Vt18 Ultimos Avances Diagnostico Molecular e Imagen Alzheimer

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Cecilia Gonzlez de Ordua Esther Garca Cristina Rodrguez Rivero Javier Benito
ltimos avances en el diagnstico molecular y por imagen de la enfermedad de alzheimer
informe de vigilancia tecnolgica
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Cecilia Gonzlez de Ordua Esther Garca Cristina Rodrguez Rivero Javier Benito
informe de vigilancia tecnolgica
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Coleccin de Informes de Vigilancia Tecnolgica madri+d

Dirigida por:
Jos de la Sota Rus

Coordinada por:
Fundacin madri+d para el Conocimiento CEIM Confederacin Empresarial de Madrid - CEOE
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El Crculo de Innovacin en Biotecnologa (CIBT) se enmarca dentro del IV Plan Regional de Investigacin Cientfica e Innovacin Tecnolgica (IV PRICIT). El CIBT es una iniciativa de la Direccin General de Universidades e Investigacin de la Comunidad de Madrid en la que participan el Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC), la Universidad Autnoma de Madrid (UAM), la Universidad Complutense de Madrid (UCM) y Parque Cientfico de Madrid (PCM). Los autores agradecen los consejos y correcciones del informe original a: Dr. D. Fernando Valdivieso (Universidad Autnoma de Madrid) Agradecimientos especiales a los tcnicos del CIBT que han participado y revisado el informe: Jose Luis Fernndez Jos Manuel Gonzlez
Informe realizado para:
Ttulo: Informe de Vigilancia Tecnolgica madri+d ltimos avances en el diagnstico molecular y por imagen de la enfermedad de alzheimer Autores: Cecilia Gonzlez de Ordua, Esther Garca, Cristina Rodrguez Rivero y Javier Benito De los textos: Los autores De la coleccin vt y de la presente edicin: CEIM Confederacin Empresarial de Madrid - CEOE Direccin General de Universidades e Investigacin Fundacin madri+d para el Conocimiento Edita: Fundacin madri+d para el Conocimiento Velzquez, 76. E-28001 Madrid Proyecto Grfico: base12 diseo y comunicacin s.l. Ilustraciones: Los autores ISBN: 978-84-612-9486-2
5 7 15
CAPTULO 1
Antecedentes
CAPTULO 2
Introduccin
CAPTULO 3
Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

3.1 Diagnstico in vitro (PG. 18) 3.2 Diagnstico por imagen (PG. 36)
51 53 57
ndice de contenidos
CAPTULO 4
Entorno cientfico y empresarial
CAPTULO 5
Legislacin
CAPTULO 6
Principales retos y tendencias
61 65 71
CAPTULO 7
Conclusiones
CAPTULO 8
Referencias
CAPTULO 9
Abreviaturas
CAPTULO 1
Antecedentes
La Asociacin Nacional del Alzheimer, Afal Contigo (AFALcontigo) est interesada en conocer los ltimos avances y las lneas de investigacin ms recientes en el mbito del diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. En concreto, esta Asociacin desea saber cules son las tcnicas de diagnstico molecular y diagnstico por imagen para la enfermedad de Alzheimer. La Asociacin contacta con el Crculo de Innovacin en Biotecnologa (CIBT) del Sistema Madri+d y plantea este tema de inters como una posible lnea de trabajo conjunta. Como resultado se acuerda la firma de un convenio-marco de colaboracin entre ambas entidades en el que se establece la elaboracin de un informe de vigilancia tecnolgica por parte del CIBT sobre el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. El objetivo del informe es dar una visin global de la situacin actual que existe en el campo del diagnstico molecular in vitro y del diagnstico por imagen de la enfermedad de Alzheimer.
vt ltimos avances en el diagnstico molecular

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y por imagen de la enfermedad de alzheimer
CAPTULO 2
Introduccin
La enfermedad de Alzheimer es un trastorno cerebral degenerativo asociado al envejecimiento, que est producido por la prdida gradual de neuronas que termina afectando a las reas del cerebro que controlan el pensamiento, la memoria y el lenguaje. Aunque cada vez es mayor el conocimiento sobre esta enfermedad, todava se desconoce la causa exacta de la misma, si bien se sabe que existen algunos factores de riesgo, entre los que se podran destacar los factores genticos, ambientales y sociales que parecen influir en el desarrollo de esta demencia.
En 1906 el Dr. Alois Alzheimer, mdico alemn que dio su nombre a la enfermedad, describi por primera vez la enfermedad como cambios inusuales en el tejido cerebral. Hoy en da se conocen esos cambios como placas seniles o neurticas, formadas por depsitos insolubles de la protena -amiloide alrededor de las neuronas y ovillos neurofibrilares, formados por depsitos dentro de las propias neuronas cuyo principal componente es la protena tau. Adems se han descubierto otras alteraciones asociadas a la enfermedad, como prdida de neuronas, alteraciones cerebro vasculares y cambios en las concentraciones de neurotransmisores. El proceso degenerativo comienza probablemente 20-30 aos antes de que la enfermedad se manifieste clnicamente. Durante este periodo preclnico, el nmero de placas y ovillos neurofibrilares va aumentando hasta que sobrepasa un determinado umbral que provoca la aparicin de los primeros sntomas. Despus, durante el transcurso de la enfermedad se produce la alteracin de procesos crticos como la comunicacin entre neuronas, el metabolismo celular y la capacidad de reparacin del tejido nervioso [2].
Sintomatologa
La caracterstica principal de esta enfermedad es la prdida de memoria que afecta a la comunicacin, al aprendizaje, al pensamiento y al razonamiento. Aunque los sntomas de la enfermedad de Alzheimer pueden ser variables, se podran agrupar en tres esferas, la cognitiva, la conductual y la funcional que sufren un progresivo empeoramiento. Los primeros sntomas de la enfermedad comienzan normalmente con la aparicin de pequeos olvidos frecuentes, que se engloban dentro de los sntomas del deterioro cognitivo leve. En esta fase de la enfermedad se produce la destruccin de neuronas de una determinada parte del cerebro, denominada hipocampo, que se encarga de controlar la memoria. Con la prdida de las neuronas del hipocampo la memoria a corto plazo empieza a fallar y se deteriora la capacidad de la persona para realizar tareas sencillas.
A continuacin el deterioro afecta a la corteza cerebral y como consecuencia se reducen las capacidades lingsticas y de razonamiento de la persona. Los pacientes, adems pueden sufrir cambios de personalidad, arrebatos emocionales y conductas perturbadoras, que se hacen cada vez ms frecuentes a medida que avanza la enfermedad. Finalmente se afectan otras reas del cerebro, que se atrofian y conducen al paciente a un estado vegetativo hasta el fallecimiento.
Prevalencia e incidencia
Esta enfermedad es el tipo ms frecuente de demencia, afectando a ms de 20 millones de personas en el mundo. Se calcula que a partir de los 65 aos su frecuencia se duplica cada 5 aos, hasta afectar al 30% de los mayores de 85 aos. Adems, segn indican los estudios poblacionales esta cifra crecer enormemente en los prximos aos. Esto se debe a que el aumento en la esperanza de vida en los pases desarrollados provocar un incremento importante de la poblacin mayor de 65 aos y, por tanto, aumentar el nmero de enfermedades ligadas a la edad, entre las que se encuentra la enfermedad de Alzheimer. Este hecho supondr un aumento en las necesidades sanitarias, sociales y econmicas en la sociedad, por lo que los mtodos diagnsticos y los tratamientos ayudarn a reducir dichos costes y a mejorar la calidad de vida de los enfermos.
18.000 16.000 14.000 12.000 Miles 10.000 8.000 6.000 65-79 4.000 2.000 0 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1981 1991 2000 2010 2020 2030 2040 2050 Aos 80 y ms
CAPTULO 2 Introduccin
FIGURA 1 Evolucin de la poblacin mayor desde 1900 hasta el 2050. De 1900 a 2003 los datos son reales, pero de 2010 a 2050 se trata de proyecciones [3].
TABLA 1 Prevalencia de la enfermedad de Alzheimer. a por 100.000 habitantes, b Datos de Mlsa, c Estudio prospectivo de Baltimore.
Prevalencia de la enfermedad de Alzheimer Intervalos de edad Prevalencia
45-54 55-65 66-69 70-74
25b 72b 590c 1.780c 4.110c 8.620c 17.030c 31.630c 53.610c
75-79 80-84 85-90 90-94 95 +
Diagnstico
Hasta el momento, el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer era fundamentalmente clnico, basndose en la existencia de los dficits cognitivos que ocurren durante el desarrollo de la enfermedad como los trastornos del lenguaje (afasia), la disminucin o incapacidad en la realizacin de actividades motrices (apraxia), el reconocimiento o identificacin de objetos aunque no presente ningn trastorno de la visin (agnosia) y disminucin de la memoria. Para realizar este diagnstico se elabora la historia clnica, una exploracin neurolgica y se evala la memoria y otras funciones mentales siguiendo los criterios de diagnstico NINCDS-ADRDA, que proporcionan una sensibilidad cercana al 100% y una especificidad alrededor del 70%. Adems, se realizan otras pruebas complementarias, que permiten descartar otras causas de demencia y con el conjunto de todas las pruebas se emite el diagnstico probable de la enfermedad de Alzheimer. Las pruebas diagnsticas se clasifican en funcin del grado de recomendacin, que se muestran en la siguiente tabla. Estos grados se basan en la evidencia cientfica, estratificando la fuerza de cada recomendacin segn los niveles de evidencia.
10
TABLA 2 Grados de recomendacin para pruebas diagnsticas de la enfermedad de Alzheimer.

Grados de recomendacin Grado Descripcin
A B
Existen pruebas slidas para hacer esta recomendacin. Estudios o alguna revisin sistemtica de buena calidad con resultados homogneos y claros. Existen pruebas suficientes para hacer la recomendacin con claridad. Hay al menos un estudio de muy buena calidad o mltiples estudios con diseo aceptable que la sustentan. Existen pruebas limitadas. Al menos algn estudio aceptable. No hay pruebas basadas en estudios clnicos. La recomendacin se sustenta nicamente en la opinin de expertos.
C D
A pesar de todo, la valoracin clnica es difcil de realizar en los estadios tempranos de la enfermedad, donde se puede confundir con otras demencias, por lo que el proceso diagnstico se alarga hasta comprobar la progresin de la enfermedad, llegando a durar aos. Una deteccin ms temprana de la enfermedad aumentara en gran medida las posibilidades de tratamiento de los enfermos de Alzheimer, al poder comenzar una terapia en una fase inicial de evolucin de la enfermedad. Por este motivo cada vez es ms frecuente completar el diagnstico clnico con pruebas de imagen y tcnicas de diagnstico in vitro, aunque hasta la fecha no existe ninguna prueba que por s misma pueda establecer el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. La investigacin sobre mtodos de diagnstico de la enfermedad de Alzheimer ha producido resultados recientes que permiten pensar que en el futuro se podr contar con mtodos diagnsticos moleculares para la deteccin precoz de esta enfermedad. Actualmente se aborda el desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico en dos frentes, tcnicas de diagnstico in vitro y diagnstico por imagen. 11
Diagnstico en situaciones preclnicas: Deterioro Cognitivo Leve

