exchange papers, which have ionizable groups chemically bound to the cellulose molecules in the paper, are commercially available and can be used for initial determinations. The nature of the mobile phase can vary according to the pH, usually through using different buffer solutions, and also according to the ionic strength, particularly of ions that might displace the analyte ions from their sites on the stationary phase. In most fractionation procedures, ion exchange is used to separate charged from noncharged components and so these finer points, which affect the resolutions of the different species of charged analytes from each other, are not usually relevant.

Terjemahan : Kromatografi prosedures menggunakan kolom dan cair-cair sistem

Ada dua jenis teknik kromatografi, planar dan sistem kolom. Pada bagian pertama dari pemisahan ini biasanya dihentikan setelah fixedtime dan jarak yang berbeda tergerak oleh setiap zona diukur. Dalam teknik kolom panjang jalur untuk setiap senyawa dalam campuran adalah sama (yaitu panjang penuh dari kolom) dan itu waktu yang dibutuhkan untuk perjalanan jarak ini (atau volume dielusi dalam kondisi aliran konstan) yang diukur. Namun, perlu dicatat bahwa ketika kromatografi preparatif digunakan elusi tetap volume fraksi dalam urutan numerik yang paling sering digunakan dan sedikit perhatian dibayar waktu yang sebenarnya terlibat. 6.1 kolom kromatografi Kromatografi kolom adalah yang tertua dari teknik kromatografi. Sebuah tabung dikemas dengan fase diam padat, campuran sampel diterapkan pada bagian atas kolom dan fase gerak diperbolehkan untuk bergerak ke bawah melalui kolom di bawah gravitasi. Konstituen dari campuran bergerak pada tingkat yang berbeda melalui kolom sebagai band. Akhirnya mereka mencapai akhir dari kolom dan mengelusi dalam larutan dalam fase gerak (Gambar 6.1). rincian praktis untuk kemasan dan berjalan kolom yang diberikan dalam bagian 9.3 dan langkah-langkah yang terlibat dalam mendirikan sebuah kolom yang menggambarkan dalam bagian 9.3.1. 6.1.1 kromatografi kolom Konvensional Secara konvensional, fase alat tulis dalam kromatografi kolom adalah adsorben dari polaritas tinggi, misalnya silika gel. Namun, beberapa tahun terakhir telah menjadi pengenalan bentukbentuk lain dari fase diam, misalnya fase-balik silika, pertukaran ion resin, kromatografi eksklusi fasa diam. Gambar 6.1 pemisahan pada kolom kromatografi. 1, Elusi dimulai dengan fase gerak A. 2, Elusi berlanjut dengan fase gerak A. 3, Elusi berlanjut dengan fase gerak A, senyawa pertama mengelusi. 4, Elusi dimulai dengan B fase gerak, bahan dasar mulai bergerak melalui kolom. 5, Elusi terus dengan B fase gerak, akhirnya semua mengelusi pita dari kolom. Fase gerak melewati kolom di bawah gaya gravitasi dan, karena perlawanan dari fase diam dikemas dalam kolom, laju aliran tidak terlalu tinggi. Elusi dengan fase gerak dapat isokratik, di mana fase gerak hanya satu komposisi yang digunakan, atau gradien. Elusi gradien terdiri dari urutan komposisi yang berbeda dari fase gerak, paling sering sebagai gradien untuk meningkatkan (atau, dalam kasus fase-balik, sistem, penurunan) polaritas. Gradien dicapai paling sering sebagai rangkaian 'langkah' yang terdiri dari Aliquot dari fase gerak komposisi tetap. Sistem yang lebih canggih sekarang tersedia di mana gradien linier didirikan melalui suatu pompa pencampuran yang menggunakan dua reservoir terpisah untuk memberikan konsentrasi terus meningkat dari satu komponen dalam pelarut eluting. Belenggu compunds yang akhirnya mengelusi dari kolom tidak dapat dilihat kecuali zat berwarna dipisahkan. Metode yang biasa digunakan untuk mendeteksi zona senyawa dielusi adalah untuk mengumpulkan eluat dari kolom, biasanya dilakukan secara otomatis menggunakan kolektor fraksi, sebagai ukuran fraksi berturut-turut oleh waktu yang tetap atau volume. Fraksi ini kemudian dapat dianalisis baik secara biologis (dengan bioassay a), kimia (untuk adanya

