Anlise do Smen para Reproduo Assistida

A anlise do smen constitui-se na pedra bsica da avaliao do fator masculino em reproduo assistida. O espermograma convencional inclui o estudo de aspectos particulares da funo espermtica como a concentrao, motilidade e morfologia, assim como, na quantificao e identificao de clulas no espermticas, anticorpos antiespermatozides e testes de penetrao. A amostra de smen deve ser coletada atravs de masturbao, em frasco estril, de plstico ou vidro, aps abstinncia sexual mnima de 48 horas. A amostra ser colhida em sala prxima ao laboratrio de anlise. No sendo possvel, a coleta poder ser realizada em outro local, porm o tempo de entrega do material para estudo, no deve ser superior a 30 minutos. Assim como, a temperatura ideal para transportar o material estaria entre 20 C e 37 C. Rotineiramente, a amostra ser identificada com o nome do paciente, data e horrio da coleta. Por outro lado, o paciente deve relatar qualquer perda de material durante o ato de coleta, ou quadro febril recente (ltimos 3 meses). Uma avaliao ideal da funo espermtica baseia-se na anlise de trs amostras de smen. Anlise Macroscpica Aparncia, cor e liquefao A amostra de smen normal possui cor branca opalescente, sendo homognea e se liquefaz `a temperatura ambiente em menos de 60 minutos. A amostra pode conter grnulos gelatinosos, os quais no se liquefazem, e neste caso, ser considerada heterognea. Um aumento da viscosidade ou consistncia poderia interferir no processo de determinao da concentrao dos espermatozides. A amostra que possui uma colorao marrom indicaria a presena de glbulos vermelhos. Em geral, as amostras com filamentos de muco que comumente acarretam uma incompleta liquefao, devem ser submetidas a um processo mecnico de liquefao pela passagem atravs de uma agulha de 19 G ou por processo qumico pelo uso da bromelina (concentrao de 1g por litro). pH. Uma vez liquefeita a amostra de smen, coloca-se uma aliquota sobre o papel de pH (faixa de pH 6.1 a 10), e observa-se aps 30 segundos a cor obtida, que ser comparada com a fita de calibrao colorimtica de pH. O pH determinado pelas secrees da prstata (cida) e vescula seminal (bsica). A medida do pH ser executada dentro do perodo de 1 hora da coleta do smen, e normalmente, varia entre 7.2 e 7.8. Obrigatoriamente, as amostras com pH superior a 7.8 devem ser avaliadas quanto a presena de infeco. Em caso de pH menor que 6.5, pode se levantar a suspeita de agenesia, ou ocluso das vesculas seminais. Viscosidade A viscosidade ou consistncia da amostra liquefeita pode ser estimada por gentil aspirao do smen em pipetas de 5 ml, seguida de fcil gotejamento. Dessa forma, a amostra ser classificada como normal quando gotas so formadas. No caso de viscosidade anormal verifica-se no processo de gotejamento a formao de um filamento de mais de 2 cm. O aumento da consistncia pode estar relacionado com disfuno prosttica por inflamao crnica. A consistncia anormal tambm pode intervir na avaliao de vrias caractersticas do smen, tais como a motilidade, concentrao ou determinao de anticorpos antiespermatozides. Volume O volume do ejaculado ser medido em cilindros, pipetas ou seringas graduadas, considera-se um volume normal de 2.0 a 5.0 ml. A maior parte do volume secretada pela vescula seminal, sendo que a prstata produz entre 0.5 a 1 ml. Um volume acima de 5 ml suspeito de infeco aguda nas glndulas anexas e quando inferior a 1.5 ml sugestivo de processo inflamatrio crnico ou ejaculao retrgada. Anlise Microscpica A anlise microscpica inicial da amostra de smen consta do estudo da concentrao, motilidade, morfologia, vitalidade, citologia geral, e dos testes de penetrao espermtica e hiposmtico. Concentrao Atualmente, a concentrao dos espermatozides medida atravs de cmaras de contagem (Makler, Horwell, Neubauer, etc). A cmara de Makler possui uma profundidade de 0.01 mm e uma marcao graduada de 100 quadrados (rea total de 1 mm2) cada um com 0.1 mm x 0.1 mm. Assim sendo, o volume compreendido na rea de 10 quadrados aps a colocao da lamnula de 0.001 mm3 ou 1 milho por ml (Figura 3.1). Tal fato, facilita a leitura direta da concentrao da amostra de smen (milhes por ml) pela simples contagem dos espermatozides presentes na rea de 10 quadrados. Em geral, coloca-se um volume de 10u l de esperma liquefeito no centro da cmara de Makler, adapta-se a lamnula e realiza-se a contagem em microscopia de fase em aumento de 200 vezes (Figura 3.2). Habitualmente, a concentrao dos espermatozides definida segundo as normas da Organizao Mundial de Sade (WHO, 1992) : A. Normozoospermia : > 20 x 106 espermatozides/ml. B. Oligozoospermia: < 20 x 106 espermatozides/ml. C. Polizoospermia : > 200 x 106 espermatozides / ml. D. Azoospermia : nenhum espermatozide no ejaculado.