El diagnstico temprano del Alzheimer resulta crucial para frenar el avance de la enfermedad sin embargo, los mtodos de diagnstico hasta ahora utilizados, bsicamente clnicos, no permiten dar un resultado inequvoco hasta que la patologa est ciertamente avanzada. Es por esto que, en la actualidad, las investigaciones se centran en buscar posibles alteraciones moleculares, estructurales y conductuales durante la fase preclnica de la enfermedad que reflejen la posibilidad de padecer Alzheimer an cuando no existan sntomas evidentes. El Deterioro Cognitivo Leve (en ingls Mild Cognitive Impairment MCI) es considerado un estado intermedio entre el envejecimiento normal y la demencia. Est caracterizado
por leves alteraciones de la memoria y mnimas prdidas de la capacidad de realizar actividades. Actualmente, el MCI es considerado como un posible indicador temprano de la enfermedad de Alzheimer [3]. Aunque no todos los afectados por MCI desarrollan demencia, los estudios demuestran que ciertas alteraciones en la zona hipocampal o frontal de los cerebros de pacientes de MCI correlacionan con el posterior desarrollo de la enfermedad de Alzheimer [4, 5]. En este sentido, la iniciativa Alzheimers Disease Neuroimaging Initiative o ADNI realiza estudios de neuroimagen con el fin de establecer el grado de correlacin entre el MCI y el desarrollo del Alzheimer. Este proyecto ser tratado con ms extensin en el apartado 3.2.8. La posibilidad de contar con un sistema de diagnstico efectivo en etapas preclnicas, ha fomentado la realizacin investigaciones con el fin de determinar los posibles marcadores bioqumicos del MCI. Diversos estudios longitudinales han comprobado que casi todos los sujetos con Deterioro Cognitivo Leve que evolucionan hacia una enfermedad de Alzheimer tienen niveles altos de en el LCR, mientras que en el Deterioro Cognitivo Leve no progresivo esos niveles de se mantienen bajos [6, 7]. Esto indica que la determinacin de en el LCR podra ser usado de manera eficaz en la identificacin de sujetos con enfermedad de Alzheimer incipiente entre pacientes clnicamente diagnosticados de Deterioro Cognitivo Leve. 12 Por otro lado se ha determinado que ciertos marcadores plasmticos, detectados en enfermos de Deterioro Cognitivo Leve, permiten prever que pacientes desarrollarn demencia a largo plazo [8]. El descubrimiento de estos marcadores, que engloban molculas implicadas en procesos como la respuesta inmune, la hematopoyesis y la apoptosis, permitir en un futuro realizar diagnsticos precoces de la enfermedad de Alzheimer.
TABLA 3 Marcadores predictivos de Alzheimer en el Deterioro Cognitivo Leve.
Marcadores biolgicos Lquido Cefalorraqudeo (LCR) Sangre
Pptido A t-tau p-tau Mioinositol
CCL-18 ANG-2 IGFBP-6 CXCL8 ICAM-1 IL-11
TRAIL-R4 CCL15 CCL7 IL-3 IL-1 PDGF-BB
EGF CCL5 GDNF G-CSF M-CSF TNF
Tratamiento
Hoy por hoy no existe ningn tratamiento capaz de curar la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, se han desarrollado medicamentos que, en algunas personas en fases tempranas de la enfermedad, son capaces de prevenir el empeoramiento de algunos sntomas durante un tiempo. El tratamiento farmacolgico de la enfermedad de Alzheimer aborda diferentes aspectos, por un lado se han desarrollado frmacos para tratar la disminucin de acetilcolina que se produce en la enfermedad, tratamiento colinrgico. Tambin se emplean frmacos que ayudan a retrasar la progresin de la enfermedad y que tratan los trastornos conductuales y afectivos. Los frmacos ms empleados en las primeras etapas de la enfermedad son los inhibidores de la acetilcolinesterasa, la enzima que degrada la acetilcolina. Debido a la prdida de neuronas productoras de esta sustancia en la enfermedad de Alzheimer, los niveles en el cerebro se encuentran disminuidos, por lo que estos frmacos contribuyen a aumentar los niveles. Cuando la enfermedad se encuentra en una etapa ms avanzada para frenar su progresin se emplea la memantina, sustancia antagonista del glutamato, que evita la muerte neuronal. En la actualidad existen muchas lneas de investigacin abiertas, orientadas a la bsqueda de tratamientos eficaces que ayuden a frenar el progreso de la enfermedad. En la tabla 3 se muestran algunos de los frmacos ms empleados. Aunque cada vez son ms los compuestos que empiezan las fases de ensayos clnicos, para poder aplicarlos es necesario disponer de un diagnstico de la enfermedad de Alzheimer de manera temprana.
TABLA 4 Tratamientos para la enfermedad de Alzheimer.
Frmacos para el tratamiento del Alzheimer Nombre Casa comercial Accin
13
Donepezilo Rivastigmina Galantamina Memantina
Anticolinestersicos Anticolinestersicos Anticolinestersicos Antagoniza los receptores NMDA glutaminrgicos
CAPTULO 3
Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

3.1 Diagnstico in vitro
(PG. 18) (PG. 36)
3.2 Diagnstico por imagen
En los ltimos aos se han realizado grandes avances en la comprensin de la patogenia de la enfermedad de Alzheimer. Se han identificado cambios moleculares y estructurales asociados a la enfermedad de Alzheimer. Estos nuevos conocimientos permiten identificar los elementos clave que participan en el desarrollo de la enfermedad y que podran ser utilizados como potenciales marcadores biolgicos en su diagnstico. Sin embargo, a da de hoy el nico diagnstico definitivo sigue siendo el anlisis histolgico post mortem del cerebro del paciente.
El diagnstico de la enfermedad de Alzheimer se basa en los criterios clnicos de posible o probable de la cuarta edicin del Manual de Diagnstico y Estadsticas de Desrdenes Mentales de la Sociedad Americana de Psiquiatra (DSM-IV-TR) y del grupo de trabajo del Instituto Nacional de Desrdenes Neurolgicos, Enfermedad de Alzheimer y Desrdenes Relacionados (NINCDS-ADRDA) [9]. El criterio aceptado para el proceso diagnstico de la enfermedad de Alzheimer consta de dos etapas. Una inicial en la que se identifica la existencia de sntomas de demencia y una posterior en la que se aplican criterios para identificar de qu tipo de demencia se trata. Estos criterios clnicos deben completarse con los resultados de pruebas de diagnstico molecular in vitro y por imagen. El principal reto de las tcnicas de diagnstico reside en poder distinguir los pacientes con enfermedad de Alzheimer en estadios tempranos, de los pacientes con otros tipos de demencia, ya que existen muchas otras enfermedades distintas capaces de producir los mismos sntomas de demencia. Adems, el diagnstico temprano puede suponer ventajas en la eficacia de los tratamientos, ya que se podran aplicar cuando los daos son an pequeos. Para poder realizar un diagnstico precoz de la enfermedad es necesario disponer de mtodos fiables. Gracias a los marcadores de la enfermedad, que se conocen hasta el momento, se pueden emplear diferentes tcnicas para el diagnstico molecular in vitro y por imagen. En la siguiente tabla se recogen las tcnicas de diagnstico que se describen en el presente informe por estar implicadas en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer.
16
TABLA 5 Clasificacin de las tcnicas de diagnstico para la enfermedad de Alzheimer.

Tcnicas de diagnstico de la enfermedad de Alzheimer Diagnstico in vitro Diagnstico por imagen
Ensayos inmunoenzimticos tipo ELISA ELISA tipo sandwich ELISA competitivo Western Blot Tcnicas protemicas Espectrometra de masas Microarrays de protenas Diagnstico gentico Tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa, PCR Microarrays de ADN
Imagen estructural Tomografa computarizada Resonancia magntica nuclear Imagen funcional Espectroscopa por resonancia magntica Resonancia magntica nuclear funcional Tomografa por emisin de positrones Tomografa por emisin de fotn nico Magnetoencefalografa
17
CAPTULO 3 Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer
3.1
Diagnstico molecular in vitro
3.1.1 Marcadores para el diagnstico in vitro

El conocimiento de las bases moleculares implicadas en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, ha supuesto un avance en la bsqueda de marcadores biolgicos, que pueden emplearse para un diagnstico precoz de la enfermedad.
Para que un marcador pueda utilizarse como herramienta diagnstica debe cumplir una serie de requisitos que se resumen en la siguiente tabla.
TABLA 6 Caractersticas de un biomarcador deseables para la deteccin de la enfermedad de Alzheimer [1, 2].
Requisitos para un marcador biolgico
Detectar la caracterstica esencial de la patologa. Ser validado en casos confirmados. Sensibilidad mayor del 85% para detectar la enfermedad. Especificidad mayor del 75-80% para detectar y diferenciar la enfermedad de Alzheimer de otras demencias. Preciso, fiable y barato. Reproducible. No invasivo. Fcil de realizar.
18 Las caractersticas neuropatolgicas como la formacin de ovillos neurofibrilares, placas neurticas, angiopata amiloide, prdida sinptica y neuronal, son fenmenos que definen la enfermedad de Alzheimer y por tanto, representan la base para poder encontrar marcadores biolgicos que permitan establecer un diagnstico in vitro de la enfermedad. Los ovillos neurofibrilares, que se muestran en la figura 2, son agregaciones intracelulares de la protena denominada tau, que a da de hoy constituye uno de los principales marcadores biolgicos [10]. Por otra parte, las placas neurticas o seniles se forman por la acumulacin extracelular de varias protenas alrededor de un ncleo de pptido -amiloide, que tambin se deposita en los vasos sanguneos, formando la llamada angiopata amiloide. Este pptido -amiloide tambin es considerado un buen marcador de la enfermedad.
Placas neurticas que contienen pptidos -amiloides
Ovillos neurofibrilares que contiene la protena tau
FIGURA 2 Placas neurticas y ovillos neurofibrilares en el cortex cerebral de un enfermo de Alzheimer.
Aunque en menor medida que los anteriores, la determinacin de la apolipoprotena E (ApoE) puede reforzar el diagnstico molecular de la enfermedad y, por tanto, se considera un marcador biolgico. 19 Adems de estas protenas, que claramente estn implicadas en los procesos que conducen a la degeneracin neuronal en la enfermedad de Alzheimer, existen otras posibles molculas, que se est estudiando, para emplear como biomarcadores en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. En la tabla 7 se recogen algunas de las molculas estudiadas hasta el momento.
TABLA 7 Marcadores biolgicos [2, 10].
Marcadores biolgicos Lquido Cefalorraqudeo (LCR) Sangre
Pptido A42 t-tau p-tau t-tau/A42 p-tau/ A42 Apolipoprotena E (ApoE) F2-isoprostanos
CFH -2-macroglobulina P97 melanotransferrina Hemo- oxigenasa-1 (HO-1) Supresor Hemo-oxigenasa-1 (HOS)
Orina
Plaquetas
Protena de cadena neural (AD7C-NTP)
APP -secretasa (BACE) -secretasa (ADAM10)
Las protenas -amiloide y tau representan los principales marcadores biolgicos aceptados para emplear en pruebas de diagnstico in vitro por estar relacionadas directamente con los procesos patolgicos que tienen lugar en la enfermedad de Alzheimer. A continuacin se describe la implicacin que tiene cada una de estas protenas con la aparicin de la enfermedad y las caractersticas que las convierten en buenos biomarcadores para el diagnstico in vitro.
Pptido -amiloide
El descubrimiento de que exista una correlacin entre el nmero de placas neurticas o seniles y la severidad de la demencia en la enfermedad de Alzheimer, hizo que se prestara ms atencin a las placas seniles como elementos clave para el desarrollo de la enfermedad, identificando el pptido -amiloide como el principal componente. De hecho, la hiptesis ms aceptada sobre la causa de la enfermedad de Alzheimer se conoce como la cascada amiloide, que seala que el desequilibrio entre la produccin y reciclaje de estos pptidos en el cerebro es el primer fenmeno que tiene lugar en el inicio de la enfermedad[11]. El pptido -amiloide se produce por el metabolismo normal de la clulas, a partir del procesamiento de una protena de mayor tamao, denominada protena precursora del -amiloide APP (Amyloid Precursor Protein). Mediante la accin de determinadas enzimas se producen diversas fragmentaciones que dan lugar a la aparicin de pptidos -amiloides de diferentes tamaos, siendo las formas amiloide40, 42 (A40 y A42) las ms relacionadas con la patologa de la enfermedad. En la figura 3 se muestra un esquema de la formacin de placas seniles por la acumulacin de pptidos -amiloide. En condiciones normales este pptido se degrada por otras enzimas o bien se elimina del cerebro a travs de la barrera hematoenceflica. Sin embargo, cuando hay una sobreproduccin del pptido o anomalas para depurarlo, se produce un fenmeno de agregacin, debido a que los pptidos se vuelven insolubles y adquieren una conformacin fibrilar, que es la que aparece en las placas seniles. El depsito de los pptidos -amiloides ocurre en diferentes etapas, a lo largo de las cuales las placas aparecen en diversas regiones del cerebro, tendiendo a concentrarse en los espacios interneuronales, en el parnquima cerebral y en las paredes de los vasos sanguneos cerebrales. De esta manera, comienzan a producirse alteraciones en las funciones de las neuronas que, a medida que avanza la formacin de placas en las diferentes reas del cerebro, terminan causando la degeneracin neuronal. Esto queda reflejado en el caracterstico deterioro de la memoria que acompaa a esta enfermedad.
20
La protena -amiloide, en su metabolismo normal, se secreta al espacio extracelular como una protena soluble que pasa a formar parte de los componentes del lquido cefalorraqudeo (LCR). Gracias a que el LCR est en contacto directo con el espacio extracelular del cerebro, es una buena fuente para detectar biomarcadores que indiquen cambios bioqumicos en el cerebro. Mediante la medida de los niveles de pptido -amiloide, especialmente de la forma -amiloide40, 42, se puede ayudar en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. La deteccin de una disminucin en los niveles de pptido -amiloide puede indicar que existe una alteracin en el metabolismo de -amiloide, que al no eliminarse correctamente se deposita formando las placas seniles. Esta protena tambin se secreta al torrente sanguneo, lo que implica que se pueden medir sus niveles en plasma. Sin embargo, las pruebas realizadas hasta el momento no han logrado detectar cambios en los niveles de -amiloide42 en enfermos de Alzheimer, por lo que esta medida no refleja los cambios en el cerebro [12].
Caractersticas de los pptidos -amiloide como marcadores biolgicos Niveles disminuidos del pptido -amiloide42 en el LCR, indica deposicin del pptido en las placas y degeneracin axonal. 86% de sensibilidad para diferenciar entre enfermedad de Alzheimer y envejecimiento. 89% de especificidad para diferenciar entre enfermedad de Alzheimer y otras demencias.
21
Placas neurticas
Neurona con ovillos neurofibrilares
Microtbulo
APP Pptido -amiloide
22
Protena tau Protena tau fosforilada
FIGURA 3 Formacin de placas seniles y ovillos neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. En la parte superior de la figura se muestra como los pptidos -amiloides, formados a partir de la protena precursora APP, se agregan en el espacio extracelular dando lugar a la formacin de las placas neurticas. En la parte inferior se observa como la hiperfosforilacin de la protena tau causa la desagregacin de los microtbulos en el axn de las neuronas y se forman agregaciones intracelulares que constituyen los ovillos neurofibrilares.
Protena tau
En paralelo con la identificacin de los pptidos -amiloides en las placas seniles, se descubri que los ovillos neurofibrilares estaban formados por la acumulacin intracelular de fragmentos helicoidales pareados (PHF) compuestos por la protena tau hiperfosforilada.
Tau es una protena presente en las neuronas, que se une a microtbulos, promoviendo su ensamblaje y estabilidad para regular la morfologa axonal. Adems de estabilizar el esqueleto celular participa en la comunicacin neuronal y es liberada, en condiciones normales, fuera de las neuronas siendo detectable en el LCR. Esta protena puede encontrarse en dos estados diferentes: Fosforilada, disminuye su capacidad para promover el ensamblaje de microtbulos. Defosforilada, promueve la polimerizacin de microtbulos. En la enfermedad de Alzheimer se produce una hiperfosforilacin de tau, as como fenmenos de agregacin, que contribuyen a la formacin de los ovillos neurofibrilares, como se muestra en la figura 3. Los fenmenos de hiperfosforilacin de tau provocan el desensamblaje de los microtbulos, causando dao en el transporte de neurotransmisores y comprometiendo la funcin sinptica de comunicacin de la clula. Adems tau tiene una alta capacidad para autoagregarse dando lugar a la formacin de fibrillas insolubles que forman los ovillos neurofibrilares, terminando por afectar a la funcin neuronal. El anlisis de los niveles totales de tau presentes en el LCR es un reflejo del dao neuronal y por tanto, su aumento puede observarse en otros desrdenes neurodegenerativos, adems de en la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, las medidas de los niveles de tau fosforilada parecen ser ms especficas de la enfermedad de Alzheimer. Existen muchos sitios en la protena tau susceptibles de ser fosforilados. En funcin de qu fosforilaciones se analicen la especificidad es tambin mayor [13].
Caractersticas de tau como marcador biolgico Niveles aumentados de tau total y fosforilada en el LCR indican dao axonal y degeneracin neuronal. 80% de sensibilidad para diferenciar entre enfermedad de Alzheimer y envejecimiento si se utilizan los niveles totales de tau. 74% de sensibilidad para diferenciar entre enfermedad de Alzheimer y envejecimiento si se utilizan los niveles de tau fosforilada. 89% de especificidad para diferenciar entre enfermedad de Alzheimer y otras demencias si se utilizan los niveles totales de tau. 92% de especificidad para diferenciar entre enfermedad de Alzheimer y otras demencias si se utilizan los niveles de tau fosforilada.
23
Aunque ninguno de estos marcadores, utilizado aisladamente en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer, puede aportar datos concluyentes, su combinacin si que aumenta considerablemente la sensibilidad y especificidad del diagnstico.
3.1.2 Tcnicas de diagnstico in vitro

