Espectrometría Masas

Espectrometra de Masas
Instituto de Biotecnologa
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
MAESTRA
EN
CIENCIAS
BIOQUMICAS
CURSO DE MTODOS
ESPECTROMETRA DE MASAS
PRESENTA: GERMN PLASCENCIA VILLA
JUNIO DE 2003 CUERNAVACA, MORELOS

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INDICE
INDICE INTRODUCCIN HISTORIA DE LA ESPECTROMETRIA DE MASAS EL ESPECTRMETRO DE MASAS ENTRADA DE LA MUESTRA MTODOS DE IONIZACIN Impacto Electrnico (Electron Impact EI) Ionizacin Qumica (Chemical Ionization CI) Ionizacin de Campo (Field Ionization FI) Desorcin de Campo (Field Desorption FD) Bombardeo con tomos Rpidos (Fast Atom Bombardment FAB) Ionizacin por Electrospray (Electrospray Ionization ESI) Matrix-Assited Laser Desorption/Ionization (MALDI) ANALIZADORES DE MASAS Efecto de campos magnticos sobre los iones Principios de los analizadores de masas Espectrmetro de masas de sector magntico (Magnetic Sector Mass Spectrometer) Espectrmetros de masas de cuadrupolo (quadrupole) Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight TOF) Analizadores de trampa de iones (Ion-Trap) Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) DETECTORES DE IONES Copa Faraday Multiplicador de Electrones (Electron Multiplier) Detector Daly Detector de Microcanales ADQUISICIN Y PROCESAMIENTO DE DATOS Procesamiento de Datos APLICACIONES Anlisis de estructura y masa Sistemas acoplados Anlisis cuantitativos Anlisis de pptidos Iones de pptidos Secuenciacin de pptidos Identificacin de protenas HERRAMIENTAS PARA ANLISIS DE PROTENAS POR ESPECTROMETRA DE MASAS DEFINICIN DE TRMINOS REFERENCIAS 2 3 4 6 8 9 9 10 11 11 13 14 16 19 19 19 20 21 22 24 25 27 27 27 28 29 30 31 32 32 33 34 35 36 36 37 38 39 40
INTRODUCCIN
La Espectrometra de Masas es una poderosa tcnica microanaltica usada para identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades qumicas de molculas. La deteccin de compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeas (algunos pmoles) de muestra y obtener informacin caracterstica como el peso y algunas veces la estructura del analito. En todos los casos, alguna forma de energa es transferida a las molculas a analizar para afectar la ionizacin. En la tcnica clsica de impacto electrnico (electron ionization EI), algunas de las molculas ionizadas del analito explotan en una variedad de fragmentos ionizados, el patrn de fragmentacin resultante as como los iones residuales constituyen el espectro de masas. En principio, el espectro de masas de cada compuesto es nico y puede ser usado como se huella qumica para caracterizar el analito. El proceso de anlisis por espectrometra de masas comienza en llevar el compuesto a analizar a fase gaseosa, -2 la muestra debe tener una presin de vapor de que 10 mmHg, debido a que las molculas deben migrar por difusin desde el sistema de entrada hacia la cmara de ionizacin. Las muestras pueden ser introducidas al espectrmetro de masas usando una sonda directa o por entrada en lote (batch) para slidos puros o lquidos voltiles. Analitos purificados por diferentes tcnicas de separacin (cromatografa de gases, cromatografa de lquidos, electroforesis capilar, etc.) pueden entrar al espectrmetro de masas tan pronto como vayan saliendo. Ya que las molculas neutras difunden en forma aleatoria por la fuente de ionizacin, solo una porcin es ionizada. El proceso de ionizacin ms comn en anlisis en fase gaseosa es el de ionizacin electrnica (EI), en el cual se transfiere energa a la molcula neutra en estado de vapor, dndole suficiente energa para expulsar uno de sus electrones y de ese modo tener una carga residual positiva. Este proceso produce un ion con carga positiva y un electrn suelto. La molcula ionizada puede tener energa excesiva que puede ser disipada a travs de la fragmentacin de ciertos enlaces qumicos. El rompimiento de varios enlaces qumicos permite la produccin de fragmentos de ion cuya masa es igual a la suma de las masas atmicas de un grupo de tomos que retienen la carga positiva durante el proceso de fragmentacin. Para compuestos no voltiles, iones de la molcula intacta son producidos al pasar la solucin por un campo elctrico (electrospray ionization) o por bombardeo de partculas (fast atom bombardment) o por interaccin con especies fotoexcitadas (matrix-assisted laser desorption). Despus de producir los iones, el siguiente paso es su anlisis en el analizador de iones de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z). Los iones tienen una carga elctrica que les permite ser controlados por campos elctricos; son separados por su valor m/z en el analizador de masas. Existen diferentes tipos de analizadores de masas: magnticos, de cuadrupolo, trampa de iones cuadrupolo, trampa de iones magntica, o tiempo de vuelo (time-of-flight). Los iones son analizados de acuerdo a su abundancia a lo largo de la escala m/z. Durante el proceso de adquisicin de datos provenientes del detector, los datos pueden ser organizados en forma tabular o en formato de grfica de barras para dar finalmente el espectro de masas de la muestra analizada.
HISTORIA DE LA ESPECTROMETRA DE MASAS

La espectrometra de masas tiene su origen en los experimentos desarrollados en el Cavendish Laboratory de la Universidad de Cambridge en Inglaterra en 1897 por Joseph John Thomson, l descubri que descargas elctricas en gases producan iones y que estos rayos de iones podan adoptar diferentes trayectorias parablicas de acuerdo a su masa cuando pasaban a travs de campos electromagnticos. Thomson realiz la construccin del primer espectrmetro de masas, llamado parbola espectrogrfica (Figura 1), para la determinacin de la relacin masa/carga de iones.
Figura 1. Parbola espectrogrfica construida por J.J. Thomson
Uno de los estudiantes de Thomson, Francis William Aston fue quien diseo varios espectrmetros de masas en los cuales los iones eran dispersados por sus masas y enfocados de acuerdo a su velocidad. Esto permiti mejorar el poder de resolucin de masas y el posterior descubrimiento de istopos de diferentes elementos que estn presentes en la naturaleza. Thomson recibi el Premio Nobel de Fsica en 1906 y Aston el Premio Nobel de Qumica en 1922. En la dcada de los 20s, Arthur J. Dempster de la Universidad de Chicago, desarroll un analizador magntico que enfocaba iones formados por impacto electrnico (electron impact) sobre un colector elctrico. Este diseo fue adaptado por Josef Mattauch, Richard Herzog, Kenneth Bainbridge, Alfred Nier y otros, permitiendo importantes descubrimientos en fsica atmica y nuclear en los 30s. Pero fue hasta la dcada de los 40s que los primeros espectrmetros de masas comerciales aparecieron. Durante los 30s y 40s, Nier y algunos otros incorporaron las tecnologas de vaco y electrnica para mejorar el desempeo de los primeros diseos de espectrmetros. Instrumentos de doble enfoque, que combinan analizadores magnticos y electrostticos fueron introducidos permitiendo incrementar la precisin. Estos instrumentos fueron originalmente desarrollados con el propsito de determinar en forma precisa los pesos atmicos de los elementos y sus istopos. En la dcada de los 40s se construyeron los primeros espectrmetros de masas disponibles comercialmente por medio de diferentes compaas de Europa y Estados Unidos. En esta dcada tambin se desarroll el espectrmetro de masas de tiempo de vuelo (time-of-flight, TOF), un concepto propuesto como un analizador mas barato y simple en el cual los iones son separados en base a sus diferencias en velocidad cuando son acelerados en un tubo de vuelo lineal. A principios de los 50s, los patrones de fragmentacin de los iones comenzaron a ser entendidos, aunque los aparatos disponibles estaban limitados en el rango de masas. Otro tipo de instrumento desarrollado para el propsito de acoplar el espectrmetro de masas a un cromatgrafo de gases fue el filtro de masas cuadrupolo, el cual usa un campo elctrico cuadrupolar conteniendo componentes de radiofrecuencia y corriente directa para separar iones. En 1953 el analizador de masas cuadrupolo fue patentado. Este analizador fue reportado por Wolfgang Paul de la Universidad de Bonn, quien despus gan el Premio Nobel de Fsica en 1989 por su trabajo de trampa de iones (ion trapping). En 1956 las primeras muestras biolgicas (esteroides) fueron exitosamente analizadas. En los 60s la espectrometra de masas se estableci como una tcnica para caracterizar compuestos orgnicos. Este fue asistido con la introduccin de una fuente de ionizacin qumica. Otros mtodos de ionizacin surgieron incluyendo desorcin de campo, ionizacin secundaria (secondary ionization MS o SIMS), desorcin de plasma y desorcin lser. Aparecieron las primeras publicaciones cientficas especializadas incluyendo Organic Mass Spectrometry. La espectrometra de masas en tndem (MS/MS) surgi con el desarrollo de procedimientos de disociacin por induccin de colisin, permitiendo obtener informacin estructural de componente de una mezcla usando dos etapas de anlisis de masas. 4
Espectrometra de Masas En 1974 se desarrollo la espectrometra de masas Fourier ICR (FT-ICR MS). Una importante ventaja de este sistema es que permite detectar simultneamente varios iones y estos espectrmetros de masas tambin logran tener muy alta resolucin de masas. En los 80s se desarrollaron las tcnicas de ionizacin capaces de ionizar eficientemente molculas biolgicas. Michael Barber en Manchester desarrollo la tcnica FAB (Fast Atom Bombardment) la cual utiliza una fuente de tomos pesados neutrales para ionizar compuestos de una superficie de una matriz lquida. John Fenn de la Universidad Yale refin la fuente de iones originalmente reportada por Malcolm Dole de la Universidad Northwertern casi dos dcadas antes de la tcnica de ionizacin de electrospray (ESI). Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) fue tambin desarrollada en los 80s por Franz Hillenkamp y Michael Karas. En esta tcnica, las molculas son desorbidas por un lser de una superficie slida o lquida conteniendo una matriz de compuesto orgnico. Las tcnicas ESI y MALDI han permitido la introduccin de molculas biolgicas de ms de 1 milln de Daltons en los espectrmetros de masas como iones estables en fase gaseosa. Actualmente, los espectrmetros de masas son utilizados para el estudio de un amplio rango de sustancias y materiales con alta precisin y sensibilidad. Los campos de aplicacin son desde estudios astronmicos del sistema solar, geofsica y geoqumica, hasta anlisis qumicos y en forma fundamental en investigaciones de qumica, toxicologa, ciencias ambientales, y en forma creciente en ciencias biolgicas y biomdicas.
EL ESPECTRMETRO DE MASAS
Un Espectrmetro de Masas es un instrumento que mide las masas de molculas individuales que han sido convertidas en iones. Un espectrmetro de masas no mide la masa molecular directamente, pero mide la relacin masa/carga de los iones formados de las molculas. Los espectrmetros de masas tienen siete componentes mayores: un sistema de entrada, una fuente de iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vaco, un sistema de control y un sistema de datos. El sistema de entrada, junto con la fuente de iones y el tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrmetro y las capacidades del sistema.
Figura 2. Componentes bsicos de un espectrmetro de masas
Los instrumentos usados estn compuestos de una combinacin de sistemas de entrada, fuentes de iones, y analizadores de masas (Tabla 1). Tabla 1. Variantes de componentes del sistema de espectrometra de masas COMPONENTE VARIANTES Sistema de entrada 1. Directo. 2. Columna capilar cromatografa lquida. Fuente de iones 1. Impacto electrnico. 2. Ionizacin Qumica. 3. Ionizacin de campo. 4. Desercin de campo. 5. Bombardeo con tomos Rpidos. 6. Electrospray, incluyendo nanospray y microspray. 7. Matrix-assisted laser desorption (MALDI) Analizador de masas 1. Cuadrupolo. 2. Trampa de iones (Ion-trap). 3. Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF). 4. Analizador FT-ICR Los procesos bsicos asociados con la espectrometra de masas abarcan desde la generacin de iones en fase gaseosa de un analito, y la medicin de las relaciones masa/carga (m/z) de estos iones. La formacin de iones de la muestra en fase gaseosa es un prerequisito esencial en el proceso del espectrmetro de masas en el proceso de verificacin de masas moleculares o anlisis. Aunque los primeros espectrmetros de masas requeran que la muestra estuviera en forma gaseosa, nuevos desarrollos han permitido incluir muestras en soluciones lquidas o en una matriz slida. Dependiendo del tipo de entrada y tcnica de ionizacin usada, la muestra puede ya estar en forma de iones en solucin, o puede ser ionizada en conjunto con su volatilizacin por otros mtodos en la fuente de iones. El estudiar el analito como un ion en fase gaseosa le dan dos caractersticas fundamentales. La primera caracterstica fundamental es que el movimiento de los iones en fase gaseosa puede ser controlado en forma precisa en campos electromagnticos que contienen los iones a estudiar y pueden ser manipulados para probar el movimiento del ion en el campo. Debido a que el movimiento de los iones es proporcional a la relacin m/z del ion, esto justifica la medicin de la m/z y por lo tanto la masa del analito. Los detalles concernientes a diferentes tipos de tcnicas de anlisis de masas y tcnicas de ionizacin utilizadas determinan factores tales que la precisin y exactitud de la medicin de m/z, la resolucin, y el rango de m/z del analizador. La segunda 6
Espectrometra de Masas caracterstica fundamental es que el uso de iones en fase gaseosa incrementa la sensibilidad del espectrmetro de masas. El movimiento preciso de iones en campos electromagnticos que permiten medir m/z tambin les provee contencin y enfoque. Durante el proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los detectores de partculas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con gran sensibilidad debido a una combinacin de seales de bajo fondo y la eficiente generacin de electrones secundarios que pueden 5 subsecuentemente ser multiplicados por factores de 10 o mayores. El mantenimiento de la precisin y exactitud de estos movimientos y por lo tanto de la sensibilidad del anlisis requiere operacin experta del sistema de espectrometra de masas. Algunas desventajas del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de generacin de los iones y colocarlos en la fase gaseosa, adems de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo de experimentos. El desarrollo de la ionizacin por electrospray y MALDI han aportado dos importantes mtodos para la produccin de iones de pptidos y protenas en fase gaseosa. Otra consecuencia de la complejidad de los instrumentos es el alto precio de tales instrumentos en trminos su adquisicin y costos de mantenimiento. Sin embargo, en general y considerando la sofisticacin, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados, se puede justificar que el costo de la espectrometra de masas es proporcional con los costos asociados con otros componentes en los proyectos de investigacin que requieren este tipo de anlisis.
ENTRADA DE LA MUESTRA
Para slidos razonablemente puros, la muestra es colocada sobre la punta de una barra que es introducida dentro del espectrmetro a travs de un sistema de vaco. La muestra es entonces evaporada o sublimada en una fase gaseosa, usualmente por medio de calor. Gases y lquidos pueden ser introducidos a travs de sistemas de entrada diseados especialmente con un control de flujo, llamados sondas directas (direct probes), estos dispositivos transfieren la muestra desde el exterior a travs de un sistema de vaco hacia la fuente de ionizacin que esta a alta presin (Figura 3). Estas sondas pueden ser diseadas para soportar muestras para ser ionizadas por distintos mtodos. Una vez que la muestra est es fase gaseosa es ionizada y frecuentemente acompaado de fragmentacin para proceder al anlisis de masas. En algunas tcnicas especializadas, la volatilizacin y la ionizacin de la muestra ocurren al mismo tiempo.
Figura 3. Sondas directas (direct probes)
Para obtener el espectro de masas de un compuesto simple de una mezcla, los componentes individuales deben ser separados antes del anlisis de espectrometra de masas. La separacin de los compuestos es necesaria para tener certeza de la identificacin, ya que dos o ms compuestos presentes en la muestra pueden crear espectros que se sobrelapen o mezclen ya que los iones generan fragmentos simples que dificultaran el anlisis de los datos obtenidos. Desde que en la dcada de los 60s se acopl la cromatografa de gases (GC) a la espectrometra de masas, esta conexin permite separar compuestos ya en fase gaseosa para su entrada al espectrmetro al entrar las diferentes fracciones en diferentes tiempos en forma continua permite un anlisis secuencial de las muestras. Recientemente, equipos de cromatografa de lquidos (LC), cromatografa de fluidos supercrticos, HPLC y electroforesis capilar, utilizados para separar compuestos, se pueden acoplar a espectrmetros de masas para anlisis de muestras complejas.
MTODOS DE IONIZACIN
Un reto fundamental en la espectrometra de masas de cualquier tipo de analitos es la produccin de iones en fase gaseosa de estas especies, y dificultades en la produccin de estos iones en fase gaseosa pueden impedir el anlisis por espectrometra de masas de ciertas clases de molculas. Esta situacin fue el caso de protenas y pptidos. Las primeras tcnicas que fueron aplicadas, ionizacin electrnica (electron ionization EI) e ionizacin qumica (chemical ionization CI), son procesos de dos etapas en los cuales los analitos son vaporizados con calor y la ionizacin ocurre una vez que el analito esta en fase gaseosa. Esta etapa de vaporizacin limit los experimentos de anlisis por espectrometra de pequeos pptidos, usualmente a mximo 4 o 5 aminocidos. Adicionalmente, estos pptidos tenan que ser derivatizados para minimizar su polaridad y darles suficiente volatilidad. El anlisis de protenas no era simplemente posible, y problemas similares se encontraban en otras clases de molculas polares. La ionizacin por bombardeo con tomos rpidos (fast atom bombardment FAB) fue el primer mtodo de ionizacin que hizo posible analizar rutinariamente por espectrometra de masas a molculas polares, tambin fue fundamentalmente diferente de otros mtodos de ionizacin tal como ionizacin electrnica (IE) debido a que los iones en fase gaseosa fueron generados directamente de una solucin del analito en fase lquida. Como resultado, las diferentes formas de vaporizacin y de ionizacin del analito se convirtieron en una etapa estrechamente ligada en el proceso total de anlisis por espectrometra de masas.
Impacto Electrnico (Electron Impact EI)

