LES LEVURES

UE levures

-5 avril: gnralits (MN Simon) -6 avril: analyse gntique (MN Simon) -6 avril: Cycle cellulaire I: la rplication (E. bailly) -7 avril: Cycle cellulaire II: la mitose (E. Bailly) -8 avril: les analyses systmatiques (MN Simon) -25 avril: Cycle cellulaire III: rgulation par protolyse (E. Bailly) -26 Avril: TD I (R Eluere) -27 avril: la transmission des signaux (MN Simon) -28 avril: TD II (R. Eluere) -29 avril: les mcanismes de contrle (E. Bailly) -29 avril: sminaire recherche (Y. Corda) -2 mai: sminaire recherche (MN Simon) -3 mai: sminaire recherche (E. Bailly)

I. La levure Saccharomyces cerevisiae: mode de vie

Les levures vivent sur les fruits, les fleurs et autres sources contenant des sucres. Les levures survivent un large spectre de type environementaux:
Gamme de tolrance de temprature: de 0 55C

Temprature de prolifration: de 12 40C Tolrance au pH: croissance possible de pH 2.8-8. Tolrance presque complte vis vis de la dssication (levures sches) Tolrance vis vis de la pression osmotique: les levures peuvent pousser et fermenter jusqu des concentrations en sucre de lordre de 3M. Tolrance alcoolique: jusqu 20% dalcool.

La levure Saccharomyces cerevisiae: utilisations

- Saccharomyces cerevisiae est la principale levure pour la production vinicole (forte capacit de fermentation, tolrance au faible pH et aux hauts niveaux dalcool) - Saccharomyces cerevisiae est la levure de bire (fermente en prsence doxygne) - Saccharomyces cerevisiae est la levure de boulanger (production rapide de dioxide de carbone partir de sucres) - Outil biotechnologique pour le production de protines dintret commercial - Outil de criblage de nouveaux mdicaments - Cest un des principaux modles cellulaires eucaryotes en recherche fondamentale du fait de la performance des outils gntiques et de biologie molculaire et cellulaire qui y ont t dvelopps.

Les autres levures dintret

Schizosaccharomyces pombe: autre levure modle en biologie molculaire et cellulaire

Kluyveromyces lactis: la levure du lait est utilis comme modle pour des applications biotechnologiques Candida albicans: tudie en tant que pathogne de lhomme. Saccharomyces carlsbergensis and Saccharomyces bayanus sont proches de S. cerevisiae. spces dintret vinicole. Pichia stipidis, Hansenula polymorpha, Yarrovia lipolytica sont normment utiliss pour la production de protines htrologues. Champignons filamenteux constituent un large groupe de modles gntiques (Cryptococcus, Aspergillus, Neurospora....). Ce groupe inclus certains pathognes de lhomme.

Saccharomyces cerevisiae

-S. cerevisiae se divise par bourgeonnement. taille 4-7 mm Le bourgeonnement rsulte dans la formation de deux cellules de taille ingale. -Le cycle de vie nest pas indfini. Les cellules mres vieillissent puis meurent (la dure de vie moyenne est de 30 40 divisions) -Les cellules ont une structure de type eucaryote avec: une paroi de glucan, mannan, protines un espace priplasmique une membrane en bicouche lipidique un noyau avec un nuclole des vacuoles un appareil de scrtion (RE, golgi, vsicules de scrtion) des mitochondries....

Matriel gntique de S. cerevisiae

Le gnome de S. cerevisiae contient 16 chromosomes + de lADN mitochondrial et un plasmide (2m). Les chromosomes contiennent des centromres et des tlomres, plus simples que ceux des eucaryotes suprieurs. Le gnome de S. cerevisiae a t le premier gnome eucaryote squenc dans sa totalit (1996).