Las tcnicas de diagnstico in vitro se emplean para identificar y cuantificar los marcadores biolgicos previamente descritos y establecer diferencias entre pacientes con la enfermedad de Alzheimer y personas con otras demencias o personas sanas. Los marcadores ms fiables se determinan a partir del LCR, por lo que no se cuantifican de forma rutinaria[14].
3.1.2.1 Ensayos inmunoenzimticos tipo ELISA

La tcnica de inmunoabsorcin ligada a enzima o ELISA (del ingls Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est basada en el principio inmunolgico del reconocimiento y unin de los anticuerpos a las molculas que reconocen como extraas (antgenos). Este mtodo es ampliamente utilizado en el mbito del diagnstico clnico. Para el caso del diagnstico de la enfermedad de Alzheimer se han empleado diferentes anticuerpos que reconocen protenas implicadas en la patologa, principalmente anticuerpos frente a pptidos -amiloides y frente a la protena tau, en su estado fosforilado o defosforilado. Los ensayos tipo ELISA se realizan sobre un soporte slido, como el fondo de un tubo de ensayo o una placa multipocillo, en el que se encuentra inmovilizado bien el anticuerpo bien la protena de inters. Los anticuerpos empleados reconocen, de manera especfica, los antgenos y se unen a estas molculas formando un complejo antgeno-anticuerpo. Para detectar esa unin se emplean enzimas, normalmente unidas a un anticuerpo, que catalizan la formacin de un producto coloreado, que se cuantificar mediante la medida de luz absorbida por dicho compuesto (espectrofotometra). Los ensayos ELISA se han empleado en varios estudios para valorar la eficacia de los pptidos -amiloide y tau como marcadores de la enfermedad de Alzheimer. Las observaciones que se derivan de estos estudios indican que los pacientes con enfermedad de Alzheimer muestran una reduccin de los niveles de -amiloide y un aumento en los niveles de tau [15, 16]. Sin embargo, existen otras enfermedades que pueden producir tambin estas mismas alteraciones. Todas las enfermedades en las que se produce una degeneracin neuronal provocan un aumento de los niveles de tau en LCR. Adems el depsito de los pptidos -amiloides en las placas seniles es un proceso comn en la demencia con cuerpos de Lewy y en el envejecimiento normal. Por tanto, para aumentar la especificidad del diagnstico es necesario realizar la combinacin de estos marcadores junto con los niveles de tau fosforilada, que parece ser especfico de la enfermedad de Alzheimer [17].
24
Ventajas de las tcnicas ELISA Sencillos de realizar. Permiten procesar un gran nmero de muestras. Los anlisis son rpidos. Alta sensibilidad. Inconvenientes de las tcnicas ELISA Los kits ELISA son costosos. Las muestras procedentes de LCR suponen la realizacin de un mtodo invasivo para obtener la muestra por lo que no se realizan de rutina.
Existen diferentes modalidades de ensayos ELISA, en funcin del nmero de anticuerpos que se emplean y de la molcula que se detecta con la reaccin enzimtica (complejos antgeno-anticuerpo, anticuerpos libres). Los ms empleados en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer son los ensayos tipo sndwich y los ensayos competitivos para valorar los niveles de -amiloide y tau en muestras procedentes normalmente del LCR.
ELISA tipo sandwich

En el ELISA tipo sandwich se emplean dos anticuerpos diferentes que se unen de manera directa a la protena de inters, que queda atrapada entre ambos como en un sandwich. En esta tcnica se inmoviliza uno de los anticuerpos en los pocillos de la placa. Cuando se aade la muestra, las protenas que se quieren detectar se unen al anticuerpo de manera especfica. A continuacin, se aade un segundo anticuerpo que lleva unida una enzima que cataliza una reaccin cuyo producto final es coloreado y nos permite cuantificar la protena de inters [18].
25
E E
Anticuerpo Reactivo
Anticuerpo-enzima Producto de reaccin
Biomarcador Otras protenas de la muestra
FIGURA 4 Esquema de un ensayo inmunoenzimtico ELISA tipo sndwich.
ELISA competitivo
En el ELISA competitivo hay una primera fase en la que se incuba la muestra con el anticuerpo, producindose la unin especfica de ste con la protena que se quiere detectar. A continuacin se aade esta mezcla sobre una superficie previamente recubierta con el antgeno de manera que el anticuerpo libre no unido a su antgeno en la fase inicial, se une a la superficie. Se cuantifica la cantidad de anticuerpo libre para determinar la cantidad de protena de inters en la muestra. Cuanto ms anticuerpo libre se detecta, menos cantidad de protena de inters contiene la muestra.
E E
Anticuerpo Reactivo
Anticuerpo-enzima Producto de reaccin
Biomarcador Otras protenas de la muestra
FIGURA 5 Esquema de un ensayo inmunoenzimtico ELISA competitivo.
26
3.1.2.2 Tcnica de inmunodeteccin en membrana (Western Blot)

La tcnica de inmunodeteccin en membrana tambin conocida como Western Blot, se trata, al igual que los ELISA de un ensayo inmunoenzimtico para la deteccin de protenas concretas (-amiloide, tau, etc.) de una muestra mediante el uso de anticuerpos especficos. En el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer esta tcnica se ha empleado para la confirmacin de resultados obtenidos por otras metodologas como la protemica. Este ensayo consta de dos fases. Una primera en la que se produce la separacin de las protenas de una muestra mediante un proceso conocido como electroforesis. En una segunda etapa se produce la transferencia de las protenas a una membrana sinttica, quedando stas en su superficie. En esta membrana se produce la unin de la protena con el anticuerpo, que lleva una enzima unida a l. Esta enzima cataliza una reaccin cuyo producto final permite identificar la protena de inters. Un sistema comnmente empleado para la deteccin es la quimioluminiscencia.
Membrana Gel
Componente A
E
Anticuerpo Anticuerpo-enzima
Reactivo Producto de reaccin
Componente B
FIGURA 6 Esquema de las diferentes etapas de la inmunodeteccin en membrana o Western Blot para la deteccin del componente de inters (componente A) de una muestra compleja.
Si bien esta tcnica se emplea en investigacin, siendo til para la identificacin y deteccin de biomarcadores en determinados fluidos, tambin puede utilizarse en la clnica para la confirmacin de los resultados de otras pruebas como los ELISA. 27
Ventajas la tcnica de Western Blot Stodo altamente especfico. Inconvenientes de la tcnica de Western Blot Mtodo lento, se necesitan al menos 24 horas para obtener los resultados. Este mtodo no permite cuantificar.
3.1.2.3 Tcnicas protemicas

La protemica estudia el conjunto completo de protenas que genera un genoma, clula o tejido mediante mtodos bioqumicos, con el fin de obtener una visin global e integrada de los procesos celulares en un momento dado y bajo determinadas condiciones. Las clulas expresan varios miles de protenas diferentes y cada una de ellas puede experimentar numerosas modificaciones distintas, por lo que el estudio de las diferencias en la expresin de cada protena individualmente supondra una tarea imposible de realizar sino fuera por las tcnicas protemicas, que proporcionan un anlisis a gran escala. Por este motivo, la aplicacin de la protemica tiene un enorme potencial en el rea de la biomedicina para el desarrollo de frmacos, mtodos de diagnstico, desarrollo de vacunas, etc. Mediante la comparacin de la informacin contenida en el proteoma, el conjunto de protenas expresadas por un tejido o por una clula en un momento determinado, de un
individuo sano y un paciente con enfermedad de Alzheimer puede ser de gran utilidad a la hora de descubrir nuevos marcadores biolgicos para el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer.
Espectrometra de masas
La espectrometra de masas es una tcnica analtica para la deteccin de compuestos qumicos y biolgicos en funcin de su relacin masa-carga (m/z). Mediante esta tcnica es posible obtener informacin de la masa molecular del compuesto analizado as como informacin estructural del mismo. En la espectrometra de masas las muestras se dotan de carga, ionizadas, en una fuente de ionizacin. Los iones al tener una carga, pueden ser transportados bajo la influencia de un determinado campo elctrico o magntico hasta un analizador. La fuente de ionizacin, el analizador de masas y el detector estn en alto vaco para permitir el libre movimiento de los iones. El tiempo que tardan hasta alcanzar el analizador depende de su relacin masa por unidad de carga, produciendo un patrn especfico, un espectro de masa, que permite determinar la composicin de un compuesto qumico o biolgico. Hay muchos tipos de espectrmetros de masas que no solamente analizan los iones sino que tambin producen diversos tipos de iones. Entre los ms utilizados para el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer se encuentran MALDI-TOF (desorcin/ ionizacin por lser asistida por matriz acoplada a un detector de tiempo de vuelo), ESI (electrospray o electronebulizacin), cromatografa lquida acoplada a espectrmetros de masa en tandem (LC/MS/MS). Esta tcnica se ha empleado como herramienta para la identificacin de un alto nmero de marcadores biolgicos para la enfermedad de Alzheimer [19]. Mediante la comparacin de los niveles de expresin de protenas en personas sanas y pacientes confirmados de la enfermedad de Alzheimer, se obtiene un listado de posibles marcadores para el diagnstico de la enfermedad, que posteriormente se validarn [20]. Gracias a estas tcnicas se puede avanzar ms rpidamente en la bsqueda de marcadores biolgicos en diferentes fluidos como LCR, sangre y orina.

