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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA SETOR DE CINCIAS AGRRIAS E DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

SEME YOUSSEF REDA

ESTUDO COMPARATIVO DE LEOS VEGETAIS SUBMETIDOS A ESTRESSE TRMICO

PONTA GROSSA 2004

SEME YOUSSEF REDA

ESTUDO COMPARATIVO DE LEOS VEGETAIS SUBMETIDOS A ESTRESSE TRMICO

Dissertao apresentada para a obteno do ttulo de mestre na Universidade Estadual de Ponta Grossa, rea de Avaliao Tecnolgica de Matrias-Primas. Orientador: Prof. Dr. Paulo Irajara Borba Carneiro. Co-orientador: Prof. Dr. Egon Schnitzel.

PONTA GROSSA 2004

AGRADECIMENTOS

A Deus que me dotou de razo, inteligncia e vontade, caracteres peculiares de sua natureza imortal! A Prof Dr disponibilidade. A Dr Ivnia Teresinha Albrecht Schuquel (UEM), pelos registros dos espectros de RMN de C13 e H1. A Prof Elenise Sauer Leal (CEFET), pelo registro dos cromatogramas gasosos. Ao Prof. Dr. Jos Caetano Zurita de Silva (UEPG), pelos registros dos espectros de XRD. A Denise Maria de Souza Mendes (Laboratrio de fsico-qumica), pela sua colaborao e disponibilidade. A Ana e Elias por suas presenas sempre animadoras em todos os momentos. A todos os professores do curso de ps-graduao que direta ou indiretamente contriburam para a concluso deste trabalho. Roseli Aparecida Ferrari (UEPG), pelas sugestes e

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Deus Senhor dos senhores. Ao Prof. Dr. Paulo Borba pela contribuio com seus conhecimentos e sugestes na orientao desta dissertao.

Ao Prof. Gilvan Wosiacki pela pacincia e disponibilidade em todos os momentos.

A Empresa Cargill do Brasil pela disponibilidade em fornecer os leos para a realizao desse trabalho.

Dedico esse trabalho aos meus filhos Joo Victor e Nathlia que muitas muitas vezes me fizeram companhia nas horas solitrias em frente ao computador.

A dissertao uma descrio da realidade.


(Gilvan Wosiacki)

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1

- Alteraes oxidativas de leos vegetais insaturados em alimentos..................................................................................... 12 - Mecanismo de formao de radicais livres................................. 13 - Mecanismo de formao de um monmero cclico.................... 15 - Produtos da termo-oxidao o cido linolico............................ 17 - Formao de epoxialcenais durante a peroxidao lipdica e reao com aminos para produzir derivados pirrlicos.............. 31 - Mecanismo de halogenao de dienos: 1,2 e 1,4...................... 37 - Termo-oxidao e isomerizao do cido linolico.................... 92 - Deslocalizao eletrnica e a estabilizao dos radicais fenoxil pelos antioxidantes fenlicos...................................................... 21 - Reao de oxidao do colesterol por radicais livres, na presena de cobre (Cu)............................................................. 28 - Clculo da rea de um prton..................................................... 40 - Clculo de prtons olefnicos...................................................... 40 - Clculo do total de prtons......................................................... 41 - Clculo do peso molecular mdio dos triacilgliceris (PM)......... 41 - Clculo do ndice de iodo (I.I.) por RMN H1................................ 41 - Clculo do ndice de iodo (AOCS).............................................. 61 - Clculo da acidez........................................................................ 62 - Clculo do ndice de perxidos................................................... 63 - Clculo da relao Ro,a............................................................... 102

Esquema 2 Esquema 3 Esquema 4 Esquema 5

Esquema 6 Esquema 7 Reao I

Reao II

Equao I Equao II Equao III Equao IV Equao V Equao VI Equao VII Equao VIII Equao IX

LISTA DE ILUSTRAES Figura 1 - Estrutura geral do triacilglicerol....................................................... 4 Figura 2 - Estrutura geral de uma flavonide e do -tocoferol........................ 21 Figura 3 - Estrutura geral da Capsaicina......................................................... 23 Figura 4 - Estrutura molecular do curcuminide............................................. 24 Figura 5 - Estrutura molecular do BHT, cido ctrico e BHA........................... 24 Figura 6 - Estrutura molecular do propil galato e do TBHQ............................ 25 Figura 7 - Espectro RMN genrico de um leo vegetal.................................. 38 Figura 8 - Caracterstica geral do programa PROTEUS................................. 42 Figura 9 - Estruturas tridimensionais da triolena............................................ 50 Figura 10 - Espectro genrico de carbono 13 de leo vegetal......................... 51 Figura 11 - Curva TG/DTA e TG/DSC do cido ftico....................................... 69 Figura 12 - Curva TG/DSC do cido ctrico....................................................... 70 Figura 13 - Curva TG/DSC do BHA.................................................................. 71 Figura 14 - Curva TG/DSC do BHT................................................................... 72 Figura 15 - Curva TG/DSC do eritorbato de sdio............................................ 73 Figura 16 - Curva TG/DSC do propil galato...................................................... 74 Figura 17 - Curva TG/DSC do cido srbico..................................................... 74 Figura 18 - Curva TG/DSC do cido ascrbico................................................. 75 Figura 19 - Curva TG/DSC da SAIB.................................................................. 76 Figura 20 - Espectro de infravermelho do leo de canola em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 78 Figura 21 - Espectro de infravermelho do leo de milho em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 78 Figura 22 - Espectro de infravermelho do azeite de oliva em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 79 Figura 23 - Espectro de infravermelho do leo de soja em diferentes tempos de aquecimento.............................................................................. 79

Figura 24 - Espectro de infravermelho do leo de canola em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 80 Figura 25 - Espectro de infravermelho do leo de milho em diferentes tempos de aquecimento.................................................. 81 Figura 26 - Espectro de infravermelho do azeite de oliva em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 81 Figura 27 - Espectro de infravermelho do leo de girassol em diferentes tempos de aquecimento.................................................................. 82 Figura 28 - Espectro de infravermelho do leo de soja em diferentes tempos de aquecimento.............................................................................. 82 Figura 29 - Fotografia do leo de girassol polimerizado................................... 83 Figura 30 - Espectro por difrao de raios-x do polmero do leo de girassol.. 84 Figura 31 - Espectro UV do leo de canola...................................................... 86 Figura 32 - Espectro UV do leo de milho........................................................ 86 Figura 33 - Espectro UV do azeite de oliva....................................................... 87 Figura 34 - Espectro UV do leo de soja.......................................................... 87 Figura 35 - Espectro UV do leo de canola...................................................... 88 Figura 36 - Espectro UV do leo de milho........................................................ 89 Figura 37 - Espectro UV do azeite de oliva....................................................... 89 Figura 38 - Espectro UV do leo de girassol..................................................... 90 Figura 39 - Espectro UV do leo de soja.......................................................... 90 Figura 40 - Regresso linear entre os mtodos: Wijs e RMN H1 para o ndice de iodo............................................................................................ 99 Figura 41 - Grfico de comparao do ndice de iodo entre os mtodos de Wijs e RMN H1................................................................................ 99 Figura 42 - Espectro integrado RMN H1 do leo de canola sem aquecimento e com 8 horas de auqecimento....................................................... 107 Espectro de RMN de C13 do azeite de oliva desacoplado in Figura 43 - natura no modo DEPT e in natura com 80 horas de aquecimento................................................................................... 111

LISTA DE SIGLAS

A API AVC BHA BHT CAP CG CGMS CLAE DAC DFG DG DNA DSC DTA FTIR HDL LDL PG RMN SAIB SBA

- Comprimento de onda medido em nanmetros - Absorbncia - American Petroleum Institute - Acidente Vacular Cerebral - Butilhidroxi Anisol - Tercbutil-hidrotolueno - Capsaicina - Cromatografia Gasosa - Cromatografia Gasosa Espectrometria de Massa - Cromatografia em Camada Lquida de Alta Eficincia - Doena da Artria Coronria - German Society for Fat Research - Dodecil Galato - cido Desoxi Ribonuclico - Calorimetria Exploratria Diferencial - Anlise Trmica Diferencial - Infravermelho com Transformada de Fourier - Lipoprotena de Alta Densidade - Lipoprotena de Baixa Densidade - Propil Galato - Ressonncia Magntica Nuclear - Acetato Isobutirato de Sacarose - cido Srbico

TBHT TG TOS UV VLDL XRD

- Terc-butilhidroquinona - Termo Gravimetria - Sndrome do leo Txico - Ultravioleta - Lipoprotena de Muito Baixa Densidade - Difrao por Raios-X

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

- Composio em cidos graxos dos leos de girassol (Helianthus annus) e de canola (Brassica campestris)....................................... 7 - Teor de gordura saturada e insaturada............................................ 8 - Nomenclatura e propriedades fsicas de alguns cidos graxos....... 8 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Canola...................................................... 64 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Girassol (Hellianthus annuus).................. 65 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Milho (Zea mays)..................................... 65 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Soja (Glycine max)................................. 66 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do azeite de oliva (Olea europea).............................. 66 - Anlise fsico-qumica do leo de Canola........................................ 95

Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

Tabela 10 - Anlise fsico-qumica do leo de Milho........................................... 95 Tabela 11 - Anlise fsico-qumica do azeite de Oliva......................................... 95 Tabela 12 - Anlise fsico-qumica do leo de Soja............................................ 96 Tabela 13 - Anlise fsico-qumica do leo de Canola........................................ 96 Tabela 14 - Anlise fsico-qumica do leo de Milho........................................... 96 Tabela 15 - Anlise fsico-qumica do azeite de Oliva......................................... 97 Tabela 16 - Anlise fsico-qumica do leo de Girassol...................................... 97 Tabela 17 - Anlise fsico-qumica do leo de Soja............................................ 97 Tabela 18 - ndice de iodo determinado por RMN de H1 e pelo mtodo de Wijs em amostras de leos vegetais in natura e sob aquecimento......... 98 Tabela 19 - ndice de iodo determinado por RMN de H1 em amostras vegetais aquecidos em diversos tempos de aquecimento............................. 100

Tabela 20 - Perfil de hidrognios dos triacilgliceris, obtido da curva de 104 integrao do espectro de RMN de H1 do leo de canola............... Tabela 21 - RMN de H1 dos leos vegetais na segunda fase de aquecimento.. 104 Tabela 22 - RMN de H1 de leos vegetais na primeira fase de aquecimento..... 105 Tabela 23 - Deslocamentos qumicos de C13 do leo de leos vegetais sob diferentes tempos de aquecimento.................................................. 109 Tabela 24 - Deslocamentos qumicos de C13 do leo de canola sob diferentes tempos de aquecimento................................................................... 110

RESUMO

Neste trabalho foram estudados os seguintes leos vegetais: canola, milho, oliva, girassol e soja; in natura e sob estresse trmico: 28 horas (4h/dia) e 80 horas (8h/dia) a 180 200C. A qualidade dos leos foi monitorada por tcnicas analticas (determinao dos ndices de acidez, iodo, perxidos e cromatografia gasosa) e espectroscpicas (UVvis, FTIR, RMN de H1 e C13). Tambm foi avaliada a estabilidade trmica dos seguintes antioxidantes: propil galato (PG), acetato isobutirato de sacarose (SAIB), terc-butilhidroxitolueno (BHT), cido ctrico, butil-hidroxianisol (BHA), cido ftico, cido ascrbico, eritorbato de sdio e cido srbico (SBA), por anlise trmica. Os resultados indicaram que os antioxidantes mais termo-resistentes foram o propil galato (PG) e a acetato isobutirato de sacarose (SAIB); a cromatografia gasosa til na determinao do perfil de cidos graxos do triacilglicerol dos leos in natura; os ndices de acidez e perxidos aumentam com a progressiva deteriorao trmica dos leos. A espectroscopia de UV-vis e FTIR so ferramentas importantes na anlise dos leos in natura e sob estresse trmico, pois revelam as alteraes envolvidas. A RMN H1 mostrou-se assencial no controle de qualidade de leos, pois permite determinar o ndice de iodo, o peso molecular (PM) mdio do triacilglicerol, o grau de insaturao e o estado de oxidao do leo in natura e sob qualquer tempo de aquecimento. Igualmente a RMN de C13 mostrou-se muito til no controle de qualidade, pois mostra variaes significativas no perfil dos C13 dos leos in natura e sob estresse trmico. As anlises espectroscpicas revelaram que sob estresse trmico, os leos vegetais mais estveis com aquecimento de 4 horas/dia, por 7 dias foram os leos de soja, milho, canola e oliva. E com aquecimento de 8 horas/dia, por 10 dias, foram os leos de canola, milho, oliva, soja e girassol. Os resultados mostram que as tcnicas espectroscpicas - rpidas, sensveis e precisas so ferramentas imprescindveis no controle de qualidade dos leos vegetais.

Palavraschave: leos vegetais, estresse trmico, oxidao trmica, anlises espectroscpicas

ABSTRACT

In this work the following vegetal oils had been studied: canola, maize, olive, sunflower and soybean; in natura and under stress thermal:28 hours (4h/day) and 80 hours (8h/day) the 180 - 200C. The quality of oils was monitored by analytical techniques (determination of the acid, iodine, peroxides values and gaseous chromatography) and spectroscopic technique (UV-vile, FTIR, RMN H1 and C13). Also the thermal stability of following antirust substances was evaluated: propil galato (PG), sucrose acetate isobutirato (SAI), butil-hidroxitolueno (BHT), citric acid, butil-hidroxianisol (BHA), fitic acid, ascorbic acid, sodium eritorbat and sorbic acid (SBA), for thermal analysis. Our results had indicated that the antirust substances thermal resistant had been the propil galato (PG) and sucrose acetate isobutirato (SAI); the gaseous chromatography is useful in the determination of the profile of triacylglycerol of oils in natura; the acid values and peroxides increase with the progressive thermal deterioration of oils. The FTIR and spectroscopy UV-vile are useful in the analysis of oils in natura and under it stress thermal, therefore they disclose the alterations involved. The results of RMN H1 are extremely useful in the quality control of oils, therefore it allows to determine the iodine index, the molecular weight (PM) average of triacilglicerol, the degree of insaturao and the degree of oxidation of the oil in natura and under any warm up time. Equally the RMN of C13 reveals useful in the quality control, therefore natura shows to significant variations in the profile of the C13 of oils in and under it stress thermal. The spectroscopic analyses had shown that under it stress thermal, the vegetal oils that better resist the heating (lesser deterioration) had been: canola, soybean, maize, olive and sunflower. Our results show that the spectroscopic techniques - fast, sensible and necessary - are powerful tools in the quality control of vegetal oils. Keywords: vegetal oils, stress thermal, thermal oxidization, spectroscopic analyses

SUMRIO 1 2
2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.2 2.3

INTRODUO................................................................................. 1 REVISO DA LITERATURA........................................................ 4


LEO E GORDURAS........................................................................... Composio dos leos e gorduras....................................................... Comportamento dos leos vegetais sob estresse trmico................... Antioxidantes........................................................................................ Fisiopatologia dos leos termo-oxidados............................................. Controle de qualidade dos leos vegetais............................................ OBJETIVO GERAL............................................................................... OBJETIVOS ESPECFICOS................................................................ 4 6 9 19 26 33 55 55

3
3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.7.1 3.2.7.2 3.2.7.3 3.2.8

MATERIAL E MTODOS.............................................................. 56
MATERIAL............................................................................................ MTODOS............................................................................................ Cromatografia gasosa.......................................................................... Anlise trmica..................................................................................... Anlise por espectroscopia de infravermelho....................................... Anlise por espectroscopia de ultravioleta........................................... Anlise por difrao de raios X (XRD).................................................. Ressonncia magntica nuclear de hidrognio-1 e carbono-13.......... Caracterizao fsico-qumica dos leos vegetais................................ Determinao do ndice de iodo.......................................................... Determinao da Acidez....................................................................... Determinao do ndice de Perxido.................................................... Estresse trmico dos leos vegetais.................................................... 56 58 58 59 60 60 60 60 61 61 62 62 63

4
4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.6.1 4.6.2

RESULTADOS E DISCUSSO........................................... 64
ANLISE CROMATOGRFICA........................................................... ANLISE TRMICA............................................................................. ANLISE ESPECTROSCPICA DE INFRAVERMELHO.................... ANLISE POR DIFRAO DE RAIOS X............................................. ANLISE ESPECTROSCPICA POR ULTRAVIOLETA-VISVEL...... ANLISE FSICO-QUIMICA DOS LEOS VEGETAIS........................ ndice de Acidez e Perxido................................................................. ndice de Iodo (RMN e Wijs)................................................................. 64 68 77 83 85 93 93 98

CONCLUSES..................................................................... 112

REFERNCIAS.............................................................................................. 114 ANEXO A: Publicaes................................................................................. 128

1 INTRODUO

Os leos vegetais representam um dos principais produtos extrados de plantas da atualidade (FARIA; LELES; IONASHIRO, et al., 2002) e cerca de dois teros so usados em produtos alimentcios fazendo parte da dieta humana (MALAYSIAN..., 2002). Os lipdeos, juntamente com as protenas e os carboidratos, so fontes de energia, apresentando grande importncia para a indstria, na produo de cidos graxos, glicerina, lubrificantes, carburantes, biodiesel, alm de inmeras outras aplicaes (COSTA NETO, 1993; FERRARI; OLIVEIRA; SCABIO, 2003). Os leos vegetais so constitudos principalmente de triacilgliceris (> 95 %) e pequenas quantidades de mono e diacilgliceris (LEHNINGER, 1995). A obteno do leo vegetal bruto, feita por meio de mtodos fsicos e qumicos sobre as sementes de oleaginosas usando-se um solvente como extrator e prensagem (GONALVES; BATISTA; MEIRELLES, 2002; MORETTO; FETT, 1998; MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Nesta fase, o leo vegetal contm impurezas como cidos graxos livres, prejudiciais qualidade e estabilidade do produto, sendo necessrio remover estas impurezas, pelos processos de refino que envolve a remoo do solvente, a degomagem, o branqueamento, a desacidificao e a desodorizao (BATISTA; MONNERAT; KATO, et al., 1999). O uso cotidiano dos leos vegetais, consagrados entre a populao, levou a necessidade de se avaliar melhor o seu grau de resistncia, principalmente a sua estabilidade ao armazenamento e estresse trmico. Questes como a que temperatura os leos comestveis se decompem e que produtos so formados quando submetidos ao aquecimento devem ser investigadas.

Na populao em geral, um procedimento comum o consumo de leos e gorduras, mesmo aps terem sido submetidos a altas temperaturas em processos de fritura. Na fritura, observa-se um processo simultneo de transferncia de calor e massa. O calor transferido do leo para o alimento; a gua que evapora do alimento absorvida pelo leo. Assim, os fatores que afetam a transferncia de calor e massa, afetam as propriedades trmicas e fsico-qumicas do leo e do alimento (MONGHARBEL, 2002). O processo de fritura realizado em recipientes abertos, temperatura elevada (180 200C), em contato direto com o ar . Estas condies provocam modificaes fsico-qumicas nos leos (termo-oxidao, rancificao), algumas das quais so visveis como o escurecimento, aumento da viscosidade, formao de espuma e fumaa. Essas transformaes afetam as caractersticas sensoriais do leo em uso e influenciam na aceitabilidade do produto frito, alm de produzirem efeitos txicos como irritao grastrointestinal, inibio de enzimas, destruio de vitaminas e carcinognese, quando da ingesto contnua e prolongada de produtos rancificados (FRITSCH, 1981; DOBARGANES; PEREZ-CAMINO, 1988; STEVENSON; VAISEY-GENSER; ESKIN, 1984). O uso de leos vegetais in natura na culinria vem aumentando entre a populao, que busca nos tempos atuais, hbitos alimentares mais saudveis como o consumo de leos comestveis ricos em triacilgliceris insaturados. Os leos e gorduras constituem os principais componentes dos alimentos insolveis em gua, possuindo poucos stios reativos na molcula, de modo que a ocorrncia de reaes (rancificao) durante o processamento e armazenamento do alimento menos variada que as de compostos solveis em gua como carboidratos e protenas (ARAJO, 1999).

As reaes de rancificao podem ser resumidas como reaes de autooxidao, envolvendo a formao de radicais livres, responsveis pela deteriorao dos leos e gorduras. Em resposta a isso, surgiu uma srie de antioxidantes de diversos tipos com o propsito de prolongar a vida til dos leos vegetais durante o seu armazenamento e prevenir as reaes de rancificao. Com isso, fornecem ao consumidor um alimento seguro e agradvel ao paladar (SHAHIDI;

WANASUNDARA, 1992). Portanto, faz-se necessrio realizar estudos sobre a estabilidade de leos submetidos a estresse trmico prolongado, pois leos de frituras reutilizados deterioram a qualidade dos alimentos e so potencialmente nocivos sade do consumidor.