Motilidade A motilidade tambm realizada em cmara de contagem com microscopia de fase e aumento de 200 vezes . Uma alquota de smen de 10u l dever ser depositada na cmara, executando-se uma contagem de 100 espermatozides, o processo ser sempre em duplicata. Caso ocorra uma diferena > 10% entre as duas avaliaes ser executada uma mdia das 3 observaes que ser relatada como a motilidade final. A motilidade dos espermatozides ser classificada segundo os padres da Organizao Mundial de Sade (WHO, 1992) : Tipo A espermatozides mveis com progresso rpida. Tipo B - espermatozides mveis com progresso lenta. Tipo C espermatozides mveis porm sem progresso. Tipo D - espermatozides imveis. Finalmente, a amostra de smen ser considerada normal ou anormal segundo o critrio : Normal : >50% do tipo A e B. Anormal : < 50% do tipo A e B. Morfologia A morfologia realizada atravs da colorao de Shorr e sua avaliao executada aps a anlise de dois esfregaos de 10u l de smen fresco. Um mnimo de 200 espermatozides so estudados no aumento de 1000 vezes (Figura 3.3). Os espermatozides so classificados quanto aos aspectos morfolgico em dois grupos : A- Normal : A cabea ser levemente ovalada, nica, lisa, sem gotas citoplasmticas e com o acrossoma ocupando cerca de 40% a 70% da cabea. O dimetro varia de 3 a 5 um, podendo apresentar at 2 vacolos citoplasmticos. A pea intermediria deve medir de 6 a 10 um, alinhar-se com o eixo longitudinal da cabea, e no apresentar expanses laterais. A cauda ser nica e desenrolada, com um tamanho de 45 um (Figura 3.4). B - Anormal : 1. Defeitos no acrossoma : a. acrossoma pequeno (< 40%). b. acrossoma grande (> 70%). 2. Defeitos do corpo e pea intermediria : c. pea intermediria larga. d. gota intracitoplasmtica. e. pea intermediria separada. 3. Defeitos estruturais : f. piriforme. g. achatado. h. forma de ampulheta. i. superfcie irregular. j. mais que dois vacolos k. achatado no stio de implantao da cauda. l. no ovalada de um lado m. redonda. 4. Defeitos da cauda : n. insero. 0. espiralada. p. ngulo > 90 . (Figura 3.5 - A a C) Alm disso, deve-se analisar as chamadas formas imaturas que so definidas como clulas esfricas que apresentam dimetro nuclear entre 4 e 9 um e ausncia de cauda. A morfologia espermtica normal segundo a Organizao Mundial de Sade (WHO, 1992) definida pela presena de formas normais em 30% ou mais dos espermatozides examinados. Todavia, usando-se os critrios de Kruger (1986)

baseado na avaliao morfolgica e subsequente performance em fertilizao "in vitro" (FIV), define-se como morfologicamente normais os pacientes que mostraram formas normais em >14% dos espermatozides analisados. A colorao de Shorr usada de rotina para avaliao da morfologia espermtica. Em geral dois esfregaos de smen so preparados e aps sua secagem na temperatura ambiente, realiza-se a passagem nos seguintes reagentes : 1. lcool 70 por 15 minutos; 2.gua corrente; 3. Corante de hematoxilina por 45 segundos; 4. gua corrente; 5. lcool 90 ; 6. Corante de Shorr por 5 minutos; 7. lcool 95 (3 passagens sucessivas); 8. lcool absoluto (3 passagens sucessivas); 9. Alcool xilol (1:1); 10. Xilol (2 passagens sucessivas).

Vitalidade

A vitalidade ser avaliada atravs da combinao dos corantes eosina e nigrosina em esfregao de smen fresco. Esta tcnica baseia-se no fato de que as clulas mortas apresentam membranas lesadas que permitem a penetrao de corantes. Uma contagem de 100 espermatozides dever ser realizada em microscpio comum com aumento de 1000 vezes de forma a diferenciar as clulas vivas (no coradas) das mortas (coradas). Inicialmente, pipeta-se num tubo o volume de 100 ul de smen, adicionando-se duas gotas de eosina, e homogeiniza-se a soluo por 30 segundos. Em seguida, adiciona-se 4 gotas de nigrosina, homogeiniza-se por 45 segundos e executa-se um esfregao que aps a secagem submetido a uma anlise microscpica em aumento de 1000 vezes. O resultado apresentado na porcentagem total dos espermatozides vivos (no se coram). Lembrar que os espermatozides mortos coram-se de vermelho. As substncias usadas para a determinao da vitalidade so as seguintes : 1. Eosina amarela (Merck) na concentrao de 3% em soluo fisiolgica. Estocar na temperatura ambiente; 2. Nigrosina hidrossolvel (Merck) na concentrao de 8% em soluo fisiolgica. Filtrar e estocar na temperatura ambiente. Teste hiposmtico

A finalidade deste teste avaliar a integridade funcional da membrana celular dos espermatozides quando estes so colocados em uma soluo hiposmtica. Inicialmente, ocorre uma entrada de lquido para o interior da clula com a finalidade de se estabelecer o equilbrio osmtico. Como resposta a esse fato, a membrana dos espermatozides incha-se formando espaos lquidos na cauda dos espermatozides. A presena de inchao indicar que o transporte de fluidos atravs da membrana ocorreu normalmente, sendo esta, considerada ntegra do ponto de vista funcional. Assim sendo, uma soluo de 150 mOsm/l obtida com um meio de cultura (Menezo B2, GPM, IVF-50, etc) diluido em gua destilada (1/1). Em seguida, coloca-se 1.0 ml da soluo hiposmtica num tubo, e incuba-se na temperatura de 37 C por 10 minutos. O smen liquefeito num volume de 100 ul depositado no tubo, e o conjunto incubado por 30 minutos na temperatura de 37 C. Finalmente, retira-se uma alquota de 10 ul da suspenso de esperma, e observa-se um mnimo de 200 espermatozides em microscpio de fase com aumento de