El Impacto Electrnico (Electron Impact EI) o comnmente llamado Ionizacin Electrnica (Electron Ionization EI) es un mtodo clsico de generacin de iones en espectrometra de masas utilizado an en muchas -6 aplicaciones. El analito es introducido dentro de la fuente de ionizacin que esta al vaco (<10 mbar) y sebsecuentemente ionizado por colisiones con un flujo de electrones (a 70 eV). M+e _M +2e
+. -
Los electrones para este proceso son generados por emisin trmica de un filamento caliente. El filamento esta tpicamente hecho de tungsteno o de renio. Los electrones son subsecuentemente acelerados al aplicar un potencial entre el filamento y la muestra. El rayo de electrones cruza la fuente de iones, afectando las molculas -4 neutras que provienen de la muestra (Figura 4). La corriente tpica del filamento es de 1x10 Amp.
Figura 4. Ionizacin por Impacto Electrnico (EI)
La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) operada de 20 a 500C o por medio de un cromatgrafo de gases. Las muestras deben ser de polaridad baja o media y con cierta estabilidad trmica, adems de que deben ser evaporadas antes de su ionizacin. El proceso de EI causa mucha fragmentacin de las molculas lo cual puede tener ventajas en la deduccin de su estructura. El mecanismo de formacin de iones para la especie AB es el siguiente: -* + 1. AB + e _ A + B + e -* + 2. AB + e _ A + B + 2e -* +* +* + 3. AB + e _ [AB ] + 2e seguido de [AB ] _ AB -* 2+* 2+* + + 4. AB + e _ [AB ]" + 3e seguido de [AB ]" _ A + B - (muy baja abundancia) -* + 5. AH + e _ AH* + e seguido de AH* + AH _ [AH+H] + A 9
Espectrometra de Masas Donde: * = Especies de alta energa. = Radicales. " = Intermediarios de vida corta. En 1 y 2 se indican las especias de mayor abundancia las cuales sufren de fragmentacin instantnea. En 3 indica especias de abundancia media. En 4 indica especies de abundancia muy baja. En 5 son especies que pueden formarse a altas presiones
Ionizacin Qumica (Chemical Ionization CI)

La Ionizacin Qumica (Chemical Ionization CI) es un mtodo de ionizacin relativamente suave, y es el primer mtodo de ionizacin suave introducido a la espectrometra de masas. La ionizacin es afectada por reacciones sobre la molcula con iones de un reactivo gaseoso generados por medio de ionizacin de impacto electrnico (EI) con molculas del analito neutras. El reactivo gaseoso es empleado con un exceso de 10 -10 veces la molaridad del. Esto puede ser logrado al usar volumen de iones bastante pequeo en comparacin a las condiciones de EI. El volumen de reactivo gaseoso se controla por medio de una vlvula.
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Figura 5. Ionizacin Qumica (CI)
Entre los agentes gaseosos utilizados se incluyen el metano, el isobutano y al amoniaco, formando iones CH5 , + + C4H9 , y NH4 respectivamente como especies predominantes. En caso del metano, el siguiente proceso es el que permite la formacin de iones reactivos: 1. CH4 + e _ CH4 Y fragmentos tales como CH3 +. + . 2. CH4 + CH4 _ CH5 + CH3 (autoprotonacin) + + 3. CH3 + CH4 _ C2H5 + H2
+.
La protonacin de un analito es dependiente de la diferencia de afinidades por protones en las bases + + correspondientes. Por ejemplo, el CH5 protona la mayora de los analitos, mientras que el NH4 es ms selectivo debido a que necesita un sitio ligeramente bsico en las molculas del analito. M + CH5 _ [M+H] + CH4 + Los iones [M+H] son llamados iones cuasi-molecular. La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) a una temperatura de operacin de 20 a 500C (para slidos y lquidos de baja volatilidad, as como lquidos y gases) o por medio de un cromatgrafo de gases (mezclas). Los analitos deben tener polaridad baja o media, as como estabilidad trmica. La ionizacin qumica genera iones de energa interna relativamente baja, exhibiendo un bajo nivel de fragmentacin, la evaporacin del analito antes de su ionizacin es el paso crtico.
+ +
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Espectrometra de Masas Tabla 2. Iones producidos por CI Iones positivos Iones negativos dominante // raramente detectado dominante // raramente detectado + -. [M+H] M // [M-H] + + + -. [M+H] // [M+R] [2M+H] M [M-H] + + + -. [M+H] [M+R] // [2M+H] [M-H] // [M+R] M descomposicin descomposicin
Tipo de analito Polaridad baja Polaridad media Polaridad alta + Iones K A
Ionizacin de Campo (Field Ionization FI)

