DETERMINACIN DE LOS PRODUCTOS DE GLUCLISIS EN LA PAPA.

INTRODUCCION La gluclisis es una va metablica en la cual una molcula de glucosa se oxida, produciendo dos molculas de cido pirvico. Este proceso es muy importante para que la clula obtenga energa, ya que da como resultado un rendimiento neto de dos molculas de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico, y dos molculas de NADH a partir de NAD. La gluclisis consiste en 10 reacciones mediadas por enzimas, que escinden a la glucosa en dos molculas de piruvato, este es capaz de seguir otras vas metablicas y continuar entregando energa al organismo. Es la va inicial del catabolismo de carbohidratos, y tiene tres funciones principales: 1. La produccin de molculas de alta energa (ATP y NADH) como fuente energetica celular en procesos de respiracin aerbica (dependiente de oxigeno) y anaerbica (no depende de oxigeno). 2. La generacin de piruvato que pasar al Ciclo de Krebs en la respiracin aerbica. 3. La formacin de intermediarios de 6 y 3 carbonos tiles en otros procesos celulares. [1] La gluclisis comienza con una molcula de glucosa. En este proceso, primero se invierte energa por transferencia de un grupo fosfato desde una molcula de ATP, una por cada paso, a la molcula de azcar. La molcula de 6 carbonos luego se escinde y, de all en adelante, la secuencia produce energa. En cierto momento se reduce una molcula de NAD+ a NADH y H+ almacenandose parte de la energa producida por la oxidacin del gliceraldehdo fosfato. En los pasos finales las molculas de ADP toman energa del sistema, fosforilndose a ATP.

Resumiendo: para iniciar la secuencia glucoltica es necesaria la energa de los enlaces fosfato de dos molculas de ATP. Posteriormente se producen dos molculas de NADH a partir de dos de NAD+ y cuatro de ATP a partir de cuatro de ADP:

Glucosa + 2ATP + 4ADP + 2Pi + 2NAD => 2 cido pirvico + 2ADP + 4ATP + 2NADH + 2H + 2H2O Existen dos tipos de fermentacin: alcoholica y lctica. La primera consiste en la degradacin de la glucosa en ausencia de oxigeno por accin de la levadura saccharomyces cerevisiae (hongo unicelular), formando etanol. El segundo tipo de fermentacin (lctica) consiste en la transformacin de la glucosa en cido lctico, por accin de Lactobacillus del yogurt (bacteria gram-positiva anaerobia). En ambos casos hay una serie de reacciones comunes a ambos procesos, que van desde la glucosa hasta el cido pirvico. Identificando la presencia de cido pirvico, acetaldehdo y etanol se comprueba que se est realizando una fermentacin alcohlica. De forma similar, al identificar la presencia de cido lctico y cido pirvico se puede comprobar que se est llevando a cabo una fermentacin lctica La papa (Solanum tuberosum ssp. Andigena) contiene los siguientes carbohidratos: almidn, celulosa, glucosa, sacarosa y pectinas. Los almidones de la papa son amilosa y amilopectina en proporcin 1:3. El contenido de almidn en las papas es muy variable y depende de las variedades de especies. El porcentaje de almidn varia de un 11,93% a un 16,41% del peso del tubrculo[2]. Las levaduras se encuentran en la mayora de frutas y flores. Estas levaduras fermentan los azucares produciendo CO2 y EtOH. Si se exprime un fruta y el zumo se deja en un recipiente que tenga una superficie limitada de contacto con el aire, de manera que los microorganismos aerobios competidores no se desarrollen mas que las levaduras, es casi seguro que se producir una fermentacin alcohlica. Todas las bacterias del cido lctico fermentan diversas azucares, produciendo lactato en cantidades elevadas como para inhibir o matar la mayora de otros microorganismos. Salvo algunas excepciones como los estreptococos, estas bacterias son inocuas para el ser humano, ademas que sus productos metabolicos presentan agradable sabor. La mayoria de los productos vegetales y lacteos contienen una poblacion natural adecuada de estas bacterias[3]. DETERMINACION DEL PRODUCTO DE LA GLUCOLISIS Para la determinacin o formacin de algunos productos de la fermentacin de glucosa y la muestra biolgica (pulpa de papa) por accin de la levadura saccharomyces cerevisiae y del lactobacillus del yogurth, hay que generar ocho sistemas diferentes como lo indica la tabla 1: Tabla 1: Sistemas para la fermentacion:
Reactivos *M.B (papa) (mL) Glucosa 10% (mL) Levadura en H2O (mL) Levadura en Na2HPO4 (mL) Yogurth (mL) Sulfito sodico (mL) **Acido tricloroacetico (mL) Sistemas A 5 5 2 Am 5 5 2 B 5 5 0,5 Bm 5 5 0,5 C 5 5 2 Cm 5 5 2 D 5 5 2 Dm 5 5 2