senyawa yang menarik dengan kromatografi lebih lanjut, TLC tertentu) atau secara fisik, misalnya absorbansi. Topik-topik ini dibahas secara lebih rinci dalam Bab 8. 6.1.2 Praktis langkah dalam kromatografi kolom konvensional Pilihan fasa diam dan mobile Fase diam yang digunakan adalah sebagian besar tergantung pada jenis molekul yang hadir, seperti yang dibahas dalam bagian 8.2. Pemilihan fase gerak untuk kromatografi kolom adsorpsi dan partisi dapat dibuat dengan analisis TLC. Para metods memilih sistem TLC yang memberikan resolusi yang baik adalah menggambarkan dalam bagian 7.1.1 Kromatografi adsorbsi
n _t id UTF-8 2 1

Ketika sebuah proses adsorpsi dimanfaatkan dalam kolom, harus menyadari bahwa KLT dilakukan dengan menggunakan lapisan yang telah dikeringkan dengan baik, tetapi, sebaliknya, substansi yang sama digunakan sebagai fase diam dalam colimn sangat sering berisi air appreciablymore. Kehadiran air menempati sejumlah situs penyerapan dan sehingga mengurangi efisiensi dari adsorben dan mengurangi retensi senyawa, yang mengarah ke kali elusi menurun. Untuk mengatasi efek ini, ini adalah praktek yang berguna untuk mengurangi polaritas dari campuran fase gerak untuk pemisahan fasa normal memberikan hasil terbaik pada KLT dengan meningkatkan proporsi komponen setidaknya kutub dengan faktor sekitar dua, misalnya jika KLT pada silika gel memberikan resolusi yang baik dari campuran dengan kloroform: metanol 6: 1, maka fase gerak awal yang digunakan dalam kolom harus kloroform: metanol 12: 1. Ini biasa untuk menerapkan elusi gradien ke kolom sehingga, untuk contoh yang diberikan, eluant awal akan kloroform: metanol 12: 1 diikuti oleh chlorofrm: metanol 9: 1, 6: 1, 3: 1, dll Partisi Kromatografi kolom Metode umum untuk menentukan sistem yang cocok berdasarkan partisi adalah sama seperti yang dijelaskan di atas untuk adsorpsi, meskipun sifat dari fase dua jenis utama stasioner digunakan mempengaruhi berbagai fasegerak diuji. Fase stasioner digunakan dalam kromatografi partisi terdiri dari dua jenis, yang polar, seperti air, diadakan dalam matriks seperti selulosa, dan non-polar monomolecular lapisan fase-balik jenis,seperti gantungan okta desil terikatsilikagel(bagian5.3.2). Pelat kromatografi lapis tipis yang tersedia yang mengandung jenis ini sebagai fase diam dan sehingga dapat digunakan untuk menguji kesesuaian fase gerak untuk digunakan dalam kolom menggunakan bahan yang sama seperti fase diam. Dalam cor tipe pertama, kertas kromatografi dapat digunakan sebagai pengganti lapisan selulosa tipis. Campuran diterapkan dan dijalankan dalam serangkaian fase gerak dari polaritas yang berbeda. Dimana air yang diselenggarakan oleh selulosa adalah fase diam, fase gerak yang biasanya cukup polar dan harus terdiri dari air yang

dicampur dengan zat kurang polar tetapi larut, seperti asam asetat, butanol atau fenol. Dalam kasus fase-balik lapisan kisaran rentang fase gerak dalam polaritas dari air ke aseton. Perubahan pH fase gerak dapat memiliki efek besar pada pemisahan. Jika ionisasi komponen campuran dapat terjadi, sejumlah kecil dari sebuah garam seperti amonium nitrat dapat ditambahkan ke air untuk membantu dalam pembentukan 'pasangan ion' yang berfungsi sebagai kurang-polar entitas dari ion-ion tidak berpasangan. Sejak pemisahan partisi yang kurang peka terhadap adanya sejumlah kecil air, biasanya ada penyesuaian perlu dibuat bila sistem yang diadaptasi dari lapisan ke kolom pemisahan.