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Laser + + + Muestra + Iones + + + + + + + + Detector
Espectro de masas
FIGURA 7 Representacin esquemtica de la tcnica MALDI-TOF para identificar protenas a partir de una muestra compleja.
Ventajas de la espectrometra de masat Permite la identificacin de un alto nmero de protenas. Rapidez del anlisis. Reproducibilidad. Inconvenientes de la espectrometra de masas Instrumentacin compleja. El equipamiento es costoso. Requiere personal cualificado. No es una tcnica cuantitativa. Difcil de automatizar.
Microarrays de protenas
Esta tcnica permite comparar las diferencias en los niveles de expresin de miles de protenas a la vez, en enfermos de Alzheimer y personas sanas, posibilitando la identificacin de marcadores potenciales para el diagnstico de la enfermedad. Un microarray es un conjunto de puntos de ensayo miniaturizados sobre una superficie slida, que permite realizar muchos ensayos simultneamente, obteniendo como resultado una gran cantidad de informacin biolgica a partir de una pequea cantidad de muestra. Se basan en la captura de protenas por medio de molculas de diversa naturaleza que permanecen ancladas a la superficie del microarray. Estas molculas pueden ser antgenos, protenas recombinantes, pptidos sintticos, anticuerpos y otras molculas. Aunque hay una gran variedad, los anticuerpos suelen ser las molculas ms empleadas para inmovilizar en los microarrays de protenas. En funcin de la aplicacin que se persiga existen diversos tipos de microarrays de protenas. Para diagnstico los ms empleados son los microarrays de identificacin y cuantificacin de protenas mediante el uso de anticuerpos. Las estrategias de deteccin, en este caso se basan en las tcnicas inmunolgicas. Se pueden emplear anticuerpos secundarios marcados o bien realizar un marcaje qumico o fluorescente de las protenas de la muestra. Estudios recientes empleando esta metodologa han identificado dieciocho protenas en sangre que podran ser empleadas como marcadores biolgicos de la enfermedad de Alzheimer [8]. Estas protenas son indicadores de alteraciones que se producen en diversos procesos como la hematopoyesis, la respuesta inmune o la apoptosis (muerte celular programada), que pueden reflejar una situacin pre-sintomtica de la enfermedad de Alzheimer.
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Lser Anticuerpo Marcado AnticuerpoProtena Muestra
Muestra Chip de Anticuerpos
Microarray Punto con diferentes protenas
FIGURA 8 Esquema de las diferentes etapas que componen un Microarrays de protenas.
Ventajas de los microarrays de protenas Permiten el anlisis simultneo de muchos marcadores diferentes en un mismo ensayo. Rpido de realizar. Permiten realizar muchos ensayos simultneamente. Se pueden automatizar. Inconvenientes de los microarrays de protenas Los anticuerpos empleados pueden tener reactividad cruzada con otras protenas. Coste elevado para producir tantos anticuerpos.
3.1.2.4 Tcnicas de diagnstico gentico

Desde el punto de vista gentico, se sabe que un porcentaje bajo de casos de la enfermedad de Alzheimer presentan un patrn de herencia mendeliano autosmico dominante. Hasta el momento se han identificado 3 genes responsables del componente hereditario de la enfermedad de Alzheimer. El gen de la protena precursora de amiloide (APP), situado en el cromosoma 21, el gen de la protena presenilina 1 (PSEN1), en el cromosoma 14 y el gen de la protena presenilina 2 (PSEN2), en el cromosoma 1 [21]. El resto de casos se debe a la existencia de polimorfismos, pequeas variaciones en la secuencia de ADN que originan existan distintas formas o alelos de un mismo gen. As, en una poblacin cada individuo porta una serie de alelos determinados. En enfermedades como el Alzheimer, la expresin de un alelo concreto implica una mayor susceptibilidad al padecimiento de la forma espordica de la enfermedad. Existen diversos estudios que indican que los portadores del alelo 4/4 del gen de la apolipoprotena E (ApoE) tienden a presentar un inicio ms precoz y frecuente de la enfermedad de Alzheimer, que se asocia a un aumento de los cambios
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anatomopatolgicos neurofibrilares. La determinacin de la presencia de este alelo puede ayudar a aumentar la especificidad del diagnstico de la enfermedad. Otro gen que se asocia con la aparicin tarda de la enfermedad de Alzheimer es el que codifica para la protena 2-macroglobulina plasmtica. Esta proteina se une a la proteina -amiloide soluble, favoreciendo su degradacin. Cuando hay cantidades anormalmente elevadas de esta protena se producen efectos neurotxicos [22]. Los factores genticos que intervienen en la enfermedad de Alzheimer podran ser de utilidad en el proceso diagnstico y predictivo de personas con antecedentes familiares de la enfermedad de Alzheimer, aunque la utilidad del consejo gentico est an por determinar.
TABLA X Clasificacin de los genes implicados en la enfermedad de Alzheimer.
Genes implicados en la enfermedad de Alzheimer Autosmicos Dominantes Polimorfismos
APP (protena precursora amieloide) PSEN1 (presenilina 1) PSEN2 (presenilina 2)
alelo 4/4 gen APOE 2-macroglobulina plasmtica
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Tcnica de PCR
La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR permite detectar fragmentos especficos del ADN responsable de la sntesis de las protenas, proceso conocido como expresin gnica y que constituye la base del funcionamiento de todos los seres vivos. Esta tecnologa fue desarrollada a principios de los aos 80 por Kary Mullis y sus colaboradores y, desde su descubrimiento, se ha convertido en una herramienta de biologa molecular indispensable, con aplicaciones tales como la bsqueda de mutaciones en enfermedades hereditarias, criminalstica y ciencia forense, anlisis genticos, pruebas de paternidad, identificacin de especies y bsqueda de microorganismos patgenos. Hoy en da, el proceso de amplificacin de fragmentos de ADN se encuentra automatizado. Mediante esta tcnica se pueden detectar mutaciones concretas de los genes implicados en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. La PCR permite obtener mltiples copias de un fragmento especfico de ADN a partir de una muestra compleja, para realizar su deteccin y estudio posterior, como puede ser la identificacin de mutaciones en un gen determinado.
FIGURA 9 Reaccin en cadena de la polimerasa mediante los siguientes pasos: obtencin de ADN (A), separacin de las hebras de la doble hlice de ADN (B), hibridacin de fragmentos de ADN concretos a la secuencia de ADN (C) y creacin de nuevas copias (D).
Ventajas de la PCR Alta sensibilidad en la deteccin del ADN. Permite discriminar entre una mutacin y otra. Se necesita poco material de partida. Inconvenientes de la PCR Se necesita personal cualificado para el anlisis. El ADN puede fragmentarse durante el procesamiento de la muestra.
Microarrays de ADN
32 La secuenciacin del genoma humano ha sentado las bases para el desarrollo de estudios comparados de la expresin gnica a gran escala. Gracias a esta tecnologa es posible analizar la expresin gnica de un tipo celular o un tejido en una situacin determinada, permitiendo identificar genes como dianas teraputicas, genes marcadores del pronstico o predisposicin de enfermedades, entre otras aplicaciones. Esta tcnica se basa en la inmovilizacin de colecciones de molculas de ADN, que recogen la secuencia conocida de genes, sobre un soporte slido, microarray. Despus de la extraccin del ADN de las clulas de inters, ste es marcado, por ejemplo con sondas fluorescentes. En la siguiente fase el ADN marcado se pone en contacto con el microarray. Cuando se produce el reconocimiento de una secuencia igual se une a ella en un proceso conocido como hibridacin. Posteriormente se analiza la seal mediante un escner de fluorescencia que da informacin sobre la expresin de los genes. Cuantificando la intensidad de la seal y comparndola con un caso control se determina si la expresin de un gen se encuentra aumentada, disminuida o no ha experimentado modificaciones.
En el caso del diagnstico de la enfermedad de Alzheimer esta tcnica se ha empleado para establecer diferencias de expresin gnica entre individuos sanos e individuos con enfermedad de Alzheimer o individuos con alto riesgo de desarrollar la enfermedad. Mediante el anlisis de los resultados se pueden identificar nuevos marcadores genticos de la enfermedad, pero tambin obtener informacin acerca de los procesos que se encuentran alterados.
Microarray de ADN
Muestra control
Muestra enfermo
Extraccin ADN
Marcaje
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Secuencia de un gen Hibridacin Escaner de la seal fluorescente
FIGURA 10 Representacin del proceso de anlisis de la expresin gnica mediante microarrays de ADN.
Ventajas de los microarrays de ADN Permiten analizar rpidamente y en paralelo un gran nmero de muestras. Se puede estudiar la expresin de todos los genes del organismo. Alta sensibilidad. Se puede automatizar. Inconvenientes de los microarrays de ADN Se necesita personal cualificado para el anlisis. Anlisis complejo de los resultados.
Aplicacin PCR y microarrays en la deteccin de polimorfismos: Tcnicas de genotipado

En el ADN humano los polimorfismos apenas representan un 0,1% del genoma global, siendo la forma ms frecuente de polimorfismo la variacin de una nica base (tambin denominadas SNP) generalmente por sustitucin. Puesto que la mayora de los casos de la enfermedad de Alzheimer estn relacionados con la existencia de polimorfismos que incrementan la susceptibilidad de padecerla, es
imprescindible para el proceso diagnstico, disponer de una herramienta que permita de modo fiable, determinar qu alelos se expresan en cada individuo, para ello se recurre a diversas tcnicas de genotipado. Entre las tcnicas de genotipado ms frecuentes destacan la PCR-cuantitativa, hibridacin de ADN en microarrays e hibridacin en microesferas.
PCR-cuantitativa
La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real no es ms que una variacin de la PCR convencional, en ella la amplificacin del ADN puede ser detectada mediante molculas fluorescentes (fluorocromos) no especficas (Sybr Green) o mediante sondas especficas fluorescentes (TaqMan o KASPar). La principal ventaja de la PCR a tiempo real con respecto a la PCR convencional, es el hecho de que la amplificacin mediante fluorocromos permite la monitorizacin del proceso, de modo que podemos conocer la cantidad exacta de ADN amplificada en cada ciclo, tambin acorta el tiempo de anlisis al no requerirse ningn experimento adicional para la visualizacin de los resultados. En el genotipado de alelos se utilizan generalmente sondas especficas, puesto que este tipo de tecnologa permite la deteccin de los distintos alelos en un mismo tubo de reaccin, cosa que no sucede con el Sybr green.
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Hibridacin en microarrays
La principal ventaja de los microarrays con respecto a otras tcnicas de genotipado es la posibilidad de detectar de forma simultnea y en una misma muestra de un mayor nmero de SNPs (generalmente entre 12-48 SNPs por ensayo segn la tecnologa aplicada). La principal diferencia entre las distintas tcnicas de genotipado por microarray radica fundamentalmente en el mtodo de discriminacin entre alelos, entre los que podemos distinguir: Uso de la ligacin especfica de alelo (OLA)/PCR combinada con electroforesis capilar (tcnica SNPlex de Applied Biosystems), en este caso la sonda fluorescente que se une especficamente a cada SNP posee una movilidad electrofortica determinada (se desplaza hasta un determinado punto al ser sometida a una separacin electrofortica en un capilar), esto permite, discriminar entre los distintos alelos.
Separacin por MALDI-TOF (tenologa MassArray de Sequenom), en ella la discriminacin de alelos se realiza por espectrometra de masas (se ioniza la muestra para realizar una posterior separacin por masa/carga) que permite determinar los distintos elementos que forman parte de un compuesto.
Hibridacin en microesferas
En este tipo de arrays cada pocillo de la placa contiene una pequea esfera (de unas 3 micras) de slice que est recubierta de pequeos fragmentos de ADN que inmovilizan las secuencias presentes en la muestra que son complementarias.
35
3.2
Diagnstico por imagen
Las tcnicas de neuroimagen cada vez se emplean ms para realizar un diagnstico precoz de la enfermedad de Alzheimer. Entre las tcnicas de diagnstico por imagen ms empleadas se distingue la resonancia magntica y la tomografa computarizada como herramientas para analizar los cambios estructurales que tienen lugar en el transcurso de la enfermedad como la reduccin del volumen del hipocampo, relacionado con la prdida de memoria y el desarrollo de procesos neuropatolgicos caractersticos de la enfermedad. Adems el desarrollo de tcnicas de imagen funcional, como la tomografa por emisin de positrones y la tomografa por emisin de fotn nico, aportan informacin adicional sobre las alteraciones que se producen en el cerebro de los pacientes con enfermedad de Alzheimer como la reduccin en el metabolismo de la glucosa y del flujo sanguneo en determinadas regiones del cerebro. Muchas investigaciones recientes optan por la combinacin de distintas tcnicas de imagen, aunque en ningn caso se puede emitir un diagnstico empleando exclusivamente una de estas tcnicas.
3.2.1 Tomografa computarizada