*M.B= muestra biolgica. Los sistemas que se rotulan con la letra m, contienen la muestra biolgica (M.B). **La adicin del cido tricloroacetico debe desarrollarse despus del calentamiento durante 1 hora a 30-40C. Los sistemas generados deben simular situaciones distintas en que etapas como la fermentacin alcohlica, lctica, e inhibicin de ambas, se presentan de forma independiente, siendo caractersticas de ellas la formacin de productos como el piruvato, cido lctico y etanol, nicos para cada sistema. Asi por ejemplo, en los sistemas A y Am daran como resultado segn las condiciones, la fermentacin alcohlica debido a la accin de la levadura en agua. En los sistemas B y Bm, la adicin del sulfito de sodio (Na2SO3) tiene dos fines: el primero es eliminar el oxigeno disuelto en el agua, favoreciendo as la fermentacin que es un proceso anaerobio. La segunda es atrapar al acetaldehido por la formacion de un compuesto de adicion de bisulfito (ec. 1), por ende no se lleva a cabo la

reduccion de acetaldehido a etanol. La adicion del sulfito aumentar el pH en el rango de 8 a 8,5; si bien este pH no inhibe la accion de la enzima piruvato descarboxilasa (PDG), es capaz de atrapar el CO 2 producido en la descarboxilacion del piruvato, en forma de bicarbonato (HCO 3) disuelto, lo que genera un nuevo equilibrio en que la concentracion del CO 2 no incrementa notablemente en los productos y por tanto no se favorece la reaccion revercible hacia el piruvato[4]. Ec. 1:

C y Cm son dos sistemas en que la adicin de levadura en Na 2HPO4 se realiza con el fin de generar un pH bsico (pH 10) en el sistema, lo que implicara la inhibicin de la ruta de fermentacin alcohlica, ya que esta se da por accin de la enzima piruvato descarboxilasa que requiere de un pH ligeramente alcalino en el sistema para llevar a cabo la conversin del piruvato hasta acetaldehdo, con esto se asegura que la glucolisis se detenga en el producto piruvato. Se adiciona a los sistemas D y Dm yogurth, el cual contiene la bacteria lactobacillus que permite la fermentacin lctica. La adicin del cido tricloroacetico tiene como fin asegurar la precipitacin de agentes coagulantes como la casena presente en el yogurth, y otras sustancias proteicas presentes en la muestra, de esta manera se pueden separar los productos etanol, cido lactico y piruvato de las dems sustancias interferencias en los sistemas. Para corroborar los productos de la fermentacin, hay que desarrollar diferentes pruebas colorimtricas que permitan determinar el producto final de las distintas rutas metablicas tanto de la glucosa como de la muestra biolgica, segn las condiciones anteriormente citadas para cada sistema: 1. Determinacin de etanol: La fermentacin alcohlica de azucares consiste bsicamente en la degradacin de glucosa mediante la secuencia glicolitica que produce cido piruvico y NADH2. Dos reacciones adicionales son necesarias para completar el proceso, en la primera, el cido piruvico es descarboxilado por accin de la enzima piruvato descarboxilasa, producindose acetaldehdo; este a su vez es reducido por la enzima alcohol deshidrogenasa, empleando los equivalentes reductores del NADH2, generndose etanol [5]. En la siguiente figura se esquematiza el proceso:

Para detectar si la fermentacin se llevo a cabo en el sistema, se desarrollan pruebas que caracterizan ciertos grupos funcionales como el hidroxilo (-OH) y el carbonilo (-C=O).