Kromatografi pertukaran ion

Larutan air biasanya digunakan sebagai fase gerak dalam Kromatografi pertukaran ion. Pemilihan fase diam tergantung pada jenis ion untuk dipisahkan sebagai fase harus menanggung biaya yang berlawanan dengan komponen ini. Tidak ada cara mudah untuk menguji sebuah sistem, meskipun pertukaran ion kertas, yang memiliki kelompok terionisasi secara kimia terikat pada molekul selulosa di koran, tersedia secara komersial dan dapat digunakan untuk penentuan awal. Sifat dari fase gerak dapat bervariasi sesuai dengan pH, biasanya melalui menggunakan larutan buffer yang berbeda, dan juga sesuai dengan kekuatan ion, khususnya ion yang dapat menggantikan ion analit dari situs mereka pada fase diam. Dalam prosedur fraksinasi paling, pertukaran ion digunakan untuk memisahkan biaya dari non-dibebankan komponen dan poinpoin penting ini, yang mempengaruhi keputusan dari spesies yang berbeda dari analit dibebankan satu sama lain, biasanya tidak relevan. An exerciseinvolving ion-exchange chromatography is given insection 10.2.9. Exclusion chromatography The choice in exclusion chromatography is mainly in the type of stationary hase to be used. In all circum stances the gel must be allowed to awell in the mobile phase for some time before it is packed into the column. Many separations involing exculsion chromatography have a very hydrophilic gel stationary phase and aqueous mobile phases.The stationary phases available var according to the size of the pores, so it is necessary to have a some idea of the range of molecular sizes present in the mixtures in order to choose the best one for the situation. Layers of exclusion phases are available but they are costly, rather fragile and not so versatile as conventional thin layers, so

they are seldom used of method development. A small column can be packed and tested with little of the sample and eluted in order to assess the suitability of a proposed method. An exercise involving exclusion chromatography is given in section 10.2.4.

6.1.3. New column chromatography procedures Improvoments in resolution in column chromatography have been made by speeding up the passage of the mobile phase and by the introduction of better commercial stationary phases which have a reduced particle size and range of sizes (10-20 m). The time for separation in column chromatography have been made by speeding up the passage of the mobile phase to force it on run through the stationary phase bed more quickly. These techniques are known as flash chromatography and vacuum liquid chromatography, respectively. Increased pressure also makes it possible to use a stationary phase of smaller particle size, which improves resolution. This is further enhanced by commercial availability of more refined stationary phases with a narrow range of particle sizes specifically designed for the column procedures described below. Flash chromatography Flash chromatography is simply column chromatography where the mobile phase passes through relatively quickly because of the application pof positive pressure, usually about 10 bar, from a nitrogen cylinder or from an on-line supply. Compressed air could be used but, since this contains oxygen and water vapour, it is more likely to lead to decomposition of the products present in the extract and to changes in the chromatographic separation. A range of different, small particle size, narrow size range adsorbents designed for flash chromatography is now available from manufacturers of chromatography materials. Pressure is applied to the mobile phase either directly after it is introduced into the column or indirectly to an enclosed reservoir connected by tube to the column, as shown in figure 6.2. (NB Flash chromatography can only be carried out effectively with a stationary phase of the correct particle size. Some materials, particularly TLC-grade-silica, hav particles which

are too fine for flash chromatography but can be used for the vacuum liquid chromatography technique described below). An exercise involving flash chrmatgraphy is given in section 10.2.6