La tomografa computarizada (TC), o tambin conocida como tomografa axial computarizada (TAC), es una tcnica de imagen estructural. 36 Esta tcnica se basa en la utilizacin de los rayos X para obtener imgenes tomogrficas, que ofrecen informacin sobre las diferencias entre las densidades radiolgicas de los tejidos. Las imgenes obtenidas mediante TC son de gran utilidad en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer para descartar otros fallos orgnicos como causa de demencia. La obtencin de imgenes de tomografa computarizada se realiza a travs de un tubo de rayos X que gira alrededor del individuo. El aparato emite un haz muy fino de rayos X que incide sobre el paciente, al que atraviesa la radiacin. Se detecta la atenuacin de los rayos X, es decir, la radiacin que no se absorbe por el individuo. Esta medida se repite hasta que el tubo de rayos X da una vuelta completa alrededor del paciente. Las seales recibidas se analizan despus en un ordenador que reconstruye la imagen. Las imgenes de TC proporcionan ms detalles que una imagen radiogrfica convencional ya que se obtienen muchas vistas diferentes del mismo rgano o estructura. Gracias a esta tcnica se ha observado que pacientes con enfermedad de Alzheimer muestran, en relacin con individuos sanos, una reduccin de los lbulos temporales, especialmente del hipocampo [23].
FIGURA 11 Imagen de TC.
Por el momento la informacin que se extrae de esta tcnica no permite obtener un patrn especfico de neuroimagen para utilizarlo en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer y en la actualidad se emplea para descartar otras causas de demencia como la hidrocefalia, tumores cerebrales o infartos cerebrales, entre otros.
Agentes de contraste empleados en TC

37 Los agentes de contraste se emplean para mejorar la calidad de las imgenes, gracias a que aumentan la sensibilidad y especificidad en la deteccin, permitiendo distinguir ms fcilmente las reas anormales que pudieran indicar la presencia de una patologa. Estas sustancias pueden administrarse por va oral o bien por va intravenosa. En la siguiente tabla se recogen algunos de los agentes de contraste ms empleados.
TABLA 7 Agentes de contraste empleados en la TC.
Trazadores Compuesto Accin
Bario Yodo en agua Yodo hidrosoluble
Para hacer opaco el tracto gastrointestinal. Para tomar artrografas. Para hacer opacos los vasos sanguneos.
Ventajas de la tomografa computarizada Tcnica rpida de realizar. No es un proceso invasivo. Las imgenes obtenidas presentan gran nitidez. Se obtienen imgenes de huesos, tejidos blandos y vasos sanguneos al mismo tiempo. Inconvenientes de la tomografa computarizada Se recibe una dosis de radiacin ionizante. A veces es necesario el uso de agentes de contraste. Se pueden producir alergias por el agente de contraste.
3.2.2 Resonancia magntica nuclear

La resonancia magntica nuclear (RMN), es una tcnica de medicina nuclear que permite obtener imgenes de diferentes planos de los tejidos blandos como el cerebro y el corazn, entre otros. Gracias a la utilizacin de la RMN en la prctica clnica se obtienen imgenes, de forma no invasiva y sin emitir radiaciones ionizantes, que permiten diferenciar, mejor que otras pruebas de radiologa, las distintas estructuras anatmicas.
El uso de esta tcnica para el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer es til como primer paso para descartar otras lesiones. Los estudios realizados indican que una de las primeras alteraciones morfolgicas que se producen es la reduccin del volumen de los lbulos temporales y, en especial, atrofia del hipocampo [24, 25]. Esto se correlaciona con los procesos neuropatolgicos que dan lugar a la prdida de memoria en fases precoces de la enfermedad, por lo que la determinacin del volumen de la regin del hipocampo aporta informacin muy til para realizar un diagnstico temprano de la enfermedad de Alzheimer [26]. Esta tcnica debe su nombre al fenmeno fsico de la resonancia, que ocurre cuando el ncleo de ciertos tomos se somete a un campo magntico. Estos ncleos son capaces de aceptar y emitir energa, resonando, al someterse a la accin de ondas de radiofrecuencia [27]. Durante el estudio de RMN el paciente, a travs de una camilla, se sita dentro del aparato, de estructura similar a un tubo, cuyo elemento principal es un imn generador de un campo magntico de gran intensidad. Los cambios fsicos que se producen en el organismo se devuelven como seal elctrica que capta el instrumental adecuado y que servir para construir la imagen.
38
Procesamiento de la seal y Reconstruccin de la imagen
Aislamiento Magntico y de Radiofrecuencia
FIGURA 12 Esquema de un aparato de resonancia magntica.
Las diferencias de seal entre los distintos tejidos se traducen en mayor o menor brillo de la imagen final, que reflejan las diferencias en el contenido de agua. Esta tcnica es til para detectar trastornos que aumenten el lquido en determinadas reas del cuerpo. Las imgenes obtenidas a partir de la RMN pueden dar informacin de diferentes tipos y en funcin de este criterio se clasifican en: Volumtricas, dan informacin acerca del volumen de los tejidos. De Difusin, reflejan el movimiento al azar de las molculas de agua dando informacin acerca de la integridad estructural del parnquima cerebral. El aumento de la difusin en el cerebro puede reflejar cambios en la organizacin de tejidos del cerebro representando un marcador de atrofia neuronal. En pacientes con la enfermedad de Alzheimer se ha observado un aumento de la difusin en el lbulo temporal. De Perfusin, que permiten analizar el flujo sanguneo gracias al uso de agentes de contraste. En la enfermedad de Alzheimer se ha observado como se produce una reduccin del flujo sanguneo en determinadas reas del cerebro [26]. 39
EC
FIGURA 13 Imagen de RMN. A la izquierda individuo de edad avanzada sin patologa y a la derecha paciente con enfermedad de Alzheimer. H indica la localizacin del hipocampo y EC muestra el crtex entorrinal. Imagen tomada de [28].
Agentes de contraste empleados en RMN

Los agentes de contraste ms utilizados en la RMN son los denominados paramagnticos, que son aquellos que por sus propiedades magnticas son capaces de modificar las seales de resonancia de las estructuras que las rodean. El agente de contraste paramagntico ms empleado es el denominado gadolinio que tiene la propiedad de realzar la seal de las zonas a las que accede. El modo de administracin suele ser por la va intravenosa. Aunque existen estudios que indican que mediante la RMN se puede medir la atrofia del hipocampo permitiendo diferenciar enfermos de Alzheimer de enfermos con deterioro
cognitivo leve, se ha observado que este fenmeno ocurre tambin en otras demencias por lo que los datos de imagen obtenidos por esta tcnica no son suficientes, por si solos, para establecer un diagnstico de la enfermedad de Alzheimer [11].
Ventajas de la RMN Ausencia de efectos nocivos conocidos al no utilizar radiaciones ionizantes. Las imgenes permiten observar detalles anatmicos no apreciables con otras tcnicas. Las imgenes se obtienen en los planos axial, sagital y coronal permitiendo el estudio tridimensional. Detecta los cambios en el contenido de agua de los tejidos. Es una tcnica no invasiva, que no causa dolor.
Inconvenientes de la RMN Elevado coste econmico. Puede producir claustrofobia. En algunos casos es necesario inyectar un agente de contraste. Las personas con determinados tipos de implantes no pueden someterse a esta prueba.
3.2.3 Espectroscopa por resonancia magntica

La espectroscopia por resonancia magntica (ERM) se trata de una modalidad de la resonancia magntica nuclear, que permite determinar in vivo la concentracin de distintos compuestos de inters y aporta, por tanto, informacin sobre el metabolismo cerebral [28]. Los ncleos atmicos que se estudian mediante esta tcnica son los mismos que en la resonancia magntica nuclear. El ms estudiado es el 1H por encontrarse en abundancia en la composicin de los metabolitos. Los ncleos se someten a un campo magntico y a pulsos de radiofrecuencia. Esto provoca que los ncleos entren en resonancia y que regresen a su situacin original al suspender el pulso de radiofrecuencia. Este cambio se detecta como una diferencia de voltaje por un detector. Cuando la seal se analiza se obtiene un espectro de resonancia, que se caracteriza por dos parmetros: 1. La frecuencia de resonancia, que va a ser diferente en funcin del compuesto. 2. La intensidad del pico, que da informacin sobre la concentracin del metabolito [27].
40
NAA Cr mins Control
NAA mins Cr
AD
4.0
3.0
2.0
1.0
ppm
FIGURA 14 Espectro de resonancia magntica. Imagen tomada de [25].
En la siguiente tabla se recogen algunos de los metabolitos estudiados mediante esta tcnica, cuyos niveles se han visto alterados en pacientes con enfermedad de Alzheimer respecto a individuos sanos.
TABLA 8 Compuestos de inters que se estudian mediante ERM.
Metabolitos cerebrales detectables mediante ERM Compuesto Descripcin
41
N-acetil aspartato (NAA) Colina Creatina y lactato Mioinositol
Marcador neuronal Sntesis de membranas Indicadores del estado energtico Marcador de clulas gliales
El N-acetil aspartato (NAA) es un aminocido presente nicamente en el sistema nervioso central, que refleja la densidad y viabilidad de las neuronas. La disminucin en sus niveles se relaciona con la muerte neuronal en las regiones cerebrales que se ven afectadas en la enfermedad de Alzheimer en las fases iniciales[29]. De hecho, diversos estudios realizados tanto in vitro, con cerebros de pacientes fallecidos por causa de la enfermedad, como in vivo, han mostrado que se produce una disminucin en los niveles de este aminocido [28]. Mediante esta tcnica tambin se ha mostrado que en los pacientes con enfermedad de Alzheimer se produce un aumento en los niveles de mioinositol, que es un componente de las membranas lipdicas, que podra estar relacionado con disfunciones en las membranas y anormalidades del citoesqueleto que provocan alteraciones en el cerebro [29].
En la mayora de los estudios de ERM en pacientes de Alzheimer se valora la proporcin de estos metabolitos en relacin con los niveles de creatina, que se considera un metabolito cerebral que permanece constante en casos de alteraciones cerebrales.
FIGURA 15 Espectro de resonancia magntica. A la izquierda se muestran los resultados de un individuo de 62 aos sano y a la derecha los datos obtenidos de un paciente de 80 aos con enfermedad de Alzheimer. Los espectros muestran el aumento en los niveles de mioinositol (Ino) y colina (Cho), y la disminucin en los niveles de NAA. Imagen tomada de [28].
A pesar de los datos obtenidos hasta el momento en diversos estudios, esta tcnica no es lo suficientemente especfica como para discriminar entre casos de enfermedad de Alzheimer y otras causas de demencia, motivo por el cual todava no se aplica rutinariamente en la clnica. Sin embargo, las medidas de NAA en combinacin con las imgenes de RMN volumtrica ayudan a completar el diagnstico de esta enfermedad.
Ventajas de la ERM
42
Permite obtener informacin de procesos metablicos. Se trata de una tcnica no invasiva. Inconvenientes de la ERM Poca especificidad para diferenciar entre la enfermedad de Alzheimer y otras demencias.
3.2.4 Resonancia magntica nuclear funcional