La Ionizacin de Campo (Field Ionization FI) es un mtodo de ionizacin suave. La muestra es introducida por las mismas tcnicas que en EI y CI. La ionizacin de campo lleva el riesgo de descomposicin trmica de la muestra. Las molculas son ionizadas por medio de ionizacin de campo (FI) en los bordes del campo del nodo emisor. El emisor consiste de un alambre de tungsteno de 10-13mm de dimetro que es activado por un procedimiento especial creando miles de microagujas en su superficie. Un voltaje alto de 10-12 kV es aplicado al emisor causando polarizacin y finalmente ionizacin de las molculas que estn cerca de las puntas de las microagujas donde el campo elctrico alcanza una gran fuerza. Este proceso tiene una eficiencia de ionizacin +. + muy baja y por lo tanto, FI produce una corriente de iones muy baja. FI produce iones del tipo M y/o [M+H] , dependiendo del analito. Aunque los iones generados pueden estar casi libres de fragmentacin, se prefiere la ionizacin CI en lugar de FI no puede ser utilizada debido a la volatilidad del analito. La muestra es introducida por medio de una sonda directa (direct probe) a una temperatura de operacin de 20 a 500C (para slidos y lquidos de baja volatilidad, as como lquidos y gases), el uso de un cromatgrafo de gases acoplado al espectrmetro de masas es complicado ya que las condiciones son difciles de estabilizar en las corridas de las muestras. Mientras que F I genera iones con muy baja energa interna y casi nula fragmentacin, la evaporacin del analito antes de su ionizacin es la etapa crtica. Tabla 3. Iones producidos por FI Iones positivos Iones negativos dominante // raramente detectado Dominante // raramente detectado +. + M // [M+H] +. + M [M+H] + +. [M+H] // M -
Tipo de analito Polaridad baja Polaridad media Polaridad alta
Desorcin de Campo (Field Desorption FD)

La Desorcin de Campo (Field Desorption FD) es un mtodo de ionizacin muy suave utilizado en espectrometra de masas. Este mtodo esta basado en el de Ionizacin de Campo (Field Ionization FI), FD ha sido desarrollado al combinar la desorcin y la ionizacin del analito, pero no hay necesidad de evaporacin antes de la ionizacin, generando iones con muy baja energa interna y casi nula fragmentacin. En la Figura 6 se muestra un equipo de espectrometra de masas con una fuente de FD.
Figura 6. Fuente de FD
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Espectrometra de Masas Molculas neutras son ionizadas principalmente por FI en el borde del campo del nodo emisor, los cationes son desorbidos tal cual. Un alto voltaje de 10-12 kV es aplicado al emisor causando polarizacin y finalmente ionizacin de las molculas que estn cerca de las puntas de las microagujas donde el campo elctrico alcanza una enorme fuerza (Figura 7). Un ligero calentamiento de la muestra ayuda a mantener el equipo limpio al evitar su acumulacin.
Figura 7. Esquema general de ionizacin por FD
Usualmente, se pasa una corriente de 50 mA sobre el emisor (un alambre de 10mm) o incluso hasta 80-100 mA en emisores de 13mm. Esto incrementa la movilidad de las molculas sobre la superficie del emisor, ayudando a la migracin hacia las puntas de las agujas. El emisor puede resistir hasta 800C. La muestra es introducida dentro de la fuente de iones por medio de una sonda directa que lleva el emisor de campo en su punta (Figura 8), el alambre activado entre las dos puntas de acero inoxidable es de 5mm de longitud. Este par de alfileres de acero estn aislados elctricamente mutuamente por medio de una pieza de cermica. La sonda transfiere el emisor F D dentro de la muestra y se suministra un alto voltaje para la desorcin/ionizacin y ocurre el calentamiento del emisor.
Figura 8. Sonda y emisor de FD
El emisor FD consiste de un alambre central de tungsteno de 10-13mm de dimetro. La activacin a alta temperatura esta basada en una descomposicin trmica de la superficie del alambre de tungsteno caliente al vaco. La activacin crea miles de microagujas en la superficie del emisor (Figura 9).
Figura 9. Supericie del emisor (80x80mm)
La muestra es introducida como una solucin (1 a 2 ml a 0.1-1.0 mg/ml en solventes voltiles) hacia el emisor. Durante este proceso una solo gota colgante en la punta de una jeringa de un microlitro puede tocar la superficie del emisor, de otra manera se rompera el emisor (Figura 10).
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Figura 10. Proceso de montaje de una gota de 1.5ml sobre el emisor activado. La gota permanece en el alambre donde el solvente se avaporar para permitir tener solo una delgada capa de muestra.
Es preferible que la muestra sea soluble en solventes voltiles, se pueden analizar compuestos de baja o alta polaridad, inclusive es posible analizar mezclas de compuestos, aunque solo se pueden cuantificar compuestos puros. Si la muestra esta contaminada con sales inorgnicas puede ocurrir dao en los componentes del sistema. Se pueden analizar muestras de 1-5000 amu. Tabla 4. Iones producidos por FD Iones positivos Iones negativos Tipo de analito dominante // raramente detectado dominante // raramente detectado +. + 2+ +. Polaridad baja M // [M+H] M [2M] +. + + 2+ + + Polaridad media M [M+H] // [M+Cat] M [2M+H] [2M+Cat] + + + + +. 2+ Polaridad alta [M+H] [M+Cat] [2M+H] [2M+Cat] // M M [M-H] // [M+An] + + + +. Iones K A K [Kn+An-1] // [KA] A [An+Kn-1] + + + Cat: cationizacin por Li , Na , K , y otros iones metlicos. - An: anionizacin por Cl , Br , I , HSO4-, y otros aniones.
Bombardeo con tomos Rpidos (Fast-Atom Bombardment FAB)

Los mtodos de desorcin de partculas fueron desarrollados en los 70s y 80s, y a diferencia del mtodo de desorcin de campo (field desorption), evito complicaciones en diseo de equipo y preparacin de la muestra. FAB es un mtodo de ionizacin suave, resulta de la combinacin de desorcin del analito desde una fase condensada (mezcla de analito slido+matriz) con su subsecuente ionizacin. La matriz esta formada de molculas orgnicas (glicerol o 3-nitrobencil alcohol) que mantienen una superficie homognea para el + bombardeo. Ocurre el bombardeo de la muestra con tomos rpidos (Ar o Xe de 3-10 keV) o iones rpidos (Cs arriba de 35 keV) (Figura 11). Si se utilizan iones rpidos la tcnica se conoce tambin como liquid secondary ion mass spectrometry (LSIMS o liquidSIMS). En la prctica, no hay una diferencia significativa entre los espectros obtenidos por FAB o LSIMS.
Figura 11. Sistema general de FAB
El rayo primario de tomos rpidos es librado por una pistola de tomos rpidos (FAB gun) (Figura 12) o por + + una pistola de iones Cs que utiliza un horno conteniendo CsI como fuente de Cs . La pistola FAB esta localizada fuera de la fuente de iones, a travs de ella pasa un flujo de Xe neutro, los iones Xe son generados 13
Espectrometra de Masas por EI. Los iones son acelerados, enfocados y neutralizados por intercambio de cargas con Xe neutro al haber colisin. El rayo de tomos pega con una gota de muestra y debido a colisiones y disrupciones se forman iones secundarios que son expulsados de la superficie de la muestra, los iones generados son acelerados y enfocados al analizador.
Figura 12. FAB gun
La muestra es introducida por medio de una sonda directa. Bsicamente la sonda FAB consiste de una simple barra con un contenedor para la muestra donde se dirigen los tomos rpidos que soporta la gota de la solucin de analito contenida en una matriz. Este contenedor de la muestra esta aislado elctricamente. La funcin de la matriz es absorber energa de las partculas primarias que la impactan, actuar como solvente para el analito, refrescar la superficie de la gota y ayudar en el proceso de ionizacin, ya que puede ser aceptor/donador de protones o electrones. Para que una matriz lleve a cabo todas sus funciones es necesario que la muestra sea 100% soluble en ella, solo aquellos solventes con baja presin de vapor pueden ser usados fcilmente, el solvente debe tener una viscosidad suficientemente baja que permita la difusin de los solutos a la superficie, ser qumicamente inerte. Las muestra que pueden ser analizadas por FAB deben ser altamente solubles, e incluso altamente polares (pptidos, oligosacridos), ionicos (sales), o apolares (compuestos neutros, oligomeros sintticos). FAB puede ser utilizado para deteccin directa de iones positivos o negativos. El rango de masa es desde 300 amu hasta 5000 amu, en compuestos de menor masa resultan algunas complicaciones en la deteccin de los picos del espectro y en molculas mayores se presentan problemas en la desorcin. Los iones secundarios generados pueden permanecer estables por varios minutos, ya que poseen baja energa interna y exhiben un bajo nivel de fragmentacin. Tabla 5. Iones producidos por FAB Iones positivos Iones negativos Tipo de analito dominante // raramente detectado dominante // raramente detectado +. + -. Polaridad baja M // [M+H] M // [M-H] +. + + -. Polaridad media M [M+H] // [M+Cat] M [M-H] + + +. -. Polaridad alta [M+H] [M+Cat] // M [M-H] // [M+An] M + + + +. -. Iones K A K [Kn+An-1] // [KA] A [An+Kn-1] // [KA] + + + Cat: cationizacin por Li , Na , K , y otros iones metlicos. - An: anionizacin por Cl , Br , I , HSO4-, y otros aniones.
Ionizacin por Electrospray (Electrospray Ionization ESI).