Vacuum liquid chromatography Vacuum liquid chromatography (VLC) is a form a column chromatography that is especially useful for the rapid crude fractionation of extracts. The column, which may be either normsl or reverse-phase TLC-grade adsorbent, is relatively squat and the mobile phase is sucked through by reduced pressure. Fractions are usually collected as aliquots of eluants of one polarity. The sequence of eluant aliquots can be designed to produce a stepwise gradient elution. Thecolumn is usually contained in a Buchner funnel and the eluant collected in a Buchner flask. However, this arrangement means that the flask has to be disconnected after each elution. A useful modification is to attach a separating funnel connected to the Buchner funnel via a T-piece adaptor, with the the side-arm connected to the vacuum supply, as shown in Figure 6.3. This allows the eluant to be drained off from the collecting separating funnel (as long as the vacuum is released) without any dissembling of the apparatus. Exercises involving VLC are given in sections 10.2.5 and 10.2.7

Sorbent extraction Sorbent extraction is a form of column chromatography in which the compounds of interest are removed from solution by adsorption on to the stationary phase rather than being eluted in the mobile phase. After passage of the original mobile phase, the compounds of interest are adsorbed on the stationary phase whence they are removed by eluting with a suitable solvent-either with a different polarity than the initial solvent or by a change in PH. The process in shown in figure 6.4. Sorbent extraction can be used with any type of stationary phase except those used for exclusion chromatography. An exercise involving sorbent extraction is given in section 10.2.5

TERJEMAHAN: Sebuah pertukaran ion kromatografi melibatkan diberikan insection 10.2.9. Pengecualian kromatografi Pilihan dalam kromatografi eksklusi terutama dalam jenis dasar stasioner yang akan digunakan. Dalam semua sikap sirkum gel harus dibiarkan dengan baik dalam fase gerak untuk beberapa waktu sebelum itu dikemas ke dalam kolom. Pemisahan kromatografi banyak melibatkan pengecualian memiliki fase gel hidrofilik sangat diam dan berair ponsel fasa diam.Itu tersedia sesuai dengan ukuran pori-pori, sehingga perlu untuk memiliki beberapa ide dari berbagai ukuran molekul hadir dalam campuran di memerintahkan untuk memilih yang terbaik untuk situasi ini. Lapisan fase pengecualian yang tersedia, tetapi mereka mahal, agak rapuh dan tidak begitu fleksibel sebagai lapisan tipis konvensional, sehingga mereka jarang digunakan metode pengembangan. Sebuah kolom kecil dapat dikemas dan diuji dengan sedikit sampel dan dielusi untuk menilai kesesuaian metode yang diusulkan. Latihan yang melibatkan kromatografi eksklusi diberikan pada bagian 10.2.4.

6.1.3. Kromatografi kolom prosedur baru Perbaikan dalam resolusi dalam kromatografi kolom telah dibuat dengan mempercepat berlalunya fase gerak dan dengan pengenalan yang lebih baik fasa diam komersial yang memiliki ukuran partikel berkurang dan berbagai ukuran (10-20 m). Waktu untuk pemisahan dalam kromatografi kolom telah dibuat dengan mempercepat berlalunya fase gerak untuk memaksa itu di jalankan melalui fase diam tidur lebih cepat. Teknik ini dikenal sebagai cahaya kromatografi dan kromatografi cair vakum, masing-masing. Peningkatan tekanan juga memungkinkan untuk menggunakan fase diam ukuran partikel yang lebih kecil, yang meningkatkan resolusi. Hal ini lebih ditingkatkan dengan ketersediaan komersial lebih fasa diam

disempurnakan dengan kisaran yang sempit ukuran partikel khusus dirancang untuk prosedur yang dijelaskan di bawah kolom.