200 vezes. O clculo da porcentagem de espermatozides que apresentam inchao na cauda determinado pela relao : THO (%) = Nmero de espermatozides com inchao x 100/Total de espermatozides contados A amostra de smen ser considerada normal quando mais que 60% dos espermatozides apresentarem inchao de cauda (Figura 3.6). O significado do teste hiposmtico na previso da fertilidade masculina ainda controvertido. Alguns grupos relatam uma pobre correlao entre o teste hiposmtico e os resultados posteriores em FIV (Barrat e cols., 1989, Jager e cols., 1991). Entretanto, Uchida e cols. (1992) mostraram que o teste hiposmtico efetivo na avaliao da capacidade de fertilizao dos espermatozides quando usada a tcnica de sedimentao-migrao ("swim-up") como mtodo de capacitao dos espermatozides. Em 1988, Liu e cols. selecionaram espermatozides mveis e utilizaram uma anlise de regresso, no achando correlao entre os escores do teste hiposmtico no smen (ou aps "swim-up") e a fertilizao de ocitos "in vitro". Franco Jr. e cols. (1995a) apesar de empregarem o mtodo de "swim-up" verificaram que o teste hiposmtico no foi eficaz na identificao de uma populao masculina com posterior falha total de fertilizao ou em diferenciar aquela com taxas de clivagem 50% daquela com valores < 50%. Alm disso, coeficiente de correlao "pi" entre os valores do teste hiposmtico e a taxa de clivagem embrionria foi fraco ( = 0.19).

Exame citolgico

O smen tambm possui outras clulas alm dos espermatozides, tais como as clulas epiteliais poligonais do trato uretral, clulas espermatognicas, leuccitos e hemcias. A concentrao destas clulas na amostra, pode ser estimada na cmara de Makler, por ocasio da contagem dos espermatozides. Nos casos em que a amostra de smen apresentar uma concentrao de leuccitos superior a 1 x 106 por ml, deve-se avaliar a possibilidade de o paciente possuir qualquer infeco nas glndulas sexuais acessrias. Em seguida, afastar a presena de protozorios (Trichomonas vaginalis) ou fungos (Candida albicans). Teste de penetrao espermtica O teste de penetrao espermtica tem como finalidade medir a habilidade dos espermatozides penetrarem no muco cervical, ou qualquer fluido substitutivo, como o muco bovino, clara de ovo, etc. Em virtude da dificuldade da obteno rotineira do muco cervical humano, executa-se em nosso laboratrio o chamado teste de penetrao na clara do ovo. Inicialmente, um volume da clara do ovo aspirado atravs de uma seringa e avaliado quanto ao pH, ajustando-se o mesmo entre 7.0 e 7.5 atravs de uma soluo tampo com Hepes (0.119 g/10ml, Sigma H6147). O teste de penetrao na clara do ovo realizado em capilar plano (Microslides, Vitro Dynamics Inc., USA), preenchido com clara de ovo, vedado na extremidade superior e colocado verticalmente em contato com smen liquefeito (200 ul). Em seguida, incuba-se na temperatura de 37 C por 90 minutos. A penetrao dos espermatozides avaliada por um sistema graduado em milmetros utilizando-se um microscpio de contraste de fase com um aumento de 400 vezes. O teste de penetrao considerado normal quando o espermatozide vanguardeiro atingiu ou ultrapassou, o valor de 30mm (Figura 3.7). Franco Jr. e cols. (1995b) testaram a hiptese de que o teste de penetrao dos espermatozides na clara do ovo (TPECO) poderia identificar uma populao masculina com maior probabilidade de fertilizar ocitos em cultura. O TPECO foi executado num total de 70 amostras de esperma durante a investigao prvia ao programa de FIV; posteriormente os 70 pacientes e suas esposas participaram do programa de FIV. O nvel mdio de clivagem embrionria foi de 68 33.6%. A sensibilidade do TPECO foi de 0.62, a especificidade de 0.85, o valor preditivo do teste anormal de 0.35, e o valor preditivo do teste normal de 0.95 quando usado para avaliar a habilidade da populao masculina formar embries. A eficcia (0.73) foi prxima da obtida com a anlise morfolgica dos espermatozides (0.79). Por outro lado, quando diferentes parmetros do smen (concentrao, morfologia e motilidade) e o TPECO foram comparados em termos de poder identificar populaes com >50% ou <50% de nveis de clivagem embrionria, apenas a morfologia e o TPECO mostraram significativa correlao com a taxa posterior de clivagem embrionria. Em concluso, o TPECO pode identificar uma populao masculina com maior probabilidade de fertilizar ocitos em cultura.