La resonancia magntica nuclear funcional (RMNf) combina las imgenes de resonancia magntica nuclear con la identificacin de zonas que se activan en el cerebro en respuesta a un determinado estmulo sensorial o tarea cognitiva. Mediante la comparacin de las imgenes obtenidas durante el estmulo y las obtenidas en periodos de reposo se puede generar un mapa de activacin del cerebro. El principio en el que se basa esta tcnica fue descrito en los 40 aos por Linus Pauling, quien describi el magnetismo del pigmento que transporta el oxgeno de la sangre y da color a los glbulos rojos, la hemoglobina. En funcin del grado de oxigenacin de la hemoglobina se la denomina oxihemoglobina, cuando est oxigenada, o deoxihemoglobina, cuando se encuentra desoxigenada.
Se sabe que la actividad cerebral va acompaada de un aumento del flujo sanguneo en los vasos locales que provoca una reduccin en los niveles de deoxihemoglobina. Este fenmeno se emplea por la RMNf que mide la actividad cerebral indirectamente mediante la determinacin del nivel de oxigenacin de la sangre dependiente de respuesta hemodinmica a un estmulo determinado. A este parmetro se le denomina BOLD, de sus siglas en ingls Blood Oxygenation Level Dependent [30]. Para determinar el cambio entre las concentraciones de oxihemoglobina y deoxihemoglobina, despus de la estimulacin, se emplean las propiedades magnticas de la hemoglobina como agente de contraste endgeno para obtener imgenes de resonancia magntica y poder estudiar las funciones cerebrales, sin tener que acudir a la administracin de agentes de contraste.
43
FIGURA 16 Mapa de activacin cerebral en las regiones frontal y temporal, obtenido durante la estimulacin con actividades de memoria. Imagen modificada de [28]
Gracias a esta tcnica se sabe qu regiones del cerebro se activan en funcin de la tarea a desarrollar lo que permite realizar comparaciones entre individuos sanos y enfermos, ayudando en el diagnstico de enfermedades del cerebro. Para el caso del diagnstico de la enfermedad de Alzheimer el empleo de esta tcnica indica que los pacientes con enfermedad de Alzheimer sufren una disminucin en la seal o inactivacin en respuesta a estmulos, en las regiones del lbulo medio temporal donde se encuentran estructuras relacionadas con la memoria como el hipocampo o la amgdala, en comparacin con sujetos sanos [28, 31].
Ventajas de la RMNf Tcnica no invasiva. No requiere la inyeccin de un agente radioactivo, por lo que se pueden repetir las medidas ms a menudo. Rpida de realizar. Disponible como tcnica en la prctica clnica. Inconvenientes de la RMNf Las personas con determinados tipos de implantes no pueden someterse a esta prueba. Se tarda ms tiempo en realizar la prueba que otras pruebas de imagen.
3.2.5 Tomografa por emisin de positrones

La tomografa por emisin de positrones (PET), de sus siglas en ingls Positron Emission Tomography, es una tcnica de diagnstico por imagen, no invasiva, que permite analizar in vivo diversos procesos fisiolgicos o fisiopatolgicos en tejidos y rganos. Esta tcnica de medicina nuclear se basa en el anlisis y deteccin, mediante un tomgrafo, de la distribucin de un radiofrmaco, que es un compuesto marcado radiactivamente unido a una molcula que se desea analizar. Tras la administracin del radiofrmaco, generalmente por va intravenosa, ste se distribuye en el interior del cuerpo segn el flujo sanguneo y se capta por las clulas para metabolizarlo del mismo modo que su anlogo no marcado. En funcin del radiofrmaco empleado, se obtiene informacin de diferentes procesos biolgicos como el metabolismo de la glucosa, la proliferacin celular, la actividad enzimtica, la tasa de consumo de oxgeno, el flujo sanguneo o la transmisin de seales, entre otros [32]. La obtencin de imgenes mediante esta tcnica de imagen funcional se realiza a travs de un tomgrafo que est formado por varios anillos de detectores, permitiendo el paso por la zona central de la camilla del enfermo hasta la regin del cuerpo donde se realiza la medida. Las molculas marcadas que se utilizan son emisoras de partculas subatmicas denominadas positrones. Estas partculas son destruidas, en un proceso conocido como aniquilacin, por los electrones orbitales prximos de los pacientes, dando lugar a la emisin de radiacin gamma en un ngulo de 180. Esta radiacin se detecta de manera simultnea por los detectores situados a lo largo del anillo uno frente a otro. La seal que reciben los detectores de la localizacin e intensidad de la seal se procesa por un ordenador mostrando la imagen de la regin del cerebro deseada en tiempo real [33, 34].

44
AD
Control
Max
Min
MR
[C-11]PIB PET
[C-11]PIB PET
MR
45
FIGURA 17 Esquema del sistema empleado para la obtencin de imgenes de PET. Imagen modificada de [35].
Trazadores empleados en PET

Los trazadores o radiofrmacos que se emplean se administran en pequeas cantidades. Adems la vida media de estas sustancias radiactivas es muy corta, por lo que las medidas deben realizarse en un breve periodo de tiempo tras su administracin. Las caractersticas ideales de un trazador son: Llegar fcilmente al tejido que se desea estudiar. Metabolizacin escasa para permitir la deteccin. No producir efectos farmacodinmicos. Elevada afinidad por su sitio de unin.
Hay diversos radioistopos emisores de positrones que se utilizan en la prctica clnica para ayudar en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. La molcula que ms se emplea es la 2-[18F]-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (FDG), que lleva unida el 18F, como istopo radiactivo que emite positrones. Esta molcula, es un anlogo de la glucosa que atraviesa la barrera hematoenceflica y se capta por las clulas. Una vez en el interior de la clula sufre atrapamiento metablico, por no poder seguir el ciclo bioqumico normal de la glucosa, reflejando de esta manera la utilizacin de glucosa por los tejidos [32, 36].
La seal de radiacin que se recoge tras administrar el compuesto FDG, cuando se analiza el cerebro, se relaciona directamente con la actividad neuronal. Las alteraciones en las conexiones neuronales, que se producen en la enfermedad de Alzheimer, son una de las caractersticas de la enfermedad que originan una disminucin en el nmero de neuronas. Como consecuencia se producen variaciones en el metabolismo de la glucosa, que gracias a las tcnicas de imagen como el PET se pueden identificar, localizar y cuantificar en determinadas regiones del cerebro como las reas del neocrtex asociativo parietal, temporal y cingulado posteriores as como en el hipocampo. De esta manera se describe la reduccin en el consumo de glucosa, hipometabolismo, como una caracterstica ms de la enfermedad de Alzheimer [30, 37].
FDG
PCG
FIGURA 18 Imgenes FDG-PET. A la izquierda se muestra una imagen tomada de un individuo sano y a la derecha la de un paciente con enfermedad de Alzheimer. Las reas rojas y amarillas indicas incorporacin de glucosa. Imagen modificada de [38].
46
Para el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer mediante PET, el Dr. Bill Klunk y sus colaboradores desarrollaron, en el ao 2004 en la Universidad de Pittsburg en Pensilvania, el compuesto [N-metil-11C]2-(4-metilaminofenil)-6-hidroxibenzotiazolio, que tras ser administrado se una a los depsitos de -amiloide, permitiendo visualizar in vivo las placas seniles. El compuesto recibi el nombre de Pittsburg Compound-B (PIB) [39] y se ha convertido en una herramienta importante en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. Los pacientes con esta enfermedad muestran una marcada acumulacin del compuesto PIB en las regiones corticales, en comparacin con individuos sanos.
3 2 1 0 Control AD
FIGURA 19 Imagen que muestra las diferencias en la retencin del compuesto PIB en individuos control y en enfermos de Alzheimer (AD) mediante PET. Imagen modificada de [39].
En la actualidad se estn desarrollando nuevas molculas que sirvan de marcadores para visualizar las placas de -amiloide y los ovillos neurofibrilares mediante PET. Por ejemplo, en el ao 2006 Gary Small describi como el compuesto 18F-FDDNP poda unirse a los pptidos -amiloides y a los ovillos neurofibrilares. [38, 40] Adems de los compuestos mencionados existen diversos radiofrmacos que se emplean para estudiar diferentes procesos, como se muestra en la tabla 8, que podran ayudar a establecer un diagnstico de la enfermedad de Alzheimer.
TABLA 9 Trazadores empleados en la tcnica PET [32, 38, 39].
Trazadores Compuesto Actividad que detecta
(18F)FDG L-(metil-11C)metionina (11 C)Timidina (15O)agua (11C)PIB (18F)FDDNP
Metabolismo de la glucosa Metabolismo de aminocidos Proliferacin Flujo sanguneo Acumulacin -amiloide -amiloide y ovillos neurofibrilares
47
El diagnstico de la enfermedad de Alzheimer mediante PET puede dar informacin antes de la manifestacin de los sntomas clnicos gracias a la deteccin de las alteraciones metablicas, que preceden a las lesiones [37]. Gracias a los avances en esta tcnica se aumentan la sensibilidad y especificidad en el diagnstico, permitiendo diferenciar entre enfermedad de Alzheimer y otras demencias [41].
Ventajas de PET Alta sensibilidad y especificidad. Analiza procesos bioqumicos in vivo. Imgenes con mejor resolucin espacial que el SPECT. Inconvenientes de PET Requiere de personal cualificado. Escasa definicin anatmica. Falsos positivos en pacientes con hiperglucemia y diabetes. Utilizacin de trazadores marcados radiactivamente. Costes elevados.
3.2.6 Tomografa por emisin de fotn nico

La tomografa por emisin de fotn nico (SPECT), es una tcnica de imagen funcional que permite obtener imgenes tridimensionales sobre el flujo sanguneo en el cerebro ofreciendo informacin relativa a la actividad metablica [30].
Esta tcnica, del mismo modo que la tcnica PET, se fundamenta en la deteccin de radiacin gamma para la obtencin de imgenes. Sin embargo, a diferencia del PET el compuesto radiactivo que se administra permanece en la sangre en lugar de ser absorbido por las clulas. Esta tcnica emplea molculas biolgicamente activas marcadas con un radioistopo, que tras ser introducidas por va intravenosa en el cuerpo del individuo, son capaces de atravesar la barrera hematoenceflica distribuyndose en las estructuras del cerebro en funcin del flujo sanguneo. Las imgenes obtenidas mediante SPECT se utilizan para valorar el metabolismo del cerebro ya que las medidas del flujo sanguneo en el cerebro se relacionan estrechamente con la actividad metablica [42]. La adquisicin de imgenes se realiza a travs de una gamma cmara que rota alrededor del individuo, adquiriendo imgenes de diferentes proyecciones. Despus, mediante programas informticos estas imgenes se procesan dando una reconstruccin topogrfica en tres dimensiones. Las imgenes reconstruidas se representan mediante una gama de colores que indican ms o menos perfusin del radiofrmaco.
Trazadores empleados en SPECT