Kromatografi Kilat Kromatografi kolom merupakan dimana fase gerak melewati relatif cepat karena tekanan aplikasi POF positif, biasanya sekitar 10 bar, dari silinder nitrogen atau dari pasokan online. Udara tekan dapat digunakan tetapi, karena ini mengandung oksigen dan uap air, itu lebih cenderung mengarah pada dekomposisi produk hadir dalam ekstrak dan perubahan pemisahan kromatografi. Berbagai berbeda, ukuran partikel kecil, adsorben berbagai ukuran sempit dirancang untuk flash kromatografi sekarang tersedia dari produsen bahan kromatografi. Tekanan diterapkan pada fase gerak baik secara langsung setelah diperkenalkan ke dalam kolom atau tidak langsung ke waduk tertutup yang dihubungkan dengan tabung untuk kolom, seperti pada gambar 6.2. (NB kilat kromatografi hanya dapat dilakukan secara efektif dengan fase diam dari ukuran partikel yang benar. Beberapa bahan, terutama TLC kelas-silika, partikel hav yang terlalu baik untuk flash kromatografi tetapi dapat digunakan untuk teknik kromatografi cair vakum dijelaskan bawah). Latihan yang melibatkan kilat kromatografi diberikan pada bagian 10.2.6 Ruang hampa Kromatografi Cair Ruang hampa kromatografi cair (VLC) adalah bentuk kromatografi kolom yang sangat berguna untuk fraksinasi minyak mentah yang cepat dari ekstrak. Kolom tersebut, yang dapat berupa normal atau membalikkan-fase KLT kelas adsorben, relatif jongkok dan fase gerak tersedot melalui oleh tekanan berkurang. Fraksi biasanya dikumpulkan sebagai Aliquot dari eluants satu polaritas. Urutan Aliquot eluen dapat dirancang untuk menghasilkan elusi gradien bertahap. Kolom tersebut biasanya dimuat dalam corong Buchner dan eluant dikumpulkan dalam suatu tabung Buchner. Namun, pengaturan ini berarti bahwa labu harus terputus setelah elusi masingmasing.Sebuah modifikasi yang berguna adalah untuk melampirkan corong pisah terhubung ke corong Buchner melalui adaptor T-sepotong, dengan lengan samping terhubung ke satu vakum, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6.3.

Hal ini memungkinkan eluent yang akan dikeringkan dan ditutup dari saluran pengumpulan memisahkan (selama vakum dilepaskan) tanpa dissembling alat tersebut. Latihan yang melibatkan VLC diberikan dalam bagian 10.2.5 dan 10.2.7

Ekstraksi Sorben

Ekstraksi sorben adalah bentuk kromatografi kolom di mana senyawa-senyawa dari bunga dikeluarkan dari larutan dengan adsorpsi pada fase diam bukannya dielusi dalam fase gerak.Setelah berlalunya fase ponsel asli, senyawa dari bunga yang teradsorpsi pada mana fase diam mereka dihapus oleh eluting dengan pelarut yang cocok baik dengan polaritas berbeda dengan pelarut awal atau oleh perubahan PH. Proses dalam yang ditunjukkan pada gambar 6.4. Ekstraksi sorben dapat digunakan dengan semua jenis fase diam kecuali yang digunakan untuk kromatografi eksklusi. Latihan yang melibatkan ekstraksi sorben diberikan pada bagian 10.2.5 Large-scale adaptations of HPLC HPLC using a closed, prepacked column can be used preparatively if the phum used to deliver to mobile phase has sufficient capacity and power pressure liquid chromatography if the stationary phase particle zise is langer than that used for analytical HPLC. These methods are expensive but have the advantage that the extractcan be injected online so that the initial applications is quite small. Commercial prepacking isolation of the column also ensures a good resolution regularly,but their cost prohibits casual use. Preparative adaptations of HPLC are being used increasingle in laboratories where the isolation of natural compounds is perfomed regularly, but their cost prohibits casual use.

LIQUID-LIQUID PARTITON SCHEMES 6.2.1 INDRODUCTION

There is some debate over whether these are really chromatography systems but they fulfil all the criteria for such. They are sometimes known as countercurrent distribution systems and rely, to an almost exclusive extent,on exploiting the different partition coefficiens of the components of a mixture to achieve separation.