Teste do hamster

Desde o trabalho pioneiro de Yanagimachi (1976) que demonstrou a possibilidade da penetrao dos espermatozides humanos nos ocitos de hamster, diversos laboratrios tm usado esse mtodo na investigao do fator masculino em infertilidade. Essa tcnica avalia a capacidade de penetrao dos espermatozides "in vitro" sem o uso de ocitos humanos. Entretanto, uma anlise da literatura identifica uma dificuldade no estabelecimento das condies padres para esse teste (Rogers e cols., 1979; Cohen e cols., 1982). Em linhas gerais. o mtodo propicia o conhecimento de inmeras variveis que participam do processo de interao dos gametas "in vitro", apesar das ressalvas quanto a complexidade e elevado custo na sua instalao e manuteno. Em sntese, o smen colhido aps masturbao sendo submetido ao processo de capacitao laboratorial. Os espermatozides ativados so incubados na temperatura de 37 C com a finalidade de completarem o tempo ideal de capacitao (teste curto : 3 a 4 horas; teste longo : 18 a 20 horas). Em seguida, selecionam-se fmeas adultas de hamster que so submetidas ao mtodo de estimulao ovariana com gonadotrofinas para a obteno de uma superovulao. O "cumulus oophorus" retirado com a abertura dos ovidutos e submetidos ao da hialuronidase (0.1%). Tal fato permite a liberao de inmeros ocitos. Numa prxima etapa, os ocitos so colocados sob a ao da tripsina (0.1%) e perdem sua zona pelcida, fator limitante para a fertilizao interespcie. Habitualmente, entre 25 e 30 ocitos so incubados com uma concentrao de 2 a 10 milhes de espermatozides mveis por ml, durante o perodo de duas horas (teste curto). Aps esse perodo, o fenmeno de fertilizao determinado pela presena de espermatozides com cabea aumentada (inchao ceflico) dentro do ocito (Franco Jr. e cols., 1988). Com respeito aos critrios de interpretao do teste do hamster numa populao masculina frtil, ainda permanecem dvidas pois, enquanto Rogers e cols. (1979) consideram como normal o paciente que apresenta ndices de fertilizao iguais ou superiores a 15%, Hall (1981) e Werlin e cols. (1985) referem limite inferior de normalidade o valor de 20%, e validam o teste com um mnimo de trs exames repetidos com intervalo de tempo apropriado. A especificidade do teste do hamster relativamente boa, entretanto, sua sensibilidade na seleo das populaes infrteis no das melhores, ou seja, 24.2%. O critrio rigoroso na definio do valor anormal do teste de hamster fundamental, pois situaes clnicas reversveis, como a piospermia no lquido seminal, podem alterar de forma passageira os ndices de fertilizao dos ocitos (Berger e cols., 1982). Outro aspecto de real interesse, seria a determinao do verdadeiro papel do teste do hamster na previso da capacidade de fertilizao dos espermatozides humanos quando colocados em contacto com os ocitos das esposas. Hall e cols., (1983) analisando uma populao masculina que participava de um programa de FIV, observou que os maridos com ndices de fertilizao superiores a 14% fertilizaram, no mnimo, um ocito. Ao contrrio, aqueles com ndices inferiores a 14% falharam em fertilizar os ocitos em 80% das vezes. Foreman e cols. (1984) verificaram que nove homens de um total de quinze que falharam em fertilizar os ocitos de sua esposa "in vitro", conseguiram fertilizar os ocitos do hamster. Enfim, o valor clnico do teste do hamster na identificao do homem infrtil, tanto na previso da gravidez "in vitro" quanto "in vivo" ainda no est bem estabelecido. Alm disso, provvel que outros testes mais simples de previso do poder dos espermatozides fertilizar ocitos "in vitro" (Franco Jr. e cols., 1993) possam apresentar sensibilidade e especificidade idntica, ou superior, ao teste do hamster. Do ponto de vista clnico, a introduo da injeo intracitoplasmtica dos espermatozides (ICSI) causou uma diminuio geral no uso de testes de previso da fertilizao de ocitos em cultura como rotina na avaliao prvia ao emprego de tcnicas de reproduo assistida.

Referncias Bibliogrfica

Barrat C.L.R., Osborn J.C., Harrison P.E., Monks N., Dunphy B.C., Lenton E.A., Cooke I.D. - The hypoosmotic swelling test and the sperm mucus penetration test in determining fertilization of the human oocyte. Hum. Reprod., 4 : 430-434, 1989. Berger R.E., Karp L.E., Williamson R.A., Koehler J., Moore D.E., Holemes K.K. - The relationship of pyospermia and seminal fluid bacteriology to sperm function as reflected in the sperm penetration assay. Fertil. Steril., 37 : 557-564, 1982. Cohen J., Weber R.F.A., Van de Vijver J.C.M., Zeilmaker G.H. - In vitro fertilizing capacity of human spermatozoa with the use of zona-free hamster ova : interassay variation and prognostic value. Fertil. Steril., 37 : 565-572, 1982. Foreman R., Cohen J., Fehilly C.B., Fishel S.B., Edwards R.G. The application of the zona-free hamster egg test for the prognosis of human in vitro fertilization. Journal of In Vitro Fertilization and Transfer., 1 : 166-171, 1984. Franco Jr. J.G., Werlin L.B., Weathersbee P.S., Plowman M., Stone S.C. - Comparao entre o teste do hamster e a anlise espermtica comum numa populao masculina infrtil. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., 10 : 108-110, 1988.Franco Jr. J.G., Mauri A.L., Petersen C.G., Baruffi R.L.R., Campos M.S., Oliveira J.B. - Efficacy of the sperm survival test for the prediction of oocyte fertilization in culture. Hum. Reprod., 8 : 916-918, 1993. Franco Jr. J.G., Baruffi R.L.R., Mauri A.L., Petersen C.G., Campos M.S. - Previso de fertilizao de ocitos em cultura : teste hiposmtico versus teste de sobrevida dos espermatozides. Rev. Lat. Amer. Est. Fert., 9 : 7-10, 1995a.Franco Jr. J.G., Baruffi R.L.R., Mauri A.L., Petersen C.G., Campos M.S. - Pode a performance no teste de penetrao dos espermatozides na clara do ovo predizer a fertilizao de ocitos em cultura ?. Rev. Lat. Amer. Est. Fert., 9 : 59-63, 1995b.Hall J.L. - Relationship between semen quality and human sperm penetration of zona-free hamster ova. Fertil. Steril., 35 : 457-463, 1981. Hall J.L., Marik J., Engel D. Screening for human in vitro fertilization success using the hamster zona-free ovum test. Fertil. Steril., 39 : 412a, 1983. Jager S., Kremer J., Wijchman J. - Hypo-osmotic sperm swelling test does not assess fertilizing capacity of human spermatozoa. Arch. Androl., 26 : 195-197, 1991. Kruger T.F., Menkveld R., Stander F.S.H., Lombard C.J., Van der Merwe, J.P., van Zyl J.A., Smith K. - Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization. Fertil. Steril., 46 : 1118-1123, 1986. Liu D.Y., Du Plessis Y.P., Nayadu P.L., Johnston W.I.H., Baker H.W.G. - The use of in vitro fertilization to evaluate putative tests of human sperm function. Fertil. Steril. 49 : 272-277, 1988. Rogers B.J., Van Campen H., Ueno, M., Lambert H., Bronson R., Hale R. - Analysis of human spermatozoal fertilizing ability using zona-free ova. Fertil. Steril., 32 : 664-670, 1979. Uchida A., Takahashi K., Kitao M. - Usefulness of the hypo-osmotic swelling test for evaluation of sperm fertilization. Hum. Reprod., 7 : 1264-1267, 1992. Werlin L.B., Plowan M., Franco Jr. J.G., Weathersbee P.S., Stone S. - Zona-free hamster ova penetration test as a negative predictor of pregnancy. Fertil. Steril., 44 : S , 1985. World Health Organization Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge University Press, Cambridge, 1992. Yanagimachi R., Yanagimachi H., Rogers B.J. - The use of zona-free animal ova as a test-system for the assessment of fertilizing capacity of human spermatozoa. Biol. Reprod., 15 : 471-476, 1976.