2 REVISO DA LITERATURA

2.1 LEOS E GORDURAS Os leos e gorduras so substncias insolveis em gua (hidrofbicas), de origem animal ou vegetal, formados predominantemente por steres de

triacilgliceris, produtos resultantes da esterificao entre o glicerol e cidos graxos (MORETTO; FETT, 1998). Os triacilgliceris (Figura 1) so compostos insolveis em gua e a temperatura ambiente, possuem uma consistncia de lquido para slido. Quando esto sob forma slida so chamados de gorduras e quando esto sob forma lquida so chamados de leos (GIESE, 1996; FARIA; LELES ; IONASHIRO, et al., 2002). Alm de triacilgliceris, os leos contm vrios componentes em menor proporo, como mono e diglicerdeos (importantes como emulsionantes); cidos graxos livres; tocoferol (importante antioxidante); protenas, esteris e vitaminas (FARIA; LELES; IONASHIRO, et al, 2002; HIDALGO; ALAIZ; ZAMORA, 2001).

O O R1
n n

O O R2

O O

R3

Figura 1 - Estrutura geral de um triacilglicerol [R1, R2, R3 = grupo alquil saturado ou insaturado; podendo ser igual ou diferente].

Segundo Fennema (2000), os leos oriundos de frutos, como o azeite de oliva, so denominados azeites. Denominao que ser empregada neste trabalho. Os leos vegetais, possuem de uma a quatro insaturaes (ligaes duplas) na cadeia carbnica, sendo lquidos temperatura ambiente; as gorduras so slidas temperatura ambiente, devido a sua constituio em cidos graxos saturados (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Assim, gorduras animais como a banha, o sebo comestvel e a manteiga, so constitudas por misturas de triacilgliceris, que contm um nmero de saturaes maior do que o de insaturaes, conferindo-lhes maior ponto de fuso (slidos temperatura ambiente) (FENNEMA, 2000). De maneira anloga, os leos por possurem um nmero maior de insaturaes, expressam menor ponto de fuso (lquidos temperatura ambiente) (GIESE, 1996 FARIA; LELES ; IONASHIRO, et al., 2002). A maioria dos cidos graxos de leos comestveis possuem uma cadeia carbnica de 16 a 18 carbonos, embora o leo de cco contenha um alto grau de cido lurico com 12 tomos de carbono na sua constituio (ZALIHA; CHONG; CHEOW, et al., 2003).

2.1.1 Composio dos leos e gorduras

Os leos e gorduras apresentam como componentes, substncias que podem ser reunidas em duas grandes categorias: a) glicerdeos e b) no-glicerdeos. a) glicerdeos: so definidos como produtos da esterificao de uma molcula de glicerol com at trs molculas de cidos graxos. Os cidos graxos so cidos carboxlicos de cadeia longa, livres ou esterificados, constituindo os leos e gorduras (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Quando saturados possuem apenas ligaes simples entre os carbonos e possuem pouca reatividade qumica. J os cidos graxos insaturados, contm uma ou mais ligaes duplas no seu esqueleto carbnico; so mais reativos e mais suscetveis a termoxidao (GIESE, 1996). Na Tabela 1, so apresentados os cidos graxos presentes nos leos de girassol e canola; na Tabela 2, o teor de gordura saturada e insaturada e o teor em cidos graxos em alguns leos vegetais estudados neste trabalho e na Tabela 3, a nomenclatura e propriedades fsicas de alguns cidos graxos. b) no-glicerdeos: em todos os leos e gorduras, encontramos pequenas quantidades de componentes no-glicerdeos (MORETTO; FETT, 1998). Os leos vegetais brutos possuem menos de 5% e os leos refinados menos de 2%. No refino, alguns desses componentes so removidos completamente, outros parcialmente. Aqueles que ainda permanecem no leo refinado, ainda que em traos, podem afetar as caractersticas dos leos devido a alguma propriedade peculiar, como apresentar ao pr ou antioxidante, ser fortemente odorfero, ter sabor acentuado ou ser altamente colorido (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Alguns exemplos de grupos no-glicerdeos so os

fosfatdeos (lecitinas, cefalinas, fosfatidil inositol); esteris (estigmasterol); ceras (palmitato de cetila); hidrocarbonetos insolveis (esqualeno); carotenides; clorofila; tocoferis (vitamina E); lactonas e metilcetonas (FARIA; LELES ; IONASHIRO, et al., 2002).

Tabela 1 - Composio em cidos graxos dos leos de girassol (Helianthus annus) e de canola (Brassica campestris).

cidos Graxos (%) 12:0 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 20:2 22:0 24:0 24:1
FONTE: FIRESTONE, 1999.

leo de girassol (Helianthus annuus) 0,0 0,1 0,0 0,2 5,0 8,0 0,0 0,3 2,5 7,0 13 40 48 74 0,0 0,3 0,2 0,5 0,0 0,5 0,5 1,3 0,0 0,4

leo de canola (Brassica campestris) 0,1 0,2 1,5 6,0 0,0 3,0 0,5 3,1 8,0 60 11 23 5,0 13 0,0 3,0 3,0 15 0,0 1,0 0,0 2,0 0,0 2,0 0,0 3,0

Tabela 2 - Teor de cidos graxos em leos vegetais.

leos CANOLA GIRASSOL MILHO OLIVA SOJA

cido graxo saturado 6% 11% 13% 14% 15%

cido graxo monoinsaturado 58% 2% 25% 77% 24%

cido graxo poliinsaturado ac. ac. linolico Linolnico 26% 69% 61% 8% 54% 10% 1% < 1% 7%

FONTE: MORETTO; FETT, 1998; Modificado.

Tabela 3 - Nomenclatura e propriedades fsicas de alguns cidos graxos

cido Butrico (butanico) Caprico (hexanico) Caprlico (octanico) Cprico (decanico) Lurico (dodecanico) Mirstico (tetradecanico) Palmtico (hexadecanico) Esterrico (octadecanico) Araqudico (eicosanico) Behnico (docosanico) Lignocrico (tetracosanico) Olico (9(Z)-octadecenico), (-9) Linolico (9(Z),12(Z)-octadecadienico, (-6) Linolnico (9(Z),12(Z),15(Z) - octadecatrienico, (-3)
FONTE: UIEARA, 2004

Smbolo 4:0 6:0 8:0 10:0 12:0 14:0 16:0 18:0 20:0 22:0 24:0 18:19 18:26 18:33

Ponto de fuso (oC) - 4,2 - 3,4 16,7 31,6 44,2 54,4 62,9 69,6 75,4 80,0 84,2 16-17 5,0 11,0

2.1.2 Comportamento dos leos vegetais sob estresse trmico

Sabe-se que alimentos contendo leos e gorduras deterioram durante o armazenamento em atmosfera de oxignio, devido auto-oxidao. Mas quando eles so aquecidos a altas ocorrendo reaes de temperaturas, o processo da oxidao acelerado, oxipolimerizao e decomposio termo-oxidativa

(KOVALSKI, 1990; DOBARGANES; REZ-CAMINO; MRQUEZ-RUIZ, 1989). Isto tambm pode ser observado durante as fases de refino dos leos vegetais (GOMES; CAPONIO; DELCURATOLO, 2000). Segundo Helln e Pilar Rueda (1984), as modificaes e alteraes dos leos e gorduras, podem ser classificadas como: a) auto-oxidao: oxidao que ocorre a temperaturas abaixo de 100C; b) polimerizao trmica: oxidao que ocorre a temperaturas que variam entre 200 e 300C, na ausncia de oxignio; c) oxidao trmica: oxidao que ocorre na presena de oxignio a altas temperaturas (oxipolimerizao); d) modificaes fsicas: modificaes que ocorrem nas propriedades fsicas; e) modificaes nutricionais: modificaes nos aspectos fisiolgicos e nutricionais dos leos; f) modificaes qumicas, que podem ser de trs tipos (ARAJO, 1999): hidrlise dos triacilgliceris: resulta na liberao de cidos graxos, glicerina, mono e diglicerdeos; oxidao: ocorre nos cidos graxos com ligaes duplas; polimerizao: extensa condensao de monmeros de cidos graxos polinsaturados a altas temperaturas por perodos prolongados.

H alguns anos, aumentou o interesse sobre os efeitos fisiolgicos que os leos e gorduras aquecidos a elevadas temperaturas, principalmente na presena de ar, exercem sobre o organismo humano (PREZ-CAMINO; MRQUEZRUIZ; SALGADO RAPOSO, et al., 1998). No processo de fritura, o alimento submerso em leo quente, que age como meio de transferncia de calor (HELLN; PILAR RUEDA, 1984). Deve-se ainda considerar que parte do leo utilizado para a transferncia de calor absorvido pelo alimento e torna-se parte da dieta, exigindose leos de boa qualidade no preparo dos alimentos e que permaneam estveis por longos perodos de tempo (VARELA; MAREIRAS-VARELA; RUIZ-ROSO, 1983). Durante o aquecimento do leo no processo de fritura, uma complexa srie de reaes produz numerosos compostos de degradao. Com o decorrer das reaes, as qualidades funcionais, sensoriais e nutricionais se modificam (FARIA; LELES; IONASHIRO, et al., 2002). Quando o alimento submerso no leo quente em presena de ar, o leo exposto a trs agentes que causam mudanas em sua estrutura: gua, proveniente do prprio alimento, que leva a alteraes hidrolticas; oxignio que entra em contato com o leo e a partir de sua superfcie leva a alteraes oxidativas e finalmente, a temperatura em que o processo ocorre, resultando em alteraes trmicas, como isomerizao e reaes de ciso (aldedos e cetonas), formando diversos produtos de degradao, como epxidos e hidroperxidos (MORETTO; FETT, 1998). Portanto, as formas de deteriorao de leos vegetais so a hidrlise, a oxidao, e a polimerizao (MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). Sendo a oxidao a principal causa de deteriorao, ela provoca alteraes do sabor, textura, aroma e da cor nos alimentos, ocasionando perda do valor nutricional e gerando toxidez (FENNEMA, 2000). Um esquema geral sobre estas alteraes mostrado no Esquema 1.

A estabilidade trmica dos leos depende de sua estrutura qumica: leos com cidos graxos saturados so mais estveis do que os insaturados. Como estes leos so muito utilizados na culinria e na indstria, tem-se exigido de pesquisadores e tcnicos especializados, novos mtodos analticos capazes de avaliar as condies de processamento e estocagem, sendo, portanto, de fundamental importncia o conhecimento da estabilidade trmica dos leos vegetais para um rigoroso controle de qualidade (ARAJO, 1999). Segundo a German Society for Fat Research (DGF), por exemplo, o leo de fritura considerado deteriorado se a acidez estiver acima de 1%. O que est de acordo com o proposto por Lima e Gonalves (1995).

Esquema 1 - Alteraes oxidativas de leos vegetais insaturados em alimentos.

R = grupo alquil

DIMINUIO DO VALOR NUTRITIVO

ALDEDOS,

CIDOS, LCOOIS, EPXIDOS,

POLMEROS,

HIDROCARBONETOS, CIDOS GRAXOS CCLICOS, ETC.

FONTE: ARAJO, 1999; Modificado.

Um dos principais fatores que determinam a estabilidade de uma substncia, a sua estrutura molecular (MINN, 1985). Nos leos vegetais, as insaturaes presentes na cadeia carbnica so um alvo de ataque importante de agentes oxidantes como radicais livres, enzimas, metais que atuam como catalisadores de processos oxidativos e da foto-oxidao (MORETTO; FETT,1998). No Esquema 1, o hidrognio allico do fragmento do acido graxo insaturado presente no triacilglicerol (o hidrognio, do carbono vizinho ao carbono da ligao dupla) removido pelo oxignio singlete [1O2], ativado termicamente (fase de induo) (MINN, 1985). Em seguida o radical alila formado (derivado do fragmento do cido graxo insaturado) reage rapidamente com o oxignio formando o radical alquilperoxil que abstrai hidrognio allico de outro fragmento alquil dando seqncia a reao de propagao da cadeia e formando o derivado alquilhidroperxido. Os perxidos e hidroperxidos so clivados, formando compostos de oxidao secundria como aldedos e cetonas (ADHVARYU; ERHAN; LIU, et al., 2000; ESPN; SOLER-RIVAS; WICHERS, 2000), responsveis pelo odor desagradvel (rano) (KUBOW, 1990), como mostrado no Esquema 2.

Esquema 2 - Mecanismo de formao de radicais livres.

1 passo: iniciao

. . RH R. + H.
catalizado r

RH + O 2 catalizado r R + OOH

2 passo: propagao

. + O ROO . ROO . + RH ROOH + R .


R
2

reao em cadeia alto consumo de oxignio rpido aumento do ndice de perxido

3 passo: trmino

. . ROO. + R. ROOR ROO. + ROO. ROOR + O


R + R R -R
FONTE: LOURY, 1970.

Como a reao de oxidao pode ser definida como o processo de adio de oxignio ou remoo de hidrognio ou eltrons, tal reao pode ser acelerada pelo calor, luz (fotoxidao), ionizao, traos de metais (Cu e Fe), metaloprotenas e pela enzima lipoxigenase. Um dos mecanismos mais importantes o da fotoxidao. um mecanismo independente da formao de radicais livres e da presso de oxignio e depende de sensores como a clorofila e a mioglobina. No apresenta perodo de induo e na presena de luz e oxignio, transferem energia para a formao de perxido. Sua principal contribuio alterao dos leos e gorduras, est na mudana da configurao da insaturao de cis para trans (ARAJO, 1999; SCHUCHARDT; SERCHELI; VARGAS, 1998). Contudo, nos leos e gorduras de origem vegetal os ismeros trans esto praticamente ausentes. Exceto uma pequena quantidade residual que permanece durante a fase de hidrogenao, o que inevitvel. Em alguns produtos como margarinas, porm, foram encontrados valores de cidos-trans excessivamente

elevados (~25%) (BARRERA-ARELLANO; BLOCK, 1993). Durante o refino do leo, possvel que traos de resduos indesejveis como os ismeros trans e monmeros cclicos de cidos graxos estejam presentes (Esquema 3). No refino do leo de colza (rico em cido ercico, [22:1]), na fase de desodorizao so produzidos ismeros trans numa porcentagem superior a 5% do total de cidos graxos do leo e uma quantidade de monmeros cclicos de cidos graxos em torno de 650 mg/kg de leo, quando condies severas so usadas (56h a 250C). O principal responsvel pela formao destes monmeros alta concentrao do cido linolnico e que sob aquecimento prolongado e por um perodo de tempo longo, sofre ciclizao por meio da reao de DielsAlder (LAMBELET; GRANDGIRARD; GRAGOIRE, et al, 2003; SOLOMONS,1996).
Esquema 3 - Mecanismo de formao de um monmero cclico do cido linolnico.
( )6 HO2 H H H L
9
12 15 17

18

L LH

.
12 11

.
LH
12

.
9

.
16

14

11

14

10

15 10 15 9

. .

16

O OH

( )7
18

L-H ( )7 HO2
18

H-L

L
12

.
12 11

14

10 10

15 9 16

H O ( )7 HO
9
17

( )7 Me HO2
18

(CH2)xCO2H (CH2)yCH3

FONTE: MELTZER; FRANKEL; BESSLER, et al., 1981; SOLOMONS, 1996.

Os monmeros cclicos so compostos resultantes da oxidao dos leos vegetais e fazem parte dos resduos no-volteis. Os monmeros mais comuns, provm de cidos graxos com 18 carbonos, poliinsaturados, que ciclizam e sofrem uma dupla substituio no anel (MELTZER; FRANKEL; BESSLER, et al., 1981). A formao de monmeros cclicos mais pronunciada nos aquecimentos

intermitentes dos leos vegetais. Dependendo das condies de aquecimento, a concentrao de monmeros cclicos varia de 736 ppm (0,07%) a 1803 ppm (0,18%) no leo aquecido (ROJO; PERKINS, 1987). Outra preocupao a formao de polmeros. H duas classes de polmeros: os polmeros oxidativos e os polmeros trmicos, formados por degradao trmica, que indicam degradao dos leos vegetais (WALTKING; SEERY; BLEFFERT, 1972). Uma outra alterao sensvel, a rancidez hidroltica muito comum durante o armazenamento de alimentos, onde a frao lipdica presente lentamente hidrolisada pela gua temperatura elevada ou por enzimas lipolticas. Tipicamente, cidos graxos contendo de quatro a dez carbonos, conferem reverso do sabor em alimentos, como sabor de sabo, por exemplo, inerente hidrlise dos azeites de coco e dend em alimentos de confeitaria (ARAJO,1999). Alm disso, hidroperxidos so formados em leos vegetais que possuem alto teor de cidos graxos poliinsaturados, durante a estocagem, na presena de traos de oxignio. Isso resultar tambm numa reverso do sabor do leo pela formao de produtos volteis, resultantes do processo de degradao de hidroperxidos termolbeis em radicais alcoxil (Esquema 4).

Esquema 4 - Produtos da termo-oxidao do cido linolico (18:2

9,12

).

O.
COOH

CHO

COOH 2

+
O

COOH

OH

.
OH

OH
CHO 4

OH
CHO 3

CHO
5

OH

.
O

O
COOH
6 7 8 CHO

Legenda: 1 = 2,4decadienal; 2 = cido octanico; 3 = 2,4-nonadienal; 4 = 3nonenal; 5= heptanal; 6 = 2 heptanona; 7 = cido heptanico; 8 = 2 heptenal. FONTE: KESZLER; KRISKA; NMETH, 2000.

Por exemplo, a formao de hidroperxidos e dienos conjugados, est relacionada baixa na concentrao de -tocoferis (DEIANA; ROSA; CAO, et al., 2002). Logo, a formao de hidroperxidos e dienos conjugados, alvos fceis de ataques por radicais livres, formados sob altas temperaturas, deterioram o leo, tornando-o imprprio para o consumo (BRENES; GARCIA; DOBARGANES, et al., 2002). Dentre os fatores que influenciam as alteraes que surgem nos leos durante a fritura, alguns tm maior influncia: a) o efeito da temperatura: em temperaturas superiores a 200C h decomposio mxima dos leos;

b) aquecimento intermitente: onde a formao de perxidos durante o aquecimento e sua decomposio durante o ciclo de resfriamento, produzem muitos radicais livres e por conseguinte, severa deteriorao dos leos; c) efeito da razo superfcie / volume: quanto maior a superfcie de contato do leo com o ar, maior ser a sua deteriorao; d) efeito da adio de leo fresco: ao se colocar leo fresco sobre o leo de fritura, acelera sua decomposio (HELLN; CLAUSSEL; 1984; VARELA; MAREIRAS-VARELA; RUIZ-ROSO, 1983).

2.1.3 Antioxidantes

Os antioxidantes so substncias que impedem ou minimizam a formao de compostos como perxidos, aldedos, cetonas, dmeros e polmeros, produtos formados por termo-oxidao de leos e gorduras, impedindo a etapa inicial da autooxidao, a formao de radicais livres, removendo-os do meio. Com isso, preservam os alimentos, previnem a reverso do sabor e retardam a deteriorao por rancificao e descolorao (FOOD TECHNOLOGY, 1994; SHAHIDI;

WANASUNDARA, 1992; WAYNER; BURTON; INGOLD, et al 1985). Isto se deve propriedade dos antioxidantes - especialmente os derivados fenlicos de estabilizar o radical livre, por deslocalizao eletrnica no anel aromtico (efeito de ressonncia) e assim impedir a propagao de reaes radicalares oxidativas no meio (ESPN; SOLER-RIVAS; WICHERS, 2000; LITWINIENKO; KASPRZYCKA; JAMENEK, 1999). Dentre os principais antioxidantes fenlicos, encontram-se os tocoferis e os flavonides (Figura 2). Ambos os antioxidantes encontram-se distribudos livremente na natureza. Os tocoferis so antioxidantes monofenlicos que ajudam a estabilizar a maioria dos leos vegetais e so classificados em oito diferentes compostos pertencendo a duas famlias distintas: os tocis e os tocotrienis, tendo como prefixos as letras gregas , , e dependendo do nmero e da posio dos grupos metil ligados ao anel aromtico. So chamados de , , ou tocoferis, sendo que a atividade antioxidante decresce do para o -tocoferol (MELO; GUERRA, 2002). Os flavonides so antioxidantes polifenlicos, ocorrendo em clulas vivas, amplamente na natureza, na forma de glicosdeos, sendo considerados potentes antioxidantes. Constituem-se em aceptores de radicais livres, clivam ligaes

hidroperxidos e quelam metais considerados pr-oxidantes como o Zn, Cu e o Fe (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1992). Podem ser extrados das mais variadas fontes como do Citrus paradisi, de onde se extrai a naringina, um flavonide presente na casca deste citro (GIANNUZZO; NAZARENO; MISHIMA, et al., 2000). Num estudo feito por Pereira e Das (1990), avaliou-se a ao antioxidante de vrios derivados flavonides (Figura 2), em que a miricetina foi o flavonide mais eficaz. Em relao ao de destruir radicais livres provenientes da peroxidao lipdica, os flavonides so consagrados os mais eficazes (HANASAKI; OGAWA; FUKUI, 1993; HERTOG; FESKENS; HOLLMAN, et al., 1993). De outro lado, diversos antioxidantes sintticos como o BHA, TBHQ, etc., so utilizados na conservao de leos vegetais estocados (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1992). Segundo Bors; Heller; Michel, et al., (1990), o BHT (hidroxitolueno butilado), antioxidante sinttico, tem sua ao antioxidante devido a presena de grupos ativadores no anel aromtico, orto e para substitudos, contribuindo para a melhor deslocalizao de eltrons e estabilizao de radicais livres, formados nos processos oxidativos.

a)

CH3 O

CH3 CH3 CH3

CH3 CH3

HO CH3

b)

3' 2' 8 7 6 5 4 4' 5' 6' 3

Figura 2 a) estrutura do -tocoferol; b) estrutura geral de um flavonide;

Antioxidantes como os flavonides e tocoferis, apresentam estrutura complexa (LITWINIENKO; KASPRZYCKA; JAMENEK, 1999) e sua atividade antioxidante depende dos grupos hidroxil presentes em sua estrutura. A presena de grupos alquila (ativadores) na posio para no anel aromtico, favorecem a deslocalizao eletrnica e a estabilizao dos radicais fenoxil formados durante a reao (I):

PhOH + LOO . PhO . + LOOH


onde: LOOH e LOO = hidroperxidos de lipdeos e radicais perxidos de lipdeos PhOH e PhO = antioxidante fenlico e radical fenoxil formado

(I)

Isto mostra que a estrutura do antioxidante fundamental para a atividade antioxidante (atividade protetora), minimizando os efeitos txicos da decomposio termo-oxidativa de cidos graxos insaturados (LITWINIENKO; KASPRZYCKAGUTTMAN, 1998).