La Ionizacin por Electrospray (ESI) es uno de los mtodos de ionizacin mas recientemente desarrollados en espectrometra de masas. El diseo y operacin de fuentes de ionizacin por electrospray usadas comnmente en los espectrmetros de masas estn basados en diseos descritos por Fenn y colaboradores en 1985. Este mtodo es llevado a cabo a presin atmosfrica a diferencia de otros mtodos, por lo que se le conoce tambin como un mtodo de ionizacin a temperatura ambiente (atmospheric pressure ionization API). ESI es 14
Espectrometra de Masas ampliamente utilizado en aplicaciones de ciencias bioqumicas y biomdicas debido a su capacidad de analizar molculas altamente polares tales como pptidos, oligonucletidos y oligosacridos. En el proceso general de electrospray, que ocurre en la punta del emisor (capilar o aguja), una solucin acuosa -4 -5 cida o bsica (dependiendo del la muestra) diluida del analito (10 -10 molar) es rociada desde la punta del emisor en el cual se aplica un potencial de 3-4 kV, la solucin debe proveer conductividad elctrica que puede ser obtenida por el uso de analitos inicos o aditivos inicos tales como buffers o por algn grado de disociacin electroltica del solvente. El lquido comienza a salir de la aguja, incrementa su carga y asume una forma cnica, llamada cono de Taylor, en honor a G.I. Taylor quien describi este fenmeno en 1964 (Figura 13). El lquido asume esta forma cuando incrementa su carga ya que una forma cilndrica puede retener mas carga que una esfera. En la punta del cono, el lquido cambia de forma a una lnea fina, que se vuelve inestable ya que es forzado a retener mas y ms carga, y finalmente llega a un punto crtico donde no puede soportar mas carga elctrica y la solucin entonces se dispersa en forma de niebla de pequeas gotas (de menos de 10 mm de dimetro) altamente cargadas que vuelan buscando una superficie de carga opuesta. Debido a que las gotas estn altamente cargadas con la misma carga elctrica se repelen fuertemente, las gotas vuelan y se dispersan cubriendo un rea cada vez mayor y se van reduciendo de tamao ya que las molculas de solvente se evaporan en su superficie, y la distancia entre las molculas cargadas disminuye dramticamente. Si la gota no encuentra donde disipar su carga, las cargas elctricas llegan a un estado crtico y la gota explota violentamente (Figura 14). Este proceso fue originalmente observado por el fsico John Zelany en 1914.
Figura 13. Cono de Taylor
Figura 14. Reduccin de tamao de gota en ESI
An no existe una explicacin 100% aceptada de lo que le sucede a las gotas, pero algunas de las teoras son: 1. Modelo de Residuo Cargado (charged residue model) de Dole. Las gotas sufren repentinamente de explosiones coulombicas produciendo gotas ms pequeas y ms pequeas que finalmente contendrn solo una molcula cargada y quiz algunas molculas de solvente. 2. Modelo de Evaporacin Inica (ion evaporation model) de Iribarne y Thomson. Ocurre la expulsin de molculas cargadas para reducir la densidad de carga de la superficie. 3. La gota original sobrevive despus de haber expulsado algunas micro gotas cargadas. De cualquier forma, el proceso termina con molculas cargadas que pueden todava llevar molculas de solvente. El proceso de evaporacin y rompimiento de gotas se repite hasta que el tamao y carga de las gotas desorba molculas protonadas dentro de la fase gaseosa, donde pueden ser dirigidas en el espectrmetro de masas por medio de campos elctricos apropiados (Figura 15). El proceso de evaporacin puede ser suplementado con un flujo de gas (tpicamente nitrgeno) y calor.
Figura 15. Proceso general de Ionizacin por Electrospray (ESI)
Una caracterstica de ESI es que debido a las condiciones cidas usadas para producir las gotas cargadas positivamente se tienden a protonar todos los sitios bsicos en las molculas de analito. Una segunda caracterstica de ESI es la eficiencia del proceso de ionizacin y, como resultado, la sensibilidad de los experimentos basados en esta forma de ionizacin, la eficiencia en la protonacin de estos sitios bsicos en 15
Espectrometra de Masas ambientes cidos parece contribuir a la sensibilidad. Una tercera caracterstica es su compatibilidad con los solventes de HPLC de fase reversa (reverse-phase high-performance liquid chromatography), ya que las mezclas agua/solvente tienen excelentes propiedades compatibles con ESI.
Figura 17. Rociador (sprayer) de ESI y el orificio del capilar (0.4mm de ancho).
La seal observada en el proceso ESI es proporcional a la concentracin del analito en la solucin que esta siendo rociada pero no a su velocidad de flujo. Esto es debido a que un incremento en la velocidad de flujo simplemente provoca tener que eliminar un mayor porcentaje de solvente, debido a que en muchas ocasiones se tienen muestras biolgicas en un volumen pequeo y en poca cantidad, es preferible poder rociar un volumen extremadamente pequeo, por lo que a partir de ESI que maneja flujos de 5-1000ml/min se han derivado el micro ESI que maneja una velocidad de flujo de 0.5-5ml/min y el nano ESI 0.02-0.5ml/min (Figura 17).
Figura 17. ESI, microESI y nanoESI
En direccin contraria, se han diseado ESI asistidos neumticamente, llamados Ion Spray (ISP) donde una corriente de gas inerte es aplicada en conjunto con un alto voltaje para ayudar al proceso de rociado de volmenes grandes.
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Esta tcnica de ionizacin, comnmente llamada MALDI, fue descrita por Karas y Hillenkamp en 1988. En este mtodo de ionizacin los analitos son disueltos en una solucin de un compuesto que absorbe UV, llamado matriz (matrix), y colocado dentro del espectrmetro de masas. Debido a que los solventes se van secando, los compuestos de la matriz cristalizan y los analitos quedan contenidos dentro de la matriz de cristales (Figura 18).
Figura 18. Proceso de Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)
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Espectrometra de Masas Pulsos de lser de luz UV (3-5 ns, 337 nm, 10 W/cm ) son utilizados para vaporizar pequeas cantidades de la matriz donde se incluyen los iones del analito y llevados a fase gaseosa en el proceso (Figura 19). La ionizacin ocurre por protonacin en el ambiente cido producido por los compuestos de la matriz y por la adicin de cido diluido en la muestra. La protonacin de pptidos es particularmente eficiente en ambientes cidos, haciendo de MALDI, un mtodo efectivo para producir pptidos protonados. Debido a que con la desorcin por lser la produccin de iones es discreta y es pequeos paquetes, el MALDI esta comnmente combinado con un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad.
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Figura 19. Laser UV
Mientras que ESI es afectado por especies contaminantes, MALDI puede tolerar niveles variables de algunos contaminantes. Cada pulso lser genera una pequea cantidad de plasma que se expande en vaco, del cual se extraen los iones (positivos o negativos) del analito que son acelerados por un potencial de 10-30 kV y controlados por medio de campos electromagnticos. Debido a diferencias de velocidades que resultan de sus diferencias en masas los iones llegan al detector en diferentes tiempos. Los tiempos de vuelo son del rango de 10-100 ms. Una muestra de 1 ml de la solucin del analito o de la solucin analito/matriz es aplicada en un contenedor y se seca, formando una capa delgada y cristalina. Los contenedores son de acero pulido, plata o cromo plateado (Figuras 20 y 21).
Figura 20. Contenedor de plata para 10 muestras, cada pozo mide 23 mm de dimetro.
Figura 21. Detalle del pozo 10 del contenedor. El rectngulo muestra el lugar donde impactar el lser. La lnea blanca es un rasguo. La muestra aplicada es una solucin en acetona que formo una capa cristalina. Se necesitan entre 10-100 disparos del lser para evaporar la capa completamente.
La funcin de la matriz es en primer lugar absorber la energa del lser. Por lo que las matrices para MALDI estn formadas de compuestos aromticos (Figura). La ionizacin del analito puede ser afectada por deprotonacin, al aceptar o ceder un electrn, por unin de cationes o fotoionizacin, por lo que los iones generados por MALDI son de una amplia variedad de molculas, ya que dependiendo de la combinacin entre el analito y la matriz ser el tipo de iones predominantes en el espectro obtenido.
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Figura 22. Compuestos utilizados en las matrices MALDI
Tabla 6. Iones producidos por MALDI Iones positivos Iones negativos Tipo de analito dominante // raramente detectado dominante // raramente detectado +. + -. Polaridad baja M // [M+H] M // [M-H] +. + + + -. M [M+H] // [M+Cat] [2M+H] M [M-H] // [2M-H] Polaridad media n+ nMW > 3000: [M+nH] , n = 2, 3 MW > 3000: [M-nH] , n = 2, 3 + + + + -. [M+H] [M+Cat] // [2M+H] [2M+Cat] [M-H] // M [2M-H] Polaridad alta n+ nMW > 3000: [M+nH] , n = 2, 3 MW > 3000: [M-nH] , n = 2, 3 + + + +. -. Iones K A K // [Kn+An-1] [KA] A // [An+Kn-1] [KA] + + + Cat: cationizacin por Li , Na , K , y otros iones metlicos. - An: anionizacin por Cl , Br , I , HSO4-, y otros aniones. + Residuos de la matriz pueden formarse con todos los analitos dando: [M+H+matriz] .
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ANALIZADORES DE MASAS
Todos los espectrmetros de masas combinan la formacin de iones, el anlisis de masas, y la deteccin de iones. Los analizadores de masas llevan a cabo la separacin de los iones producidos por diferentes mtodos en una fuente de iones, de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z) para que puedan llegar al detector. La unidad para m/z es el Thomson (Th). En los experimentos de espectrometra de masas aparecen dos clases principales de iones, el ion molecular, que es la molcula completa del analito, y fragmentos inicos, los cuales contienen solo una parte de la estructura. El peso molecular de una molcula puede ser calculado de la m/z del ion molecular, si la carga (z) es conocida, la informacin estructural se obtiene a partir de las m/z de los fragmentos del ion. Una variedad de analizadores de masas estn disponibles para realizar estas mediciones, incluyendo cuadrupolo (quadrupole), trampa de iones (ion-trap), tiempo de vuelo (time-of-flight), sector magntico (magnetic sector), ciclotrn (ion cyclotron resonance) y otros. Cada tipo de analizador posee caractersticas y aplicaciones especiales, as como beneficios y limitaciones. La seleccin del tipo de analizador a utilizar es en base a que aplicacin se le dar, el costo y el rendimiento deseado, ya que el analizador determina varias caractersticas del resultado del experimento, entre estas la resolucin y el rango de m/z de los iones que pueden ser medidos.
Efecto de campos magnticos sobre los iones

Todos los analizadores de masas comnmente usados utilizan campos elctricos y magnticos para aplicar una fuerza a partculas cargadas (iones). La relacin entre fuerza, masa y los campos aplicados puede verse a travs de la segunda ley de Newton y la ley de Lorentz. Segunda ley de Newton Ley de Lorentz F=ma F=e(E+vB)
Donde, F= fuerza aplicada al ion, M= masa del ion, a= aceleracin, e= carga inica, E= campo elctrico, vB= producto de la velocidad del ion y el campo magntico aplicado. De la segunda ley de Newton se observa que la fuerza aplicada causa una aceleracin que es dependiente de la masa del ion, y la Ley de Lorentz indica que la fuerza aplicada es tambin dependiente de la carga del ion. Por lo tanto, los espectrmetros de masas separan los iones de acuerdo a su relacin masa/carga (m/z) y no solo a partir de la masa nicamente.
Principios de los analizadores de masas

Un analizador de masas es anlogo al equipo utilizado en espectroscopia ptica para el anlisis del contenido de color de luz visible. En espectroscopia ptica, se inicia con luz visible que esta compuesta de colores individuales (a diferentes longitudes de onda) que estn presentes en diferentes intensidades. Un prisma separa la luz es sus diferentes longitudes de onda, y pequea salida es usada para seleccionar cual longitud alcanza el detector. Las diferentes longitudes de onda son barridas o escaneadas al otro lado de la salida del detector y la intensidad de luz es registrada como una funcin del tiempo (longitud de onda) (Figura 23). En espectrometra de masas, se inicia con una mezcla de iones que tienen diferentes relaciones masa/carga y diferentes abundancias relativas. Campos electromagnticos separan los iones de acuerdo a sus relaciones masa/carga, y una hendidura es usada para seleccionar cuales iones llegan al detector. Las diferentes relaciones masa/carga son entonces analizadas en la salida del detector y las corrientes de iones son registradas como una funcin del tiempo (figura 23).
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Figura 23. Comparacin entre espectrofotmetro y espectrmetro de masas
Espectrmetro de masas de sector magntico (Magnetic Sector Mass Spectrometer)

En un espectrmetro de masas de defleccin magntica, los iones que llegan de la fuente de iones son acelerados a una gran velocidad. Los iones entonces pasan a travs de un sector magntico (magnetic sector) en el cual se aplica un campo magntico en una direccin perpendicular al movimiento de los iones. Cuando se aplica aceleracin perpendicular al movimiento de los iones, su velocidad permanece constante, pero se mueven en direccin circular, es por esto que el sector magntico tiene forma de arco, el radio y el ngulo del arco varan de acuerdo a diferentes diseos. Un sector magntico por si mismo es capaz de separar iones de acuerdo a su relacin masa/carga, pero su resolucin se ve limitada ya que no todos los iones que llegan de la fuente de iones tienen la misma energa ni la misma velocidad. Para tener una mejor resolucin se aade un sector elctrico (electric sector) que enfoca los iones de acuerdo a su energa cintica, esto se realiza aplicando una fuerza perpendicular a la direccin del movimiento de los iones, tambin en forma de arco.
Figura 24. Espectrmetro de masas de sector magntico.
La configuracin de este aparato es tambin llamada de geometra reversa, ya que el sector magntico esta antes del sector elctrico. La operacin del espectrmetro de masas se logra manteniendo constantes el potencial de aceleracin y el potencial del sector elctrico y variando su campo magntico. Los iones que tienen una energa cintica constante, pero una relacin m/z diferente son captados por el detector a diferentes fuerzas de campo magntico. La dependencia de la relacin m/z sobre los campos elctrico y magntico es deducida a partir de que todos los iones formados en la fuente de iones son acelerados a una energa cintica (T) de acuerdo a:
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Espectrometra de Masas Despejando velocidad (v) tenemos:
De la Ley de Lorentz, el campo magntico aplicado a una fuerza evB debe ser igual a la fuerza centrpeta mv /r ya que los iones se mueven en un arco a travs del sector:
Substituyendo velocidad (v), se llega a la ecuacin de trabajo aplicable al espectrmetro de masas de sector magntico:
El sector magntico se mantiene constante usualmente a un valor en el cual pasen solo los iones que tengan una energa cintica especfica, por lo que el parmetro que es variable es B, la fuerza del campo magntico. El campo magntico es generalmente analizado exponencialmente o linealmente para obtener el espectro de masas. El anlisis de campo magntico puede ser usado para cubrir un amplio rango de m/z con una sensibilidad que es independiente de la relacin masa/carga. Una alternativa es mantener B constante y analizar V. El potencial del sector elctrico rastrea el voltaje, esto tiene la ventaja de que la relacin m/z y el voltaje tienen una relacin linear, pero una desventaja al analizar el voltaje es que la sensibilidad es proporcional a la relacin m/z. El analizador de masas de sector magntico es un modelo clsico que posee varias ventajas: alta reproducibilidad, alto desempeo en anlisis cuantitativos, alta resolucin, sensibilidad y rango dinmico. Algunas limitaciones son que no pueden adaptarse a algunos mtodos de ionizacin (por ejemplo: MALDI), costos mayores que otros analizadores. Son ampliamente usados en anlisis de compuestos orgnicos, realizan mediciones exactas de masas, en cuantificacin y en mediciones de istopos.
Espectrmetros de masas de cuadrupolo (quadrupole)