Capacitao Espermtica
As tcnicas de reproduo assistida agem no tratamento da infertilidade conjugal pelo manuseio e transferncia de gametas e embries para o trato genital da mulher. Assim sendo, a coleta, o preparo e a obteno desses "agentes teraputicos" merecem cuidados especiais. A coleta do smen realizada atravs de masturbao, aps um perodo de abstinncia sexual de 3 a 5 dias. Esta a forma corrente de obteno do esperma, entretanto, quando no h condies para esse procedimento, outros mtodos so empregados (estimulao eltrica ou vibratria direta sobre a prstata ou pnis, puno das vias espermticas, bipsia do testculo, coleta e isolamento de espermatozides na urina). Por outro lado, os espermatozides de mamferos necessitam sofrer modificaes funcionais e estruturais para fertilizarem os ocitos. Habitualmente, o conjunto destas transformaes definido como capacitao espermtica (Austin, 1952). Originalmente, acreditava-se que estas mudanas ocorreriam apenas quando os espermatozides estivessem em contacto com o trato genital feminino. Do ponto de vista fisiolgico, essas alteraes deveriam ser progressivas desde que os espermatozides gastam um tempo para atingirem as trompas e iniciarem sua interao com os ocitos. Precocemente, adquirir a capacidade de fertilizar poderia ser um problema (Bedford e Chang, 1983). Todavia, subseqentes estudos mostraram que se pode obter capacitao "in vitro" dos espermatozides na presena de fluidos biolgicos ou simples meios de cultura (Chang, 1951). Em geral, os espermatozides capacitados so aqueles que apresentam reao acrossmica. Inicialmente, essas modificaes ocorrem ao nvel molecular da membrana plasmtica e resultam em alteraes morfolgicas (reao acrossmica) e fisiolgicas (hiperativao do flagelo). A reao acrossmica caracterizada pela fuso entre a membrana plasmtica e a acrossomal externa, resultando em formao de vesculas e permitindo a liberao de enzimas do contedo acrossmico (Figura 4.1). Os espermatozides necessitam reagir com componentes dos ocitos (clulas do "cumulus", fluido folicular, zona pelcida) para completarem a reao acrossmica. O processo de capacitao depende de alteraes da permeabilidade da membrana ligadas ao transporte dos ons Ca++. A modulao do on clcio fundamental para os espermatozides adquirirem a capacidade de fertilizao tendo esse processo 3 aspectos fundamentais :1 - a presena de uma TPA se capaz de bombar o Ca++ para fora da clula. 2 - o processo de troca de Ca++ (exterior) com Na+ para o interior. 3 - canais de clcio que facilitariam a rapidez de fluxo (Fraser, 1994). Por outro lado, existem vrias evidncias que sugerem a necessidade da presena de Ca++ no meio extracelular. Fraser (1982) tratou os espermatozides com Ca++ ionforo A23187 na presena de Ca++ extracelular, observando uma rpida passagem de Ca++ para dentro da clula, tal fato acompanhado de exocitose da regio acrossmica. Por outro lado, com o sucesso da injeo intracitoplasmtica de espermatozides (ICSI) ficou estabelecido que a reao acrossmica no pr-requisito para o ncleo do espermatozide participar no processo meitico (Liu e cols., 1995). A hiperativao caracteriza-se por mudanas no padro do batimento flagelar, fato que facilitaria a penetrao dos espermatozides atravs dos diversos envoltrios dos ocitos. Alm das diversas tcnicas de preparo do esperma, fatores biolgicos e farmacolgicos poderiam ser usados para melhorar a qualidade do esperma em laboratrio. Freqentemente, o soro humano empregado para enriquecer o meio de cultura aps inativao na temperatura de 56 C por 45 minutos. Acredita-se que este procedimento aumentaria a sobrevida dos espermatozides, assim como a taxa de fecundao e gravidez nos casos de oligoastenozoospermia (Makler e cols., 1980). Diversos trabalhos, porm, relataram que o fluido folicular age sobre os espermatozides de modo significativo, elevando sua motilidade, o poder de penetrao nos ocitos de hamster e a taxa de fertilizao dos ocitos humanos em cultura "in vitro" (Delgado e cols., 1987; Mortimer e Camenzind, 1989; Ghetler e cols., 1990; Chao e cols., 1991). Da mesma maneira, a adio de fluido folicular humano melhoraria a motilidade dos espermatozides e a taxa de gravidez aps inseminaes intra-uterinas (Blumenfeld e Nahhas, 1989; Mbizvo e cols., 1990). Na mesma linha de pensamento, Franco Jr. e cols. (1994) no observaram diferenas significativas entre a taxa de formao embrionria (total de embries obtidos / total de ocitos inseminados) quando os espermatozides foram capacitados com (tempo de incubao curta ou lenta) ou sem fluido folicular. Diferentemente, Revelli e cols. (1995) observaram que o fluido folicular e uma mistura de fluido folicular e peritoneal (mas no o fluido peritoneal isolado) podem induzir uma rpida reao acrossmica. Os derivados da metilxantina (cafena, teofilina, pentoxifilina) possuem a propriedade de estimular a motilidade progressiva espermtica pois inibem a adenosina cclica 3''-5'' monofosfato (AMP) fosfodiesterase levando a um aumento intracelular das concentraes de cAMP (Bunge, 1973; Yovich e cols., 1988). Fuse e cols. (1993) observaram que a pentoxifilina induziu "in vitro" um aumento da motilidade espermtica, com aumento da velocidade e da amplitude do deslocamento lateral da cabea dos espermatozides, fato observado at 120 minutos do incio da incubao. Em linhas gerais, os procedimentos laboratoriais de preparo e capacitao dos espermatozides podem ser divididos nos seguintes mtodos :A - Migrao. B - Sedimentao-migrao ou "swim-up". C - Separao por gradientes de densidade.