1.1. prueba de yodo-yoduro: La prueba yodo-yoduro consiste en la halogenacin en medio bsico de una cetona, en este caso acetaldehdo, precursor del etanol. El segundo paso es una sustitucin nucleofilica en el grupo carbonilo, en que se obtiene como productos un cido carboxilico y yodoformo que presenta una coloracin amarilla caracterstica. La reaccin se describe en la siguiente figura:

1.2. Prueba del cido sulfocromico: Los alcoholes se pueden determinar por la oxidacin con anhdrido crmico (CrO 3) en cido sulfrico acuoso, la solucin transparente anaranjada se vuelve azul verdosa y opaca, como lo muestra la siguiente ecuacin:

2. Determinacin de acetaldehido: Para determinar la presencia de un aldehido se emplea nitroprusiato de sodio el cual en presencia de una base como la piperidina, reacciona con el producto de adicin bisulfito-acetaldehido (ec. 1) formado un compuesto de color azul[6].

Figura 1: Estructura del nitroprusiato 3. Determinacin de piruvato: Para determinar la presencia de piruvato, producto de la va catablica de la glucosa, se realizan las siguientes pruebas en los sistemas C y Cm: 3.1. Con nitroprusiato de sodio: Para determinar la presencia del piruvato en los sistemas, se desarrolla la prueba con nitroprusiato de sodio, en que la formacin de dos fases y la aparicin de un anillo verde entre ellas indicara un resultado positivo para el

nitroprusiato. De igual forma, la aparicin de un anillo rosado es indicio de la presencia de tioles. 3.2. Con 2,4 fenilhidrazina: La presencia de piruvato se demuestra por la formacin de la 2,4-dinitrofenilhidrazona, de coloracin roja caracterstica. Esta reaccin se da entre -cetoacidos con 2,4-dinitrofenilhidrazina, como lo describe la siguiente ecuacin:

4. Determinacin del cido lctico: La fermentacin lctica es una ruta metablica anaerbica que se desarrolla en el citoplasma de la clula, en este proceso la glucosa se oxida parcialmente para obtener energa y cido lctico. Este cido se identifica en los sistemas D y Dm que siguen la ruta de la fermentacin lctica, dada la adicin de la lactobacillus del yogurth. El mtodo empleado para su determinacin colorimtrica es la adicin de cloruro frrico (formacin de lactato frrico de coloracin amarillo verdoso). Las ecuaciones que describen el proceso, son las siguientes[7]: H3C-CH(OH)-COOH + (CH3-CH2)2-O ----> H3C-CH(OH)-COO + (CH3-CH2)2-OH 3H3C-CH(OH)-COO + Fe ----> Fe(H3C-CH(OH)-COO)3 Lactato frrico (verde amarillento). BIBLIOGRAFIA [1]. Luque, E. Fundamentos de bioqumica. Pg 84-92. [2]. Cultivo y mejoramiento de la papa, pg 99. [3]. Introduccin a la microbiologa, Volumen 2 Escrito por John L. Ingraham, cap 29, pg 734-6 [4]. BIOCHEMISTRY THE PRODUCTION OF PYRUVATE AND ACETALDEHYDE DURING THE FERMENTATION OF GLUCOSE BY YEAST. [5]. Fernandez, T; Martn, C; Taherzadeh, M. EXISTENCIA DE CEPAS INDUSTRIALES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE A INHIBIDORES DE LA FERMENTACIN PRESENTES EN HIDROLIZADOS CIDOS DE BAGAZO DE CAA DE AZCAR. Grupo de Tecnologa de Biorrecursos, Departamento de Qumica e Ingeniera Qumica. Universidad de Matanzas, Cuba. [6]. Quintero, L; Amicarelli, A. Estimador de Estados en Fermentacin Alcohlica en Continuo de Zymomonas Mobilis Mediante Filtrado Bayesiano Recursivo. Instituto de Automtica (INAUT) Universidad Nacional de San Juan, Argentina. [7]. Hoyos, J; Carrera, E. DESARROLLO DE UN COMPLEJO ENZIMTICO POR FERMENTACIN DE SUSTRATO SLIDO CON Rhizopus Niveus, PARA LA OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN DE ALCOHOL ETLICO A PARTIR DE MELAZA. Universidad complutense, Espaa.