El analizador de masas de cuadrupolo (quadrupole) es probablemente el analizador de masas mas utilizado, ya que adems de su alto desempeo analtico combina facilidad de uso. Este tipo de analizador esta compuesto de cuatro barras organizadas paralelamente como dos grupos de dos barras conectadas elctricamente (Figura 25). Una combinacin de voltajes de radiofrecuencia (rf) y corriente directa (dc) son aplicados a cada par de barras, este arreglo simtrico permite producir campos hiperblicos. Superficies diagonalmente opuestas estn conectadas juntas a fuentes de voltajes rf y dc. Los iones se extraen de la fuente de iones y son acelerados (515 V) dentro del espacio central formado por el cuadrupolo a lo largo del eje longitudinal hacia el detector. Miller y Denton describieron el concepto de filtro de masas cuadrupolo como la combinacin o superposicin de filtros de pase bajo y pase alto. Al menos para iones relativamente ligeros (<300 Da), el anlisis m/z no es afectado por la estructura del ion.
Figura 25. Analizador cuadrupolo (quadrupole)
El filtro cuadrupolo m/z es examinado al modificar la magnitud de la amplitud de voltaje de rf y manteniendo dc a una proporcin fija. El poder de resolucin es establecido por la relacin de los voltajes rf y d c . Las trayectorias de los iones a travs del espacio central de las barras es complicado, y para cada par de voltajes dc y rf solo iones de un valor m/z especfico evitaran colisionar con las barras y pasaran el filtro cuadrupolo a travs del eje Z hasta alcanzar el detector, todos los dems iones chocarn con las superficies del cuadrupolo a 21
Espectrometra de Masas estos valores de rf y dc. El espectro de masas completo puede ser examinado ya que se hace un barrido desde un valor de voltaje mnimo preestablecido hasta un mximo, pero manteniendo la relacin dc/rf constante. Una exploracin rigurosa de la trayectoria de los iones a travs del filtro cuadrupolo incluye un gran nmero de variables fsicas que afectan los campos elctricos instantneos que afectan los iones. Para un filtro de masas hiperblico clsico, el potencial de distribucin (F) a cualquier tiempo (t) es descrito por la siguiente ecuacin: F = [U+Vcos(wt)] x - y 2 2r0
2 2
donde x y y son las distancias a lo largo de ejes de coordenadas, r0 es la distancia desde el eje z a cualquiera de las superficies del cuadrupolo, w es la frecuencia angular (2p) de la corriente alterna aplicada (AC), V es la magnitud de la seal rf aplicada, y U es la magnitud del potencial dc aplicado a las superficies. El campo elctrico instantneo a lo largo de cualquiera de los tres ejes (x-y-z) puede ser calculado al derivar parcialmente la ecuacin anterior en funcin de un eje particular, al realizar esto, se observa que los potenciales dc y AC aplicados a las superficies no afecta la aceleracin de los iones en la direccin Z, es decir a travs del eje entre la fuente de iones y el detector, ya que la formula no tiene dependencia de Z. Desde un punto de inicio del espectrmetro de masas de cuadrupolo, una solucin frontera para la ecuacin de Mathieu corresponde a un desplazamiento finito de los iones a lo largo de los ejes x y y, esto es que los iones siguen una trayectoria para evitar colisiones con las superficies y llegar al detector. Otro tipo de solucin describe el desplazamiento radial de los iones que chocan con las superficies del cuadrupolo para excluir transmisin al detector. Definicin de los trminos a y q de la ecuacin de Mathieu, en la cual a se relaciona con dc y q con rf. ax = -ay = 4zeU/m r0
2 2 2 2
qx = -qy = 2zeV/m r0
Los valores a (proporcional a U/m) y q (proporcional a V/m) corresponden a trayectorias estables de los iones en el filtro cuadrupolar. Estas trayectorias le permiten a los iones llegar a la superficie del detector sin chocar o colisionar con las superficies del cuadrupolo. Estas transformaciones matemticas permiten crear un diagrama a-q que simplifica los parmetros que afectan el movimiento de los iones en el cuadrupolo, estos diagramas son bidireccionales (en a y en q) pero incluyen seis variables (e, w , r 0, m, U, y V), este diagrama de estabilidad (Figura 26) relaciona el potencial dc aplicado (U) y el potencial rf aplicado (V).
Figura 26. Diagrama de estabilidad a-q
El analizador cuadrupolo ofrece alta reproducibilidad, adems de costos relativamente bajos de manejo y mantenimiento del sistema, pero puede llegar a tener una resolucin limitada, puede no adaptarse a algunos mtodos de ionizacin. Este analizador esta frecuentemente acoplado a sistemas de cromatografa de gases/espectrmetro de masas (GC/MS) y cromatografa lquida/espectrmetro de masas (LC/MS).
Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight TOF)

El principio de operacin del analizador de tiempo de vuelo (time-of-flight TOF) involucra la medicin del tiempo requerido por un ion para viajar desde la fuente de iones hasta el detector localizado a 1-2m de la fuente. Todos los iones reciben la misma energa cintica durante la aceleracin instantnea (3000 eV), pero debido a que 22
Espectrometra de Masas tienen diferentes valores de m/z, se separan en grupos de acuerdo a su velocidad (por lo tanto m/z) como van recorriendo la regin libre de campo entre la fuente de iones y el detector. Los iones chocan secuencialmente en el detector en forma de un incremento de m/z. Los iones de baja m/z llegan al detector antes que aquellos con m/z alta debido a que entre mas m/z tengan los iones tendrn una velocidad menor (Figura 27).
Figura 27. Analizador TOF
La energa cintica de un ion se define por: T = eV = mv 2 La velocidad del ion: v = 2zeV m

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Debido a que es imprctico medir directamente la velocidad del ion, el tiempo de vuelo (time-of-flight tof) desde la fuente de iones hasta el detector (separados por una distancia L) provee la informacin necesaria: tof = L = m v 2zeV
El valor de m/z para un ion es determinado por su tof al detector calibrado con los tof de al menos dos iones de m/z conocida. El tiempo de trnsito de un ion de 3000 eV de 800 m/z es aproximadamente 70 mseg a travs de un tubo de 1m de vuelo, el ciclo de produccin de iones, aceleracin y deteccin es completado en un periodo de aproximadamente 100mseg para un rango mayor de 1000 m/z. Los iones que parten de la fuente de iones en un espectrmetro de masas TOF no tienen los mismos tiempos de partida ni exactamente la misma energa cintica, por lo que estos aparatos han sido diseados para compensar estas diferencias. Un reflectron es un aparato ptico en el cual los iones en un espectrmetro TOF pasan a travs de un espejo o reflectron y su vuelo es invertido (Figura 28). Un campo de refleccin linear permite a los iones con mayores energas cinticas penetrar ms profundamente dentro del reflectron en comparacin con iones de energas cinticas menores. Los iones que estn ms dentro del reflectron tardarn ms en llegar al detector. Si un paquete de iones de una m/z dada contiene iones con diferentes energas cinticas, el reflectron disminuir la dispersin de los tiempos de vuelo de los iones, mejorando la resolucin del espectrmetro.
Figura 28. Reflectron
El analizador TOF es el analizador de masas ms rpido, puede adaptarse a los mtodos de ionizacin por pulsos (MALDI), tiene alta transmisin de iones y el rango de masas ms grande de todos los analizadores de masas. Algunas limitantes son que en muchas ocasiones requieren exclusivamente de un mtodo de ionizacin por pulsos y que la selectividad de los iones puede limitarse en algunos experimentos. Casi todos los sistemas 23
Espectrometra de Masas MALDI estn en conjunto con un analizador de TOF, los sistemas GC/MS con TOF poseen una alta velocidad de anlisis.
Analizador de trampa de iones (Ion-Trap)

El espectrmetro de masas de trampa de iones cuadrupolo (quadrupole ion-trap), as como el filtro cuadrupolo, utilizan campos elctricos oscilantes para atrapar los iones en forma controlada. En la trampa de iones cuadrupolo, los iones son atrapados en un espacio tridimensional, mientras que en el filtro de masas cuadrupolo solo es en un espacio bidimensional. La trampa de iones cuadrupolo atrapa los iones en un pequeo volumen entre tres electrodos, uno circular (ring electrode) y dos electrodos hiperblicos en los extremos (end-cap electrodes), por medio de campos elctricos oscilantes (Figura 29).
Figura 29. Analizador de trampa de iones (ion-trap)
La trampa de iones es operada al aplicar un potencial sinusoidal (rf a una frecuencia determinada) al electrodo circular, mientras que los de los extremos se mantienen constantes (frecuentemente en cero), o mantenidos a un potencial oscilante. La variedad de potenciales posibles que pueden aplicarse a los electrodos de los extremos permite atrapar los iones dentro de un rango m/z especfico, es decir atrapar iones por encima de un valor m/z especfico, atrapar iones solo de un valor m/z seleccionado, o expulsar iones de un valor m/z especfico. Como fue originalmente concebido, la trampa de iones puede ser ajustada para almacenar iones de un valor m/z dado. Al cambiar las condiciones de operacin, iones de un valor m/z especificado podrn salir o ser expulsados de la trampa. Stafford y colaboradores establecieron el modo de operacin de la trampa de iones, en el cual los iones los iones que tienen un valor m/z por encima de un valor predeterminado son almacenados, pero eventualmente son expulsados de acuerdo a valores secuenciales de m/z al cambiar los parmetros de operacin para permitir un examen analtico. El movimiento dentro de la trampa de iones, al igual que en el filtro cuadrupolo, puede ser descrito por las ecuaciones de Mathieu. Debido a que potenciales dc pueden ser aplicados a la trampa, puedes usarse diagramas de estabilidad basados en a y q para indicar cuales iones de acuerdo a su valor m/z permanecen estables dentro de la trampa de iones y cuales sern expulsados bajo unas condiciones especficas. Las condiciones para estabilidad de iones dentro de la trampa de iones pueden ser graficadas en funcin de a-q de Mathieu. Los valores de a y q de la ecuacin de Mathieu dependen de las dimensiones de la trampa de acuerdo a las ecuaciones: az = -2ar = -16 eU 2 2 mr0 w RF qz = -2qr = -8 eV 2 2 mr0 w RF . .
Los subndices z y r representan el movimiento axial y radial entre los electrodos de los extremos, U es el potencial dc aplicado a cualquiera de los electrodos de los extremos, V es potencial rf aplicado al electrodo 24
Espectrometra de Masas central, r0 es el radio del electrodo central, y w RF es la frecuencia angular. Iones cuyos valores a y q caen dentro de la grfica tendrn trayectorias estables en la trampa de iones (Figura 30).
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Figura 30. Diagrama de estabilidad a-q
Durante la operacin del espectrmetro de trampa de iones, las oscilaciones de los iones atrapados son -3 reducidas por colisiones con helio a alta presin (10 torr). Durante el proceso de deteccin, los potenciales de los electrodos son alterados para producir una rampa de amplitud de radio frecuencia en las trayectorias de los iones y as expulsar los iones en direccin axial. Los iones son expulsados en orden de decrementos de m/z, enfocados a la salida de la trampa y detectados por el sistema de deteccin de iones. Algunos investigadores han demostrado gran resolucin y rango de masas en sistemas de trampas de iones diseadas especialmente. Sin embargo, estas caractersticas no son aplicables a todos los sistemas de trampa de iones disponibles comercialmente. Este sistema posee alta sensibilidad adems de ser equipos relativamente compactos, pero ofrecen poca capacidad en anlisis cuantitativos, pueden sufrir de efectos por cargas y reacciones de los iones, muchos parmetros influyen la calidad del espectro obtenido por este mtodo (excitacin, atrapado y deteccin de los iones) por lo que debe contarse con sistemas de control sumamente precisos. Puede acoplarse a sistemas cromatogrficos.
Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)

