INTRODUCCIN

Este es un protocolo de extraccin rpida para aislar el ADN del organismo de investigacin ms comnmente utilizado procaritico, Escherichia coli. El protocolo no slo es similar a los ampliamente utilizados en los laboratorios de investigacin, tambin es bastante robusta: temporizacin, la temperatura y volmenes tienen una amplia rango de tolerancia. Los diferentes pasos en el protocolo estn diseados para lograr la purificacin creciente del ADN, principalmente por liberndola de membrana, las protenas y ARN. Las variaciones en el protocolo (por ejemplo, dejando de lado algunos pasos, acortando los tiempos de incubacin, etc) dar ADN de menor pureza, pero este ADN es, sin embargo suficiente para muchas actividades en el aula. Las caractersticas del protocolo que lo hacen atractivo para uso en la clase son la disponibilidad y la seguridad de los reactivos y el hecho de que tiene una respuesta visual (uno realmente ve el ADN durante la etapa de precipitacin).

PROCEDIMIENTO 1. Resuspender un asa de colonias de una placa de agar en 500l de TE hasta conseguir una perfecta homogenizacin o cultivar un caldo LB una cepa de E.coli. 2. centrifuge el cultivo en una microcentrifuga (esto debe hacerse relativamente suave --- es decir, 12.000 RPM durante 5 min). 3. Resuspender el precipitado (s) en 200l de solucin salina-EDTA 4. Opcional: a la suspensin celular aadir 10ml de lisozima e incubar 30 min. A 37 C 5. A la suspensin aade: 10l de SDS al 3%, 100l de NaCl 5M, 50 l de proteinasa K. Se incuba a 60 C durante al menos una hora y un mximo de 24 horas

6. suavemente aadir 2 volmenes de etanol frio congelador con cuidado por el orillo del tubo de manera que forme una capa en la parte superior de la suspensin acuosa. Esperar y observar durante unos 5 min. En la interfase se forma un material blanco de aspecto fibroso que es el ADN. (Junto con otros grandes molculas contaminantes)

7. Cuidadosamente enrolle este precipitado en la varilla de vidrio. Poner el precipitado en el tubo de microcentrifuga. Se debe tener cuidado en este paso no perder el ADN, sino que puede llegar a ser algo transparente y difcil de ver. 8. Dejar el tubo abierto durante unos 5 min. Para dejar evaporar el alcohol (es decir, cuando a no se puede oler el alcohol). A continuacin, aadir con cuidado 100l TE buffer y dejar reposar a temperatura ambiente durante la noche o en el refrigerador por varios das para permitir que el ADN se resuspendio completamente. 9. A la suspensin, aadir RNasa e incubar a 37 C por 30 min.

10. Aadir un volumen igual de cloroformo isoamilico; mezcle suavemente las dos capas de forma continua, con la mano, durante 10 min. Centrifuga (alrededor de 4000RPM durante 2 min en una microcentrifuga, como alternativa, la reaccin de RNasa y etapa de extraccin se puede realizar en un tubo ms grande adecuado para su uso en una centrifuga de mesa).

11. Retire con cuidado la parte superior fase no acuosa, RESULTADOS junto con el material esponjoso de color blanco de la interfaz (se trata principalmente de protena desnaturalizada)

12. El paso de extraccin con alcohol cloroformoisoamilico puede realizarse 2-3 veces ms, si lo desea, hasta que la interfaz ya no es blanco. 13. Repita el paso precipitacin con etanol, como se indica ms arriba, en la fase acuosa final, incluyendo la resuspencion del ADN en buffer TE

PROCEDIMIENTO 2

RESULTADOS Los resultados de esta prctica fueron evidenciados al hacer la lectura en la lmpara UV. En el poso nmero 1 se realiz siembra de un marcador al igual que el nmero 16, los cuales deberan tener mejor desplazamiento en el corrido electrofortico; pero el primer poso no se logra observar el desplazamiento, y en el 16 si se ve la perfecta siembra y corrido que se obtuvo. En los posos nmero 2 y 3 se ve muy leve el corrido que se pudo obtener, ya sea por mala siembra o por no haber realizado correctamente los procedimientos al preparar la prctica. En los posos nmero 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14 y 15 no se determina presencia de ADN, porque no se logra ver el corrido de las bandas en la lmpara UV En los posos nmero 10 y 11 se puede ver el ADN por el corrido electrofortico que se realiz de la mejor forma, una buena tcnica de siembra y un buen procedimiento al alistar los materiales y manejo de reactivos. En el poso nmero 9 podemos observar que se realiz una buena tcnica pero a la hora de la siembra se puyo el agar y por esto se ve diferente el corrido de bandas.