It is important to realize that many forms of colomn chromatographywith solid stationary phases such as cellulose or reversed-phase silica also rely mainly on partition phenomena. The mayor difference between these techniquest and liquid-liquid system is that the letter involve no.solid material at all. The advantage of liquid-liquid system is that,theoretically at least,no material is lost trough irreversible binding to solid matter. 6.2.2 simple methods The simples form of liquid-liquid chromatography is a series of separating funnels,each containing the stationary phase. The mixture, dissolved in the mobile phase, is introduced to the first funnel and the mixture shaken carefully but thoroughly so that equilibrium is reached. The mobile phase is then transferred to the second funnel, while a new aliquot of mobile phase containing no mixture is added to the first funnel. Both are shaken and equilibrated and the process, called the cycle, is repeated until the first eliquot of mobile phqse is transferred from the last funnel to a collegting vessel. The procedure can be continued so that a large number of units of mobile phase are collected the method is simply a simply a scaled-up version of the process shown in figure 5.1. This process is obviously very time-consuming and the Craig countercurrent apparatus was developed to mechanize and perform a large series of cycles independently. These machine were very bulky and used large amouts of solvents, so they are not valid for use nowadays for cost and safety reasons. There have been several developments to reduce time and the amount of solvent used. These are discussed in some detail by Hostettmann, Hostettmann and Marston (1986). Two of the more popular thecniques are described below in brief, but detailed instructions regarding use are not given as these machines are expensive and found only in laboratories specializing in extractions. 6.2.3 Droplet countercerrent chromatography This technique is based on the passage off droplets of the mobile phase trough the stationary phase over along distance. The stationary phase is contained in 200 or more glass tubes connected in series by norrow intert plastic tube. These tubes are held in racks in the instrument called a droplet countercurrent chromatograph (DCCC). The mobile phase is phumped through as a continuous series of droplets which are small enough to rise (or fall) trough the stationary phase without touching the sides of the tube. The components of the mixture, dissolved in the mobile phase, are partitioned between the two phase ase the bubble of the mobile phase passes along the series of tubes. Eventually the mobile phase bubbles reach the end of the series of tubes and and are collectedas fractions. The components of the mixture which have the greatest affinity for the mobile phase (i.e. partition coefficient in fovour of it) are contained in the first fractions to be collected, whereas others are eventually cluted. Any compounds having a strong affinity for the stationary phase wil remain in the system, but the stationary phase can be displaced by a new solvent, pumped out and collected. A diagrammatic scheme of the DCCC is shown in figure 6.5.

Partitioning and subsequent equilibrium is attained raplidly only if a high degree of interfacial activity accurs, and yhis limits the solvent mixture that are used. Butanol : acetic : water mixture and chloroform : methanol water mixture are those most commonly utilized for polar compounds, but systems have been developed for non-polar compounds. When the solvent combinations specified are mixed and equilibrated, two immiscible phase are formed. One of these is used as the mobile phase and the other as the stationary phase. The choice of solvent compositition to be used for separating a particular mixture is made by using the less polar phase of the solvent combinations as the mobile phase in TLC examination of the sample. Yhe sample should resolve into discrete zones. If these are mainly in the upper half of the TLC plate, i.e. Rf values greater than 0,5 then the less polar phase should be used as the mobile phase in he DCCC. If the components separate with Rf values less than 0,5, then the more polar phase shuld be used as the mobile phase. The DCCC is designed so that the droplets can either rise (ascending technique) or fall (descending technique) through the stationary phase, and thus either phase can be used as the mobile phase. DCCC uses relatively low volumes of solvent but it can take several days to separate a mixture. The other major disadvantage of this technique is the limited range of solvent mixtures that can be used. 6.2.4 centrifugal countercurrent chromatography Centrifugal countercurrent chromatography is a more recently introduced technique, which yields much faster results than DCCC and is also less restricted in the solvent that can be used. It consists of a very long tube with many coils. The more-dense stationary phase is held in the tube as a thin layer by centrifugal force as the coils are spun around a central axis. The mobile phase is pumped trough the tubes, and so there is a large interface between the two phases across which solute molecules can pass and equilibrium occrurs. The mobile phase is collected as time-based fractions as it passes out of the end of the tube. Using this method, separation of mixture takes only a few hours. The major limitation of this technique is the cost involved. Terjemahan: Skala besar adaptasi dari HPLC HPLC menggunakan kolom, tertutup rapi dapat digunakan preparatif jika Ph digunakan untuk menyampaikan kepada fase gerak yang memiliki kapasitas cukup dan daya kromatografi cair tekanan jika ukuran fase diam partikel lebih panjang daripada yang digunakan untuk analisis HPLC. Metode ini mahal tapi memiliki keuntungan bahwa extractcan yang disuntikkan on-line sehingga aplikasi awal cukup kecil. Prepacking isolasi Komersial kolom juga memastikan resolusi yang baik secara teratur, tetapi biaya mereka melarang penggunaan kasual.