El radiofrmaco ms utilizado para obtener neuroimgenes es el 99mTc-HMPAO (99mTcd,l-hexametilpropilenamino-oxima). Este compuesto, de caractersticas lipoflicas cruza rpidamente la barrera hematoenceflica y permite su empleo en los estudios de perfusin cerebral. Los estudios de SPECT con este radiofrmaco en pacientes con la enfermedad de Alzheimer muestran que se produce un dficit en la perfusin en la regin parietal y en el lbulo temporal [2]. Gracias a esta tcnica, una de las ms empleadas para la evaluacin de las demencias, se caracteriza la reduccin en el flujo sanguneo de determinadas regiones del cerebro, cortical y regiones temporales y parietales, como una caracterstica de las fases tempranas de la enfermedad de Alzheimer [2]. Adems, diversos estudios muestran que esta tcnica es til para mejorar el diagnstico clnico de la enfermedad de Alzheimer, sobre todo en los casos de deterioro cognitivo leve, y para diferenciarlo de otras demencias [28].
48
90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 0%
Significant areas of under-activity (Hypoperfusion)
Temporal Lobe (medial, apical and lateral)
Frontal Lobe Dorsal and Orbital S
Frontal Parietal Occipital
FIGURA 20 Imagen de SPECT de un paciente con enfermedad de Alzheimer. Imagen tomada de http://www.drrobertkohn.com/BrainSpect/SPECTscans/DementAlzh.htm
Ventajas de SPECT Menos costosa que PET. Permite conocer informacin acerca del metabolismo. Alta sensibilidad y especificidad en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. Inconvenientes de SPECT Peor resolucin espacial que en PET. Empleo de agentes radiactivos. Requiere personal cualificado. Costes elevados.
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3.2.7 Magnetoencefalografa
La magnetoencefalografa (MEG), es una tcnica de diagnstico por imagen que permite detectar la actividad cerebral mediante el registro de campos magnticos generados por las neuronas activas del cerebro. Con esta tcnica se registra la actividad postsinptica de millones de neuronas obteniendo informacin sobre la actividad cerebral en milisegundos y con una delimitacin de la estructura cerebral de hasta milmetros cbicos. Las medidas se realizan en una situacin basal y en respuesta a un estmulo determinado permitiendo, de manera simular a la RMNf, comparar ambas situaciones. La obtencin de imgenes se realiza a travs de magnetgrafos localizados a lo largo de la convexidad craneal en una sala magnticamente aislada. La actividad de las neuronas crea corrientes elctricas que originan campos magnticos. stos son detectados y amplificados mediante los sensores que estn dentro del magnetgrafo. Posteriormente se reconstruye la imagen por ordenador. Una de las aplicaciones de esta metodologa es la deteccin de reas con ritmos de baja frecuencia o actividad disminuida, que ocurren en las regiones daadas. De esta manera, se observa que los pacientes con enfermedad de Alzheimer muestran valores de
frecuencias menores que sujetos control, en las regiones temporales, indicando que la velocidad para procesar informacin disminuye [43, 44]. Los datos obtenidos de estos estudios muestran resultados coincidentes con los hallazgos obtenidos mediante otras tcnicas de imagen, que permiten pensar que existe un patrn caracterstico de esta patologa.
Left
Control
AD
Controls
Right
Am X 10-11 6.794 7.853 8.913 9.972 11.032 12.091 13.15 14.21 15.269 (Hz)
13 0
AD patients
FIGURA 21 Se muestran los resultados de un estudio de las intensidades de frecuencias obtenidas mediante MEG en pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) y sujetos control. Imagen modificada de [44, 45].
3.2.8 Diagnstico global: la iniciativa ADNI

La iniciativa ADNI (del ingls Alzheimers Disease Neuroimaging Initiative) intenta establecer la relacin directa entre el Deterioro Cognitivo Leve y la enfermedad de Alzheimer, para ello estudia, desde el ao 2004, el progreso de pacientes diagnosticados con MCI con el fin de determinar cuales acaban padeciendo Alzheimer. ADNI ana las diferentes tcnicas de diagnstico con el fin de identificar, mediante el uso de la neuroimagen, datos clnicos y biomarcadores, los cambios cognitivos asociados al Deterioro Cognitivo Leve y la enfermedad de Alzheimer. Diversas investigaciones han demostrado que el uso de tcnicas de neuroimagen como el PET o la RMN, son ms adecuadas y sensibles que los criterios neurolgicos aplicados hasta ahora para el diagnstico y medida de la progresin de enfermedades en las que se produce una perdida de memoria. La realizacin un proyecto de esta envergadura busca establecer un modelo estandarizado que sirva de gua para realizacin de ensayos clnicos, reduciendo los costes y el tiempo necesario para testar un determinado frmaco y mejorando la seguridad y eficacia de los nuevos frmacos en desarrollo. El proyecto de investigacin cuenta con la colaboracin de ms de 400 afectados por Deterioro Cognitivo Leve, 200 pacientes de la enfermedad de Alzheimer y 200 individuos control.
50
CAPTULO 4
Entorno cientfico y empresarial
Los anexos del presente informe incluyen informacin acerca de los grupos de investigacin espaoles identificados, que realizan labores de investigacin en el mbito del diagnstico de la enfermedad de Alzheimer. Se han detectado cincuenta grupos de investigacin en toda Espaa de los cuales veintiuno se encuentran en la Comunidad de Madrid, quince en Catalua y los catorce restantes distribuidos entre el resto de Comunidades Autnomas. La informacin correspondiente a cada grupo incluye los datos de la institucin a la que pertenecen, los datos de contacto del investigador, las lneas de investigacin y los proyectos en los que colabora cada grupo. En los anexos tambin se ha incluido informacin relacionada con empresas dedicadas al diagnstico molecular de la enfermedad de Alzheimer. En este apartado se recogen las empresas que se han identificado por estar vinculadas con el diagnstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer. Debido a que las tcnicas de diagnstico por imagen se llevan a cabo en muchos centros y clnicas hospitalarias nicamente se presentan los datos de empresas relacionadas con el diagnstico in vitro. En formato de tabla se ofrece la informacin correspondiente a cada empresa indicndose los datos de contacto, la pgina Web, una breve descripcin sobre la compaa y los productos y servicios que ofrecen relacionados con el diagnstico in vitro de la enfermedad de Alzheimer. De todas las empresas identificadas por ofrecer servicios o productos para el diagnstico in vitro seis son espaolas y nueve extranjeras, siendo EE.UU. uno de los pases con mayor nmero de empresas. En su mayora los servicios que ofrecen estas empresas estn basados en kits ELISA para detectar biomarcadores o en anlisis genticos para el estudio de genes implicados y algunas ofrecen reactivos para emplear en investigacin.

52
CAPTULO 5
Legislacin
En materia de diagnstico molecular existe una serie de disposiciones legales destinadas a controlar la calidad de los dispositivos de diagnstico, la seguridad de su uso y la informacin obtenida a partir de ellos.
Diagnstico in vitro
En la legislacin vigente en Espaa el Real Decreto 1143/2007, de 31 de agosto [46], por el que se modifica el Real Decreto 1662/2000, de 29 de septiembre, sobre productos sanitarios para diagnstico in vitro [47] se recogen las condiciones que deben cumplirse para su comercializacin y requisitos para su utilizacin. Asimismo, esta normativa recoge los procedimientos de evaluacin de la conformidad que aplican a estos productos.
Diagnstico por imagen

En lo relativo a la normativa que aplica en Espaa en materia de diagnstico por imagen existen directivas que regulan aspectos concretos que tienen que ver con las instalaciones donde se realizan las medidas de diagnstico, las normas de seguridad relacionadas con los niveles de exposicin a radiaciones y los criterios de calidad en radiodiagnstico y medicina nuclear. La Directiva 2004/40/CE, sobre las disposiciones mnimas de seguridad y de salud relativas a la exposicin de los trabajadores a los riesgos derivados de los agentes fsicos (campos electromagnticos) [48], establece los lmites de exposicin para las densidades de corriente y los coeficientes de absorcin especfica en el interior del personal que trabaja en una instalacin que emite campos electromagnticos (incluyendo equipos de resonancia magntica). El empleo de las radiaciones ionizantes en el campo de la medicina ha permitido realizar importantes progresos y desarrollar nuevas tcnicas para el diagnstico, la terapia y la prevencin, que resultan ventajosas si se utilizan en el momento oportuno y adoptando las medidas necesarias. Las siguientes normativas fijan estas medidas fundamentales relativas a la proteccin radiolgica de los pacientes que permite mejorar la calidad y eficacia del acto radiolgico mdico, evitando exposiciones inadecuadas o excesivas, sin impedir el uso de las radiaciones ionizantes en el plano de la deteccin precoz, diagnstico o tratamiento de las enfermedades, atendiendo as a las recomendaciones formuladas por la Comisin Internacional de Proteccin Radiolgica, Organizacin Mundial de la Salud y el Comit Cientfico de las Naciones Unidas para el estudio de los efectos de las radiaciones ionizantes. El Real Decreto 1841/1997, de 5 de diciembre, por el que se establecen los criterios de calidad en medicina nuclear [49], tiene como objetivo asegurar la optimizacin de la
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administracin de radiofrmacos y de la proteccin radiolgica del paciente. Esta normativa se refiere a los mtodos de medicina nuclear in vivo, ya que se trata de una disposicin de desarrollo relativa a la proteccin del paciente, y exige la implantacin de un programa de garanta de calidad en las unidades asistenciales de medicina nuclear. El Real Decreto 1976/1999, de 23 de diciembre, por el que se establecen los criterios de calidad en radiodiagnstico [50], establece los criterios de calidad en radiodiagnstico para asegurar la optimizacin en la obtencin de las imgenes y la proteccin radiolgica del paciente en las unidades asistenciales de radiodiagnstico y que las dosis recibidas por los trabajadores expuestos y el pblico en general, tiendan a valores tan bajos como pueda razonablemente conseguirse. Adems este Real Decreto incluye los procedimientos necesarios para dar cumplimiento a lo previsto en el artculo 4 del Real Decreto 1132/1990, de 14 de septiembre, por el que se establecen medidas fundamentales de proteccin radiolgica de las personas sometidas a exmenes y tratamientos mdicos [51]. El Real Decreto 815/2001, de 13 de julio, sobre justificacin del uso de las radiaciones ionizantes para la proteccin radiolgica de las personas con ocasin de exposiciones mdicas [52], incorpora al ordenamiento jurdico espaol la Directiva 97/43/EURATOM, relativa a la proteccin de la salud frente a los riesgos derivados de las radiaciones ionizantes en exposiciones mdicas [53]. El objeto del presente Real Decreto es establecer los principios de justificacin del uso de las radiaciones ionizantes para la proteccin radiolgica de las personas siguiendo los criterios de calidad en medicina nuclear, radioterapia y radiodiagnstico. Asimismo se establecen medidas fundamentales de proteccin radiolgica de las personas sometidas a exmenes y tratamientos mdicos. En cuanto a las instalaciones de medicina nuclear, que incluye las instalaciones radiolgicas destinadas al diagnstico mdico tambin estn sujetas al Real Decreto 1976/1999, de 23 de diciembre, por el que se establecen los criterios de calidad en radiodiagnstico y al Real Decreto 1891/1991, de 30 de diciembre, sobre instalacin y utilizacin de aparatos de rayos X con fines de diagnstico mdico [54]. En este ltimo decreto se indica que las instalaciones constituidas por aceleradores de partculas, equipos de rayos X para terapia y dems equipos generadores de radiaciones ionizantes utilizados con fines mdicos se regirn por lo establecido en el reglamento de instalaciones nucleares y radiactivas en el Real Decreto 1836/1999, de 3 de diciembre, por el que se aprueba el reglamento sobre instalaciones nucleares y radiactivas [55]. Adems, de acuerdo con la legislacin vigente en Espaa, las instalaciones radiactivas deben tener una autorizacin de funcionamiento otorgada por la Direccin General de Poltica Energtica y Minas del Ministerio de Industria, Turismo y Comercio o del organismo competente de la comunidad autnoma correspondiente, cuando esta competencia se haya transferido.
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CAPTULO 5 Legislacin
CAPTULO 6
Principales retos y tendencias
Retos
El nmero creciente de casos de enfermedad de Alzheimer que se producen al ao y las previsiones de crecimiento, como consecuencia del baby boom, convierten la gestin de esta enfermedad en un gran reto. El primer paso para poder afrontar esta gestin sera disponer de un mtodo de diagnstico temprano, que permitiera la aplicacin de tratamientos en fases iniciales de la enfermedad aumentando de esta manera su eficacia.
En este sentido, durante los ltimos diez aos se ha producido un importante avance en el conocimiento de las bases moleculares de la enfermedad de Alzheimer que han permitido conocer desde las protenas responsables de que se produzcan estructuras aberrantes en los cerebros de los enfermos, hasta los mecanismos que originan estas alteraciones y los genes implicados. Con ayuda de estos avances las investigaciones tratan de resolver cuestiones como el evitar que se produzcan las alteraciones, detectarlas una vez que se han producido e impedir su progresin. Cada vez son ms los recursos que se destinan a la investigacin en la enfermedad de Alzheimer, y en concreto al campo del diagnstico. Uno de los principales retos que existen en este campo es encontrar biomarcadores fiables, no invasivos, sencillos y baratos, imprescindibles para establecer de manera segura el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer en etapas tempranas, que a menudo se presentan como asintomticas. La obtencin de estos biomarcadores permitira desarrollar pruebas estandarizadas que se podran emplear de rutina en el diagnstico precoz. Por este motivo, muchas de las investigaciones actuales se encaminan hacia la bsqueda de cambios bioqumicos en la sangre, lquido cefalorraqudeo y orina, que permitan hallar algn marcador biolgico representativo de esta enfermedad. Gracias al desarrollo de tcnicas en el campo de la genmica y la protemica, que permiten analizar un gran nmero de molculas a la vez, cada vez son ms los estudios que se publican mostrando la implicacin de nuevas protenas con la aparicin de la enfermedad. Otro gran reto que se presenta en el rea del diagnstico de la enfermedad de Alzheimer es la mejora en las tcnicas de imagen, que permitan examinar la relacin entre dao precoz en el tejido cerebral y sntomas externos. Gracias a estas metodologas se podrn medir los cambios iniciales en la funcin o estructura cerebral para identificar a aquellas personas que estn en estados iniciales de la enfermedad. Son muchas las investigaciones que se desarrollan en este rea y en los ltimos aos se han conseguido grandes avances en el diagnstico por imgenes, sin embargo todava es necesario seguir avanzando en la aplicacin de estas tcnicas al diagnstico temprano de la enfermedad.
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Tendencias
En los ltimos aos se han producido importantes avances en la investigacin sobre la enfermedad de Alzheimer y cada vez son ms los recursos que se destinan a su investigacin. Una de las reas sobre las que ms se ha investigado es en el desarrollo de frmacos para el tratamiento de la enfermedad, existiendo ms de trescientos compuestos diferentes, en distintas etapas de desarrollo [56]. Sin embargo, se ha observado que los estudios que se llevan a cabo para el desarrollo de nuevas drogas para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer seran ms eficaces si se pudieran aplicar en etapas tempranas. Por este motivo se han incrementado las investigaciones encaminadas hacia el diagnstico. Si se tuviera un marcador de la enfermedad fiable, que permitiera un diagnstico temprano, se podra acelerar el desarrollo de terapias porque se facilitara la toma de decisiones sobre los agentes empleados en los ensayos clnicos. Adems se reduciran los costes asociados al desarrollo de nuevas medicinas para el tratamiento ya que se podra seleccionar una poblacin de pacientes ms pequea y los ensayos clnicos seran ms coste efectivo. Pero adems de encontrar un marcador biolgico para el diagnstico de la enfermedad, cada vez se investiga ms en el desarrollo y mejora de las tcnicas de imagen. De hecho, el descubrimiento del compuesto Pittsburg B (PIB), agente para visualizar las placas -amiloides, es uno de los ms prometedores avances en tcnicas de imagen, estimndose que este y otros compuestos lleguen al mercado en el 2011 y que incrementen el nmero de pacientes diagnosticados [57].
CAPTULO 6 Principales retos y tendencias
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Adems, aunque las tcnicas de imagen no son empleadas rutinariamente en el diagnstico clnico de la enfermedad de Alzheimer, y se utilizan ms como herramientas de investigacin, cada vez es ms frecuente realizar pruebas de RMN, PET o SPECT para complementar el diagnstico de la enfermedad.
CAPTULO 7
Conclusiones del informe
La enfermedad de Alzheimer es un trastorno degenerativo que supone una de las formas ms frecuentes de demencia en los ancianos. Esta enfermedad supone un grave problema de salud pblica por la magnitud de poblacin afectada, que adems se prev aumente considerablemente en los prximos aos y por el impacto social y familiar que provoca. Los esfuerzos investigadores en el campo del Alzheimer se centran en la bsqueda de nuevos tratamientos y terapias que frenen el progreso de la enfermedad y en los mtodos de diagnstico para la deteccin precoz. En el presente informe se han recogido diversas tcnicas que se emplean para apoyar el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer, o que se encuentran en fase de investigacin y podran tener una aplicacin para el diagnstico temprano, ya que hasta el momento el diagnstico se basa nicamente en la historia clnica. Los mtodos diagnsticos descritos en el informe se han clasificado en dos frentes, tcnicas de diagnstico molecular in vitro y tcnicas de diagnstico por imagen. En el primer caso se han detectado siete tecnologas diferentes que engloban mtodos inmunolgicos y diversas tcnicas de protemica y genmica. Mediante estas tcnicas se detectan y cuantifican biomarcadores de la enfermedad que se podran emplear en el diagnstico temprano. De esta manera, se ha observado que los marcadores biolgicos ms empleados por los mtodos inmunolgicos son los pptidos b-amiloides y la protena tau total y tau en su estado fosforilado, medidos en el LCR. Sin embargo, gracias a las tcnicas protemicas se estn identificando numerosos nuevos biomarcadores a partir de diferentes fluidos corporales, como la sangre o la orina, que suponen un mtodo menos agresivo para obtener muestras que del LCR, en el que se requiere someter al paciente a una puncin lumbar. Adems las tcnicas genmicas se estn empleando cada vez ms, aunque nunca de forma rutinaria, para realizar pruebas de diagnstico gentico en los casos de enfermedad de Alzheimer familiar, as como para detectar el riesgo de poder desarrollar la enfermedad por la presencia de determinadas mutaciones. En el caso del diagnstico por imagen han sido siete las metodologas identificadas a lo largo de la elaboracin de este informe. A su vez estas tcnicas se diferencian en las que sirven para dar informacin de neuroimagen estructural e informacin de neuroimagen funcional. La tomografa computarizada y la resonancia magntica nuclear, tcnicas de imagen estructural, se emplean cada vez con ms frecuencia en el diagnstico de la enfermedad de Alzheimer para excluir otras causas alternativas de demencias como tumores o infartos cerebrales, entre otras. Sin embargo, por s solas no aportan suficiente informacin como para establecer un diagnstico de la enfermedad de