Mtodos de Migrao Migrao ascendente O mtodo de migrao ascendente ou vertical a mais simples tcnica de preparao espermtica, tambm chamado de camada. O esperma liquefeito depositado na parte inferior de um tubo contendo um volume de meio de cultura (Menezo B2, GPM, IVF-50, etc). Em seguida, incuba-se na temperatura de 37 C por um perodo de 45 a 60 minutos, permitindo, dessa forma, a migrao dos espermatozides para o meio. Em seguida, 80% da parte superior do meio de cultura retirada e os espermatozides obtidos usados para as tcnicas de reproduo assistida. Rotineiramente, o meio de cultura enriquecido com soro inativado da paciente a 30% e um volume de 1.5 ml colocado em tubo de Falcon. Em seguida, deposita-se no fundo do tubo sob o meio, cerca de 1.0 ml de smen liquefeito. Incuba-se por 45 minutos 37 C em atmosfera de CO2 a 5% (exceto para a tcnica de inseminao). Aps esse perodo, retira-se o sobrenadante que centrifugado em 200 g por 5 minutos. Posteriormente, dilui-se o sedimento obtido com 1 ml de meio e repete-se a centrifugao nas condies citadas. Finalmente, o segundo sedimento obtido ressuspenso no volume desejado. (Figura 4.2). Em caso de fertilizao "in vitro" (FIV), retirar o sobrenadante sob o segundo sedimento e adicionar 0.5 ml de meio enriquecido com soro inativado da paciente a 30%. Incubar durante 15 minutos 37 C. Retirar 0.4 ml do sobrenadante e transferir para novo tubo de Falcon, aps o que uma alquota de 10u l depositada numa cmara de Makler para avaliao da concentrao e motilidade dos espermatozides.

Migrao ascendente-sedimentao Tea e cols. (1983) descreveram um mtodo de migrao ascendente e sedimentao numa cmara especial (Figura 4.3). Lucena e cols. (1989) empregando este mtodo para capacitao dos espermatozides em procedimentos de FIV conseguiram fecundao oocitria em 85% dos pacientes com normozoospermia. As amostras no apresentaram espermatozides imveis, morfologicamente anormais, imaturos, demais clulas ou debris. O mtodo de capacitao espermtica atravs da migrao scendente-sedimentao requer a utilizao de cmara de TeaJondet-Scholler. Dessa forma, um volume de 1.5ml de meio de cultura enriquecido com 30% de soro inativado da paciente depositado na parte interna e externa da cmara. Em seguida, 0.2ml do smen liquefeito depositado nas laterais de fora da cmara e aps um perodo de incubao de 2 horas `a 37 C, retira-se 0.3ml do fundo do cone central da cmara. Em seguida, a concentrao e motilidade dos espermatozides analisada, acertando-se a concentrao conforme a tcnica de reproduo assistida indicada.

