IR(INFRAROJO)- BASADO EN PROTEINA DE CUANTIFICACION SUPERA LA CUANTIFICACION DEL ENSAYO COLORIMETRICO Y LOS RESULTADOS SON INDEPENDIENTES DE LOS DETERGENTES,

REDUCIENDO AGENTES Y ANALISIS DE TIEMPO. Resumen La cuantificacin de protenas exacta en mezclas complejas es crucial para obtener datos reproducibles biologicos y bioquimicos para ambas aplicaciones tanto hacia arriba como hacia abajo (agua) .Los ensayos de proteina colorimetrica son frecuentemente usados para determinar la concentracion de proteinas; sin embargo, la concentracion calculada puede variar dependiendo de la composicion de la muestra, secuencia de la proteina y el punto de tiempo dentro de la reaccin qumica en la que los datos se recogen. Los estudios que implican lisados de clulas y protenas mltiples y diversas (tales como la aclaracion de las vias del analisis multianalitico) requiere el desarrollo de un rapido metodo universal de cuantificacion de proteinas que es compatible con muestras complejas. Aqu comparamos el infrarojo basado en la cuantificacion de proteinas usando el detector directo sistema de cuantificacion de Bradford y ensayos colorimetricos de acido bicinconinico (BCA) y muestran que el IR(infrarojo) basado en la cuantificacion proporciona resultados que coinciden con las concentraciones determinadas por anlisis de aminocidos, incluso en presencia de detergente o agente reductor. Tambin se muestra que, a diferencia de los ensayos colorimtricos, la concentracion de proteina calculada obtenida del IR basado en el analisis es inalterado independientemente del tiempo de retardo entre el ensayo y la adquisicion de los datos. Introduccion Lo mas comun en los ensayos colorimetricos para cuantificacion de proteina implican proteina-quelacion de cobre (BCA y ensayos de lowry) y el tinte de unin basado en la deteccin (Bradford y los ensayos de "660"). Mientras esos ensayos son faciles de usar mayores desventajas incluye la gran variacion en la eficiencia de unin a las protenas diferentes, reproducibilidad y la sensibilidad a los contaminantes de muestras. Las Caractersticas intrnsecas de las protenas que pueden afectar a las estimaciones de concentracin en ensayos colorimtricos incluyen contenido de aminoacidos, modificaciones post-traduccionales y estructuras de proteinas secundarias y terciarias. En un estudio los ensayos colorimetricos dieron resultados hasta el 60% distinto de los valores derivados de anlisis de aminocidos.

Ensayos de Bradford y sus limitaciones El ensayo de Bradford depende se basa en la unin de Azul Brillante de Coomassie G250 a la protena. Este colorante se une a aminocidos bsicos, particularmente arginina, y su absorbancia se desplaza de 465 nm a ~ 595 nm tras la unin. Como resultado, la respuesta del ensayo depende del nmero de residuos de aminocidos bsicos en la protena. Porque los ensayos requieren la generacion de una curva estandar para cada experimento, la proporcion de aminoacidos basicos en los estandares de proteina debe ser similar a la de la protena que fue ensayada. Adems, puede haber una gran variacin en la respuesta de ensayo entre las diferentes preparaciones del reactivo de Bradford. Especficamente, se ha demostrado que el mximo de absorbancia del complejo protena colorante vara entre 595 nm y 620 nm, dependiendo de la fuente de colorante. Adems, la respuesta de ensayo se ve afectada por los detergentes (tales como los utilizados para solubilizar las protenas de membrana). Finalmente, el ensayo de Bradford es no lineal en el extremo superior del rango de concentracin de protenas recomendada.