Adaptasi HPLC preparatif yang makin digunakan di laboratorium dimana isolasi senyawa alam sedian secara teratur, tetapi biaya mereka melarang penggunaan kasual. CAIR-CAIR partiton SKEMA

6.2.1 INDRODUCTION Ada beberapa perdebatan tentang apakah ini benar-benar sistem kromatografi tetapi mereka memenuhi semua kriteria tersebut. Mereka kadang-kadang dikenal sebagai sistem distribusi arus balik dan mengandalkan, untuk tingkat yang hampir eksklusif, pada mengeksploitasi koefisien partisi yang berbeda dari komponen-komponen dari campuran untuk mencapai pemisahan. Adalah penting untuk menyadari bahwa banyak bentuk fase kolom padat kromatografi dengan stasioner seperti silika selulosa atau fase terbalik juga terutama mengandalkan pada fenomena partisi. Perbedaan antara wali kota Techniquest dan cair-cair sistem adalah bahwa surat itu melibatkan bahan no.solid sama sekali. Keuntungan dari cair-cair sistem adalah bahwa, paling tidak secara teoretis tidak ada bahan hilang mengikat melalui permanen pada zat padat.

6.2.2 metode sederhana Bentuk simples dari kromatografi cair-cair adalah serangkaian saluran memisahkan, masingmasing berisi fase diam. Campuran, dilarutkan dalam fase gerak, diperkenalkan ke corong pertama dan campuran dikocok hati-hati namun menyeluruh sehingga kesetimbangan yang tercapai. Fase gerak yang kemudian ditransfer ke saluran kedua, sementara alikuot baru fase gerak yang mengandung campuran tidak akan ditambahkan ke corong pertama. Keduanya terguncang dan diseimbangkan dan proses, yang disebut 'siklus', diulang sampai eliquot pertama ph ponsel akan ditransfer dari corong lalu untuk kapal. Prosedur ini dapat dilanjutkan sehingga sejumlah besar unit dari fase gerak dikumpulkan metode ini hanya sekedar versi skala-up dari proses yang ditunjukkan pada gambar 5.1. Proses ini jelas sangat memakan waktu dan aparat lawan Craig dikembangkan untuk mekanisasi dan melakukan serangkaian besar siklus independen. Mesin ini sangat besar dan digunakan jumlah sebesar pelarut, sehingga mereka tidak berlaku untuk digunakan saat ini untuk alasan biaya dan keamanan. Ada beberapa perkembangan untuk mengurangi waktu dan jumlah pelarut yang digunakan. Ini dibahas secara rinci oleh Hostettmann, Hostettmann dan Marston (1986). Dua dari teknik lebih populer dijelaskan di bawah ini secara singkat, tapi petunjuk rinci tentang penggunaan tidak diberikan sebagai mesin ini mahal dan hanya ditemukan di laboratorium yang mengkhususkan diri dalam ekstraksi.