Mtodos de sedimentao-migrao ou "swim-up" O mtodo tradicional de sedimentao-migrao chamado de "swim-up". Recentemente, certas crticas foram levantadas sobre a tcnica de "swim-up", pela deteco da presena de radicais superxidos nos sedimentos formados aps as centrifugaes (Aitken e Clarkson, 1988). Tal fato, ocorrendo antes do processo de migrao, acarretaria leses irreversveis das membranas plasmticas dos espermatozides, basicamente compostas por fosfolpides e sensveis ao destes radicais oxidantes, prejudicando o futuro processo de capacitao. A tcnica de "swim-up" usada nos programas de reproduo assistida, especialmente quando o espermograma prvio foi considerado normal. Nessa situao, geralmente h uma alta proporo de espermatozides mveis, morfologicamente normais, ausncia de massas citoplasmticas anucleadas e debris, sendo os nveis de fertilizao excelentes, especialmente em FIV convencional. Os problemas de fertilizao com o "swim-up" surgiram quando se trabalhou com amostras de smen ricas em espermatozides anormais, mortos, debris, restos celulares, neutrfilos, macrfagos, etc. Na sedimentao-migrao, o esperma liquefeito distribuido em vrios tubos e lavado com meio de cultura suplementado com soro inativado da paciente a 30%, na proporo de 2 ml de meio para 1 ml de smen. Em seguida, executa-se duas centrifugaes consecutivas em 200 g por 5 minutos, sempre com subseqente eliminao do sobrenadante. Aps o que, um volume de meio de cultura cuidadosamente depositado sobre o sedimento resultante da ltima centrifugao, sendo incubado pelo tempo de 45 a 60 minutos `a 37 C em atmosfera de C02 a 5% (exceto para a tcnica de inseminao), para permitir a migrao dos espermatozides. Aps esse perodo, retirar o sobrenadante, analisar a concentrao e motilidade dos espermatozides recuperados e acertar a concentrao dos espermatozides conforme a tcnica de reproduo assistida indicada (Figura 4.4).

Mtodos de separao por gradientes de densidade Atualmente, o mtodo de gradientes de Percoll um dos mais utilizados, aumentando a recuperao e porcentagem de espermatozides mveis, especialmente nos casos de oligoastenozoospermia. Em 1981, Gorus e Pipeleers empregaram o Percoll pela primeira vez na separao espermtica. Esse mtodo consiste de uma filtrao dos espermatozides atravs de gradientes com diferentes densidades de Percoll, de forma que nas camadas de densidades inferiores so retidos os espermatozides imveis e componentes celulares do plasma seminal, nas camadas de densidade superiores permanecem os espermatozides mveis. Geralmente, o gradiente descontnuo de Percoll preparado atravs de uma sequncia de pipetagens das fraes 100%, 90%, 70%, 60% e 40%, sendo o esperma liquefeito depositado no topo da coluna que centrifugada por cerca de 20 a 30 minutos de 300 g a 600 g . As fraes 40%, 60%, 70% contm o plasma seminal, espermatozides imveis e outras clulas, enquanto que as demais fraes, onde se encontram os espermatozides mveis so diludas com meio de cultura e centrifugadas para eliminar o Percoll. Diversos pesquisadores simplificam ao mximo este mtodo propondo o uso de gradientes com um menor nmero de fraes de Percoll (Tredway e cols., 1990; Van der Zwalmen e cols., 1991). Por outro lado, Ord e cols. (1990) indicaram uma reduo no nmero (50%, 70%, 95%) e volume (0.3ml) das fraes de Percoll (Mini-Percoll) em casos de oligoastenozoospermia (menos que 5 x 106 espermatozides mveis por ml) e relataram uma fertilizao em 40% dos ocitos inseminados "in vitro" contra apenas 7% no grupo controle (swimup). No Centro de Reproduo Humana da Maternidade Sinh Junqueira usa-se o mtodo dos gradientes de Percoll da seguinte forma : 1 - Prepara-se uma soluo isotnica de Percoll (SI) com 9 ml de Percoll mais 1 ml de Ham F-10 (10 x concentrado). Ajusta-se a osmolaridade para 280 mOsm/Kg H20. Em seguida, adiciona-se penicilina na dose de 60 mg/l. Filtra-se a soluo em 0.22 m sendo estocada at 30 dias `a 4 C. 2 - O preparo dos gradientes de Percoll realizado com as seguintes diluies (Figura 4.5) : A. Soluo 90% : 1.35 ml de SI + 0.15 ml de meio de cultura com 30% de soro inativado (MC-30). B. Soluo 40% : 0.6 ml de SI + 0.9 ml de MC-30. Assim sendo, coloca-se 1.5 ml dos diferentes gradientes em tubo cnico de 15 ml (Corning). Acima do gradientes de 40%, deposita-se um volume at 3 ml de smen liquefeito. Centrifuga-se em 200 g por 20 minutos, no caso de amostras viscosas aumenta-se o tempo de centrifugao. Aps a centrifugao remove-se o plasma seminal e a camada do gradiente de 40%. Finalmente, lava-se o sedimento formado no fundo do tubo e a camada correspondente ao gradiente de 90% com 10 ml de MC-30, uma vez em 200 g por 10 minutos. O sedimento ressuspenso no volume desejado com MC-30. Nesse ponto, na execuo da tcnica de FIV, realiza-se um "swim-up" no ltimo sedimento com adio de 0.5 ml de MC-30, e incubao por 15 minutos em atmosfera de CO2 a 5% na temperatura de 37 C. Em seguida, acerta-se a concentrao de espermatozides para a inseminao dos ocitos. Por outro lado, uma soluo de Nycodenz tambm pode ser utilizada para preparar gradientes, selecionar e recuperar espermatozides mveis (Gellert-Mortimer e cols., 1988). Mauri e cols. (1993) analisaram um total de 17 ciclos de FIV com o objetivo de comparar os ndices de clivagem embrionria aps a inseminao de ocitos com espermatozides capacitados pela

tcnica modificada de sedimentao-migrao (grupo A) e pelos gradientes de densidade do Nycodenz (grupo B). Todas as amostras de smen eram normais quanto a concentrao e motilidade dos espermatozides. Os resultados no mostraram diferena entre os ndices de clivagem nos embries do grupo A versus os do grupo B. Assim sendo, no houve vantagem no emprego dos gradientes de densidade de Nycodenz na capacitao dos espermatozides em relao `a tcnica clssica modificada de sedimentao-migrao.