Le gnome de S. cerevisiae contient environ 6,200 genes. A peu prs 1/3 des gnes ont t caracteriss par des analyses gntiques, 1/3 prsentent des homologies permettant la dtermination de leur fonction et 1/3 ne sont homologues aucun gne connu.

II. NOMENCLATURE
Le nom des gnes de levure contient 3 lettres et jusqu 3 chiffres:GPD1, HSP12, PDC6...Ces 3 lettres ont souvent une signification, lie la fonction du gne Le gne sauvage est crit en majuscule et en italique: TPS1, RHO1, CDC28... Les gnes portant une mutation rcessive sont crits en minuscule et en italique: tps1, rho1, cdc28 Les allles mutants sont rprsents par un tiret et un nombre : tps1-1, rho1-23, cdc28-2 Le produit dun gne est crit avec une lettre majuscule suivie de deux minuscules. sans italique. un p est souvent ajout la fin. Tps1p, Rho1p, Cdc28p Beaucoup de gnes ont t identifis lors du squenage du gnome et restent sans fonction connue. Ils sont nomms YDR518C, YML016W..., avec: Y pour yeast La deuxime lettre dsigne le chromosome (D=IV, M=XIII....) L ou R dsigne le bras droit (Right) ou gauche (Left) du chromosome. Les trois chiffres correspondent au n de lORF compt partir du centromre. C or-C et W disent sur lORF est transcrite sur le brin Crick or Watson Comme pour toute rgle, il existe quelques exceptions: HO, MAT...

III. Cycle de vie des levures

Budding Yeast

Fission Yeast

IV. Le bourgeonnement

Bourgeonnement axial
(cellules haplodes)

Bourgeonnement bipolaire
(cellules diplodes)

Le bourgeonnement correspond une polarisation de la croissance cellulaire et un partage des organelles entre les deux compartiments cellulaires (la cellule mre et le bourgeon). Cette polarisation est lie une rorganisation du cytosquelette dactine.

Myo2 cbles d actine

vacuole noyau
ASH1 mRNA

CAP

mitochondries

Rseau de septines

myo4

La mise en place du bourgeon est sous la dpendance dune petite G protine de la famille des RHO: Cdc42.

cdc42-1

Cdc42 fluctue entre deux formes: lie au GDP (inactif) ou lie au GTP (actif). Cdc42 est activ par un Guanosine Exchange Factor, Cdc24 et inactiv par des GTPase Activating Protein, Rga1-Bem3 et Bem2.

Cdc24

Cdc42

GDP

Cdc42
GAP:
Rga1, Bem3, Bem2

GTP

Le complexe de polarisation est recrut la membrane via linteraction entre Cdc24 et le marqueur de site Rsr1. Rsr1 est aussi un activateur de Cdc24. Le complexe de polarisation est stabilis au site de croissance par deux mcanismes: le recrutement de la protine Bem1 par la forme Cdc42-GTP et la stabilisation de la forme Cdc24 active par une interaction Cdc24/Bem1.
Rsr1 Bem1

Cdc24
Cdc24

Cdc42

GDP

Cdc42
GAP:
Rga1, Bem3, Bem2

GTP

Cdc42-GTP active un certain nombre deffecteurs

Cla4, Ste20

PAK:

Bni1

Gic1,2

exocyst

organisation de lactine

nuclation de lactine

Stabilisation du complexe

fusion des vsicules de scrtion

Mise en place du site de pr-bourgeonnement et croissance du bourgeon

Membrane plasmique

Marqueurs spcifiques de site

Marqueurs Gnraux Rsr1

Cdc24 Cdc42 Bem1

Bem3 Polarisome Rga1 0 te2 /S la4 C

Rsr1: petite G protine (famille des Ras) Cdc42: p21 GTPase (famille des Rho) Cdc24: Guanosine exchange factor de Cdc42 Rga1,Bem3: GTPase activating protein Ste20/Cla4: PAK ( p21 Activated protein Kinases) Polarisome: Bni1, Spa2, Bud6, Pea2 septines