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Alzheimer. Por el contrario, las tcnicas de imagen funcional han mostrado un gran desarrollo en los ltimos aos. El descubrimiento de compuestos como el PIB que se utiliza en la tomografa por emisin de positrones, que permiten localizar marcadores moleculares como los depsitos de las placas -amiloides en el cerebro, ha supuesto un gran avance. As como la posibilidad de analizar el metabolismo del cerebro con tcnicas como el SPECT o la espectroscopia por resonancia magntica. La introduccin de estas tcnicas con fines diagnsticos es cada vez ms usual para apoyar el diagnstico clnico de la enfermedad de Alzheimer, pero adems las investigaciones recientes tienden a la combinacin de distintas tcnicas de imagen funcional y estructural para mejorar la especificidad y fiabilidad del diagnstico. En cuanto al entorno cientfico en Espaa, relacionado con el diagnstico molecular de la enfermedad de Alzheimer, se han identificado cincuenta grupos de referencia que se dedican a investigar en este campo, de los cuales ms de la mitad (veintiuno) se encuentran en la Comunidad de Madrid. Sin embargo, el nmero de cientficos que dedican su actividad investigadora al estudio de diversos aspectos de la enfermedad de Alzheimer, como nuevas terapias, es mucho mayor. Este hecho pone de manifiesto que existe un creciente inters por avanzar en el conocimiento sobre esta enfermedad. En el anexo II del presente informe se recoge una relacin de las patentes espaolas relacionadas con tcnicas de diagnstico molecular, que se han detectado desde el ao 1999 hasta la actualidad. Se observa que se ha pasado de patentar en temas relacionados con las bases genticas de la enfermedad a patentar en temas relacionados con la deteccin de biomarcadores mediante mtodos inmunolgicos. En este anexo tambin se recogen los resultados de las bsquedas de patentes sobre mtodos de diagnstico de la enfermedad de Alzheimer, en el resto del mundo, restringiendo el periodo de tiempo desde el ao 2006. En este caso se observa que existe un mayor nmero de patentes del campo del diagnstico in vitro que por imagen. El uso de pptidos y anticuerpos para emplear en mtodos de diagnstico de la enfermedad de Alzheimer ha originado la solicitud de una gran cantidad de patentes. Por ltimo, se ha recopilado informacin de dieciseis empresas que cuentan con servicios y productos para el diagnstico molecular in vitro. Entre las distintas empresas que figuran en el anexo III una parte se dedican a la realizacin de test genticos para analizar la predisposicin a padecer la enfermedad de Alzheimer y otra parte se dedican a la produccin y comercializacin de diferentes kits ELISA, para la deteccin de los principales marcadores descritos en el presente informe. Debido a que las tcnicas de imagen requieren instalaciones especiales y se encuentran en un gran nmero de centros hospitalarios no se ha incluido informacin relativa a centros que ofrecen estos servicios.
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CAPTULO 7 Conclusiones del informe
CAPTULO 8
Referencias
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CAPTULO 8 Referencias
CAPTULO 9
Abreviaturas
APP ADN ApoE BOLD ELISA ERM ESI
Protena precursora del -amilode (Amyloid Precursor Protein) cido desoxirribonucleico Apolipoprotena E Blood Oxygenation Level Dependent Ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzima (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Espectroscopia por resonancia magntica Electrospray (Electrospray ionization) 2-[18F]-fluoro-2-desoxi-D-glucosa Cromatografa lquida acoplada a espectrmetros de masa en tandem (Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry) lquido cefalorraqudeo Desorcin/ ionizacin por lser asistida por matriz acoplada a un detector de tiempo de vuelo (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight) Magnetoencefalografa N-acetil aspartato Instituto Nacional de Desrdenes Neurolgicos, Enfermedad de Alzheimer y Desrdenes Relacionados Reaccin en cadena de la polimerasa Tomografa por emisin de positrones Fragmentos Helicoidales Pareados Pittsburg Compound-B Presenilina 1 Presenilina 2 Resonancia magntica nuclear Resonancia magntica nuclear funcional Tomografa por emisin de fotn nico Tomografa axial computarizada Tomografa computarizada
FDG LC/MS/MS
LCR MALDI-TOF
MEG NAA NINCDS-ADRDA
PCR PET PHF
72
PIB PSEN1 PSEN2 RMN RMNf SPECT TAC TC
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informe de vigilancia tecnolgica

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Coleccin de Informes de Vigilancia Tecnolgica madri+d

Jos de la Sota Rus

Fundacin madri+d para el Conocimiento CEIM Confederacin Empresarial de Madrid - CEOE

Informe realizado para:

Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

Entorno cientfico y empresarial

Principales retos y tendencias

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y por imagen de la enfermedad de alzheimer

45-54 55-65 66-69 70-74

25b 72b 590c 1.780c 4.110c 8.620c 17.030c 31.630c 53.610c

vt ltimos avances en el diagnstico molecular

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75-79 80-84 85-90 90-94 95 +

TABLA 2 Grados de recomendacin para pruebas diagnsticas de la enfermedad de Alzheimer.

Diagnstico en situaciones preclnicas: Deterioro Cognitivo Leve

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Pptido A t-tau p-tau Mioinositol

CCL-18 ANG-2 IGFBP-6 CXCL8 ICAM-1 IL-11

TRAIL-R4 CCL15 CCL7 IL-3 IL-1 PDGF-BB

EGF CCL5 GDNF G-CSF M-CSF TNF

Donepezilo Rivastigmina Galantamina Memantina

Anticolinestersicos Anticolinestersicos Anticolinestersicos Antagoniza los receptores NMDA glutaminrgicos

Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

3.2 Diagnstico por imagen

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TABLA 5 Clasificacin de las tcnicas de diagnstico para la enfermedad de Alzheimer.

CAPTULO 3 Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

Diagnstico molecular in vitro

3.1.1 Marcadores para el diagnstico in vitro

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Placas neurticas que contienen pptidos -amiloides

Ovillos neurofibrilares que contiene la protena tau

FIGURA 2 Placas neurticas y ovillos neurofibrilares en el cortex cerebral de un enfermo de Alzheimer.

Marcadores biolgicos Lquido Cefalorraqudeo (LCR) Sangre

Protena de cadena neural (AD7C-NTP)

APP -secretasa (BACE) -secretasa (ADAM10)

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CAPTULO 3 Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

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Neurona con ovillos neurofibrilares

APP Pptido -amiloide

Protena tau Protena tau fosforilada

CAPTULO 3 Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

3.1.2 Tcnicas de diagnstico in vitro

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3.1.2.1 Ensayos inmunoenzimticos tipo ELISA

ELISA tipo sandwich

CAPTULO 3 Diagnstico de la enfermedad de Alzheimer

Anticuerpo-enzima Producto de reaccin