Diversos aspectos da oxidao lipdica tm sido investigados como meio de se estudar mecanismos cada vez mais avanados de anlise e controle de qualidade dos alimentos (WAYNER; BURTON; INGOLD et al 1985). Assim, segundo Shahidi e Wanasundara (1992), os antioxidantes podem ser agrupados da seguinte maneira: a) eliminadores de radicais livres; b) quelantes de ons metlicos; c) clareadores de oxignio: reagem com o oxignio em sistemas fechados;

Mas de acordo com sua natureza, os antioxidantes podem ser classificados como: a) antioxidantes primrios: reagem com radicais lipdicos altamente energticos, convertendo-os em produtos termodinamicamente mais estveis. Ex.: antioxidantes fenlicos; b) antioxidantes secundrios: tambm conhecidos como antioxidantes preventivos, agem por retardar a velocidade de formao da cadeia de iniciao de radicais lipdicos, por destruir os hidroperxidos formados. Ex.: cido tiodipropinico (SNCHEZ-MORENO; LARRAURI; SAURA-CALIXTO, 1998). Embora se tenha a preocupao de adicionar sempre ao alimento substncias antioxidantes, durante toda a vida as pessoas so expostas a diversas fontes de estresses oxidativos potencialmente prejudiciais como: poluio ambiental, fumaa dos cigarros e produtos de radiao ionizante. No obstante, muitos produtos oxidados so gerados endogenamente durante os processos fisiolgicos normais (WHITEHEAD; THORPE; MAXWELL, 1992). Num estudo feito por Wang; Cao e Prior (1996), concluiu-se que a baixa incidncia de cncer e a diminuio da taxa de mortalidade pelas complicaes

advindas daquele tipo de doena, esto associados ao aumento no consumo de antioxidantes, naturalmente presente nos alimentos como tocoferis e flavonides (flavonas, isoflavonas, flavononas, antocianinas, catequinas e isocatequinas), contribuindo para diminuir os riscos de ataques cardacos e de acidente vascular cerebral (AVC), assim como cnceres de pulmo, de pele e do trato digestivo (ANGUELOVA; WARTHESEN, 2000). Alguns antioxidantes so muito eficazes no combate aos processos oxidativos a altas temperaturas, como a Capsaicina (CAP) (Figura 3) que protege o cido olico durante o aquecimento. O rizoma de algumas espcies de gengibre como o Zingiber officinale, demonstraram ter potente ao antioxidante. Isto se deve ao alto teor de curcuminides (Figura 4), cuja ao antioxidante comparvel a do -tocoferol (DOLL, 1990; MALTZMAN; HURT; ELSON, 1989; FOOD TECHNOLOGY, 1994). Extratos de folhas de organo (Origanum vulgare L.) tm atividade antioxidante, em especial quando na preservao de leos vegetais refinados de milho, soja e oliva. A ao antioxidante das folhas de organo, deve-se aos flavonides presentes como: flavona, apigenina, eriodictiol, flavana, dihidroflavonol, etc (DEIANA; ROSA; CAO, et al., 2002).

H3C HO

O CH3 HN O CH3

Figura 3 - Estrutura molecular da capsaicina (CAP).

H 3C HO

O OH O O O CH 3

Figura 4 - Estrutura molecular do curcuminide.

Os antioxidantes sintticos mais utilizados na indstria so: 3,5-di-t-butil-4hidroxitolueno (BHT), cido ctrico, 2 e 3-t-butil-4-metil-metoxifenol (BHA) (Figura 5), propil galato (PG), terc-butilhidroquinona (TBHQ) (Figura 6), dodecil galato (DG), (SHAHIDI; WANASUNDARA, 1992).

a)

OH C(CH3)3

b)

O
(CH3)3C

O OH OH

HO

CH3

HO

c)

OH

O Me

Figura 5 a) estrutura molecular do BHT; b) estrutura molecular do cido ctrico; c) estrutura molecular do BHA;

a)

O HO HO HO O CH 3

b)

OH
1 2

OH

Figura 6 a) estrutura molecular do propil galato (PG); b) estrutura molecular d tercbutil hidroquinona (TBHQ).

Recentemente, estudos mostram que o azeite de oliva possui efeito protetor contra o cncer, devido existncia de muitos compostos antioxidantes como fenis (tirosol e hidroxitirosol) e flavonides, potentes inibidores do oxignio reativo, em sua composio. O oxignio reativo est envolvido com alguns tipos de cnceres relacionado a gorduras, como o cncer de seio e o de colorectum. O mecanismo pelo qual aparece esta espcie de oxignio, est no consumo de cidos graxos poliinsaturados -6, os quais so particularmente sensveis a peroxidao lipdica, levando a adutos1 altamente pr-mutagnicos (OWEN; GIACOSA; HULL, et al., 2000). Em pases como a Grcia e a Itlia, onde a dieta tradicional baseada no alto consumo de azeite de oliva, encontram-se baixos nveis de colesterol plasmtico e de doena da artria coronria (DAC) (GRUNDY, 1986).

Adutos: produto da reao de Diels-Alder (SOLOMONS,1996).

2.1.4 Fisiopatologia dos leos termo-oxidados

O consumo de leos termo-oxidados, como verificado na fritura dos mais diversos tipos de alimentos, traz srios riscos sade, pois alm de aumentar muito a saturao dos leos comestveis, os produtos formados pela termo-oxidao, tm atividade biolgica. fato, por exemplo, que a hemaglutinao afetada pelos produtos da oxidao e da degradao trmica do azeite de oliva aquecido, os quais agem como aglutininas, promovendo um aumento da coagulao intravascular (PATRIKIOS; PATSALIS, 2003). Igualmente, o alto consumo de gorduras saturadas na alimentao, vem contribuindo para o aumento da obesidade, verificado na populao norte-americana (ASSIS, 2001). Isto porm, no se verifica nos povos do Mediterrneo, onde o grande consumo de gorduras insaturadas contribui para o baixo nvel de doena arterial coronariana (DAC) (ARMSTRONG; MANN; ADELSTEIN, et al., 1975). Sendo a DAC uma das doenas mais perigosas ao homem, tem sido a principal causa de morte entre os ocidentais (GEY, 1990). O efeito basal do consumo de cidos graxos saturados, presentes em leos vegetais termo-oxidados, o de elevar as fraes de LDL (Lipoprotena de Baixa Densidade), que em excesso no sangue circulante, depositam-se sobre as artrias (aterosclerose) e com o tempo acabam provocando doena coronariana (ASSIS, 2001; GRUNDY, 1986; KANNEL; CASTELLI; GORDON, 1979; MERCK, 1999; STEINBERG, 1990; RIEMERSMA; WOOD; MACINTYRE, 1988). Alguns estudos mostram que dieta rica em cido -6 (presente no azeite de oliva) entre os povos do Mediterrneo, efetivo na preveno de DAC, por diminuir os nveis plasmticos de colesterol (GORINSTEIN; LEOTOWICZ; LOJEK, et al.,

2002). Algumas experincias in vivo e in vitro em animais de laboratrio, demonstraram inibio da oxidao da LDL-colesterol (LDL: Low Density Lipoproteins, Lipoprotena de Baixa Densidade) pelos constituintes do azeite de oliva (PARASASSI; BITTOLO BON; BRUNELLI, et al., 2001). A oxidao da LDLcolesterol (Reao II), resulta em uma partcula com alta afinidade pelas artrias coronrias, com potencial para depositar-se no seu interior (CHANG; ABDALA; SEVANIAN, 1996). O azeite de oliva sendo rico em cido olico e linolico, acreditase que em parte, esta composio seja responsvel pelo aumento do HDL colesterol (HDL: High Density Lipoprotein, Lipoprotena de Alta Densidade), o qual representa um fator de proteo na preveno de DACs. O cido olico tambm reduz a trombognese e a agregao plaquetria, contribuindo para a estabilizao da presso arterial e glicemia; assim como, exerce influncia positiva sobre o crescimento sseo (RANALLI; FERRANTE; DE MATTIA, et al., 1999). Em muitas espcies animais, as respostas s dietas com cidos graxos diferem sensivelmente. Porm, uma dieta contendo 20% de leo de aafro, rico em cido linolico (-6), provoca reduo nos nveis sricos de colesterol, em nveis comparveis ao do azeite de oliva. O aumento no consumo do leo de aafro de 20 para 35%, causa uma baixa significativa do nvel do colesterol srico. Contudo ao se avaliar uma dieta com cido palmtico (cido graxo saturado), observa-se um aumento significativo no nvel do colesterol. E o mesmo efeito observado no consumo de leos ou gorduras ricas em cido eladico (cido graxo insaturado, trans) (KATAN; VAN GASTEL; DE ROVER, et al., 1988). Os cidos graxos de configurao trans contribuem para aumentar os nveis de colesterol, por diminurem as quantidades de HDL, popularmente chamado de bom colesterol e por elevar os valores de LDL, o mau colesterol (MORETTO;

FETT, 1998). Uma dieta baseada no consumo de 250 mg de colesterol, que contenha 20% em cidos graxos insaturados e apenas 10% em cidos graxos saturados, observa-se uma reduo crtica dos nveis de colesterol plasmtico (ASCHERIO; EIMM; GIOVANUCCI, et al., 1992; HEGSTED, 1986; GINSBERG; BARR; GILBERT, et al., 1990).
Reao II: Reao de oxidao do colesterol por radicais livres, na presena de cobre (Cu). As setas indicam o local de ataque na molcula de colesterol pelo radial livre inicial.

C8H17

LOH / LOOH

C8H17

(II)
3 7 5 6

Cu2+ LO./ LOO.


HO

HO

Colesterol livre
FONTE: CHANG; ABDALA; SEVANIAN, 1996.

Radical alila do colesterol

O colesterol encontra-se no alimento intimamente associado a outros lpides (gorduras saturadas), com os quais pode ser oxidado. A presena de calor, oxignio, radiao e metais de transio desencadeia o processo oxidativo, onde o 7cetocolesterol e o 25hidroxicolesterol atuam como xidos biologicamente ativos, capazes de desencadear processos citotxicos, aterognicos, mutagnicos e cancergenos (KUBOW, 1990; MOURA; TENUTAFILHO, 2002; TAI; CHEN; CHEN, 1999). O mecanismo pelo qual o consumo de cidos graxos saturados eleva o nvel do colesterol plasmtico est relacionado diminuio dos receptores hepticos. Isso reduz a depurao do LDL-colesterol e das lipoprotenas de muito baixa densidade VLDL (VLDL Very Low Density Loprotein, Lipoprotena de Muito

Baixa Densidade) (ASSIS, 2001; MERCK, 1999). O consumo regular de cidos graxos poliinsaturados especialmente os -6 e -3, provoca uma queda nos nveis de LDL-colesterol, principalmente quando a dieta de substituio s gorduras saturadas se baseia no cido linolico (-6). Contudo, sabe-se que o consumo de cidos graxos saturados com 12 ou menos tomos de carbono na cadeia, assim como a dieta rica em cido esterico, tm pouco ou nenhum efeito sobre o colesterol total em homens. O mecanismo de ao parece estar relacionado a um aumento da excreo de colesterol, pelo aumento da formao de cidos biliares, redistribuio do colesterol entre o soro e os tecidos e uma diminuio da capacidade de transporte do colesterol por meio da LDL (ASSIS, 2001; GRUNDY, 1986; KEYS; ANDERSON; GRANDE, 1965). Alm da evidncia de que os leos estressados termicamente podem ter uma funo na acelerao no processo da aterosclerose, existe a forte suspeita de que estes leos possuam atividade mutagnica. Os produtos da peroxidao lipdica, incluindo hidroperxidos (Esquema 1) e epxidos, reagem com o DNA na presena de metais e cido ascrbico (KUBOW, 1990). Espcies radicalares (presentes em leos altamente termo-oxidados), tambm reagem com os lipdios das membranas biolgicas levando a formao de radicais lipdicos, os quais reagem com o oxignio e formam hidroperxidos lipdicos. A clivagem destes hidroperxidos gera diversos compostos carbonlicos solveis em gua, como os hidroxialcenais (aldedos insaturados), que atacam e lesam as membranas biolgicas. Estas reaes so a origem das conseqncias de muitos problemas de sade do mundo industrializado.

Os aldedos derivados do 4,5epoxi-2-alcenais, produtos secundrios da peroxidao lipdica, so produzidos na decomposio dos intermedirios

epoxihidroperxidos, provenientes da oxidao de cidos graxos poliinsaturados (6 e -3, Esquema 5). A reao entre os 4,5epoxi2-alcenais e o grupo amino do aminocido lisina, por exemplo, formam derivados pirrlicos relativamente estveis, sendo encontrados em mais de 20 produtos alimentcios frescos, incluindo carnes e vegetais (ZAMORA; HIDALGO, 2003).

Esquema 5 - Formao de epoxialcenais durante a peroxidao lipdica e reao com aminos para produzir derivados pirrlicos.

.OH .O
O2
R1 R2 HOO R1 R2 R1 R2

.OH
R1 O R2 O ciso

.
R3NH2

R1

R2 OOH

O2

R1

R2

R1

O H

R1

R1

NR3

O-

..

+ N R3

R1CHO

..
H
R1 + N R3 R1

N R3

.. -

..
N OH R3

R1

..
N R1 R3 N R3

R1 N R3 N R3 N R3

R1

R1

R1=pentil; R2= etil; R3=lisina;

Derivado pirrlico polimerizado

FONTE: ZAMORA; HIDALGO, 2003.

certo, porm, que o consumo de flavonides (presentes em alguns leos vegetais) e outros antioxidantes polifenlicos, inibem a oxidao da LDL-colesterol reduzindo a tendncia trombose (HERTOG; FESKENS; HOLLMAN, 1993), assim como o consumo de tocoferol (presente no azeite de oliva), reduz a peroxidao de cidos graxos poliinsaturados e conseqentemente reduz os danos causados ao endotlio vascular e tecido cardaco pelos radicais peroxil (GEY, 1990; LA ROSA; CLEEMAN, 1992). Alm dos efeitos patolgicos causados naturalmente pelo consumo de leos e gorduras saturadas, a adulterao de leos vegetais pode ser muito nocivo sade, podendo conduzir o consumidor sndrome do leo txico (TOS) (Toxic Oil Syndrome). Na Espanha, a venda de leo de colza adulterado, vendido como azeite de oliva, fez com que muitas pessoas apresentassem sintomas como: perda de peso, caquexia, mialgia, falncia respiratria e tromboembolismo. O agente qumico causador da TOS, foi identificado como uma anilida do cido olico, presente no leo de colza adulterado (BELL; KUNTSE; CAPUTO, et al., 2001).

2.1.5 Controle de qualidade dos leos vegetais

Atualmente os estudos da degradao oxidativa dos lipdeos em alimentos so de grande interesse. Diversos mtodos analticos foram desenvolvidos para avaliar a qualidade dos leos e gorduras. Por exemplo, a determinao dos ndices de iodo, perxido e acidez. So tcnicas volumtricas clssicas, processos laboriosos que demandam tempo e sujeitos a dificuldades na visualizao do ponto final da titulao. Os mtodos volumtricos foram os primeiros mtodos a serem utilizados, no controle de qualidade de leos vegetais. Dentre estes mtodos, a determinao da acidez revela o estado de conservao do leo, assim como a decomposio dos triacilgliceris acelerada pelo aquecimento e luz. Mais recentemente, so as tcnicas instrumentais de anlises como a anlise trmica, a espectroscopia de ultravioleta, visvel e infravermelho; a espectrometria de massa e ressonncia magntica nuclear (RMN). Estas tcnicas apresentam muitas vantagens sobre as tcnicas analticas, apesar do custo dos equipamentos. A anlise trmica tem sido empregada para o estudo de leos vegetais e fraes de leos. Como exemplo, citam-se as gorduras, triacilgliceris, leos totais e misturas de leos e gorduras (BERGER; AKEHURST, 1996; DYSZEL, 1982; KOVALSKI, 1990). O estudo do leo de soja epoxidizado como fonte potencial de lubrificantes, a altas temperaturas, por RMN e Espectroscopia de Infravermelho (FTIR), mostrou-se conclusivo na anlise sobre o comportamento trmico, oxidativo e friccional deste leo e sua utilizao como leo lubrificante (ADHVARYU; PEREZ; SINGH, et al., 1998; ADHVARYU; ERHAN, 2001), bem como no estudo da estabilidade termo-

oxidativa de alguns leos do grupo II e III, classificados pela API (American Petroleum Institute) (ADHVARYU; ERHAN; SAHO, et al., 2001). O controle de qualidade dos leos feito por mtodos analticos, classificados em: a) mtodos volumtricos: para a determinao de acidez; teor de perxidos, ndice de iodo e outros parmetros; b) mtodos instrumentais, utilizando-se equipamentos. So mais sensveis e apresentam custos elevados; por exemplo, a anlise trmica, espectroscopia de ultravioleta-visvel, infravermelho, ressonncia magntica nuclear,

espectrometria de massa; cromatografia: CG, CGMS, CLAE, etc.

A rancidez quase sempre acompanhada pela formao de cido graxo livre, denominada de acidez livre do leo vegetal e decorre da hidrlise parcial dos triacilgliceris que perfazem a quase totalidade das molculas que constituem os leos vegetais. Acidez alta, indica a ao de reaes hidrolticas e pode ser definida como a quantidade - em gramas - de cido olico livre para cada 100 g de leo analisado. Na realidade, a expresso do resultado indica uma idia geral de acidez e no uma determinao especfica de cido olico. O que este mtodo acusa a formao em andamento de grupos carboxila (COOH). O ndice ou teor de perxidos um indicador do grau de oxidao do leo ou gordura. A sua presena indcio de deteriorao, que poder ser verificada com a mudana do sabor e do odor caractersticos dos leos. definido em termos de miliequivalentes de perxidos por 1000 g de leo, que oxidam o iodeto de potssio nas condies do teste.

O mtodo convencional usado para determinar o grau de insaturao de leos e gorduras o ndice de iodo. Molculas contendo ligaes duplas carbonocarbono (insaturadas) reagem com iodo, de modo que, quanto maior o nmero de insaturaes, maior a quantidade de iodo consumida, maior o ndice de iodo e maior a probabilidade da ocorrncia de processos oxidativos na molcula do cido graxo insaturado devido aos hidrognios allicos (hidrognios adjacentes ao carbono da ligao dupla). A reao de adio do iodo s ligaes duplas carbono-carbono lenta (30-60 minutos), devendo ser conduzida sem aquecimento e na ausncia de luz, para prevenir ou minimizar as reaes indesejveis de substituio allica - que ocorrem na presena de luz e aquecimento - e assim, elevam o consumo de iodo no processo, conduzindo a resultados errneos. O ndice de iodo no uma medida quantitativa, um nmero emprico que til na definio do grau de insaturao, porm sujeito a erros. Nos mtodos de determinao do ndice de iodo e que utilizam soluo de ICl (Wijs) ou IBr (Hanus), a soluo de iodo (liberado pela adio de KI) e amido, j titulada com soluo de tiossulfato de sdio, deixada em repouso, freqentemente reverte a colorao anterior. O mesmo comportamento observado com os mtodos que utilizam soluo de I2 . Ambos so mtodos empricos, pouco precisos e sujeito a erros. Estas dificuldades limitam a aplicao destas tcnicas. O ndice de iodo a medida do grau de insaturao de um leo, definido pela quantidade de halognio absorvido em 100 g de amostra. Est relacionado com a quantidade de ligaes duplas presentes na amostra e a reduo observada neste ndice se deve quebra de ligaes duplas resultantes de reaes de polimerizao, ciclizao e oxidao, o que aumenta o grau de saturao da amostra, tornando-a por fim, imprpria para o consumo humano. Sob determinadas condies, o iodo

pode ser introduzido quantitativamente nas ligaes duplas dos cidos graxos insaturados dos triacilgliceris e proporciona uma medida do grau de insaturao da amostra. Quanto maior for o ndice, maior ser a insaturao da amostra. Mesmo este mtodo tendo algumas desvantagens, deve ser considerado como um mtodo emprico cujo resultado final d uma idia aproximada da realidade. Isto fica evidente quando se analisa a proposta fundamental do mtodo. Ao se utilizar iodo (halognio) para reagir especificamente com as ligaes duplas, esbarra-se em algumas dificuldades: uma que o iodo sempre vai sofrer alguma interferncia da luz, reduzindo sua participao na reao de halogenao. Outra que a adio devido ligaes duplas isoladas, ou conjugadas podem resultar em algumas ligaes duplas intactas sem a adio do iodo devido adio 1,2 e 1,4 (Esquema 6), resultando em valores menores do que o normal (JOSEPH-NATHAN, 1982). Valores mais consistentes podem ser obtidos por RMN de H1. Neste trabalho foram realizadas algumas determinaes do ndice de iodo pelo mtodo tradicional (Wijs) em leos in natura e aquecidos. Foi determinado o ndice de iodo de dados retirados das curvas de integrao dos espectros de RMN de H 1 dos leos vegetais, cujos resultados so mais consistentes do que aqueles obtidos com a metodologia usual (mtodo de Wijs).