6.2.3 Droplet countercerrent kromatografi Teknik ini didasarkan pada bagian dari tetesan palung fase gerak fase diam lebih sepanjang jarak. Fase diam yang terkandung dalam 200 atau lebih tabung kaca dihubungkan secara seri

dengan tabung plastik intert norrow. Tabung tersebut diadakan di rak dalam alat yang disebut arus balik tetesan kromatografi (DCCC). Tahap mobile dipompa melalui sebagai rangkaian berkelanjutan dari tetesan yang cukup kecil untuk naik (atau turun) melalui fase diam tanpa menyentuh sisi tabung. Komponen campuran, dilarutkan dalam fase gerak, yang dipartisi antara ase tahap dua gelembung fase gerak melewati sepanjang serangkaian tabung. Akhirnya gelembung fase gerak mencapai akhir dari seri tabung dan dan fraksi dikumpulkan Komponen campuran yang memiliki afinitas terbesar bagi fase gerak (yaitu koefisien partisi di fovour itu) yang terkandung dalam fraksi pertama yang akan dikumpulkan, sedangkan yang lain pada akhirnya cluted. Setiap senyawa memiliki afinitas yang kuat untuk wil fase diam tetap di sistem, tetapi fase diam bisa diubah dengan suatu pelarut baru, dipompa keluar dan dikumpulkan. Skema diagram dari DCCC yang ditunjukkan pada Gambar 6.5. Partisi dan keseimbangan berikutnya dicapai raplidly hanya jika tingkat tinggi terjadi aktivitas antarmuka, dan yhis membatasi campuran pelarut yang digunakan. Butanol: asetat: air dan campuran kloroform: metanol campuran air adalah yang paling sering digunakan untuk senyawa polar, tetapi sistem telah dikembangkan untuk non-polar senyawa. Ketika kombinasi pelarut ditetapkan adalah campuran dan diseimbangkan, fase bercampur dua terbentuk. Salah satunya digunakan sebagai fase gerak dan yang lain sebagai fase diam. Pemilihan komposisi pelarut yang akan digunakan untuk memisahkan campuran khusus ini dibuat dengan menggunakan fase kurang polar kombinasi pelarut sebagai fasa gerak dalam pemeriksaan KLT sampel. Sampel itu harus menyelesaikan ke zona diskrit. Jika hal ini terutama di bagian atas pelat KLT, yaitu Rf nilai lebih besar dari 0,5 maka fase kurang polar harus digunakan sebagai fase gerak dalam dia DCCC. Jika komponen yang terpisah dengan nilai Rf kurang dari 0,5, maka tahap yang lebih polar shuld digunakan sebagai fase gerak. DCCC ini dirancang sehingga tetesan dapat naik (teknik ascending) atau jatuh (teknik descending) melalui fase diam, dan dengan demikian fase dapat digunakan sebagai fase gerak. DCCC menggunakan volume yang relatif rendah pelarut tetapi bisa memakan waktu beberapa hari untuk memisahkan campuran. Kerugian besar lainnya dari teknik ini adalah jangkauan terbatas dari campuran pelarut yang dapat digunakan.

6.2.4 kromatografi sentrifugal lawan arus Kromatografi lawan arus sentrifugal adalah teknik yang lebih baru-baru ini diperkenalkan, yang memberikan hasil jauh lebih cepat daripada DCCC dan juga kurang dibatasi dalam pelarut yang dapat digunakan. Ini terdiri dari sebuah tabung yang sangat panjang dengan kumparan banyak. Fase lebih padat stasioner diadakan di tabung sebagai lapisan tipis dengan gaya sentrifugal sebagai kumparan yang berputar di sekitar poros tengah. Fase gerak dipompa melalui tabung, dan sehingga ada antarmuka yang besar antara dua fase di mana molekul zat terlarut dapat melewati dan terjadi keseimbangan. Fase gerak yang dikumpulkan sebagai fraksi berdasarkan waktu saat melintas keluar dari ujung tabung. Menggunakan metode ini, pemisahan campuran hanya memakan waktu beberapa jam. Keterbatasan utama dari teknik ini adalah biaya yang terlibat