El analizador FT-ICR (Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) es probablemente el mtodo ms complejo de anlisis de masas. Esta tcnica fue desarrollada en los 50s, es altamente sensible, pero tiene limitaciones de resolucin de masas (>106 Da). Este tipo de espectrmetros consisten principalmente de tres secciones, la primera es la fuente de iones (ESI y MALDI son las ms comunes), despus la regin de transferencia de iones donde los iones producidos son captados, enfocados y transferidos a una regin de alto vaco antes de entrar al analizador, y finalmente el analizador. El arreglo estndar para el analizador FT-ICR, es una trampa de iones localizada dentro de un campo magntico especialmente uniforma de una fuerza B0. El efecto del campo magntico es obligar a los iones incidentes a circular en una rbita (Figura 31), la frecuencia es determinada por la masa (m), la carga (z) y velocidad (v) del ion, por accin de la ley de Lorentz, ecuacin. El ion es llevado a una trayectoria circular en un plano perpendicular al campo magntico. La frecuencia angular de los iones (wc) se define por la ecuacin 2. El sentido contrario de rotacin es experimentado por iones de carga opuesta. Ecuacin 1. Ecuacin 2. F = zivB0
wc = ziB0 2pmi
Ecuacin 3. mi = B0 . 2zipwc 25
Espectrometra de Masas Donde, F = fuerza de lorentz B0 = campo magntico mi = masa del ion zi = carga del ion v = velocidad incidente del ion wc = frecuencia rotacional inducida (ciclotrn)
Figura 31. Analizador FT-ICR
La presencia de iones entre el par de electrodos (en trampa) no producir ninguna seal medible, por lo que es necesario excitar los iones de una m/z dada como un paquete a un radio orbital mayor al aplicar barrido de potencial rf de milisegundos. Una frecuencia excitar una m/z particular (la transformacin de Fourier permite medir simultneamente todas las frecuencias). La medicin de la frecuencia angular (wc) lleva a valores de m/z y al espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede ser medida ms exactamente que otras propiedades fsicas, esta tcnica de anlisis tiene una gran resolucin. Despus de la excitacin, los iones regresan a su estado normal. Este tipo de analizadores poseen la resolucin de masas mas alta, alta capacidad, y acoplamiento a mtodos de ionizacin por pulsos (MALDI), es un mtodo no destructivo, pero posee un rango de masa limitado, puede sufrir de efectos por cargas y por reacciones entre los iones, se deben cuidar muchos parmetros para tener buenas mediciones. Se acopla bien a MALDI y ESI.
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DETECTORES DE IONES
Sensibilidad, precisin, y tiempo de respuesta son criterios importantes que distinguen los diferentes sistemas de deteccin de iones. Alta precisin y rpido tiempo de respuesta son caractersticas mutuamente excluyentes. Idealmente, la sensibilidad debe definir explcitamente la corriente de ion recibida por el detector. La definicin debe incluir: (1) el nombre del compuesto de calibracin, (2) el valor m/z del ion medido, (3) el poder de resolucin del instrumento, (4) la cantidad de compuesto de calibracin consumido por minuto, (5) la intensidad de la corriente de electrones y presin de la fuente de iones (para CI), (6) la corriente del ion que llego al detector. Estas unidades de sensibilidad permiten comparar instrumentos, que en ocasiones es difcil ya que las diferentes compaas usan diferentes criterios.
Copa Faraday
Este es un detector elctrico convencional, iones positivos que impactan sobre el colector son neutralizados por electrones despus de pasar a travs de una resistencia. La cada de voltaje en la resistencia de acuerdo a un estndar es la medicin de la corriente del ion. La seal del voltaje de la resistencia es entonces amplificada por un amplificador DC o por unn electrmetro. El pequeo electrodo de metal que intercepta los iones positivos esta montado en una jaula de Faraday (Figura 32). La corriente del ion medida y amplificada es directamente proporcional al nmero de iones y al nmero de cargas de los iones. La respuesta de la copa faraday es independiente de la energa, la masa, o la naturaleza qumica de los iones. Este tipo de detector es simple, barato, resistente y fiable. Posee alta precisin, sensibilidad y produce poco ruido de salida. La principal desventaja es que tiene un gran retraso inherente a la simplificacin del sistema. Por esto es que se utiliza para mediciones precisas o de corrientes de iones poco cargados y no debe ser usado para realizar examinaciones rpidas (por ejemplo en sistemas GC/MS).
Figura 32. Copa Faraday
Multiplicador de Electrones (Electron Multiplier)

El multiplicador de electrones (electron multiplier) utiliza el principio de emisin secundaria de electrones para afectar la amplificacin. En el dinodo discreto (discrete-dynode) los iones provenientes del analizador de masas son enfocados sobre un dinodo que emite electrones en proporcin directa al nmero de iones bombardeados hacia l. Los electrones secundarios del dinodo (iones en electrones) son acelerados y enfocados hacia un segundo dinodo, el cual tambin emite electrones secundarios (electrones en electrones). De este modo, la amplificacin es llevada a cabo a travs de un efecto cascada de electrones secundarios de dinodo a dinodo, ya que el nmero de electrones que llegan a un dinodo es menos al que sale del mismo (Figura 33). Cada etapa es un dinodo de cobre-berilio conectado a un potencial sucesivamente mayor por un divisor de voltaje. 7 Pueden llegar a tener de 10 a 20 etapas amplificando la seal en un orden de hasta 10 .
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Figura 33. Multiplicador de electrones de dinodo discreto (discrete-dynodo)
Este tipo de detectores son de amplio uso, ya que adems de ser sistemas confiables, baratos y que pueden captar casi todos los electrones poseen sistemas electrnicos y mecnicos simples, aunque pueden no ser tan sensibles (al no tener amplificacin de seal) y un tiempo de respuesta lento debido a alta impedancia en el amplificador. Un diseo alternativo de multiplicador de electrones utiliza un dinodo continuo en forma de cuerno hecho de vidrio cubierto con plomo. Este vidrio cubierto es elctricamente resistente y provee un gradiente elctrico que esta conectado a una fuente de poder. Hacia el final del cuerno se ajusta el ngulo para poder captar todos los iones y convertirlos en electrones secundarios. Estos electrones secundarios son atrados a lo largo de un gradiente elctrico positivo en el cuerno, estos electrones chocan con la pared y ms electrones secundarios son expulsados, provocando amplificacin (Figura 34). La forma de dinodo continuo (frecuentemente llamado channeltron) es curva para prevenir que iones positivos causen seales de ruido debido a ionizacin secundaria de molculas residuales de gas.
Figura 34. Principio general y entrada de muestra de un dinodo continuo (channeltron)
La rpida respuesta y alta sensibilidad, con una ganancia de 10 hacen que el detector multiplicador de electrones sea indispensable en sistemas como el GC/MS.
Detector Daly
Una corriente de iones positivos pasan por la hendidura del detector y son atrados hacia un ctodo de aluminio (el botn Daly) teniendo un gran potencial negativo (-15000 V). Ocurre el impacto con el botn Daly, el cual esencialmente sirve como un dinodo de conversion que produce ms de ocho veces electrones secundarios que son atrados hacia un aparato centelleante, los electrones secundarios generan fotones que son amplificados en un fotomultiplicador (Figura 35).
Figura 35. Detector Daly
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Espectrometra de Masas El detector Daly tiene la ventaja de que no opera bajo vaco, puede detectar iones de masas grandes, y puede detectar iones estables y metaestables, pero solo es capaz de detectar iones de alguna m/z especfica ya es un detector de canal simple.
Detector de Microcanales
Un arreglo de capilares de vidrio huecos (de 10-25mm de dimetro), unidos a un material emisor de electrones, formando un microcanales. Manteniendo estos microcanales a un alto voltaje permite a los iones golpear el material y expulsar electrones, esto causa una avalancha, creando electrones secundarios con una ganancia de 3 4 10 -10 (Figura 36). Estos detectores son tiles en seales de baja intensidad.
Figura 36. Principio del detector de microcanales
Los microcanales pueden tambin emitir electrones a travs de pantallas fosforescentes. Un detector de arreglo de fotodiodo es usado para convertir los fotones liberados en seales elctricas (Figura).
Figura 37. Detector de arreglo de fotodiodo.
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ADQUISICIN Y PROCESAMIENTO DE DATOS