Esquema 6 - Mecanismo de halogenao de dienos: 1,2 e 1,4.

-
R

::
1,4 e/ou 1,2

I
1 2

Duplas no halogenadas

I
I

FONTE: SOLOMONS, 1996.

Em geral, os mtodos analticos oficiais disponveis para a anlise de leos so pouco sensveis, morosos, de baixa confiabilidade e seletividade. pois, necessrio, novas metodologias, tcnicas mais sensveis, rpidas e automatizadas para a determinao adequada do ndice de iodo. A RMN de H1 resolve esta dificuldade. Na Figura 7, mostrado o espectro de RMN de H1 genrico de um leo vegetal para anlise.

LEGENDA: a = prtons metlicos; b = prtons metlicos do cido linolnico; c = prtons metilnicos dos cidos graxos do triacilglicerol; d = prtons -carboxlicos; e = prtons allicos externos; f = prtons -carboxlicos; g = prtons allicos internos; h + i = prtons metilnicos do glicerol; j = prton H-2 metilnico do glicerol; k = prtons olefnicos;

a k ih j f e d g b

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 ppm

Figura 7 - Espectro RMN de H genrico de um leo vegetal. A insero mostra os sinais dos prtons H1 da metila do cido linolnico em 0,98 ppm [sinal em b].

Do espectro de RMN de H1 integrado, obteve-se a medida direta do grau de insaturao de modo preciso. Todos os hidrognios olefnicos (aqueles conectados diretamente nos carbonos das ligaes duplas carbono-carbono) mostram deslocamento qumico () entre 5,40-5,26 ppm (k). Todos os hidrognios metlicos

parte saturada da molcula mostram deslocamento qumico entre () 0,80 e 1,00 ppm (a + b). Portanto o nmero total de insaturao, em moles, a medida direta da rea dos picos normalizados e integrados, dos hidrognios que geraram aqueles sinais, naquelas regies do espectro de RMN de H1 (MANNINA, 2003). A RMN de H1 uma tcnica extremamente sensvel densidade eletrnica e a populao de hidrognios que gerou o sinal. Hidrognios em ambientes eletrnicos diferentes mostram diferentes deslocamentos qumicos, e a intensidade do sinal estritamente proporcional a quantidade de hidrognios que o gerou. Felizmente, o espectro de RMN de H1 dos triacilgliceris bem resolvido, observando-se sinais distintos, caractersticos, para os prtons olefnicos, do glicerol e alqulicos, que mostram absoro em regies diferentes do espectro. Os prtons olefnicos so observados em () 5,26 5,40 ppm (k); os prtons metilnicos do glicerol em () 4,10 4,32 ppm (i + h) [H-1 e H-3]; H-2 o prton metilnico em () 5,25 ppm (j). Os prtons metlicos so observados em () 0,80 1,00 ppm (a; b). Somente os prtons metlicos do cido linolnico so observados em () 0,98 ppm (b); sua concentrao pode ser diretamente medida a partir do valor da curva de integrao. Prtons allicos internos so observados em () 2,80 2,70 ppm (g). Os prtons allicos externos so observados em () 2,10 1,90 ppm (e). Prtons carboxlicos so observados em () 2,34 2,22 ppm (f). Os prtons -carboxlicos so observados em () 1,70 1,50 ppm (d). Um cluster de picos sobrepostos em () 1,40 1,15 e centrado em 1,2 ppm (c), corresponde aos demais prtons metilnicos dos cidos graxos presentes no triacilglicerol (VIGLI; PHILIPPDIS; SPYROS, et al., 2003). Fortuitamente, porm, a curva de integrao dos prtons olefnicos inclui o prton metlico do glicerol em C-2 e que deve ser considerado nas equaes obtidas

a partir do contido nas curvas de integrao, e que permitam o clculo correto do ndice de iodo por RMN de H1, segundo as equaes:

Clculo da rea de um prton (Equao I):

i+h 4

(I)

Clculo de prtons olefnicos (Equao II):

V=

[k + j ]

[i + h] 4 i+h 4

(II)

onde: (k + j) = representa a populao de prtons vinlicos, obtidos por leitura direta do espectro integrado; (i + h) = os prtons dos dois grupos metilenos do glicerol. O hidrognio metino (H-2) do glicerol aparece em 5,26 ppm sobreposto aos prtons vinlicos na curva de integrao. Portanto a rea relativa a um prton ser (i + h)/4 (JOSEPH-NATHAN, 1982).

Clculo do total de prtons (Equao III):

T=

k + j +i+h+ g + f +e+d +c+b+a i+h 4

(III)

Clculo do peso molecular mdio dos triacilgliceris (PM) (Equao IV):

PM = 119,7 + 7,036T + 5,983V

(IV)

Assim, o ndice de iodo foi determinado a partir do espectro de H1 integrado, conforme a equao (V), descrita por Joseph-Nathan (1982):

I=

126,91 x 100V PM

(V)

onde: I = ndice de iodo V = nmero de prtons vinlicos (olefnicos). PM = peso molecular mdio do triacilglicerol que compe o leo em estudo

O PM mdio determinado por RMN, substitui com vantagem a determinao do ndice de saponificao por volumetria, uma vez que aquele s serve para dar uma idia do tamanho da cadeia de cido graxo que compe o triacilglicerol. O valor numrico do ndice de saponificao inversamente proporcional ao tamanho da

cadeia do cido graxo (se ele tem uma cadeia carbnica maior ou menor do que 12 carbonos). Para agilizar os clculos, desenvolvemos para o ambiente Windows, o programa PROTEUS (Figura 8) para calcular o ndice de iodo por RMN de H1. O programa foi escrito em Visual Basic 5.0, onde os campos de entrada dos dados de (i + h), (k + j), e T correspondem as integrais tiradas dos espectros de RMN de H1. E os campos Prtons olefnicos, Total de prtons e Peso molecular mdio, correspondem aos clculos supracitados para se encontrar o ndice de iodo (I.I.), que calculado automaticamente pela entrada de dados.

Figura 8 Caracterstica geral do programa PROTEUS

A ressonncia magntica nuclear (RMN) tornou-se ao longo de seu desenvolvimento o principal instrumento de avaliao de leos (AZEREDO; COLNAGO; SOUZA, et al., 2003). Ncleos atmicos contendo ncleons (prtons e nutrons) desemparelhados (pelo menos um) so ativos em RMN. Por exemplo, 1D2,
1H 1

, 6C13, 7N15 8O17. Sob a ao de um campo magntico constante (Bo) e potente

(MHz) posicionado no eixo z das coordenadas girantes (x, y, z), os ncleons se

comportam como micromagnetos (representveis fisicamente por vetores) e se ordenam a favor e contra o campo magntico. A resultante um alinhamento a favor do campo, responsvel pelo experimento. O experimento consiste em perturbar o equilbrio dos spins por ao de um pulso curto e intenso de radio freqncia (Hz) fornecido por um gerador posicionado no plano x,y de outro campo magntico oscilante (B), ortogonal ao campo constante (Bo). A seqncia de pulsos a intervalos de tempos ( , At) programada por computador. Em conseqncia os vetores de magnetizao dos spins nucleares sofrem um torque, entram em precesso num movimento giratrio semelhante ao de um pio em ngulo de 90, por exemplo, que tende a retornar ao equilbrio (ngulo de 0 com o campo constante). No processo, o componente vetorial no plano x,y gera um sinal (FID) que detectado pelo equipamento como uma onda senoidal radiao no domnio do tempo - que convertida no domnio da freqncia por transformada de Fourier (FT). O grfico (espectro) gerado mostra sinais (picos) cujas intensidades so proporcionais

populao de spins, e cujas freqncias (Hz, ppm) so distribudos numa janela espectral de 0 10 ppm para RMN de H1 e 0 -240 ppm para RMN de C13. Diversas modalidades de espectros de RMN podem ser obtidos de acordo com programao prvia, utilizando-se determinada seqncia de pulsos e pequena quantidade de amostra (10-100 mg). O pulso curto e intenso de radiao eletromagntica no comprimento de onda de radiofreqncia do ncleo atmico da amostra provoca o efeito de rotao (giro de pio) levando um certo tempo para retornar ao repouso. Este tempo denominado de tempo de relaxao. No processo, a energia de radiofreqncia absorvida dissipada como uma onda (FID) que captada pelo espectrmetro e convertida por computador num grfico (espectro) por transformada de Fourier (FT). O espectro de

RMN fornece informaes importantes sobre a estrutura molecular, como o deslocamento qumico (), constantes de acoplamento (J), curvas de integrao (proporcionais populao de ncleos que gerou o sinal). Todos estes parmetros esto relacionados aos diferentes tipos de tomos que constitui a amostra. A RMN sensvel a densidade eletrnica, a efeitos estricos e conformacionais. Como os leos vegetais so formados por molculas pequenas (triacilgliceris), os grficos gerados do boa resoluo. Neste trabalho, utilizou-se RMN de prton (RMN H1) e de carbono 13 (RMN C13), para estudos das alteraes termoxidativas dos leos. Dos espectros integrados de RMN H!, calculou-se o ndice de iodo de todas as amostras de leos vegetais analisadas (sob diferentes tempos de aquecimento), procedimento invivel pelo mtodo tradicional (Wijs). As amostras mais deterioradas, polimerizadas, no podem ser analisadas pelo mtodo de Wijs, nem por cromatografia gasosa (inutilizaria a coluna). Somente a RMN contorna esta dificuldade (GUILLN; RUIZ, 2001). A RMN uma importante ferramenta no estudo dos alimentos como leos e gorduras. RMN de baixa resoluo foi usado por um longo tempo para se determinar o contedo de gordura slida em uma amostra, as curvas do ponto de fuso de gorduras semi slidas, ou a porcentagem em massa de leos nos alimentos. RMN H1 e de C13 de alta resoluo tambm usado no estudo de lipdeos em alimentos. O uso da RMN H1 no estudo dos leos, gorduras e lipdeos nos alimentos aumentou particularmente por causa da grande quantidade de informaes que os instrumentos de RMN de campo alto podem fornecer num curto perodo de tempo. Hoje em dia, a anlise dos leos vegetais dominada pelas determinaes clssicas, tais como acidez, teor de perxido, assim como pelo uso de tcnicas

cromatogrficas em camada delgada, a gs e CLAE. Essas tcnicas so usadas primariamente para medidas quantitativas de compostos. Uma desvantagem destes procedimentos que existem muitas diferenas entre os ensaios para serem plicados na anlise de rotina. Alguns destes mtodos requerem o isolamento e a anlise de componentes menores da matria insaponificvel, por meio de mtodos laboriosos e demorados. Assim, muitos estudos foram realizados no sentido de se aplicar novas tcnicas analticas que, com muito pouco ou sem nenhuma manipulao da amostra, mostrassem resultados similares ou superiores queles obtidos pelos mtodos clssicos. Neste contexto, tcnicas espectroscpicas tm emergido como ferramentas potenciais nos tempo atuais, como a espectrometria de massa e a

espectrofotometria por infravermelho e de Raman (BAETEN; DARDENNE; APARICIO, 2001). Uma das tcnicas espectroscpicas com alto potencial neste campo, a Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de alta resoluo. O espectro de RMN contm uma grande quantidade de informaes que podem ser obtidos num curto perodo de tempo e pode se empregado como uma alternativa aos mtodos clssicos de anlise atuais. Os diferentes sinais presentes no espectro de RMN de H1, do dois tipos de informaes: o deslocamento qumico, de valor qualitativo, relacionado aos diferentes ambientes dos tomos presentes na mostra analisada (KIM; CHEN; MCCARTHY, et al 1999); a intensidade relativa, que prove

informaes quantitativas dos diferentes sinais. Ento ao se aplicar todas essa informaes na anlise de leos, possvel caracterizar sua qualidade e autenticidade.

A RMN de H1 est relacionada aos nveis de energia do ncleo do H1 que resulta quando a amostra colocada no interior de um campo magntico externo. Cada ncleo de H1 em ambiente diferente, blindado diferentemente pelo ambiente eletrnico, afetado e afeta os ncleos vizinhos. Estas interaes magnticas causam pequenas modificaes locais ao campo externo aplicado. O ncleo dos tomos de hidrognio em diferentes ambientes, mostra comportamentos qumicos diferentes, pois apresentam energias diferentes. Essas separaes no nvel de energia podem ser medidas com muita preciso como freqncias usando a transformada de Fourier, a qual monitora a resposta do ncleo aps ele ter sido perturbado do seu equilbrio por um pulso curto e intenso de radiao eletromagntica de radiofreqncia. O espectro de RMN uma srie de sinais agudos cujas freqncias podem ser relacionada natureza qumica dos tomos de hidrognios (grupos metil, metilenos, etc.) e cujas intensidades so diretamente relacionadas ao nmero de hidrognios que produzem o sinal. As caractersticas do instrumento de RMN requerido no estudo dos leos e gorduras dependem do tipo de estudo feito. Os instrumentos usam campo magntico de 60 a 600 MHz. Obviamente, quanto maior o campo magntico, melhor a resoluo da transio das ressonncias e melhor a sensibilidade e qualidade do espectro. A amostra preparada por dissoluo de uma quantidade de leo ou gordura em solvente apropriado, em propores especficas, usualmente 10 100 mg/mL de solvente em um tubo de 5 mm de dimetro. Os solventes mais comuns usados so o clorofrmio deuterado, o tetracloreto de carbono, o dimetilsulfxido deuterado ou metanol deuterado. O espectro realizado normalmente temperatura ambiente ou temperatura controlada entre 20 C e 30 C. O tempo de anlise varia entre 1,28 e 2,7 s. Em molculas de triacilgliceris os prtons metilnicos do grupo

gliceril tm tempo de relaxao (T1) curto, e um tempo maior para os prtons de grupos metil terminal, prximo a 2,2 s. O nmero de scans comumente usados varia de 16 a 64 e o pulso usado fica entre 45 90(GUILLN; RUIZ, 2001). No espectro, tomos de hidrognios sob o mesmo ambiente qumico, produzem sinais na mesma freqncia. A posio do sinal de ressonncia no espectro chamada de deslocamento qumico (). O deslocamento qumico, a intensidade e a multiplicidade dos sinais contm muitas informaes teis sobre cada tipo diferente de ncleo de 1H na amostra. O deslocamento qumico de um tomo ou grupos de tomos medido em relao ao composto de referncia, o tetrametilsilano (TMS). Esse composto usualmente adicionado amostra numa concentrao prxima a 0,03%. Os deslocamentos qumicos so obtidos em partes por milho (ppm) por dividir a diferena da freqncia entre os sinais da amostra e o sinal do TMS, em hertz (Hz), pela freqncia do equipamento em megahertz (MHz). Por esta razo, o deslocamento qumico em ppm, independente da medida da fora do campo, mas a separao em hertz de dois sinais com uma certa diferena de deslocamento qumico, aumenta a linearidade com a fora do campo. Os deslocamentos qumicos de sinais de lipdeos so sempre positivos em relao ao TMS e so caractersticos do comportamento molecular em particular. Os leos comestveis e gorduras so principalmente constitudos de triacilgliceris, com diferentes padres de substituio devido extenso, grau e espcie de insaturao dos grupos acil, e por componentes menores como os mono e diglicerdeos, esteris, vitaminas, cidos graxos, e outros. O grau de insaturao dos leos um importante indicador da provvel desenvolvimento de rancidez nos alimentos e usado para determinar as propriedades qumicas e fsicas dos leos. A determinao tradicional envolve testes

qumicos, relacionados com reaes envolvendo as ligaes duplas existentes na molcula lipdica. Um dos testes mais comuns, consiste na adio de iodo para reagir quantitativamente com as ligaes duplas. Deste tipo de experimento que o valor do ndice de Iodo obtido. Este mtodo, porm, consome tempo em comparao com outros mtodos mais rpidos que podem ser de interesse para a indstria. Os experimentos com RMN H1 permitem a determinao deste parmetro e outros, como: peso molecular mdio, o nmero mdio de ligaes duplas, ndice de saponificao, concentrao de cidos graxos insaturados, rapidamente e de modo simples, usando diferentes abordagens. O ndice de iodo usando-se RMN H1 tem boa reprodutibilidade se comparado com o mtodo tradicional de Wijs (AOCS mtodos Cd 1 25) para um nmero de amostras significativo. No mesmo caminho, est a estimativa de se determinar qual a proporo dos diferentes tipos de grupos acil nos leos comestveis e gorduras, ponto de grande interesse nutricional e tecnolgico. Tambm pelos mtodos tradicionais, h uma demora considervel na determinao e envolve etapas trabalhosas como reaes de transesterficao do leo para produzir steres metlicos de cidos graxos e a subseqente separao, identificao e quantificao deste compostos individualmente por cromatografia gasosa. Esta metodologia envolve problemas relacionados com a oxidao da amostra, com a formao de artefatos durante a transesterificao e com a separao e identificao dos steres metlicos na corrida cromatogrfica. Da mesma forma, a estimativa da proporo de grupos acil poliinsaturados -3 em lipdeos, como o de pescado, por exemplo, de grande importncia, devido a sua influncia na estabilidade oxidativa e sua influncia positiva sobre a sade humana por causa do aumento dos nveis sricos de HDL. Assim, este parmetro o

principal critrio de julgamento, em alguns pases, para a avaliao da qualidade do leo de peixe (GUILLN; RUIZ, 2001). A oxidao dos leos comestveis do maior interesse no s do ponto de vista tecnolgico e econmico, mas tambm da segurana, devido a propriedades indesejveis de alguns compostos produzidos deste modo. Embora outros mecanismos de degradao sejam possveis, o processo de degradao do leo, inicia pela formao de um radical livre alila que oxidado a hidroperxidos, denominados de produtos de oxidao primrios, os quais se degradam em aldedos, cetonas, lcool lactonas, cidos, etc., denominados de produtos de oxidao secundrios (Esquema 1). Para anlise destes compostos resultantes de degradao oxidativa, a RMN de H 1 uma alternativa bastante til s anlises qumicas tradicionais envolvidas. O estudo por RMN dos produtos gerados na oxidao de substncias como a trilinolena (Figura 9), trilinolenina e triolena, podem ser de interesse na sntese de lipdios estruturados, pois prov informaes valiosas a respeito da distribuio e da posio dos grupos acil dos tristeres de glicerol nos leos vegetais, utilizados como substratos pela indstria. Os lipdios estruturados podem ser definidos como triacilgliceris reestruturados ou modificados na sua composio em cidos graxos, tm propriedades fsicas e funcionais modificadas, como por exemplo, alterao do ponto de fuso e reduo do valor calrico, respectivamente. Na prtica, so utilizados na clnica mdica para melhorar o sistema imunolgico, na preveno de cncer, trombose e diminuir a hipercolesterolemia. Na indstria alimentcia, so usados com a finalidade de diminuir o contedo energtico de alimentos como chocolates, laticnios, sorvetes, etc. (DAGOSTINI, 2001; MANNINA; LUCHINAT; EMANUELE, et al., 1999).

Figura 9 - Estruturas tridimensionais da triolena

Na anlise especfica de um leo vegetal por RMN C13 (Figura 10), quatro regies bem distintas no espectro podem ser descritas: 173,3-172,8 ppm (A) regio dos carbonos dos grupos carboxilas; 132,0-127,1 ppm (B), regio dos carbonos olefnicos; 69,1-61,6 ppm, regio dos carbonos do glicerol (C) [C1 e C2]; e 34 ppm (D), onde esto presentes os carbonos alifticos saturados. Quando se analisa a regio dos grupos carboxlicos, os substituintes nas posies 1 e 2 do glicerol podem ser distinguidos, porque mostram intensidades diferentes. leos deteriorados termicamente, mostram reduo do nmero de carbonos olefnicos; 34 ppm correspondem aos grupos -metilnicos em relao carboxila; os grupos CH2 saturados encontram-se em 30,0-28,5 ppm; os CH2 allicos externos C=C, esto em 27,5 ppm; os CH2 olefnicos internos, so observados em 26,0-25,0 ppm; os

carbonos -carbonlicos so observados em 25,0 ppm e as metilas podem ser observadas em 14,0 ppm.
Legenda: A = grupos COOH; B = carbonos olefnicos; C = carbonos do glicerol (C1 e C2); D = carbonos alifticos saturados.

H O H C O C R1 O H C O C R2 H C O C R3 O H
C B A

200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

ppm

Figura 10 - Espectro genrico de RMN de carbono 13 de leo vegetal.