CONCLUSIONES

Se logro la extraccin y purificacin de ADN, obteniendo la extraccin y purificacin. Se llevo a cabo mediante la tcnica de electroforesis, realizamos el corrido electrofortico de cidos nucleicos (muestra) El ADN genmico, d e a l t a c a l i d a d , p u r i f i c a d o s e p u e d e u t i l i z a r p a r a a p l i c a c i o n e s c o n PCR , digestin con enzimas de restriccin Se evidencio el ADN electroforesis. de la muestra, gracias el desplazamiento que se mostr en la

Se aprendi a realizar una prctica de electroforesis en gel de agarosa para hacer el corrido de bandas, y todo su procedimiento incluido reactivos y tiempos que necesita esta tcnica Aprendimos que dicha rotura celular se lleva a cabo en presencia de conservantes, que garantizan la integridad del DNA; esto es, que impiden o limitan la accin de las DNAsas presentes en las clulas o contaminantes del medio y nos ayudan a realizar el aislamiento de una forma efectiva sin ninguna limitacin. Aprendimos que para realizar el aislamiento de la E.coli debemos hacer la rotura de clulas, desnaturalizacin de restos celulares y separacin de RNA por ribonucleasa seguida de una precipitacin selectiva DNA, para obtener resultados efectivos del aislamiento.

CONSULTA

1. Qu haria ud para demostrar que el material precipitado es realmente ADN? como cuantificar la cantidad? R/: Realizaria pruebas donde me muestren que lo que fue aislado se encuentra la informacin gentica de este microorganismo como la prueba cualitativa condifelamina en donde se comparara con muestras patrn de ARN y ARN y para cuantificar realizara una curva de calibracin que es utilizada para determinar la concentracin de ADN en una muestra, puesto que dicha concentracin se infiere segn el valor de Ct encontrado o se puede hacer diluciones tambin de la muestra obtenida o se calculara la concentracin del ADN bacteriano extrado mediante el uso de la espectrofotometra

2. Cules son los principales contaminantes en la extraccin de ADN como se mide su concentracin R/: Precipitante protenas - este proceso separa los cidos nucleicos a partir de protenas, que es uno de los principales contaminantes en la extraccin de ADN Lisis de la clula - reventar la apertura de la clula o bacteria para liberar el contenido de celdas en el seno del medio 3. El SDS es un detergente inico que lisar mayora de las clulas y desnaturalizar algunas protenas

4. Qu hace la lisozima en este protocolo? Dnde se producen de forma natural? Cul es su funcin? R/: La lisozima, tambin llamada muramidasa, es una enzima de 14,4 kilodalton que daa las clulas bacterianas catalizando la hidrlisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de cido Nacetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano. La lisozima es abundante en numerosas secreciones como la saliva, las lgrimas y el moco. Est presente tambin en los grnulos citoplasmticos de los neutrfilos polimorfonucleares PMN. Una gran cantidad de esta enzima puede hallarse en las claras de huevo. La lisozima es una enzima presente en las lgrimas y la saliva en donde acta como una barrera frente a las infecciones. Tambin es muy abundante en la clara del huevo, de donde se extrae para su uso industrial, en particular para el control de las bacterias lcticas en los vinos. La lisozima fue descubierta por Fleming, el mismo que descubri la penicilina. Adems de encontrarse en la saliva y en las lgrimas, la lisozima est presente en el bazo, los pulmones, los leucocitos, el plasma, la leche y el cartlago. La deficiencia en lisozima, debida a mutaciones en el gen LYZ situado en el cromosoma 12, ha sido asociada a displasias esquelticas y a un aumento de la propensin a las infecciones.