Le mme type de polarisation se met en place lors de la conjugaison

shmooing

bourgeonnement

Les cellules de type sexuel oppos peuvent conjuguer

prolifration des haplodes arrt du cycle et shmooing zygote: fusion cellulaire et nuclaire bourgeonnement du zygote

sporulation

Les cellules prsentent donc un certain niveau de spcialisation: pour la conjugaison (cellules haplodes) ou pour la miose et la sporulation (cellules diplodes)

V. La conjugaison
Les cellules haplodes mettent des phromones (facteurs a ou a) dtectes par les cellules de type sexuel oppos grce des rcepteurs spcifiques. Les phromones induisent un arrt du cycle cellulaire et des transcriptions spcifiques La fusion cellulaire et nuclaire des deux cellules haplodes aboutit la formation dune cellule diplode

Yeast sexual cycle

fusion nuclaire

fusion cellulaire

Attachement des cellules

VI. DETERMINATION DU TYPE SEXUEL Les diffrences entre les types cellulaires sont dtermines par le locus MAT (mating-type locus) MAT est situ au milieu du chromosome III. les cellules exprimant lallle MATa ont un phnotype a les cellules exprimant lallle MATa ont un phnotype a les cellules exprimant les deux allles ont un phnotype diplode. Les deux allles codent pour des protines qui rgulent lexpression de sets de gnes spcialiss. Les produits du locus MAT sont au sommet dune cascade qui spcifie la diffrenciation des cellules.

Le locus MAT Le locus MAT peut coder pour trois protines rgulatrices: - a1 est code par lallle MATa - a1 et a2 sont codes par lallle MATa

Donnes gntiques sur les cellules haplodes

. Les mutations dans a1 empchent lexpression des gnes a spcifiques: le facteur a1 est un rgulateur positif des gnes a spcifiques . Les mutations dans a2 entranent lexpression des gnes a spcifiques dans les cellules a : le facteur a2 est un rgulateur ngatif des gnes a spcifiques . Les mutations dans a1 sont sans effet sur les cellules haplodes de type a: les gnes de type a sont donc exprims du fait de labsence du rgulateur ngatif a2

cellules haplodes de type a

gnes a

gnes a
gnes haplodes spcifiques

Les facteurs Mata1p et Mata2p sont produits Mata1p active les gnes spcifiques du type a. Mata2p rprime les gnes spcifiques du type a. Les gnes spcifiques des cellules haplodes sont exprims.

cellules haplodes de type a

Le facteur Mata1p est produit les gnes spcifiques du type a et les gnes spcifiques des cellules haplodes sont exprims du fait de labsence de a2 les gnes spcifiques du type a ne sont pas induits du fait de labsence de a1

cellules diplodes a/a

- Les deux locus sont prsents dans la cellule - le facteur a2p rprime lexpression des gnes a-specific - les protines a1 et a2 forme un nouveau facteur qui rprime lexpression des gnes haplodes-spcifiques et lexpression du gne a1 - les gnes a-specific ne sont pas exprims du fait de labsence de a1

Mcm1, un co-facteur important

MCM1 est ncessaire au contrle de lexpression du locus MAT. MCM1 est exprim dans tous les types cellulaires. La protine Mcm1 se lie aux sites rgulateurs des gnes a et a-spcifiques et est un rgulateur positif des deux types de gnes. Mcm1 peut se lier aux squences rgulatrices a mais doit former un dimre avec a1pour se lier aux squences rgulatrices des gnes a spcifiques.

cellules haplodes de type a

Mcm1 induit lexpression des gnes a-spcifiques et haplodes spcifiques

cellules haplodes de type a

Les facteurs Mata1p et Mata2p sont produits Mata1p + Mcm1p activent les gnes a-spcifiques Mata2p + Mcm1p rpriment les gnes a-spcifiques Mcm1p induit lexpression des gnes haplode-spcifiques

cellules diploides a/a

Mata2 + Mcm1 repriment les gnes a-spcifiques Mata1 + Mata2 repriment les gnes haploide-specifiques et MATa1 Mata1 nest pas prsent pour activater les gnes aspecifiques