Os mtodos instrumentais apresentam grande vantagem sobre os tradicionais (volumtricos) pela sua capacidade em necessitar apenas de quantidades mnimas de amostra e terem uma extrema sensibilidade e reprodutibilidade nas anlises, alm de serem mais precisos e exatos. A anlise trmica utiliza como fundamento os princpios da termogravimetria, em que uma quantidade de amostra (5 10 mg) colocada num cadinho de alumina e aquecida progressivamente num intervalo de tempo pr-estabelecido, sob

condies de atmosfera controlada (ar ou nitrognio). No final, gerado um grfico mostrando as respectivas perdas de massa sob diferentes temperaturas. Assim possvel determinar com preciso, por exemplo, a que temperatura uma amostra mudou de estado fsico, deteriorou ou entrou em ignio. Todos os mtodos espectroscpicos, baseiam-se nos efeitos da radiao sobre a matria. Na espectroscopia de ultravioleta (UV) se utiliza radiao de baixo comprimento de onda ( 200 400 nm) e alta energia. A resposta analisada por aparelhos chamados espectrofotmetros. A amostra para ser observvel deve apresentar estrutura molecular adequada: presena de ligaes insaturadas, ligaes (ligaes duplas ou triplas). A radiao na freqncia do UV, ao incidir sobre a amostra, excita os eltrons das ligaes , fazendo que estes eltrons saltem de um orbital de menor energia para outro de maior energia, levando-os com isso, a um estado ativado. Este fenmeno corresponde a absoro de certa quantidade de energia pela amostra. O retorno dos eltrons ao estado fundamental libera a energia absorvida sob a forma de radiao, detectada pelo

espectrofotmetro que gera um grfico (o espectro) da quantidade de radiao absorvida (absorbncia) pelo comprimento de onda em nanmetros (nm). Assim, quando uma amostra possui ligaes , o aparelho gera um grfico cujo pico mximo de absorbncia pelo comprimento de onda, caracterstico daquela amostra em particular. Isto possvel porque os leos vegetais possuem intrinsecamente uma constituio molecular homognea, de triacilgliceris (Figura 1) e cidos graxos insaturados (Tabelas 1 e 2). Assim, quando o leo sofre qualquer tipo de alterao, como oxidao, por exemplo, o espectro gerado mostra um deslocamento de banda (efeito batocrmico) e aumento da intensidade da absoro (A), acusando de imediato que o leo no est no seu estado mais puro. Este efeito foi observado

neste trabalho. A espectroscopia UV-VIS utiliza comprimento de onda na regio de 200 a 800 nm. Outra anlise importante a espectroscopia de infravermelho (FTIR) que utiliza radiao de freqncia de maior comprimento de onda (menor energia). Esta radiao de baixa energia no capaz de fazer eltrons saltarem de um orbital para outro, porm provoca vibraes entre as ligaes de tomos nas molculas da amostra sob anlise. Estas vibraes correspondem aos estiramentos (simtricos e assimtricos) e deformaes angulares (no plano, fora do plano). Estas alteraes nas ligaes qumicas - mais pronunciadas em molculas assimtricas e com significativo momento de dipolo - so captadas pelo equipamento, que gera um grfico (espectro) de transmitncia ou absorbncia (intensidade da absoro) pelo nmero de ondas ( , cm-1), em concordncia com a presena de grupos funcionais na amostra. Os leos vegetais tambm so sensveis a este tipo de anlise por possurem grupos funcionais possveis de serem analisados no infravermelho. Na anlise por infravermelho dos diversos leos neste trabalho, foi possvel observar as alteraes provocadas pelo aquecimento sucessivo das amostras, principalmente da banda de 3.500 a 3.000 cm-1 (regio dos grupos hidroxilados), mostrando que possvel se fazer uma anlise qualitativa dos leos, principalmente quando estes apresentam grau de acidez aumentado, como resultado dos processos oxidativos. Na cromatografia gasosa, o leo a ser analisado (1-10ml), primeiramente esterificado e injetado (1 l) no cromatgrafo a uma temperatura entre 200-220 C, para ser vaporizado e poder ser dividido em seus vrios constituintes. A amostra (fase gasosa mvel), passa por uma fase estacionria, levada por um gs de arraste inerte, geralmente o Hlio. Seus vrios constituintes, geram grficos que so

comparados com um padro interno para que sua composio seja determinada (SILVERSTEIN; WEBSTER, 1998; VOGEL, 1992).

2.2 OBJETIVO GERAL

2.2.1 Investigar as alteraes ocorridas em leos vegetais sob estresse trmico, por mtodos analticos e espectroscpicos e contribuir para o controle de qualidade de leos vegetais;

2.3 OBJETIVOS ESPECFICOS

2.3.1 Determinar o perfil de cidos graxos das amostras de leo in natura por cromatografia gasosa; 2.3.2 Submeter amostras de diferentes leos vegetais estresse trmico durante 28 horas, 4 horas/dia e 80 horas, 8 horas/dia, num intervalo de temperatura de 180 200 C; 2.3.3 Determinar o teor de acidez e perxidos das amostras de leo in natura e sob diferentes temperaturas de aquecimento; 2.3.4 Monitorar o perfil dos espectros de FTIR dos leos sob estresse trmico em diferentes tempos de aquecimento; 2.3.5 Determinar o perfil dos espectros UV-Vis dos leos sob estresse trmico, em diferentes tempos de aquecimento; 2.3.6 Avaliar a estabilidade trmica de alguns antioxidantes; 2.3.7 Determinar o ndice de iodo das amostras de leos in natura e sob diferentes tempos de aquecimento por RMN H1; 2.3.8 Estabelecer o perfil de RMN de C13 dos leos sob diferentes tempos de aquecimento.

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 MATERIAL:

3.1.1 Reagentes e solventes: os reagentes e solventes eram de grau de pureza PA e foram utilizados sem qualquer purificao.

3.1.2 leos vegetais: foram utilizados leos refinados de soja (Glycine max), milho (Zea mays), girassol (Hellianthus annuus), canola (Brassica campestris), cedidos pela empresa CARGILL; azeite de oliva (Olea europea), adquirido no mercado local. Para a anlise do azeite de oliva foram utilizadas duas marcas: a) Azeite de oliva extra virgem (ANVISA, 1999): - marca: La Espaola; - acidez mxima: 0,75; - 1a prensagem a frio; - embalagem de vidro transparente.

b) Azeite de oliva virgem fino (ANVISA, 1999): - marca: Raiola; - acidez mxima: 1,5 ; - embalagem de metal.

3.1.3 Antioxidantes: foram utilizados os seguintes antioxidantes, fornecidos por empresas locais: cido ftico, eritorbato de sdio, terc-butilhidroxilueno (BHT), butilhidroxianisol (BHA), propil galato (PG), cido ascrbico, cido ctrico, cido srbico (SBA), e acetato isobutirato de sacarose (SAIB).

3.2 MTODOS:

3.2.1 Cromatografia gasosa

a) Preparao de steres metlicos: a preparao de steres metlicos foi realizada seguindo o Mtodo de HARTMAN e LAGO (1973). Foram pesadas 100 mg do leo em frasco de 90 mL com tampa rosquevel, adicionou-se 5 mL de soluo de KOH 0,5 M em metanol. A mistura foi aquecida em banho-maria em ebulio por 5 minutos. Foram adicionados 15 mL do reagente de esterificao soluo ainda quente. A mistura foi mantida em banho-maria em ebulio por 15 minutos. Aps resfriamento, foram adicionados 25 mL de ter de petrleo, seguida de homogeneizao. Aps homogeneizao foram adicionados 25 mL de soluo saturada de cloreto de sdio, seguida de homogeneizao. Aps decantao de 30 minutos foram coletados 18 mL da fase orgnica em frascos de 20 mL com tampa rosquevel e mantidos em freezer at realizao da anlise cromatogrfica.

b) Anlise cromatogrfica: A anlise cromatogrfica foi realizada seguindo o Mtodo oficial AOCS (1990), utilizando um Cromatgrafo gasoso CG-Master com coluna capilar (CG-745; 30 m; 0,53 mm de espessura; filme de 1 m de polietilenoglicol, com detector de ionizao de chama; as temperaturas utilizadas no injetor e no detector foram respectivamente 220 e 250 C). A programao de temperatura da coluna foi iniciada em 100 oC, aquecida a 5 oC. min-1 at 220 oC e permaneceu em isoterma a 220 oC por 25 minutos. A soluo de referncia continha padres de quinze steres metlicos.

- foi injetado 1 L (microlitro) da soluo de referncia no cromatgrafo gasoso e os steres metlicos foram eludos, determinando-se os tempos de reteno de cada padro isoladamente; - foi injetado 1 L da soluo da amostra esterificada no cromatgrafo gasoso em duplicata, e os steres metlicos foram identificados por comparao dos tempos de reteno com os da soluo de referncia. A anlise quantitativa foi realizada por normalizao interna, assumindo que todos os componentes da amostra esto representados no cromatograma obtido, de tal forma que as reas de todos os picos representam 100 % com eluio total;

3.2.2 Anlise trmica

As curvas termoanalticas foram obtidas em mdulo simultneo TG/DSC/DTA em equipamento TA Instruments, modelo 2960, operando nas seguintes

condies: taxa de aquecimento de 20 C min-1 em atmosfera dinmica de ar, vazo de 50 mL.min-1 em cadinho de alumina (-Al2O3), contendo aproximadamente 10 a 20 mg de amostra submetida a temperatura de 25 a 600 C para as curvas TG/DSC e de 25 a 1000 C para as curvas TG/DTA, para anlise da estabilidade trmica dos antioxidantes e leos vegetais.

3.2.3 Anlise por espectroscopia de infravermelho Amostras de aproximadamente 5 l de cada leo vegetal foram prensados em pastilhas de KBr (100 mg) e seus espectros de infravermelho foram determinados em espectrofotmetro Shimadzu, modelo 8400, operando no modo FT.

3.2.4 Anlise por espectroscopia ultravioleta Foram utilizadas solues de leos vegetais em isopropanol, 10-4 e 10-7 M em cido olico, na primeira e na segunda fase, respectivamente. Foram determinadas as curvas de absoro na regio de modelo MultiSpec 1501. 200-800 nm em espectrofotmetro Shimadzu,

3.2.5 Anlise por Difrao de Raios X (XRD)

O polmero resultante da termo-oxidao dos leos vegetais foi analisado em Difratmetro de Raios-X Shimadzu, modelo XRD 6000.

3.2.6

Ressonncia magntica nuclear de hidrognio1 e carbono13:

Amostras dos leos: aproximadamente 10 a 20 mg de amostra, foram dissolvidas em 0,7 mL de CDCl3 e seus espectros de RMN foram registrados em espectrmetro Varian, modelo Mercury-300 MHz, operando no modo FT temperatura ambiente. RMN de H1: para os ncleos de Hidrognio-1 foram utilizados os seguintes parmetros de aquisio: pulso: 45 , tempo de relaxao: 1,359 s; tempo de

aquisio: 3,64 s; largura de varredura: 4.120 Hz, largura de linha 0,3 Hz. Foram acumuladas 16 repeties para cada decaimento induzido livre (FID). RMN de C13: Os ncleos de carbono-13 foram observados a 75,45 MHz com desacoplamento de Hidrognio em 300 MHz, utilizando-se os seguintes parmetros de aquisio: pulso: 30 , tempo de relaxao: 1,0 s; tempo de aquisio: 0,868 s; largura de varredura: 18.868,0 Hz, largura de linha 1,0 Hz. Foram acumuladas 512 repeties para cada decaimento induzido livre (FID). RMN 1-D DEPT: os ncleos de carbono-13 observveis a 75,45 MHz tiveram seus espectros registrados no modo DEPT (aumento da intensidade, sem distores, por transferncia de polarizao distortionless enhancement by polarization transfer) com desacoplamento de baixa potncia para ncleos de hidrognios (observveis em 300 MHz), ligado durante a aquisio de dados e desligado durante a relaxao. Foram utilizados os seguintes parmetros de aquisio: pulso: 90 , tempo de relaxao: 1,0 s; tempo de aquisio: 0,868 s; largura de varredura: 18.868,0 Hz, largura de linha 1,0 Hz. Foram acumuladas 192 repeties para cada decaimento induzido livre (FID).

3.2.7 Caracterizao fsico-qumica dos leos vegetais 3.2.7.1 Determinao do ndice de iodo: foi aplicada a metodologia oficial preconizada pela A.O.C.S. (AMERICAN OIL CHEMIST'S SOCIETY) mtodos Cd 1 25. O ndice de iodo (gramas de iodo/100 g de leo) foi calculado de acordo com a Equao (VI):
(B - A) x f x 1,27 m

I=

(VI)

Onde: B = n . de mL de soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N gasto na titulao do branco; A = n . de mL de soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N gasto na titulao da amostra; f = fator da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N; m = massa da amostra em gramas; 1,27 = centiequivalente do Iodo. (OLIVEIRA; NAGEM; SILVA, et al., 1999; MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). 3.2.7.2 Determinao da Acidez (% em cido olico): foram utilizados 2 g de cada leo dissolvidos em 25 mL de isopropanol, adicionando-se 1 mL de timolftalena [0,1%] e titulando-se com sol. 0,1 N de hidrxido de sdio, at o aparecimento de colorao azul (OLIVEIRA; NAGEM; SILVA, et al., 1999; MORETTO; FETT; GONZAGA, et al.,2002). A acidez calculada de acordo com a Equao (VII):

A=

V x f x 100 x 0,0282 m

(VII)

Onde:

V = nmero de ml de soluo de NaOH 0,1 N gasto na titulao; f = fator de correo da soluo de NaOH 0,1 N; m = massa em gramas da amostra; 0,0282 = decimiliequivalente-grama do cido olico.

3.2.7.3 Determinao do ndice de Perxido (mEq / kg): foram utilizados 5 g de cada leo dissolvidos em 30 mL da soluo de cido actico-clorofrmio (3:2 v/v),

seguida da adio de 0,5 mL de soluo saturada de iodeto de potssio [60 %]. A

mistura foi deixada em repouso por exatamente um minuto e a seguir, foram adicionados 30 mL de gua destilada e 0,5 mL de soluo de amido [1%]. O iodo liberado foi titulado com soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N, at o desaparecimento da colorao azulada. Uma prova em branco foi realizada nas mesmas condies descritas, sem a presena da amostra (OLIVEIRA; NAGEM; SILVA, et al., 1999; MORETTO; FETT; GONZAGA, et al., 2002). O ndice de perxidos foi calculado de acordo com a Equao (VIII):

P=

(B - A) x N x f x 1000 m

(VIII)

Onde: A = n . de mL de soluo de tiossulfato de sdio gasto na titulao da amostra; B = n . de mL de soluo de tiossulfato de sdio gasto na titulao do branco; N = normalidade da soluo de tiossulfato; f = fator de correo da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N; m= massa da amostra em gramas;

3.2.8 Estresse trmico dos leos vegetais: foram termo-estressados 200 ml de leo de cada amostra, em frasco de vidro refratrio (PIREX), aquecidos em anel de cermica refratria, com resistncia exposta, em duas fases: - primeira fase ou fase 1: 4h/dia, durante 7 dias; - segunda fase ou fase 2: 8h/dia, durante 10 dias.

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 ANLISE CROMATOGRFICA: A composio em cidos graxos de cada leo estudado foi determinada por cromatografia gasosa e so apresentadas nas Tabelas 4-8.

Tabela 4 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Canola (Brassica campestris).

cido graxo C 14:0 C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 C 18:2 C 18:3 C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 22:1 C 24:0 C 24:1

Nomenclatura 1 .determinao 2 . determinao mirstico palmtico palmitolico esterico olico linolico linolnico araqudico eicosenico behnico ercico lignocrico tetracosenico 0,05 4,37 0,16 1,45 57,42 24,58 8,23 0,90 0,14 0,05 4,41 0,14 1,48 57,73 24,73 7,71 0,89 0,17 -

Legislao% (g/100g) < 0,2 2,5 - 6,5 < 0,6 0,8 - 3,0 53,0 - 70,0 15,0 - 30,0 5,0 - 13,0 0,1 - 1,2 0,1 - 4,3 < 0,6 < 5,0 < 0,2 < 0,2

Tabela 5 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Girassol (Hellianthus annuus).

cido graxo C< 14 C 14:0 C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 C 18:2 C 18:3 C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 22:1 C 24:0 C 24:1 Outro

Nomenclatura mirstico palmtico palmitolico esterico olico linolico linolnico araqudico eicosenico behnico ercico lignocrico tetracosenico Entre16:1 e18:0

1 . determinao 6,80 2,96 24,43 63,71 0,49 1,61

2 . determinao Legislao% (g/100g) < 0,4 < 0,5 6,67 3,0 -10,0 < 1,0 3,21 1,0 - 10,0 24,61 14,0 - 35,0 63,36 55,0 - 75,0 0,48 < 0,3 < 1,5 < 0,5 < 1,0 < 0,5 < 0,5 < 0,5 1,67 -

Tabela 6 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Milho (Zea mays).

cido graxo C < 14 C 14:0 C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 C 18:2 C 18:3 C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 24:0

Nomenclatura Mirstico Palmtico Palmitolico Esterico Olico Linolico Linolnico Araqudico Eicosenico Behnico Lignocrico

1 . determinao 2 . determinao 0,04 13,17 0,25 1,60 34,87 47,22 1,01 0,34 0,03 12,91 0,25 1,61 35,22 47,22 1,03 0,35 -

Legislao % (g/100g) < 0,3 < 0,1 9,0 - 14,0 < 0,5 0,5 - 4,0 24,0 - 42,0 34,0 - 62,0 < 2,0 < 1,0 < 0,5 < 0,5 < 0,5

Tabela 7 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo de Soja (Glycine Max).

cido graxo C < 14 C 14:0 C 16:0 C 16:1 C 18:0 C 18:1 C 18:2 C 18:3 C 20:0 C 20:1 C 22:0

Nomenclatura 1 . determinao mirstico palmtico palmitolico esterico Olico linolico linolnico Araqudico Eicosenico Behnico 0,28 0,11 10,88 0,20 2,65 20,95 56,46 6,58 0,26 0,22

2 . determinao Legislao% (g/100g) 0,29 < 0,1 0,08 < 0,5 11,10 7,0 - 14,0 0,21 < 0,5 2,64 1,4 - 5,5 21,17 19,0 - 30,0 56,28 44,0 62,0 6,19 4,0 11,0 0,25 < 1,0 < 1,0 0,20 < 0,5

Tabela 8 - Perfil de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do azeite de oliva (Olea europea).

cido graxo C 14:0 C 16:0 C 16:1 C 17:0 C 17:1 C 18:0 C 18:1 C 18:2 C 18:3 C 20:0 C 20:1 C 22:0 C 24:0 Outros Outro

Nomenclatura Mirstico Palmtico Palmitolico Margrico Heptadecenico Esterico olico linolico linolnico araqudico eicosenico behnico Lignocrico Entre16;1 e18;0 <14:0

1 . 2 . determinao determinao 11,12 1,13 2,21 76,50 6,52 0,51 0,24 1,49 0,31 10,88 1,15 2,18 76,41 6,99 0,51 0,23 1,44 0,29

Legislao% (g/100g) 0,05 7,5 - 20,0 0,3 - 3,5 < 0,3 < 0,3 0,5 - 5,0 55,0 - 83,0 3,5 - 21,0 0,9 0,6 0,4 0,3 0,2

A composio em cidos graxos dos leos vegetais est de acordo com o que preconiza a literatura (FIRESTONE, 1999; ANVISA, 1999). Tomando-se como base a composio dos cidos graxos insaturados: olico, linolico e linolnico, observa-

se que todos os leos estudados possuem alto grau de insaturao (AOCS, 1990; HARTMAN; LAGO, 1973).

4.2 ANLISE TRMICA:

A DSC (Calorimetria Exploratria Diferencial) uma das principais tcnicas utilizadas atualmente no estudo das propriedades trmicas dos alimentos (FARKAS; MOHCSI-FARKAS, 1995; RAEMY; LAMBERT, 1990; WESOLOWSKI,

ERECINSKA, 1998), como na determinao do estado oxidativo dos leos vegetais (PATTERSON; RIGA, 1993), mostrando se o efeito exotrmico observado causado pela oxidao do antioxidante ou pela oxidao do cido graxo (JAMANEK, 1999; LITWINIENKO; KASPRZYCKA-GUTTMAN). Igualmente as curvas de DTA (Anlise Trmica Diferencial), fornecem informaes muito teis, no caso de gorduras slidas, sobre o eu ponto de fuso e comportamento polimrfico (HANNEWIJK; HAIGHTON, 1958). As curvas trmicas das amostras dos antioxidantes utilizados, mostram que os antioxidantes cido ctrico, BHA, BHT, Eritorbato de Sdio e cido Srbico se decompem a temperaturas abaixo de 180 C, tornando-os inadequados para possvel uso em frituras de alimentos com leos vegetais. Os antioxidantes: acido ftico, propil galato, cido ascrbico e acetato isobutirato de sacarose, comeam a se decompor em temperaturas maiores que 180/200C, sendo mais resistentes para a conservao de leos nos processos de termo-oxidao, do que o BHA, BHT, Eritorbato de Sdio e o cido Srbico. A Figura 11, mostra as curvas TG/DTA e TG/DSC do antioxidante cido ftico. Observa-se que o cido ftico, na curva TG, possui uma perda de massa importante em 180C, comprovado pela curva DTA. Isso indica que o cido ftico no deve ser utilizado como antioxidante para leos vegetais nos processos de frituras. A mesma anlise se verifica pela curva TG/DSC.

a)

13
m(mg)

TG: preto DTA: verde

12

11

10

7 0
b)

200

400

600

800

1000
Temperatura (C)

8,5

TG: preto DSC: verde

8,0
m(mg)

7,5

7,0

6,5

6,0 0 100 200 300 400 500 600

Temperatura (C)

Figura 11 - Curvas a) TG/DTA do cido ftico; b) TG/DSC do cido ftico.