En los 60s y 70s el oscilgrafo de rayo de luz fue el primer aparato de registro con suficiente respuesta de alta frecuencia para registrar en forma precisa los espectros de masas. Hasta el desarrollo de la minicomputadora fue posible hacer procesamiento de datos al tener algoritmos para su proceso e interpretacin.
Figura 37. Componentes esenciales de un sistema de adquisicin de datos
La salida anloga del detector es tpicamente una seal de voltaje que vara en funcin del tiempo, esta es convertida a una seal digital por medio de un convertidor anlogo-digital. Los datos digitales son procesados y almacenados en el CPU de una computadora. El sistema de datos almacena solo la informacin de los picos del espectro de masas (valor de m/z y la intensidad) para cada anlisis. Estos datos son entonces procesados para producir diferentes representaciones al interpretar y procesar los datos por medio de la computadora. Los datos procesados son entonces desplegados ya sea en el monitor o impresos en formato de grfica de barras.
Figura 38. Diagrama de procesamiento de datos. ARRIBA: Seal analoga. EN MEDIO: Seal procesada. ABAJO: Datos procesados mediante software y produciendo el espectro de masas.
La calibracin del espectrmetro de masas, en el eje de masa es llevado a cabo al introducir una muestra de un compuesto cuyo espectro de masas es bien conocido. Dependiendo del tipo de algoritmo utilizado, el operador puede ingresar los valores conocidos de m/z a los picos en el espectro de masas del compuesto de calibracin, la computadora realizar los ajustes necesarios en la escala de masa. En otros casos, el operador puede ajustar los parmetros de la escala de masa hasta que en la computadora se indiquen los valores apropiados de m/z de los picos conocidos en el espectro de masas del compuesto de calibracin. 30
Procesamiento de datos
Debido a las grandes cantidades de informacin que son generadas y la gran cantidad de parmetros que cambian en un periodo de tiempo, las computadoras son una herramienta esencial en espectrometra de masas, tanto para control del equipo, adquisicin, almacenamiento y presentacin de datos. Los sistemas de procesamiento de datos generalmente incluyen programas tiles en cuantificacin, interpretacin de los espectros de masas y comparacin de compuestos a travs de consulta de bases de datos va internet. La estrategia es utilizar un sistema de procesamiento datos que permita adquirir datos constantemente, y obtener los datos tan rpido como sea posible teniendo una buena relacin seal-ruido sin abusar de los principios de operacin del espectrmetro de masas. Esto usualmente es completado en un ciclo de examen del orden de 1 segundo, adquiriendo un nuevo espectro de masas cada segundo, esto tiene la ventaja de no perder datos importantes pero tiene la desventaja de que se deben adquirir grandes cantidades de datos. El anlisis ser realizado con el problema de tener que determinar cuales datos son tiles y necesarios para tener el resultado final. Los sistemas de procesamiento de datos emplean procedimientos de bsqueda hacia adelante o de bsqueda reversa. En la bsqueda hacia adelante, un espectro no definido es comparado con cada miembro de una biblioteca de espectros de referencia. Un resultado siempre ser alcanzado, al calificar son cierta clase de parecido respecto a las referencias, esto tiene la ventaja de sugerir el tipo de compuestos presentes en la muestra si el grado de parecido no es aceptable o suficiente. En la bsqueda reversa, un banco de datos es comparado con el espectro no definido para determinar si algunos picos de referencia estn presentes en el espectro analizado. Un resultado puede lograrse si el espectro no definido tiene algunos picos extras que pueden ser comparables a los espectros de referencia. No se podr identificar un compuesto si no se tiene un espectro de referencia que corresponda en la base de datos. Las computadoras pueden realizar bsquedas en bases de datos de espectros de masas, para ello se basan en algoritmos de probabilidad, llamados algoritmos PBM (probability-based-matching) y variantes del algoritmo INCOS, el cual busca parecido entre los picos ms intensos del espectro (utiliza los 16 picos ms intensos) contra una base de datos.
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APLICACIONES
Anlisis de estructura y masa
En el anlisis de estructura por medio de espectrometra de masas de la acetona (C3H6O) se observan diferentes fragmentos de iones y el ion molecular en m/z=58 (Figura 39).
Figura 39. Espectro de masas de la acetona (C3H6O)
Los iones ms intensos han sido marcados con su m/z. Los fragmentos de ion son usados por los espectrometristas de masas para deducir las estructuras moleculares. Algunas veces los smbolos [+] y [-] son usados para indicar los iones radicales, esta informacin es til para determinar los patrones de fragmentacin. Se observa que la prdida de 15 Da del ion molecular de la acetona da un ion de m/z=43 indicando la presencia de un grupo metil (CH3) en la molcula original, la prdida de 28 Da da un ion con m/z= 15 sugiriendo la presencia de CO. Al analizar estas prdidas y organizando las posibles estructuras a partir de los iones obtenidos, se puede deducir la estructura del compuesto original. Algunas prdidas comnmente observadas son de agua (H2O 18 Da), amonio (NH3 17 Da) y grupo fenil (C6H5 77 Da). Otra aplicacin de la espectrometra de masas es la determinacin de masas. Cada istopo de cada elemento (excepto para carbono al cual se le asigno un valor de 12.00000 Da) tiene una masa no entera nica. La determinacin de mediciones de masa permite determinar composicin qumica. En el espectro de masas (Figura 40) es posible distinguir entre monxido de carbono (CO, m/z=27.995) y nitrgeno (N2 m/z=28.006) por mediciones exactas de sus masas
Figura 40. Espectro de masas CO y N2.
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Sistemas Acoplados
La espectrometra de masas es un sistema de deteccin til en tcnicas de separacin tales como cromatografa de gases (G C), cromatografa lquida (LC), electroforesis capilar y otras, debido a que es altamente sensible y es capaz de identificar compuestos qumicos en forma precisa. El reto al acoplar el espectrmetro de masas a un sistema de separacin es el mantener el vaco necesario al introducir la muestra desde el cromatgrafo. Interfaces que restringen o reducen el flujo de gas de entrada al espectrmetro permiten acoplar el cromatgrafo de masas y el espectrmetro de masas (GC/MS) (Figura 41).
Figura 41. Sistema GC/MS
Al vaporizar el solvente de una cromatografa lquida este representara un volumen de 100-100 veces ms grande que el gas usado en cromatografa de gases. Se han desarrollado interfaces que resuelven este problema al eliminar este exceso de gas usando calor y vaco, en algunos casos con ayuda de una corriente de gas que ayuda a secar. Los sistemas acoplados LC/MS utilizan ionizacin qumica (CI) o electrospray (ESI) como mtodos de ionizacin. Tabla 7. Compuestos aptos para anlisis LC/MS Bajo peso molecular Peso molecular medio Peso molecular alto < 1 kDa 1 -10 kDa > 10 kDa Drogas, compuestos endgenos, vitaminas, pesticidas, toxinas, Polipptidos sintticos y Polipptidos, protenas, conjugados (glucoronidos, SO4) polisacridos. oligonucletidos, polisacridos. de compuestos con m/z > 50.
Figura 42. Sistema LC/MS
En GC/MS y LC/MS, los datos obtenidos consisten en una serie de espectros de masas que son adquiridos secuencialmente en tiempo. Para generar esta informacin, el espectrmetro de masas examina un rango de masas (por ejemplo m/z de 30 a 500) repetitivamente durante la corrida cromatogrfica. Si se realiza un examen cada segundo y se hace una corrida de 30 minutos, se obtendrn 1800 espectros. La informacin obtenida puede ser analizada en diferentes formas. En primer lugar, las intensidades de todos los iones en cada espectro son sumadas, y esta suma graficada como funcin del tiempo de retencin cromatogrfico (TIC) cuya apariencia es similar a los datos de salida de un detector cromatogrfico convencional (Figura 43 parte superior). Otra forma es desplegar cualquiera de los espectros obtenidos (Figura 43 parte central), cada pico en TIC representa un compuesto eluido que puede ser identificado al analizar su espectro de masas obtenido es ese punto. La intensidad a una m/z especfica en el transcurso de la corrida 33
Espectrometra de Masas cromatogrfica puede ser desplegada para producir un perfil de corrientes de iones seleccionados o un cromatograma de masas (Figura 43 parte inferior). Esta tcnica puede ser usada para encontrar componentes en una mezcla compleja sin tener que examinar cada espectro en forma individual.
Figura 43. Anlisis de espectros en sistemas acoplados.
Acoplando dos etapas de anlisis de masas (MS/MS) puede ser muy til en la identificacin de compuestos en mezclas complejas y en la determinacin de sustancias no conocidas. El examen de iones producidos es el modo MS/MS mas frecuentemente usado, se generan los espectros de masas de iones producidos de un valor m/z especfico. De una mezcla de iones generados o colectados, se seleccionan aquellos iones que tengan un valor m/z particular, esta es la primera parte del anlisis. Estos iones son fragmentados y los productos de la fragmentacin de estos iones son analizados es una segunda etapa del anlisis de masas (Figura). Si la muestra es un compuesto puro y se realiza fragmentacin de los iones producidos, los espectros producidos de esta fragmentacin proveern informacin adicional respecto la estructura del analito. Si la muestra original es una mezcla y se usa ionizacin suave, la segunda etapa de MS puede usarse para obtener un espectro de masas para cada componente en la mezcla. MS/MS puede tambin usarse para eliminar interferencias en experimentos SIM donde se producen varias seales de iones de una m/z especfica.
Anlisis cuantitativos
Cuando ya se conoce el espectro de masas de un compuesto especfico, se puede confirmar la presencia de sustancias especficas o medir la cantidad presente en la muestra. Este tipo de anlisis son rutinarios en mediciones de contaminantes ambientales y estudios farmocinticos donde se requiere cuantificar analitos en concentraciones muy bajas y adems en mezclas complejas. El espectrmetro de masas se ajusta para monitorear solo valores especficos de m/z representativos de las molculas a analizar. El tipo de ionizacin utilizado puede favorecer la produccin de ciertos tipos de iones, incrementando la sensibilidad y manteniendo la seal de ion en su valor de m/z.
Figura 44. Sistema MS/MS
En la Figura 45, se muestra un espectro en el cual se monitorearon solo los valores de m/z=158 y m/z=160 durante una corrida cromatogrfica. Este proceso se conoce como monitoreo selectivo de iones (SIM).
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Figura 45. Monitoreo selectivo de iones (SIM)
Este espectro es un anlisis cuantitativo de un derivado de 5-fluorouracil en plasma, la respuesta de la sustancia de inters es medida relativamente en comparacin con un estndar interno aadido a la muestra. En la parte superior de la Figura se muestra el perfil SIM del ion a una m/z=158, el compuesto de inters produce el pico central, dos pequeos picos aparecen y corresponden a compuestos que tambin producen iones a m/z=158. En la parte inferior de la Figura es el perfil SIM de la misma molcula teniendo el N15 sustituido por N14 normal en dos posiciones, debido a que ambos nitrgenos estn sustituidos, la seal de este ion es a m/z=160, 2 Da mas pesado. Aunque la muestra y es estndar tienen el mismo tiempo de retencin, son detectados en forma separada ya que tienen masas diferentes. Los estndares pueden ser sustancias altamente relacionadas o qumicamente idnticas pero sintetizadas sustituyendo un istopo de uno de los elementos como en este caso. La medicin de istopos es til en diferentes reas tales como estudios metablicos que utilizan sustancias marcadas isotpicamente, en estudios climticos al usar istopos de oxgeno y carbono que son temperatura dependientes, en clculo de edades de materiales (por ejemplo rocas) al medir plomo, neodimio o estroncio. La relacin de istopos de un elemento puede ser determinada en forma precisa y exacta por medio de espectrometra de masas, pero es necesario reducir los compuestos a molculas simples antes de la medicin, los compuestos orgnicos son reducidos a CO2, H2O y N2.
Anlisis de pptidos
Para realizar anlisis de pptidos, una vez obtenida la protena o extracto de protenas, se realiza una digestin proteoltica para obtener pptidos, esta mezcla de pptidos son separados y purificados por medio de cromatografa de gases (GC), HPLC u otras tcnicas de separacin (Figura 45). Los pptidos separados y purificados son sometidos a espectrometra de masas para obtener los espectros de las diferentes fracciones. Se analizan los espectros obtenidos, la relacin m/z y la intensidad de los iones obtenidos en los diferentes espectros son usados para identificar los pptidos de las muestras.
Figura 45. Anlisis de pptidos por medio de espectrometra de masas.
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Iones de pptidos
Cuando un pptido es fragmentado por colisin con molculas un de gas neutro, la fragmentacin es inducida por transferencia de energa cintica de las molculas del gas al pptido. Cuando un pptido es fragmentado en un enlace peptdico particular entre carbonilo (-CO-) y nitrgeno (-NH-), se forman dos fragmentos, un fragmento del pptido retiene la carga positiva en el C terminal del pptido ionizado y es llamado in-y, el otro fragmento retiene la carga positiva en el N terminal y es llamado in-b. Un in-b generalmente tiene un in-y complementario. Cuando un pptido que tiene una sola carga es fragmentado, la carga se mantiene solo en un fragmento y solo aquel que tenga la carga podr ser detectado mientras que el otro permanecer como fragmento neutro no detectable. Pptidos doblemente cargados producirn dos iones cargados.
Figura 46. Iones formados durante fragmentacin de pptidos.
Durante la fragmentacin de pptidos pueden formarse otros tipos de iones adems de los iones-y y los ionesb. Los iones-a y los iones-x, los iones-c y los iones-z, siendo complementarios entre a-x y c-z. Los iones a-x se forman por rompimiento entre el pptido y el carbonilo en el extremo N terminal. Los iones c-z se forman al haber un rompimiento entre el nitrgeno (-NH-) y el resto del pptido. Los iones a, x, c y z se forman en condiciones de alta energa y los b-y en baja energa.
Secuenciacin de pptidos
La secuenciacin de novo de pptidos es llevada a cabo al determinar la secuencia directamente del espectro de masas sin consulta de bases de datos. Las diferencias entre m/z sucesivas se usan para determinar la secuencia aminoacdica del pptido. Se asume que solo ocurre formacin de iones b-y durante el proceso de fragmentacin del pptido, se forman iones-b ascendentes desde el extremo N terminal mientras que se forman iones-y en forma descendente desde el C terminal. Se determinan las m/z de los fragmentos aminoacdicos. Al comparar las diferencias entre masas sucesivas de cada serie y comparndolos con las masas conocidas de residuos de aminocidos, se puede determinar la secuencia de un pptido. Tanto los iones de la serie b como de la serie y indican la misma secuencia.
Figura 47. Secuenciacin de novo de un pptido AVAGCAGAR
La precisin de la secuencia deducida es limitada por las caractersticas del equipo. La calidad de la reaccin de fragmentacin, ya que en ocasiones no ocurre el corte y los fragmentos obtenidos diferirn en algn aminocido que no podr deducirse, por ejemplo, en presencia de prolina la fragmentacin puede no ocurrir y causar errores en la secuencia. 36
Identificacin de protenas
Para identificar protenas se utilizan las huellas de masas de pptidos (peptide mass fingerprinting) o huellas peptdicas, este mtodo utiliza los pptidos obtenidos de la digestin enzimtica de la protena para obtener sus espectros de masas. Los pptidos son identificados por comparacin contra una base de datos, ya que las masas de los pptidos forman en conjunto la huella peptdica de la protena, es posible identificar la protena de inters. Factores importantes que deben ser considerados en este procedimiento es la pureza de la protena y la precisin de los datos obtenidos, la precisin de los datos disponibles en las bases de datos y el tipo de algoritmos usados al comparar las masas de los pptidos (Figura 48).
Figura 48. Proceso de identificacin de pptidos por medio de huellas peptdicas.
El resultado de este anlisis puede sufrir algunos problemas al tener presencia de seales provenientes de pptidos que no estn presentes en la protena de inters debido a que la purificacin dejo algunas protenas que contaminaron la muestra o presencia de pptidos contaminantes. Es posible adems obtener resultados falsos positivos al comparar los espectros obtenidos contra las bases de datos, o que la protena de estudio tenga modificaciones postraduccionales desconocidas que podran alterar el anlisis, algunas veces es difcil distinguir entre protenas que son muy similares o que podran tener las mismas huellas peptdicas. Se dispone de tres tipos de herramientas para al anlisis de huellas peptdicas: 1. Programas que asignan puntuaciones a las masas de los pptidos obtenidos que coinciden con las masas de pptidos de las bases de datos. Por ejemplo: PepSea: http://www.unb.br/cbsp/paginiciais/pepseafingerprint.htm Peptldent: http://us.expasy.org/tools/peptident.html 2. Programas que asignan puntuaciones basados en la longitud del pptido y la protena. Por ejemplo: MOWSE: http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse MS-Fit: http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm 3. Programas que asignan puntuaciones probabilisticas para determinar la significancia de los resultados obtenidos entre las muestras y las bases de datos. Esto es para evitar resultados no significativos. Por ejemplo: PROWL: http://prowl.rockefeller.edu/ MASCOT: http://www.matrixscience.com/cgi/index.pl?page=/search_form_select.html
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HERRAMIENTAS PARA ANLISIS DE PROTENAS POR ESPECTROMETRA DE MASAS