VII.Changement de type sexuel

Les souches de laboratoire sont stables sous forme haplode (a ou a). Dans la nature, S. cerevisiae nexiste que de faon transitoire sous forme haplode. Une souche naturelle amene au laboratoire peut tre induite sporuler (carence en azote). Les spores isols vont donner naissance une population de cellules haplodes. Cependant, on observera rapidement lapparition spontane de cellules diplodes La diffrence entre les souches naturelles et de laboratoire tient une mutation dans un seul gne: HO (pour homothallisme).

Changement de type sexuel

Le changement de type sexuel est li un rarrangement chromosomique programm. Au cours de ce processus, une cellule haplode va se diviser puis la cellule mre va changer de type sexuel. Deux cellules de type sexuel oppos sont donc gnres.

Le cycle de division cellulaire des haplodes donne donc naissance deux cellules capables de conjuguer.

Changement de type sexuel

Les analyses gntiques ont identifi trois zones sur le chromosome III: - Le locus MAT localis au centre du chromosome. - Les locus HML et HMR (pour hidden MAT Right and Left). HML (left arm) contient une copie silencieuse de MATa . HMR (right arm) contient une copie silencieuse de MATa.

Conversion gnique au locus MAT

Au cours du changement de type sexuel, linformation au locus MAT est remplace par linformation des locus HMR ou HML. Lchange dinformations entre les locus MAT et HM nest pas rciproque. Cet change dinformation correpond une conversion gnique et est initi par une endonuclase spcifique dun site proche du locus MAT . Cette endonuclase est le produit du gne HO.

le type sexuel (mating type) est dtermin par lallle (a or a) port par le locus MAT. Lallle mating type specific (a or a) est introduit au locus MAT par recombinaison. Une copie silencieuse (non transcrite) de chaque allle est stocke au niveau de HMLa et HMRa

Transcriptional silencing
Comment les locus HMLa et HMRa sont ils maintenus transcriptionellement silencieux?

La structure de la chromatine autour de HMLa et HMRa est condense (heterochromatine) Les histones sont dacetyles lensemble bloque laccs la machinerie de transcription.

Silent Information Regulator (SIR) proteins Active both at HML and HMR and telomeres Origin Recognition Complex (ORC) Has several roles in initiating DNA replication and coordinating replication and transcription Origins are active on plasmids but not on the chromosome Transcription Factors Rap1p and Abf1p

SPCIFICIT MATERNELLE DU CHANGEMENT DE TYPE SEXUEL

-Lendonuclase HO nest produite que dans la cellule mre -lexpression du gne HO est rprim dans la cellule fille par le rpresseur transcriptionnel Ash1 -lARNm codant pour Ash1 est spcifiquement transport dans le bourgeon pendant lanaphase

Darzacq et al.Curr.Opin. Microbiol. 2003

LARNm de ASH1 contient 4 zipcodes reconnus par une RNA-binding protein She2. She2 sassocie via She3 She1/Myo4, une protine myosinlike qui fournit la force motrice pour le transport le long des fibres dactine.

Pourquoi les cellules diplodes sporulent-elles?

-Dans la nature, les levures prolifrent sous forme diplode (plus rsistante), alors pourquoi le sporulation? - les spores sont une forme de rsistance aux conditions extrmes - la sporulation est un moyen de protger le gnome contre laccumulation de mutations. - la miose est un moyen de crer de nouvelles combinaisons dallles ventuellement avantageuses -Pourquoi le changement de type sexuel chaque gnration:

- Si une seule spore de la ttrade survie, il peut y avoir

conjugaison entre la cellule mre et la cellule fille aprs la premire division.