A Figura 12 mostra a curva TG/DSC do cido ctrico. A anlise da figura mostra que o cido ctrico se decompe em torno de 160C, o que est bem caracterizado pela curva DSC, o que o torna inadequado como antioxidante profiltico nos processos termo-oxidativos dos leos vegetais em frituras.

8 7 6
m(mg)

TG: preto DSC: verde

5 4 3 2 1 0 0 100 200 300 400 500 600

Temperatura (C)

Figura 12 - Curva TG/DSC do cido ctrico.

A Figura 13 mostra a curva TG/DSC do BHA (Butiril Hidroxi Anisol). Observase que a decomposio do antioxidante inicia-se em torno de 120C, mostrada pela curva TG que mostra tambm um pico endotrmico bem evidente em torno de 70C, indicando o ponto de fuso do composto. Logo, o BHA no oferece proteo para os leos vegetais nas temperaturas de frituras (180-200 C) sendo este antioxidante voltil na faixa de temperatura de 100 a 240C (KOWALSKI, 1990).

12
TG: preto DSC: verde

10

m(mg)

0 0 50 100 150 200 250


Temperatura (C)

Figura 13 - Curva TG/DSC do BHA.

A Figura 14 mostra o comportamento trmico do antioxidante BHT. Observase que a sua decomposio comea em torno de 120C, de maneira anloga ao BHA. O pico endotrmico em torno de 70C corresponde ao seu ponto de fuso. Assim como o BHA, o BHT no oferece proteo antioxidante aos leos vegetais nas temperaturas de frituras. O comportamento trmico observado para os antioxidantes BHA e BHT concorda com relatos prvios do seu comportamento em leo de colza, onde ambos so volteis e relativamente susceptveis oxidao sob condies de altas temperaturas, escapando do leo aquecido ou sendo consumidos em reao com o oxignio (KOWALSKI, 1991). Na escolha do antioxidante adequado, deve-se considerar tambm o contedo de cidos graxos insaturados presentes nos leos vegetais, os quais determinam uma reduo da estabilidade e um incio de degradao trmica entre

150 e 220 C (HILL; PERKINS, 1995; KAISERSBERGER; NETZSCH-GERTEBAU, 1989), portanto, quanto maior a concentrao de cidos graxos insaturados do leo, mais termo-estvel deve ser o antioxidante.

16
TG: preto DSC: verde

14 12
m(mg)

10 8 6 4 2 0 -2 0 50 100 150 200 250


Temperatura (C)

Figura 14 - Curva TG/DSC do BHT.

A Figura 15 mostra a Curva TG/DSC do eritorbato de sdio. Observam-se alteraes trmicas do antioxidante a 180 C e 300 C. Este composto mostra maior resistncia a altas temperaturas, semelhante ao que foi registrado para cido ftico. Apesar disso, tais antioxidantes no mantm sua estrutura intacta na faixa de 180 a 200C (faixa de temperatura dos leos nos processos de fritura), por muito tempo, sofrendo alteraes logo em seguida.

TG: preto DSC: verde

8
m(mg)

4 0 100 200 300 400 500 600


Temperatura (C)

Figura 15 - Curva TG/DSC do eritorbato de sdio.

A Figura 16 mostra a curva DSC do propil galato (PG). Observa-se que a temperatura de decomposio deste antioxidante est prximo de 200 C. Um pico endotrmico em 160C, correspondendo ao seu ponto de fuso e um pico exotrmico em torno de 300C, correspondendo a sua oxidao, o que est de acordo com o encontrado por Kowalski (1990). Portanto, o propil galato nestas circunstncias indiciado como profiltico nos processos termo-oxidativos observados em todos os tipos de frituras utilizados, como registrado para o leo de colza em que a adio do PG melhorou a estabilidade trmica do leo no intervalo de temperatura de 189,5 a 203,2 C (KOWALSKI, 1991). A Figura 17 mostra a curva TG/DSC do cido srbico. Observa-se que a temperatura de decomposio deste antioxidante est em torno de 150C,

temperatura na qual ocorre a sobreposio das curvas TG e DSC, indicando que o composto inicia sua fuso e decomposio simultaneamente.
8
TG: preto DSC: verde

7 6
m(mg)

5 4 3 2 1 0 0 100 200 300 400 500 600

Temperatura (C)

Figura 16 - Curva TG/DSC do propil galato (PG).

8
TG: preto DSC: verde

7 6
m(mg)

5 4 3 2 1 0 0 100 200 300 400 500 600

Temperatura (C)

Figura 17 - Curva TG/DSC do cido srbico.

A Figura 18 mostra a curva TG/DSC do cido ascrbico, na qual se observa que a temperatura de decomposio deste antioxidante, inicia-se por volta de 190C, o que o torna inadequado para uso em leos vegetais nos processos de frituras.

120

TG: azul DSC: verde


0 100

m(mg)

dQ/dT

-2

80

-4

60

-6

40

-8 0 100 200 300 400 500

20 600

Temperatura (C)

Figura 18 - Curva TG/DSC do cido ascrbico

A curva TG/DSC da SAIB (acetato isobutirato de sacarose) na Figura 19, mostra dois pontos de inflexo na curva DSC: um ponto em torno de 90C e outro em torno de 150C. Como a curva TG no mostra perda de massa nestas temperaturas e estes pontos devem indicar mudana de estado fsico, como evaporao da gua. Estas observaes esto em concordncia com a literatura. Para o bagao de oliva, por exemplo, ocorre perda de 76% de sua massa a 80C e a gua de cristalizao evapora prximo de 150C (FREIRE; FIGUEIREDO; FERRO, 1996).

Pela anlise da curva TG possvel observar a decomposio deste antioxidante, que se inicia prximo de 250C, o que o torna o melhor antioxidante, dentre os analisados. o antioxidante de escolha para os leos vegetais nos processos de fritura, pois pode prevenir ou minimizar com maior eficcia, a deteriorao termo-oxidativa que usualmente ocorre nos leos vegetais em frituras.

120

TG: azul DSC: verde


100

m(mg)
0 80

-1

60

40 -2 20

-3 0
Exo Up

100

200

300

400

0 500

Temperature (C)

Universal (C) TemperaturaV3.2B TA Instruments

Figura 19 - Curva TG/DSC do SAIB (acetato isobutirato de sacarose)

steres de cido olico, por exemplo, tm estabilidade trmica at cerca de 175C (em atmosfera de ar), quando ento comeam a se degradar (DUFAURE; THAMRIN; MOULOUNGUI, 1999). Estes estudos mostram que os compostos SAIB e PG so os antioxidantes que podem propiciar a melhor proteo aos leos vegetais e gorduras nos processos de frituras.

4.3 ANLISE ESPECTROSCPICA DE INFRAVERMELHO

Nas Figuras 2028, mostradas a seguir, so apresentados os espectros de infravermelho dos leos estudados submetidos a estresse trmico: na primeira fase de aquecimento, 4 horas/dia a 180 C durante 7 dias consecutivos para os leos de canola, milho, oliva e soja (Figuras 20-23), respectivamente; na segunda fase de aquecimento, 8 horas/dia a 180 C durante por 10 dias, para os leos de canola, milho, oliva, girassol e soja (Figuras 24-28), respectivamente. Os espectros foram sobrepostos para facilitar a visualizao das bandas de absores de grupos funcionais. As ligaes C-H do esqueleto hidrocarbnico so observadas em 2924, 2855 e 1458 cm-1; uma banda larga entre 3600 - 3200 cm-1 que corresponde a absoro dos grupos hidroxilas presentes nas carboxilas dos cidos graxos livres (1640 cm-1) em ligao de hidrognio. A banda de absoro da ligao H-C das ligaes duplas presentes nos cidos graxos insaturados, so observadas em 3009, 1600, e 800-990 cm-1. A absoro forte do grupo carboxila de steres so observadas em 1746 cm-1. A absoro das ligaes teres, C-O-C, observada entre 1163 e 1099 cm-1. As posies relativas das bandas, so consistentes com o preconizado pela literatura (SILVERSTEIN; WEBSTER,1998). Todos os leos estudados nas duas fases mostram uma forte absoro entre 3500 e 3000 cm-1, que aumenta progressivamente medida que aumenta o tempo de aquecimento dos leos, em concordncia com a termo-oxidao dos leos, confirmando a sua progressiva deteriorao, pois nesta regio que aparecem os sinais dos grupos carboxila e hidroperxidos. um indicativo seguro do aumento da acidez dos leos, fato comprovado pela determinao da acidez.

Estas observaes concordam com as de Adhvaryu, Perez e Tyagi (1998) no estudo da degradao oxidativa de leos lubrificantes e por Chen, Liu e Hartman (1999).

100

%T
80 Legenda: 60 preto = 0 h verde = 8 h vermelho = 28 h

40

20

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

cm

-1

Figura 20 - Espectro de infravermelho do leo de canola em diferentes tempos de aquecimento.

100

%T
80

Legenda: preto = 0 h verde = 8 h vermelho = 28 h

60

40

20

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

cm

-1

Figura 21 - Espectro de infravermelho do leo de milho em diferentes tempos de aquecimento.

110 100

%T
90 80 70 60 50 40 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

Legenda: preto = 0 h verde = 8 h vermelho = 28 h

cm

-1

Figura 22 - Espectro de infravermelho do azeite de oliva em diferentes tempos de aquecimento.

100

%T
80

Legenda: preto = 0 h vermelho = 4 h verde-claro = 8 h azul = 12 h rosa = 16 h amarelo = 20 h verde-oliva = 24 h pink = 28 h

60

40

20

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

cm

-1

Figura 23 - Espectro de infravermelho do leo de soja em diferentes tempos de aquecimento.

Nas Figuras 2428, mostradas a seguir, so apresentados os espectros da segunda fase de aquecimento: 8 horas/dia por 10 dias (80 horas). possvel observar nesta fase, uma grande alterao na banda de 1300-1100 cm-1, regio de deformao dos grupos C-O-C e C-OH, assim como na faixa de ~1450 cm-1, regio de deformao dos grupos C-H. possvel que esta alterao esteja relacionada com o aumento progressivo do grau polimerizao dos leos, devido ao aumento do nmero de ligaes cruzadas (LI; LAROCK, 2003) e diminuio sistemtica das ligaes duplas (~3010 cm-1).

Legenda: em horas de aquecimento preto = 0 h vermelho = 8 h verde-claro = 16 h azul = 24 h rosa = 32 h amarelo = 40 h verde-oliva = 48 h alaranjado = 56 h azul-violeta = 64 h pink = 72 h azul-anil = 80 h

100

%T
80

60

40

20

0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

cm

-1

Figura 24 - Espectro de infravermelho do leo de canola em diferentes tempos de aquecimento.

120

100

%T
80

60

40

20

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

0
-1

cm

Figura 25 - Espectro de infravermelho do leo de milho em diferentes tempos de aquecimento.

120

100

%T
80

60

40

20

0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

cm

-1

Figura 26 - Espectro de infravermelho do azeite de oliva em diferentes tempos de aquecimento.

120

100

%T
80

60

40

20

0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

cm

-1

Figura 27 - Espectro de infravermelho do leo de girassol em diferentes tempos de aquecimento.

100

%T

80

60

40

20

0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

cm

-1

Figura 28 - Espectro de infravermelho do leo de soja em diferentes tempos de aquecimento.

4.4 ANLISE POR DIFRAO DE RAIOS X

Uma caracterstica importante observada na segunda fase foi a polimerizao apresentada por todos os leos estudados, no ltimo perodo de aquecimento; exceto o leo de girassol que polimerizou aps 56 horas de aquecimento. A Figura 30, mostra o espectro de difrao de raios-x do polmero obtido da termoxidao, o qual apresenta-se 85,4% amorfo e 14,6 % cristalino. O mecanismo de ao parece envolver a reao de Diels Alder (Esquema 3) com a formao de pontes intermoleculares a altas temperaturas, com subseqente formao de ligaes cruzadas. A polimerizao trmica (Figura 29), envolve primariamente a dimerizao dos cidos graxos presentes no leo vegetal, produzindo dmeros monocclicos de grupo de cidos graxos a uma temperatura de 200 C ou superior (LI; LAROCK, 2003).

Figura 29 - Fotografia do leo de girassol polimerizado

1000

800

600

Intesnsidade

400

200

10

20

30

40

50

60

70

80

90

2-
Figura 30 - Espectro por difrao de raios-x do polmero do leo de girassol

4.5 ANLISE ESPECTROSCPICA POR ULTRAVIOLETA - VISVEL

A espectroscopia de ultravioleta til para se observar a presena de insaturaes em compostos orgnicos. Ligaes duplas carbono-carbono, isoladas, absorvem prximo de 200 nm, com freqente deslocamento batocrmico ou hipsocrmico, dependendo dos grupamentos cromforos ligados ao sistema de eltrons (GLAZER, 1990). Por exemplo, a presena de grupos funcionais que favoream a conjugao - deslocalizao de eltrons - contribui para estabilizar o sistema (menor energia e maior comprimento de onda, pois E = hc/ ) deslocando a posio da banda de absoro para maiores comprimento de onda no espectro. Assim, ligaes duplas carbono-carbono em dienos, polienos e aromticos (sistemas conjugados), absorvem em comprimentos de ondas maiores que os alcenos (ligaes duplas carbono-carbono, isoladas). Os espectros de ultravioleta dos leos estudados so apresentados nas Figuras 3139. Nas Figuras 3134, so apresentados os espectros sobrepostos dos leos de canola, milho, oliva e soja, sob aquecimento a 180 C (4 horas/dia durante 7 dias), a primeira fase dos experimentos.

Legenda: tempo em horas de aquecimento preto = 0 vermelho = 4h verde-claro = 8h azul = 12h azul-claro = 16h pink = 20h amarelo = 24h verde-oliva = 28h

0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

nm
Figura 31 - Espectro UV do leo de canola

2,0

1,0

0,0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

nm
Figura 32 - Espectro UV do leo de milho

0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

nm
Figura 33 - Espectro UV do azeite de oliva

2,0

1,0

0,0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

nm
Figura 34 - Espectro UV do leo de soja

Nas Figuras 3539, so apresentados os espectros sobrepostos dos leos de canola, milho, girassol, oliva e soja, sob aquecimento a 180 C (8 horas/dia durante 10 dias), a segunda fase dos experimentos. O aumento da intensidade da absoro e do deslocamento batocrmico, deve-se maior deteriorao trmica do leo.
Legenda: tempo de aquecimento em horas vermelho = 8h verde-claro = 16h azul-escuro = 24h azul-claro = 32h rosa = 40h amarelo = 48h verde-oliva = 54h laranja = 62h violeta = 70h

0 200 300 400 500 600 700 800

nm
Figura 35 - Espectro UV do leo de canola

0 200 300 400 500 600 700 800

nm
Figura 36 - Espectro UV do leo de milho

2,0

1,0

0 200

300

400

500

600

700

800

nm
Figura 37 - Espectro UV do azeite de oliva.

0 200

300

400

500

600

700

800

nm
Figura 38 - Espectro UV do leo de girassol.

200

300

400

500

600

700

800

nm
Figura 39 - Espectro UV do leo de soja.

Todos os espectros para todos os leos estudados e no aquecidos mostram forte absoro em 230 nm, devido s ligaes duplas carbono-carbono presentes nos cidos olico, linolico e linolnico e que contribuem para o alto grau de insaturao dos leos. Estas observaes esto de acordo com relatos da literatura para espectros de ultravioleta de compostos insaturados (OWEN; HAUBNER; MIER, et al., 2003). Todos os espectros mostram um pronunciado efeito batocrmico inerente a progressiva termo-oxidao dos leos vegetais estudados, processo que leva a formao de perxidos e formao de ismeros trans, conjugados, o que necessariamente aumenta a intensidade e posio da banda de absoro para comprimentos de onda maiores (o efeito batocrmico). Estas observaes so

compatveis com as alteraes estruturais que ocorrem nos cidos graxos insaturados livres ou esterificados em triacilgliceris durante o processo termooxidativo, devido s reaes de isomerizao, com a conseqente formao de sistemas conjugados: reaes de epoxidao e peroxidao (Esquemas 5 e 7). Por meio dos espectros de UV-vis, possvel monitorar a qualidade dos leos em estudo. Os leos no aquecidos, apresentam A 0,7 em = 230 nm, numa diluio de 1:1000. Com isso, possvel fazer uma anlise qualitativa de qualquer leo vegetal. leos vegetais com absorbncia at 0,7 e = 230 (numa diluio 1:1000), so prprios para o consumo.

Esquema 7 - Termo-oxidao e isomerizao do cido linolico

H H

O OH

O OH

H
H

.O-O-H
CH 3

.
CH 3

.O-O

O OH

.
O=O

O OH

CH 3

CH 3

..H

OOH
7
10 11 H 12 13 H

O 5

3 4

1 OH

CH 3

cido graxo cis-trans insaturado

FONTE: KESZLER; KRISKA; NMETH, 2000

4.6 ANLISE FSICO-QUMICA DOS LEOS VEGETAIS

4.6.1 ndices de Acidez e Perxido

As Tabelas 912, mostram os resultados obtidos para os ndices perxido e acidez, dos leos de canola (Brassica campestris), milho (Zea mays), oliva (Olea europea) e soja (Glycine max) submetidos a diferentes tempos de aquecimento a 180 C, na primeira fase dos experimentos, aquecimento moderado com 4 h/dia durante 7 dias. As Tabelas 1317, mostram os resultados das determinaes dos ndices de: perxido e acidez, sob aquecimento mais enrgico (8 h/dia, durante 10 dias), dos leos de canola (Brassica campestris), milho (Zea mays), oliva (Olea europea), girassol (Helianthus annuus) e soja (Glycine max). O teor de perxidos para os leos no aquecidos refinados, manteve-se em torno de 1,90 mEq/kg, como preconiza a legislao (ANVISA,1999), com exceo do azeite de oliva que apresentou teor de perxidos muito maior: 9,51 mEq/kg na primeira fase e 5,80 mEq/kg para a segunda fase. Como o teor de perxidos indica o grau de auto-oxidao do leo (FENNEMA, 2000), fica claro que os leos refinados possuem boa proteo quanto oxidao, devido presena de antioxidantes. Com exceo do leo de girassol, em comparao com o azeite de oliva, que se mostrou mais vulnervel s aes oxidativas, devido ao processo de obteno do azeite de oliva, que implica somente numa prensagem como mtodo extrativo (RANALLI; FERRANTE; MATTIA, et al., 1999). Isto o torna mais susceptvel aos processos oxidativos, como a foto-oxidao, alm de no ser permitido pela legislao, o

acrscimo de qualquer produto sinttico ao leo, como a adio de antioxidantes, tornando-o menos resistente ao ataque foto-oxidativo. A diferena nos ndices de

perxido dos leos de oliva nas duas fases, deve-se provavelmente embalagem do produto. O azeite de oliva utilizado na segunda fase, tinha embalagem de metal, com restrio total passagem de luz; na primeira fase, foi utilizado azeite de oliva em embalagem de vidro transparente, o que facilitou os efeitos foto-oxidativos da luz. O que torna significativo o fato de algumas marcas acondicionarem o azeite de oliva em vidro transparente, interferindo negativamente na preveno da fotooxidao e aumentando o teor de perxidos. Outro efeito importante observado, foi a reduo dos teores de perxidos a partir do terceiro aquecimento, nas duas fases para todo os leos estudados. Isso est de acordo com a natureza dos perxidos formados, os quais so muito instveis, reativos e se degradam facilmente, formando produtos mais estveis como dmeros, trmeros e polmeros. O aquecimento mais enrgico na segunda fase, proporcionou as condies necessrias para que os perxidos formados

promovessem polimerizao em todos os leos, dando-lhes uma consistncia viscoelstica (Figura 29). A acidez crescente foi uma caracterstica marcante para todos os leos estudados, independente da intensidade do aquecimento. Assim, muito recomendvel que no se reutilize leos vegetais, principalmente pelos efeitos gastrintestinais que causam os leos com alto ndice de acidez.

a) Primeira fase:

Tabela 9 - Anlise fsico-qumica do leo de Canola (Brassica campestris).

Tempos de aquecimentos 0h 4h 8h 12 h 16 h 20 h 24 h 28 h

Teor de perxidos (mEq/kg) 1,90 7,59 7,77 3,88 4,80 3,80 3,80 3,80

Acidez livre (g%) 0,13 0,27 0,41 0,68 0,68 0,82 0,96 1,20

Tabela 10 - Anlise fsico-qumica do leo de Milho (Zea mays).