Protein Prospector
Coleccin de herramientas de la UCSF Mass Spectrometric Facility usadas para identificar protenas usando datos de espectrometra de masas y bases de datos. http://prospector.ucsf.edu/
ExPASy Proteomics Tools

Programas del Expert Protein Analysis System (ExPASy) del Swiss Institute of Bioinformatics. Para identificacin y caracterizacin de protenas, prediccin de modificaciones postraduccionales, topologa y estructura de protenas. http://us.expasy.org/tools/
MASCOT
Identificacin de protenas basado en bases de datos de pesos de pptidos, usa mtodos probabilisticos para calcular significancia entre datos. http://www.matrixscience.com/cgi/index.pl?page=/search_form_select.html
PeptideSearch
Identificacin de protenas en base a sus espectros de masas. http://www.mann.embl-heidelberg.de/GroupPages/PageLink/peptidesearchpage.html
MOWSE
MOWSE (MOlecular Weight Search). Utiliza pesos moleculares obtenidos por digestin de protenas con una proteasa conocida y busca en bases de datos de pptidos para identificar protenas, de 3 a 4 pptidos son necesarios para identificar una protenas entre una base de datos de 50000 protenas. http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse
Mass Spec Tools

Herramientas de Scientific Information Services usadas para generar y graficar espectros de masas y calcular distribucin de istopos. http://www.chemsw.com/13057.htm
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DEFINICIN DE TRMINOS
Relacin masa/carga
Esta expresin, abreviada m/z, es la relacin del nmero de masa (m) de una partcula dada entre el nmero (z) de unidades cargadas electrostticamente (e) que posee la partcula. As, m/z es una relacin adimensional que es el parmetro medido por el analizador de masas. La masa de una partcula dada es igual a la suma de sus masas atmicas (en Daltons) de todos los elementos que componen la partcula. El smbolo para las unidad 12 de masa es u, y corresponde a 1/12 de la masa del C, al que se la ha asignado un valor de 12.000000 por convencin.
Iones doblemente cargados

Es posible para una molcula perder dos electrones durante el proceso de ionizacin. Estos iones que estn doblemente cargados producirn un pico en el espectro de masas en un valor m/z numricamente igual a la mitad de la masa molecular del ion. Los iones doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masa para la mayora de los compuestos. Sin embargo, para aquellas molculas que los produzcan en forma estable, los picos correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la interpretacin de datos.
Ion molecular
El ion molecular resulta de la ionizacin de la molcula a analizar. Este ion representa la molcula intacta y es el ltimo precursor de todos los iones fragmentados que componen el espectro de masas. El pico del ion molecular aparece a un valor m/z numricamente igual al peso molecular del compuesto.
Pico base
Es el pico ms intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%.
Intensidad relativa
La intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparacin con el pico base. Se representa como % respecto al pico base que es 100%. Por convencin, este dato se indica en la izquierda del espectro de masas.
Porcentaje total de ionizacin

Este trmino expresa la abundancia de un ion individual comparado con la suma de las abundancias de todos los iones en un rango de masa especifico. La escala de porcentaje total de ionizacin esta representada a la derecha del espectro de masas con el smbolo (%Sn), este dato puede ser utilizado para comparar diferentes espectros de masas de diferentes compuestos.
Espectro de masas
Un espectro de masas es una grfica de intensidad relativa del ion como funcin de la relacin masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado como un histograma simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades sirven para establecer el peso molecular y estructura del compuesto a ser analizado. Debido a que ocurre la fragmentacin del analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro a valores m/z menores que la molcula completa ionizada (ion molecular) a partir de es tos datos se deduce la estructura y peso molecular de la molcula completa.
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REFERENCIAS
Bafna V and Edwards N. SCOPE: A probabilistic model for scoring tandem mass spectra against a peptide database. Bioinformatics. 2001;17 Suppl 1:S13-21 Clauser KR, Baker P, Burlingame AL. Role of Accurate Mass Measurement (10 ppm) in Protein Identification Strategies Employing MS or MS/MS and Database Searching. Anal Chem 1999 Jul 15;71(14):2871-82. Coligan (Editor), Ben M. Dunn (Editor), Hidde L. Ploegh (Editor), David W. Speicher (Editor), Paul T. Wingfield (Editor). Current Protocols in Protein Science. June 1995 Wiley Eng J, McCormack A and Yates J. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society of Mass Spectrometry, 1994, 5, 976-989 Kinter, M.; Sherman, N. E.. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. Wiley Interscience. 2000. New York, USA. Pappin DJC, Hojrup P, Bleasby AJ. Rapid Identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. Current Biology (1993), vol 3, 327-332 Perkins, DN, Pappin, DJ, Creasy, DM and Cottrell, JS. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 1999; 20(18):3551-3567. Pevzner PA, Mulyukov Z, Dancik V, Tang CL. Efficiency of database search for identification of mutated and modified proteins via mass spectrometry. Genome Res 2001 Feb;11(2):290-9 Watson, J.T.. Introduction to Mass Spectrometry. Lippincott-Raven Publishers. Third Edition. 1997. Philadelphia, PA, USA. Wilkins MR, Gasteiger E, Bairoch A, Sanchez JC, Williams KL, Appel RD, Hochstrasser DF. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol 1999;112:531-52.
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Espectrometría Masas

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Espectrometra de Masas

PRESENTA: GERMN PLASCENCIA VILLA

JUNIO DE 2003 CUERNAVACA, MORELOS

HISTORIA DE LA ESPECTROMETRA DE MASAS

Figura 1. Parbola espectrogrfica construida por J.J. Thomson

Figura 2. Componentes bsicos de un espectrmetro de masas

Figura 3. Sondas directas (direct probes)

Impacto Electrnico (Electron Impact EI)

Figura 4. Ionizacin por Impacto Electrnico (EI)

Ionizacin Qumica (Chemical Ionization CI)

Figura 5. Ionizacin Qumica (CI)

Tipo de analito Polaridad baja Polaridad media Polaridad alta + Iones K A

Ionizacin de Campo (Field Ionization FI)

Tipo de analito Polaridad baja Polaridad media Polaridad alta

Desorcin de Campo (Field Desorption FD)

Figura 7. Esquema general de ionizacin por FD

Figura 8. Sonda y emisor de FD

Figura 9. Supericie del emisor (80x80mm)

Bombardeo con tomos Rpidos (Fast-Atom Bombardment FAB)

Figura 11. Sistema general de FAB

Figura 12. FAB gun

Ionizacin por Electrospray (Electrospray Ionization ESI).

Figura 13. Cono de Taylor

Figura 14. Reduccin de tamao de gota en ESI

Figura 15. Proceso general de Ionizacin por Electrospray (ESI)

Figura 17. ESI, microESI y nanoESI

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Figura 18. Proceso de Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Figura 19. Laser UV

Figura 22. Compuestos utilizados en las matrices MALDI

Efecto de campos magnticos sobre los iones

Principios de los analizadores de masas

Figura 23. Comparacin entre espectrofotmetro y espectrmetro de masas

Espectrmetro de masas de sector magntico (Magnetic Sector Mass Spectrometer)

Figura 24. Espectrmetro de masas de sector magntico.

Espectrometra de Masas Despejando velocidad (v) tenemos:

Espectrmetros de masas de cuadrupolo (quadrupole)

Figura 25. Analizador cuadrupolo (quadrupole)

Figura 26. Diagrama de estabilidad a-q

Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight TOF)

Figura 27. Analizador TOF

La energa cintica de un ion se define por: T = eV = mv 2 La velocidad del ion: v = 2zeV m

Figura 28. Reflectron

Analizador de trampa de iones (Ion-Trap)

Figura 29. Analizador de trampa de iones (ion-trap)

Figura 30. Diagrama de estabilidad a-q

Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)

Figura 31. Analizador FT-ICR

Figura 32. Copa Faraday

Multiplicador de Electrones (Electron Multiplier)

Figura 33. Multiplicador de electrones de dinodo discreto (discrete-dynodo)

Figura 34. Principio general y entrada de muestra de un dinodo continuo (channeltron)

Figura 35. Detector Daly

Figura 36. Principio del detector de microcanales

Figura 37. Detector de arreglo de fotodiodo.

ADQUISICIN Y PROCESAMIENTO DE DATOS

Figura 37. Componentes esenciales de un sistema de adquisicin de datos

Figura 39. Espectro de masas de la acetona (C3H6O)

Figura 40. Espectro de masas CO y N2.

Figura 41. Sistema GC/MS

Figura 42. Sistema LC/MS

Figura 43. Anlisis de espectros en sistemas acoplados.

Figura 44. Sistema MS/MS