Referncias Bibliogrficas Aitken R.J., Clarkson J.S. - Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques. J. Androl., 9 : 367-376, 1988. Austin C.R. - The capacitation of the mammalian sperm. Nature., 170 : 326, 1952. Bedford J.M. e Chang M.C. - Significance of the need for sperm capacitation before fertilization in eutherian mammals. Biol. Reprod., 28 : 108-120, 1983. Blumenfeld Z., Nahhas F. Pretreatment of sperm with human folicular for borderline male infertility. Fertil. Steril., 51 : 863-868, 1989. Bunge R.G. - Caffeine stimulation of ejaculated human spermatozoa. Urology., 1 : 371-376, 1973. Chang M.C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into Fallopian tubes. Nature., 168 : 697-698, 1951. Chao H.T., Ng H.T., Kao S.H., Wei Y.N., Hong C.Y. - Human follicular fluid stimulates the motility of washed human sperm. Arch. Androl., 26 : 61-65, 1991. Delgado N.M., Reys R., Carranco A., Merchant H., Centano B., Rosado A. - Increased acrossome-reaction inducing activity of glycosaminoglycans by partial hydrolysis. Arch. Androlol., 19 : 223-228, 1987. Franco Jr. J.G., Mauri A.L., Petersen C.G., Baruffi R.L.R., Campos M.S., Oliveira J.B.A. - Embryo cleavage rates after oocyte insemination with capacitated sperms in the presence or absence of follicular fluid. Gynecol. Obstet. Invest., 37 : 145-149, 1994. Fraser L.R. - Ca2+ is required for mouse sperm capacitation and fertilization in vitro. J. Androl., 3 : 412-419, 1982. Fraser L.R. - Na+ requirements for capacitation and acrosomal exocytosis in mammalian sperm. Int. Rev. Cyt., 149 : 1-46, 1994. Fuse H., Sakamoto M., Ohta S., Katayama T. - Effect of pentoxifylline on sperm motion. Arch. Androl., 31 : 9-15, 1993. Gellert-Mortimer S.T., Clark G.N., Baker H.W.G., Hyne R.V., Jonhnston W.L.H. - Evaluation of Nycodenz and Percoll density gradients for the selection of motile human spermatozoa. Fertil. Steril., 19 : 335 - 341, 1988. Ghetler Y., Ben-Num I., Kaneti H., Jaffe R., Gruber A., Fegjin M. - Effect of sperm preincubation with follicular fluid on the fertilization rate in human in vitro fertilization. Fertil. Steril., 54 : 944-946, 1990. Gorus F.K., Pipeleers D.G. - A rapid method for the fractionation of human spermatozoa according to their progressive motility. Fertil. Steril., 35 : 662-665, 1981. Liu D.Y., Bourne H., Baker H.W.G. - Fertilization and pregnancy with acrosome intact sperm by intracytoplasmic sperm injection in patients with disordered zona pellucida-induced acrosome reaction. Fertil. Steril., 64 : 116-121, 1995. Lucena E., Lucena C., Gomez M., Ortiz J.A. - Recovery of motile sperm using the migration-sedimentacion technique in an in vitro fertilization embryo transfer programme. Hum. Reprod., 4 : 163-165, 1989. Makler A., Makler E., Itzkovitz J., Brandes J.M. - Factors afeccting sperm motility. IV. Incubation of human semen with caffeine. kallikrein, and other metabolically active compounds. Fertil. Steril., 33 : 634-640, 1980. Mauri A.L., Baruffi R.L.R., Petersen C.G., Campos M.S., Franco Jr. J.G. - ndices de clivagem embrionria aps inseminao de ocitos com espermatozides preparados atravs da tcnica de sedimentao-migrao modificada e por gradientes densidade de Nycodenz. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., 5 : 209-212, 1993.Mbizvo M.T., Burkman L.J., Alexander N.J. - Human follicular fluid

stimulates hyperactivated motility in human sperm. Fertil. Steril., 54 : 708-712, 1990. Mortimer D., Camenzind A.R. - The role of follicular fluid in inducing the acrosome reaction of human spermatozoa incubated in vitro. Hum. Reprod., 4 : 169-174, 1989. Ord T., Patrizio P., Marello E., Balmaceda J.P., Asch R.H. - Mini-Percoll : a new method of semen preparation for IVF in severe male factor infertility. Hum. Reprod., 5 : 987-989, 1990. Revelli A., La Sala G.B., Gallicchio D., Modotti M., Piffaretti-Yanez A., Massobrio M., Balerna M. - Effect of peritoneal fluid, follicular fluid, and their volumetric mixture on acrosomal reactivity in vitro. Fertil. Steril., 63 : 200-203, 1995. Tea N.T., Jondet M., Scholler R. - Procede d''isolement des spermatozoides mobiles du sperme humain por la mthode de "migration-sedimentation". Path. Biol., 31 : 688-690, 1983.Tredway R.D., Chan P., Hening I., Gullet A., Cheatwood M. - Effectiveness of stimulated menstrual cycles and Percoll sperm preparation in intrauterine insemination. J. Reprod. Med., 35 : 103-108, 1990. Van der Zwalmen P., Segal G.B., Geers L., Debauche C., Schoysman R. - Sperm morphology and IVF pregnancy rate : comparison between Percoll gradiente centrifugation and swim-up procedures. Hum. Reprod., 6 : 581-588, 1991. Yovich J.M., Edirishinghe W.R., Cummins J.M., Yovich J.L. Preliminary results using pentoxifylline in a pronuclear stage tubal transfer (PROST) program for severe male factor infertility. Fertil. Steril., 50 : 179 - 181, 1988.