Tempos de aquecimentos 0h 4h 8h 12 h 16 h 20 h 24 h 28 h

Teor de perxidos (mEq/kg) 1,90 9,51 3,79 3,80 1,90 1,90 1,89 3,81

Acidez livre (g%) 0,13 0,40 0,41 0,55 0,83 0,65 0,65 0,83

Tabela 11 - Anlise fsico-qumica do azeite de oliva (Olea europea).

Tempos de aquecimentos 0h 4h 8h 12 h 16 h 20 h 24 h 28 h

Teor de perxidos (mEq/kg) 9,51 9,51 9,74 5,85 3,80 3,87 1,90 1,90

Acidez livre (g%) 0,65 0,55 0,82 0,96 0,96 1,00 1,30 1,50

Tabela 12 - Anlise fsico-qumica do leo de soja (Glycine max).

Tempos de aquecimentos 0h 4h 8h 12 h 16 h 20 h 24 h 28 h

Teor de perxidos (mEq/kg) 1,95 9,81 7,80 1,97 1,96 <1,00 <1,00 <1,00

Acidez livre (g%) 0,10 0,27 0,40 0,67 0,55 0,54 0,67 0,81

b) Segunda fase:
Tabela 13 - Anlise fsico-qumica do leo de Canola (Brassica campestris).

Tempos de aquecimentos 0h 8h 16 h 24 h 32 h 40 h 48 h 56 h 64 h 72 h 80 h

ndice de perxidos (mEq/kg) 1,90 5,70 7,70 3,80 3,10 3,80 1,90 1,94 1,90 1,90 Polimerizao

Acidez livre (g %) 0,13 0,27 0,48 0,67 0,82 0,96 1,24 1,51 1,64 1,63 Polimerizao

Tabela 14 - Anlise fsico-qumica do leo de Milho (Zea mays).

Tempos de aquecimentos 0h 8h 16 h 24 h 32 h 40 h 48 h 56 h 64 h 72 h 80 h

ndice de perxidos (mEq/kg) 1,90 7,70 6,80 3,90 3,80 3,80 1,90 1,93 1,90 1,90 Polimerizao

Acidez livre (g %) 0,13 0,27 0,48 0,62 0,82 0,95 1,24 1,50 1,49 2,05 Polimerizao

Tabela 15 - Anlise fsico-qumica do azeite de Oliva (Olea europea).

Tempos de aquecimentos 0h 8h 16 h 24 h 32 h 40 h 48 h 56 h 64 h 72 h 80 h

ndice de perxidos (mEq/kg) 5,80 9,70 7,70 3,90 3,80 3,80 3,90 1,94 1,90 1,90 Polimerizao

Acidez livre (g %) 0,54 0,62 0,80 1,10 1,70 1,24 1,52 1,91 2,75 2,87 Polimerizao

Tabela 16 - Anlise fsico-qumica do leo de Girassol (Helianthus annuus).

Tempos de aquecimentos 0h 8h 16 h 24 h 32 h 40 h 48 h 56 h 64 h 72 h 80 h

ndice de perxidos (mEq/kg) 3,80 5,80 6,80 3,80 3,80 3,80 1,90 Polimerizao Polimerizao Polimerizao Polimerizao

Acidez livre (g %) 0,41 0,41 0,34 0,41 0,55 0,82 0,96 Polimerizao Polimerizao Polimerizao Polimerizao

Tabela 17 - Anlise fsico-qumica do leo de Soja (Glycine max).

Tempos de aquecimentos 0h 8h 16 h 24 h 32 h 40 h 48 h 56 h 64 h 72 h 80 h

ndice de perxidos (mEq/kg) 1,95 9,60 7,80 3,91 3,80 3,90 1,90 1,93 1,90 Polimerizao Polimerizao

Acidez livre (g %) 0,10 0,27 0,34 0,41 0,54 0,68 0,97 1,24 1,33 Polimerizao Polimerizao

4.6.2 ndice de iodo: o ndice de iodo (wijs) dos leos de milho, soja, girassol e oliva - no aquecidos - e leo de canola (srie completa) so apresentados na Tabela 19 para comparao com os valores determinados por RMN H1.
Tabela 18 - ndice de iodo determinado por RMN de H e pelo mtodo de Wijs em amostras de leos vegetais in natura e sob aquecimento.
1

leo vegetal

Milho in natura Oliva in natura Girassol in natura Soja in natura Canola in natura Canola 8 horas Canola 16 horas Canola 24 horas Canola 32 horas Canola 40 horas Canola 48 horas

ndice de iodo determinado por RMN de H1 (g %) 119,47 77,98 139,75 136,48 114,30 102,41 96,06 85,08 77,20 67,88 60,24

ndice de iodo determinado pelo mtodo de Wijs (g %) 108,7 82,27 114,44 124,08 110,8 103,96 92,13 91,05 84,05 82,62 79,21

Os valores do ndice de iodo de todos os leos in natura determinado por RMN H1, so pouco menores que os encontrados pelo mtodo de Wijs, o que pode ser racionalizado pela configurao das duplas ligaes conjugadas (cis, trans) existentes nos cidos graxos insaturados estressados termicamente e com o iodo passvel de adio 1,2 e 1,4, no saturando totalmente (Esquema 6). Assim, o mtodo iodomtrico de Wijs no to preciso na determinao do ndice de iodo, por causa das adies 1,4 nos sistemas conjugados que revela ligaes duplas intactas, no sofrendo com isso adio de halognio. Os dados da Tabela 18 foram usados para anlise de regresso linear entre os dois mtodos e o resultado apresentado nas Figuras 40 e 41.

y = 0,5516x + 43,595
ndice de Iodo 140 120

Wijs

100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160

RMN H

Figura 40 Regresso linear entre os mtodos: RMN H e Wijs para o ndice de iodo [r = 0,9365; r= 0,9677; n = 11].

ndice de Iodo 160 140

I.I.

120 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Calculado

114,3 102,4 96,06 85,08 77,2 67,88 60,24 139,8 119,5 77,98 136,5

Experimental 110,8 104 92,13 91,26 84,05 82,62 79,21 114,4 108,7 82,27 124,1

Figura 41 Grfico de comparao do ndice de iodo entre os mtodos: Wijs (experimental) e RMN 1 H (calculado).

possvel observar pelos grficos e pelo modelo de regresso linear, que o coeficiente de determinao (r2) entre os dois mtodos satisfatria, visto que o modelo explica 93,65% da variao dos dados, confirmando que a determinao do ndice de iodo por RMN de H1 pode ser utilizada. Na Tabela 19, foram estendidos os clculos e se determinou o ndice de iodo por RMN de H1 de todos os leos sob quaisquer tempos de aquecimento, condio que restringe o uso do mtodo de Wijs para tempos de aquecimento prolongados onde os leos polimerizam. S a RMN permite o clculo em qualquer circunstncia, mostrando que a tcnica de anlise por RMN de H1 superior, preciso e sensvel (JOSEPH-NATHAN, 1982).

Tabela 19 - ndice de iodo determinado por RMN de H em amostras de leos vegetais aquecidos em diversos tempos de aquecimento.

LEO VEGETAL Tempo de aquecimento (em h) 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 Canola 114,34 102,41 96,06 85,08 77,20 67,88 60,24 56,53 53,94 50,76 50,30 Milho 119,47 49,63 Oliva 77,98 29,20 Girassol 139,75 60,27 Soja 136,48 53,67

A Tabela 20, apresenta o perfil de hidrognios, obtidos das curvas de integrao dos espectros de RMN de H1 do leo de canola in natura e sob diversos

tempos de aquecimento (180-200C, 0-80h); na Tabela 21, observa-se o perfil de hidrognios dos demais leos estudados em diversos tempos de aquecimento (180200C, 0-80h); na Tabela 22 mostrado o perfil de hidrognio dos leos vegetais estudados nos diversos tempos de aquecimento, na primeira fase de aquecimento (180-200C, 0-80h). possvel observar na Tabela 20, a variao da intensidade dos sinais dos hidrognios do triacilglicerol com o aquecimento progressivo. O mesmo comportamento foi observado com os demais os leos vegetais estudados. Fica evidente o contnuo decrscimo do teor de cido linolnico (-3) cuja concentrao vai a zero aps 72 horas de aquecimento. Outro efeito importante da termo-oxidao pode ser observada nas regies dos prtons allicos internos (g) e externos (e). Estes prtons que correspondem aos cidos linolico e linolnico, que sob prolongado aquecimento mostram reduo das intensidades: 64,2% e 7,02%, respectivamente. Observa-se que o grau de insaturao do leo afetado de maneira progressiva e contnua, pelo aquecimento, pois diminui a intensidade dos hidrognios olefnicos. Logo, pela anlise do espectro integrado de RMN de H1 de qualquer leo vegetal, possvel fazer uma estimativa rpida, da qualidade do leo; igualmente as intensidades dos sinais dos hidrognios olefnicos (d; f) aumentam com a deteriorao do leo. O peso molecular mdio (PM) de todos os leos vegetais estudados, sofre uma reduo ao chegar ao ltimo tempo de aquecimento, mesmo tendo algumas variaes. Este efeito fica mais evidente para os leos estudados na segunda fase de aquecimento do que na primeira fase e pode ser o resultado da contnua formao e quebra de cadeias polimricas, que vo se formando com o tempo de termo-oxidao, com perda sucessiva de massa, resultando numa reduo final do PM mdio dos triacilgliceris dos leos vegetais.

Na anlise dos dados de RMN de H1 da Tabela 22 para os leos de canola, oliva, soja e milho para a primeira fase de aquecimento, possvel prever o estado de oxidao de cada leo estudado, por meio da estabilidade oxidativa dos leos. Segundo Guilln e Ruiz (2001), esse importante indicador da resistncia oxidao, pode ser obtido por meio da relao entre os prtons olefnicos e os prtons alifticos, do espectro de RMN de H1 dos leos vegetais, conforme a equao (IX):

Ro, a =

V a +b

(IX)

onde: Ro,a = relao entre prtons olefnicos / alifticos; V = prtons olefnicos (Equao II); a + b = prtons alifticos.

Para os leos estudados na primeira fase de aquecimento, tem-se a seguinte relao Ro,a: leo de canola = 0,4686; leo de milho = 0,4863; leo de soja = 0,5202; azeite de oliva = 0,3053.

Portanto, pelo estudo da estabilidade trmica dos leos aquecidos 28 horas (180-200C), pode-se dizer que o leo mais estvel foi o leo de soja, seguido pelos leos de milho, canola e azeite de oliva. Na segunda fase de aquecimento, possvel tambm se classificar os leos vegetais segundo a resistncia a termo-oxidao. Sendo a resistncia polimerizao total, um critrio importante, a ordem dos leos mais resistentes seria: canola, milho, azeite de oliva, leos de soja e girassol. Porm como os leos de canola, milho e oliva, polimerizaram todos com 80 horas, possvel prever qual dentre eles mais estvel por meio da relao Ro,a: leo de canola = 0,3264; leo de milho = 0,3197; leo de oliva = 0,1898.

Assim, o leo mais estvel o leo de canola, seguido pelos leos de milho e pelo azeite de oliva. Portanto, para a segunda fase de aquecimento, os leos mais estveis a termo-oxidao so: canola, milho, oliva, soja e girassol.

Tabela 20 - Perfil de hidrognios dos triacilgliceris, obtido da curva de integrao do espectro de 1 RMN de H do leo de canola.

0 k+j i+h 3,72 g f e d c

16

24

32

40

48

56

64

72

80

8,72 4,08 2,42 6,11 6,85

7,85 3,98 2,01 6,16 7,13 0,80 7,96 8,76

7,60 4,34 1,67 6,51 6,81 0,43 7,45 7,88

6,82 4,29 1,28 6,63 9,81 7,71 54,84 0,48 8,14 8,62 100,0 1,072 5,359 93,24

6,32 3,56 Tr 1,19 6,72 9,09 9,49 0,39 8,31 8,70

5,65 4,31 Tr 0,72 6,68 8,58 8,48 0,03 9,02 9,05

5,18 4,45 Tr 0,61 7,03 8,43 9,21 56,35 0,02 8,72 8,74 1,112 3,656 89,90

4,88 4,32 Tr 0,36 6,85 7,87 8,55 57,83 0,27 9,07 9,34 1,080 3,518 92,59

4,73 4,40 Tr 0,40 7,03 7,50 8,81 57,77 0,00 9,36 9,36 100,0 1,100 3,300 90,90

4,51 4,41 0,09 0,47 7,48 7,70 9,47 56,7 0,00 9,09 9,09 100,0 1.10 3,09 90,60

4,62 4,76 Tr 0,17 7,22 7,16 10,20 57,04 0,00 8,83 8,83 100,0 1.190 2,882 84,03 728.2

11,16 10,70 10,11 51,81 53,41 55,08 8,01 8,85

54,93 56,53

[Ln] = b 0,84 a a+b =

100,0 100,0 100,0 7,549 6,855 6,005 98,02 100,4 92,16

100,0 100,0 0,890 1,078 6,100 4,244 112,3 92,81

100,00 100,0

rea/H 1,020 0,995 1,085 Vinil =H PM, mdio

854,6 867,9 804,11 807,80 946,8 798,15 774,15 792,23 779,02 775,

Tabela 21 - RMN de H1 dos leos vegetais na segunda fase de aquecimento [180-200C, 0-80 h].

GIRASSOL
k+j i+h g f e d c b a a+b = rea/H Vinil T = H PM 0 10,51 4,24 4,09 6,35 11,02 6,03 49,74 0,01 8,01 8,02 100,0 1,060 8,915 94,33 836,7 56 5,23 4,67 1,32 7,26 6,41 9,20 56,53 0 9,38 9,38 100,0 1,167 3,480 85,662 743,234

MILHO
0 9,16 4,30 3,09 6,41 10,42 6,03 52,65 0,07 7,87 7,94 100,0 1,075 8,085 93,014 822,519 80 4,65 4,99 0,47 7,38 5,60 10,90 57,48 0 8,53 8,53 100,0 1,247 2,727 80,160 700,024

OLIVA
0 6,23 3,99 0,40 5,95 10,26 6,28 58,92 0,09 7,88 7,97 100,0 0,997 5,232 100,261 856,440 80 3,05 4,42 0,34 7,00 5,06 11,30 59,56 0 9,27 9,27 100,0 1,105 1,760 90,507 767,038

SOJA
0 10,29 4,30 4,34 6,34 10,32 7,16 49,38 0,41 7,45 7,87 100,0 1,075 9,215 93,023 829,345 72 4,80 4,79 1,01 7,24 6,02 10,83 56,02 0 9,29 9,29 100,0 1,197 3,008 83,507 725,260

Tabela 22 - RMN de H de leos vegetais na primeira fase de aquecimento [180-200 C, 0-28 h].

OLIVA
k+j i+h 3,72 G F E D C B A a+b = rea/H Vinil =H PM 0 6,19 4,03 0,36 5,93 10,19 5,91 59,25 0 8,14 8,14 100,0 1,007 5,14 99,26 848,84 28 4,05 4,49 * 0,13 6,36 6,28 9,58 60,57 0 8,54 8,54 100,0 1,122 2,61 89,08 762,06 0 9,55 3,92

SOJA
28 6,99 4,92 2,14 7,16 7,49 6,30 56,00 0,20 8,80 9,00 100,0 1,230 4,68 81,31 749,81

CANOLA
0 9,01 4,26 2,51 6,13 11,02 6,23 52,78 0,85 7,21 8,06 100,0 1,065 7,46 93,91 825,06
+

MILHO
0 8,82 4,19 2,91 6,16 10,03 6,17 53,46 0 8,26 8,26 100,0 1,047 7,42 95,46 835,79 28 5,58 4,20 1,38 6,73 7,72 9,33 56,19 0 8,87 8,87 100,0 1,050 4,31 95,23 815,54

3,99 6,04 10,18 7,31 50,20 0,73 8,08 8,81 100,0 0,980 8,75 102,04 889,97

28 5,29 4,23 *0,09 0,67 6,87 8,57 9,38 55,70 0,45 8,75 9,20 100,0 1,057 4,00 94,55 808,92

* = 3,72ppm [1,2-diacilglicerol] = evidncia da hidrlise sob H e calor.

Na Figura 42, so apresentados os espectros de RMN H1 integrado do leo de canola sem aquecimento e co 80 horas de aquecimento. Os espectros de RMN H1 integrado, mostram reduo da intensidade do pico em 0,98 ppm (metilas do cido linolnico), medida que o leo vai sendo termo-oxidado, o contedo de cido linolnico vai decrescendo. Este um dado qualitativo importante, pois fornece uma possibilidade de verificao rpida dos estado oxidativo do leo vegetal. Muito importante para a anlise qualitativa, so os sinais situados em 2,8 e 2,0 ppm (g; e) relativos aos H allicos internos e externos ligao C=C, respectivamente. Os leos vegetais contendo altos teores de cidos graxos poliinsaturados, o espectro de RMN H1 fornece informaes importantes para a determinao do contedo destes cidos graxos. Nos hidrognios allicos internos as ligaes duplas, por efeito de anisotropia magntica, mostram deslocamento qumico para campo mais baixo no espectro, prximo de 2,8 ppm. Do mesmo modo, os hidrognios allicos externos, menos desblindados pelos efeitos anisotrpicos das ligaes C=C, mostram

deslocamento qumico para campo mais alto, prximo a 2,0 ppm. Este dado muito significativo, porque revela rapidamente, se houve ou no uma diminuio do contedo de poliinsaturaes no leo, pela anlise da variao da intensidade destes picos no espectro. O que pode ser traduzido pela avaliao do contedo de cido linolico (-6) e linolnico (-3). Estas observaes podem ser notadas em espectros integrados de RMN de H1 (Figura 43). A ausncia ou reduo do sinal em 0,98 ppm (cido linolnico) e uma reduo da intensidade dos sinais em em 2,8 e 2,0 ppm (g; e), revela um contedo ausente ou pobre de cido -3 no leo vegetal. Isto tambm poder ser confirmado pela anlise do sinal situado prximo de 5,3 ppm (k), hidrognios dos carbonos das ligaes duplas, cuja intensidade diminui pelo efeito da termo-oxidao. Estas alteraes esto presentes em todos os espectros de RMN de H1 dos leos estressados termicamente.

a)

8.72

4.08

2.42

6.11 11.16 6.85

51.80

8.85

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 ppm

b)

7.85

3.98

2.01

6.16 10.70

7.13

53.40

8.76

8,0

7,5

7,0

6,5

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 ppm

Figura 42: Espectro integrado RMN H do leo de canola: a) sem aquecimento; b) com 8 horas de aquecimento;

A Figura 43, mostra os espectros de RMN C13 com desacoplamento de hidrognios, do azeite de oliva in natura e com 80 horas de aquecimento e no modo DEPT. Todos os espectros de RMN C13 dos leos vegetais estudados mostram perfil de deslocamento qumico (), semelhantes: os leos deteriorados termicamente, mostram reduo do nmero de carbonos olefnicos, como sugerem os resultados mostrados na Tabela 23, na anlise dos deslocamentos qumicos dos leos de oliva, soja, milho e girassol in natura e termo-oxidados totalmente (estado de polmero) e a Tabela 24 para as alteraes no deslocamento qumico () do leo de canola, sem aquecimento e com 80 horas de aquecimento. As Tabelas fazem referncia segunda fase de aquecimento: 8 h/dia por 10 dias. possvel ver uma sensvel diminuio de sinais de carbonos olefnicos ( 132-127 ppm) com o aumento

progressivo da termo-oxidao; o mesmo efeito pode ser observado em 22-23 ppm. A diminuio dos sinais em ~ 27 ppm, a regio dos carbonos allicos externos s ligaes duplas da cadeia carbnica, indica uma reduo no teor dos cidos: linolnico e linolico (-3 e -6, respectivamente), caracterstico de leos vegetais deteriorados. O aumento da saturao dos leos pode ser visto em ~34 ppm, regio dos carbonos alifticos saturados. Os sinais em 132, 127 e 20 ppm, quando presentes nos leos vegetais, demonstram a presena exclusivamente de -3 (cido linolnico), pois somente este cido graxo pode gerar sinais nestes deslocamentos qumicos. Portanto, na anlise das Tabelas 23 e 24, possvel observar a presena dos deslocamentos 127 e 132 ppm nos leos de soja e canola no tempo zero; a Tabela 24 mostra 20 ppm para o leo de canola, nos tempos: zero e 8 horas. Estes leos vegetais continham concentrao suficiente -3 para gerar os sinais.

Tabela 23 Deslocamentos qumicos de RMN C de aquecimento.

13

de leos vegetais sob diferentes tempos

OLIVA 80
173,496 173,084 130,237 129,932 69,104 65,273 62,327 34,410 34,256 32,836 32,134 29,997 29,921 29,910 29,753 29,710 29,585 29,539 29,510 29,402 29,341

SOJA 72
173,435 173,023 132,046 130,421 130,207 130,176 129,886 128,500 128,436 128,268 128,100 127,970 69,089 173,496 173,069 130,451 130,237 129,932 128,299 128,116

MILHO 80
173,510 173,496 173,084 130,253 129,932

GIRASSOL 0 56
173,405 172,993 130,390 130,176 130,146 129,886 129,860 128,253 128,085 69,074 62,261 34,363 34,195 32,104 31,722 29,951 29,890 29,799 29,722 29,677 29,539 29,509 29,463 29,371 29,310 29,264 29,234 173,481 173,054 130,436 130,222 129,917 128,284 128,100

173,510 173,481 173,069 130,237 129,932 129,902 69,104 62,312 34,409 34,256 32,134 29,997 29,936 29,890 29,844 29,753 29,707 29,554 29,500 29,402 29,341 29,310 29,280 27,448 27,402 25,100 25,067 22,899 14,336

27,448 27,402 25,067 22,915 14,336

62,296 34,393 34,300 34,225 32,119 31,737 29,982 29,906 29,875 29,829 29,738 29,692 29,554 29,478 29,387 29,326 29,295 29,248 27,402 25,834 25,082 25,036 22,899 22,777 14,321 14,275

69,104 65,660 65,283 62,327 34,409 34,350 34,256 32,149 31,753 29,982 29,921 29,900 29,884 29,753 29,707 29,539 29,493 29,402 29,341 29,330 29,300 27,417 25,845 25,082 25,000 22,915 22,792 14,356 14,265

173,481 173,451 173,038 130,421 130,207 130,176 129,917 129,886 128,284 128,100 125,890 69,089 62,296 34,393 34,225 32,119 31,737 29,982 29,921 29,875 29,829 29,738 29,692 29,539 29,500 29,387 29,326 29,295 29,264

27,402 25,830 25,082 25,052 22,899 22,777 14,321 14,275

69,104 62,327 34,400 34,256 32,134 31,753 29,982 29,921 29,900 29,850 29,753 29,700 29,600 29,539 29,500 29,402 29,341 29,320 29,280 27,448 27,400 25,082 22,915 22,792 14,336

27,387 25,815 25,052 25,021 22,869 22,762 14,290 14,260

69,089 62,296 34,393 34,225 32,134 32,104 31,722 29,967 29,906 29,860 29,829 29,722 29,690 29,554 29,524 29,478 29,387 29,326 29,310 29,280 27,420 27,402 25,830 25,067 25,036 22,884 22,777 14,321 14,275

Tabela 24

Deslocamentos qumicos de C aquecimento.

13

do leo de canola sob diferentes tempos de

0
173,40 172,99 132,11 130,39 130,19 130,15 130,00 129,88 129,86 128,46 128,40 128,25 128,08 127,94 69,07

8
173,40 172,99 132,11 130.37 130,19 130,15 130,10 130,00 129,88 129,84 128,46 128,40 128,26 127,94 127,30 69,07

16

Tempos de aquecimento (h) a 180-200 C 24 32 40 48 56 64


173,45 173,03 130,42 130,22 130,00 129,91 128,28 128,10 173,43 173,06 130,45 130,23 129,93 128,11 173,42 173,03 130,37 130,19 130,00 129,88 128,25 128,07 173,45 173,03 130,42 130,20 130,13 129,90 128,28 128,10 173,46 172,44 173,06 130,42 130,22 130,03 129,90 128,27 128,10 173,42 173,02 130,39 130,19 130,09 130,00 129,86 128,25 128,08

72
173,42 173,00 130,36 130,16 130,09 129,99 129,87 128,23 128,05

80
173,49 173,08 130,71 130,50 130,25 129,93

173,45 173,02 130,42 130,20 130,11 129,90 128,28 128,10

69,08

69,08

69,10

69,05 65,21 62,26 34,36 34,19 32,08 31,70 29,95 29,89 29,85 29,79 29,70 29,50 29,35 29,29 29,26

69,06 69,08

69,05

62,28 34,36 34,21 32,10 31,72 29,95 29,89 29,81 29,72 29,50 29,46 29,37 29,31 29,23

62,26 34,36 34,21 32,08 31,70 29,95 29,89 29,81 29,72 29,63 29,50 29,46 29,35 29,29 29,23 27,40 27,35 25,81 25,70 25,02 22,86 22,76 20,75 14,45 14,29

62,29 34,39 34,22 32,10 31,72 29,96 29,90 29,82 29,73 29,52 29,50 29,38 29,32 29,24

62,29 34,39 34,24 32,11 31,73 29,98 29,92 29,82 29,73 29,70 29,53 29,50 29,38 29,32 29,29 27,49 27,38 25,83 25,11 25,05 22,88 22,77

62,32 34,40 34,25 32,13 31,75 29,99 29,93 29,83 29,75 29,73 29,55 29,40 29,34 29,31 29,27 27,44 27,40 25,06

62,31 34,39 34,22 32,10 31,72 29,96 29,90 29,86 29,82 29,72 29,65 29,52 29,37 29,31 29,24 29,20 27,41 27,37 25,83 25,03

62,29 34,39 34,22 32,10

29,96 29,90 29,86 29,82 29,72 29,52 29,48 29,38 29,31 29,26 27,41 27,37 25,83 25,03

62,26 34,36 34,19 32,08 31,97 31,70 29,95 29,89 29,85 29,81 29,70 29,67 29,50 29,35 29,29 29,27 27,40 27,35 25,81 25,02

69,04 68,44 65,19 62,25 34,34 34,18 32,07 32,00 31,67 29,92 29,86 29,78 29,69 29,47 29,43 29,34 29,26 29,20

69,10 65,28 62,32 34,50 34,25 32,13

27,38 27,35 25,81 25,70 25,08 25,03 22,86 22,76 20,93 14,72 14,29 14,26

27,41 27,37 25,83 25,05

27,40 27,35 25,81 25,02

27,38 27,32 25,78 25,00

29,99 29,93 29,90 29,87 29,75 29,71 29,68 29,55 29,40 29,34 29,30 27,44 27,40 25,06

22,88 22,77

22,91

22,86 22,76

22,88 22,77

22,88

22,86 22,64

22,83 22,73

22,89 22,80

14,30

14,32

14,33

14,29

14,30

14,30

14,29

14,27

14,33

a)

b)

c)

200

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0 ppm

Figura 43 Espectro de RMN de C do azeite de oliva desacoplado: a) in natura no modo DEPT; b) in natura; c) com 80 horas de aquecimento;

13

5 CONCLUSES

a) leos vegetais sob estresse trmico, deterioram rapidamente conforme demonstraram as tcnicas analticas e espectroscpicas; b) Os resultados - dos clculos do ndice de iodo por RMN de H1 - mostram boa correlao com o mtodo clssico. A elevada sensibilidade e seletividade, credenciam a tcnica como poderosa ferramenta a servio da anlise de qualidade de leos vegetais; c) A RMN H1 permite determinar o ndice de iodo em qualquer etapa de aquecimento; d) A RMN C13 e de H1 so tcnicas muito teis para anlise qualitativa e quantitativa de leos vegetais; e) A RMN de H1 permite a determinao do peso molecular mdio do triacilglicerol, de modo mais preciso que sobre o ndice de saponificao; f) A RMN de H1 permite avaliar o grau de oxidao do leo vegetal pela anlise da relao: H vinlicos / H alifticos; g) A anlise trmica uma ferramenta muito importante para se determinar a estabilidade trmica de antioxidantes, indicando que os compostos: propil galato e a acetato isobutirato de sacarose (SAIB), so os antioxidantes que melhor resistem ao estresse trmico, podendo ser adicionados aos leos vegetais, que sero empregados em frituras; h) A espectroscopia de infravermelho importante ferramenta no controle de qualidade dos leos vegetais sob estresse trmico, os quais mostram aumento progressivo da intensidade da banda de (OH) em 3500 3000 cm-1 devido o aumento da acidez de leos deteriorados termicamente;

i) A espectroscopia por difrao de raios x de grande utilidade na resoluo estrutural de substncias slidas e ou amorfas; tendo indicado que o polmero do leo de girassol, apresenta-se 85,4% amorfo e 14,6% cristalino; j) A espectroscopia por UV-vis uma ferramenta muito til no controle de qualidade de leos e mostram deslocamento batocrmico no leo deteriorado, com aumento da intensidade de absoro na regio de 230 nm para os leos vegetais ricos em cidos graxos insaturados e termo-estressados; k) Os mtodos espectroscpicos, mais sensveis, rpidos e precisos, mostram superioridade sobre as tcnicas analticas e devem ser inseridos na rotina analtica dos leos vegetais; l) As analises realizadas indicam que sob estresse trmico os leos vegetais que sofreram menor deteriorao na primeira fase de aquecimento so: soja, milho, canola e oliva; e sob aquecimento de 8 horas/dia, por 10 dias, os leos mais estveis foram: canola, milho, oliva, soja e girassol.

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ANEXO A: Publicaes

CARACTERIZAO DO LEO EXTRADO DAS SEMENTES DE LIMO ROSA (Citrus limonia Osbeck)
REDA , S. Y; LEAL , E.S; BATISTA , E. A. C; BARANA , A. C; SCHNITZEL , E; CARNEIRO4, P. I. B. 1 Mestrando do Curso de Ps-graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos 2 Universidade Estadual de Ponta Grossa UEPG - PR. Centro Federal de Educao 3 Tecnolgica - CEFET - Ponta Grossa PR. Departamento de Engenharia de Alimentos 4 UEPG. Departamento de Qumica UEPG - Av.: Gal. Carlos Cavalcanti, 4748 Campus Uvaranas Ponta Grossa - PR 84030-900. pibc@uepg.br, a quem correspondncia deve ser enviada.
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RESUMO A finalidade deste estudo foi caracterizar os leos extrados das sementes de limo rosa. Foram determinados os ndices de iodo, teores de cidos graxos livres (AGL) e perxidos; anlises termoanalticas (TG, DTG,DSC), espectroscpicas (infravermelho e ultravioleta) e cromatogrficas (cromatografia gasosa). Os resultados mostraram que o leo apresenta caractersticas semelhantes a leos comestveis de boa qualidade.

ABSTRACT

CHARACTERIZATION OF RANGPUR LIME (Citrus limonia Osbeck) OIL SEEDS

The purpose of this study was to characterize the oil extracted from rangpur lime seeds. Were accomplished Iodine values, free fatty acid (FFA), peroxide values, thermal analysis (TG, DTG, DSC); infrared and ultraviolet spectroscopic as well gas chromatographic analysis. The results indicated that the oil shows characteristics analogous to the edible oils with good quality.

INTRODUO

O limo rosa um dos mais utilizados porta-enxerto no Brasil, participando na citricultura paulista em mais de 80% de dos pomares e mais de 90% nos viveiros. conhecido como limo cravo e limo-vinagre [2,3]. considerado um hbrido de Citrus aurantifolia e Citrus reticulata [3] e hoje encontrado na maior parte do pas como uma planta selvagem, amplamente utilizado na citricultura, como

tambm na produo de sucos e chs [4]. Basicamente, o leo das sementes de citros composto de triacilgliceris e em menores quantidades, de cidos graxos livres, hidrocarbonetos, esteris e matria no-gordurosa [6]. A finalidade deste estudo foi caracterizar o leo extrado do limo rosa por tcnicas cromatogrficas, espectroscpicas e termoanalticas.

MATERIAL E MTODOS

As sementes foram submetidas extrao de Soxhlet por 8 horas em hexano. O solvente foi rotoevaporado e um leo amarelado foi obtido, cuja estabilidade foi determinada por anlise trmica (TG, DTG, DSC). Foram determinados os ndices de iodo, teores de perxidos e de cidos graxos livres [% AGL]. O espectro de infravermelho foi obtido em espectrofotmetro Shimadzu modelo FTIR 8400, em pastilha de KBr (100 mg) e 5 l do leo. O espectro de ultravioleta (UV-VIS) foi obtido em espectrofotmetro Shimadzu modelo MultiSpec 1501 em soluo 2.10-4 M (cido olico) em isopropanol. Os steres metlicos dos cidos graxos foram obtidos segundo o mtodo de HARTMAN & LAGO [5] e as anlises cromatogrficas realizadas segundo o mtodo oficial da FIRESTONE [1] em Cromatgrafo gasoso CG-Master. Os cidos graxos foram identificados (como steres metlicos) por comparao dos tempos de reteno com padres.

RESULTADOS E DISCUSSO

Na Tabela apresentamos as anlises fsico-qumicas e o perfil cromatogrfico dos cidos graxos presentes no leo do limo rosa. A concentrao em cidos graxos insaturados - cido olico 21,2%; cido linolico 43,0% e cido linolnico [-

3] 7,60% - semelhante de leos vegetais de boa qualidade. Os baixos teores de acidez livre (menor que 1,0%) e perxidos (1,94 mEq.kg-1) atendem s exigncias legais para o leo refinado de boa qualidade. A anlise trmica mostrou que o leo apresenta estabilidade trmica at 250

C, temperatura maior que a usualmente

utilizada para fritura de alimentos [7]. A anlise no UV-VIS mostra absoro mxima em 225 nm, compatvel com o alto grau de insaturao do leo (71,80 %). A anlise de infravermelho mostrou absores das ligaes C-H do esqueleto hidrocarbnico em 2924, 2855 e 1458 cm-1; das ligaes C-OH das carboxilas livres em ligao de hidrognio em 3600 a 3200 cm-1 e deformaes em 1163 e 1099 cm-1 ; das ligaes H-C de olefinas em 3009 cm-1 e absoro da carboxila de ster em 1746 cm-1.

TABELA - Caractersticas fsico-qumicas e composio de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo extrado com hexano das sementes de limo rosa. Umidade das sementes frescas (%) Umidade das sementes secas (%) % AGL (em acido olico) ndice de iodo (g I2/100g) Teor de perxidos (mEq/kg) Lipdios totais (% peso seco) Grau de insaturao (%) a Smbolo cido graxo Ci M P S O Li L A C 8:0b caprlico mirstico C 14:0 palmtico C 16:0 esterico C 18:0 olico C 18:1 linolico C 18:2 linolncio C 18:3 araqudico C 20:0 Desconhecidos* 48,00 5,80 0,30 140,90 1,94 32,00 71,80 % 0,90 n.d. 21,40 2,60 21,20 43,00 7,60 0,20 3,10

Os cidos: C 6:0 caprico; C 7:0 enntico; C 9:0 pelargnico; C 10:0 cprico; C 11:0 undeclico; C 12:0 lurico; C 13:0 trideclico e C 22:0 behnico, esto ausentes nos leos estudados. b Em Cx.y, x = nmero de carbonos e y = nmero de duplas ligaes. n.d.= no detectado. * = no identificados e com tempos de reteno situados entre os dos cidos palmtico e esterico [C 18:0 < tr > C 16:0].

CONCLUSES

As

anlises

fsico-qumicas,

espectroscpicas,

termoanalticas

cromatogrficas indicaram que o leo de sementes de limo rosa apresenta altos teores de cidos graxos insaturados (71,3%) comparveis a leos vegetais de boa qualidade. Os teores significativos de cidos -3 (cido 4 linolnico, 7,60 %) o tornam benfico sade e adequado ao consumo humano, podendo ser uma fonte alternativa importante de alimento.

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CARACTERIZAO DO LEO DAS SEMENTES DE LIMO SICILIANO (Citrus limon), UM RESDUO AGROINDUSTRIAL
REDA , S. Y; LEAL , E.S; BATISTA , E. A. C; BARANA , A. C; SCHNITZEL , E; 4 CARNEIRO , P. I. B. 1 Mestrando do Curso de Ps-graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos 2 Universidade Estadual de Ponta Grossa UEPG - PR. Centro Federal de Educao 3 Tecnolgica - CEFET - Ponta Grossa PR. Departamento de Engenharia de Alimentos UEPG. 4 Departamento de Qumica UEPG - Av.: Gal. Carlos Cavalcanti, 4748 Campus Uvaranas Ponta Grossa - PR 84030-900. pibc@uepg.br, a quem correspondncia deve ser enviada.
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RESUMO A finalidade deste estudo foi caracterizar o leo extrado das sementes de limo siciliano. Foram determinados os ndices de iodo, teores de cidos graxos livres (AGL) e perxidos; anlises termoanalticas (TG, DTG, DSC), espectroscpicas (infravermelho e ultravioleta) e cromatogrficas (cromatografia gasosa). Os resultados mostraram que o leo apresenta caractersticas semelhantes a leos comestveis de boa qualidade.

ABSTRACT

CHARACTERIZATION OF THE SICILIAN LEMON (Citrus limon) OIL SEED, AN AGROINDUSTRIAL WASTE

The purpose of this study was to characterize the oil extracted from Sicilian lemon seeds. Were accomplished Iodine values, free fatty acid (FFA), peroxide values; thermal analysis (TG, DTG, DSC); infrared and ultraviolet spectroscopic as well gas chromatographic analysis. The results indicated that the oil shows characteristics analogous to the edible oils with good quality.

INTRODUO

Um dos citros mais importantes para indstria, depois da laranja, o limo siciliano que, originrio da China, adaptou-se muito bem ao Brasil [7]. Os citros, geralmente usados na produo de sucos e chs, tornaram-se uma fonte importante de matria-prima para o desenvolvimento de novos produtos alimentcios [2, 4, 5]. As sementes secas dos citros sem o tegumento podem produzir cerca de 50 a 55%

de leo. Tambm se pode extrair produtos de valor agregado da casca e das folhas de frutas ctricas como leos essenciais [1, 2, 4, 6, 7]. O leo das sementes de citros composto basicamente de triacilgliceris e em menor quantidade por cidos 2 graxos livres, hidrocarbonetos, esteris e matria no-gordurosa como limonina e naringina [7]. A finalidade deste estudo foi caracterizar o leo extrado das sementes de limo siciliano por tcnicas cromatogrficas, espectroscpicas e termoanalticas.

MATERIAL E MTODOS

As sementes secas foram submetidas extrao de Soxhlet por 8 horas em hexano. O solvente foi rotoevaporado e um leo amarelado foi obtido, cuja estabilidade foi determinada por anlise trmica (TG, DTG, DSC). Foram determinados os ndices de iodo, teores de perxidos e de cidos graxos livres [% AGL] O espectro de infravermelho foi obtido em espectrofotmetro Shimadzu modelo FTIR 8400, em pastilha de KBr (100 mg) e 5 l do leo. O espectro de ultravioleta (UV-VIS) foi obtido em espectrofotmetro Shimadzu modelo MultiSpec 1501 em soluo 2.10-4 M (cido olico) em isopropanol. Os steres metlicos dos cidos graxos foram obtidos segundo o mtodo de HARTMAN & LAGO [5] e as anlises cromatogrficas realizadas segundo o mtodo oficial da FIRESTONE [3] em Cromatgrafo gasoso CG-Master. Os cidos graxos foram identificados (como steres metlicos) por comparao dos tempos de reteno com padres.

RESULTADOS E DISCUSSO

Na Tabela apresentamos as anlises fsico-qumicas e o perfil cromatogrfico dos cidos graxos presentes no leo do limo siciliano. A concentrao de cidos graxos insaturados - cido olico 28,60%; cido linolico 34,40% e cido linolnico [-3] 10,00% - semelhante de leos vegetais de boa qualidade. Os baixos teores de acidez livre (menor que 1,0 %) e perxidos (1,90 mEq.kg-1) sugerem tratar-se de leo de boa qualidade.

TABELA - Caractersticas fsico-qumicas e composio de cidos graxos identificados como steres metlicos dos triacilgliceris do leo extrado com hexano das sementes de limo siciliano. Umidade das sementes frescas (%) Umidade das sementes secas (%) % AGL (em acido olico) ndice de iodo (g I2/100g) Teor de perxidos (mEq/kg) Lipdios totais (% peso seco) Grau de insaturao (%) a Smbolo cido graxo Ci M P S O Li L A C 8:0 caprlico mirstico C 14:0 palmtico C 16:0 esterico C 18:0 olico C 18:1 linolico C 18:2 linolncio C 18:3 araqudico C 20:0 Desconhecidos*
b

48,30 3,60 0,27 105,02 1,90 38,30 73,00 % 1,00 0,10 19,60 3,00 28,60 34,40 10,00 0,20 3,10

Os cidos: C 6:0 caprico; C 7:0 enntico; C 9:0 pelargnico; C 10:0 cprico; C 11:0 undeclico; C 12:0 lurico; C 13:0 trideclico e C 22:0 behnico, esto ausentes no leo estudado. b Em Cx.y, x = nmero de carbonos e y = nmero de duplas ligaes. * = no identificados e com tempos de reteno situados entre os dos cidos palmtico e esterico [C 18:0 < tr > C 16:0].

A anlise trmica mostrou que o leo apresenta estabilidade trmica at 250 C, temperatura maior que a usualmente utilizada para fritura de alimentos. Anlise

no UV-VIS mostrou absoro mxima em 225 nm, compatvel com o alto grau de insaturao do leo (73,0 %). Anlise de infravermelho mostrou absores das ligaes C-H do esqueleto hidrocarbnico em 2924, 2855 e 1458 cm-1; das ligaes C-OH das carboxilas livres em ligao de hidrognio em 3600 a 3200 cm-1 e deformaes em 1163 e 1099 cm-1 ; das ligaes H-C de olefinas em 3009 cm-1 e absoro da carboxila de ster em 1746 cm-1 .

CONCLUSES

Os altos teores de cidos graxos insaturados (73%), especialmente o alto teor de cido -3 (cido linolnico, 10%), tornam o leo benfico sade e adequado ao consumo humano. As anlises fsico-qumicas, espectroscpicas, termoanalticas e cromatogrficas do leo das sementes deste citro indicaram propriedades comparveis a leos vegetais de boa qualidade, podendo ser utilizados na indstria como fonte alternativa de alimentos.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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