Determinacin cuantitativa de saponinas y azcares reductores del Agave brittoniana T

J. O. Guerra de L.,* C. Nogueiras L.,** R. Delgado C.,*** O. Hernndez S.* *Facultad de Qumica Farmacia, Universidad Central de Las Villas,**Facultad de Qumica, Universidad de La Habana,***Facultad de Educacin, Universidad de Cienfuegos

Resumen
En este trabajo se determin los contenidos de saponinas y azcares reductores en jugo y extractos de hojas de la planta denominada Agave brittoniana T. Los procedimientos empleados fueron, en la determinacin de saponinas, un mtodo fotocolorimtrico, en el cual se midi el color desarrollado durante la hemlisis de la sangre por este tipo de compuesto; para la determinacin de azcares reductores se utiliz el mtodo de Folin-Wu. Los resultados obtenidos arrojaron un alto contenido de saponinas y baja cantidad de azcares reductores en esta planta con respecto a otros agaves. Palabras claves: glicsidos esteroidales, hemlisis.

Abstract
In this paper were determined the contents of saponins and reducing sugars in juice and leaf extracts of the plant known as Agave brittoniana T. The procedures used were, in the determination of saponins, a photocolorimetric method, in which the color developed is measured during the blood hemolysis caused by this type of compound; for the determination of reducing sugars Folin-Wo method was used. The results obtained, gave a high content of saponins and a low quantity of reducing sugars on this plant with respect to other agaves. Key words: steroidal glycosides, hemolysis.

Introduccin
Las saponinas son compuestos naturales que se encuentran en las plantas con una estructura glicosdica, y de los cuales se reporta en la literatura un gran nmero de propiedades bioactivas. Por otra parte, estos tipos de compuestos son precursores en la obtencin de frmacos esteroidales. Dentro de las plantas que se caracterizan por el alto contenido de estos glicsidos, estn las pertenecientes al gnero Agave. Tal es el caso de la denominada Agave brittoniana T., endmica de la regin central del pas, la cual ha sido objeto de este trabajo.

Resulta de inters cuantificar las saponinas presentes en el material vegetal, as como en distintos productos intermedios del proceso de separacin de las mismas, pues esto nos da una medida de rendimientos del producto final que se separa, as como de la eficacia de los procedimientos de separacin utilizados. Tambin es importante el contenido de azcares reductores, teniendo en cuenta que en la medida que ste sea mayor es ms dificil una eficaz separacin de las saponinas presentes. Adems, conocer el contenido de estos metabolitos forma parte de una caracterizacin fitoqumica completa de la planta en estudio.
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En la literatuta aparecen reportados varios mtodos para la extraccin de saponinas, los que se basan en la solubilidad de estos compuestos en solventes polares como agua, metanol y n-butanol y su insolubilidad en ter y otros solventes orgnicos. Para la determinacin cuantitativa de estos compuestos se ha planteado el uso de tcnicas colorimtricas, espectrofotomtricas, cromatogrficas y gravimtricas. En la actualidad se emplea con mucho nfasis la cromatografa en la determinacin cuantitativa de saponinas, principalmente las tcnicas de HPLC /1, 3/, aunque stas tienen como inconveniente su alto costo. Tambin se han empleado tcnicas de capa delgada preparativa /3/ lo cual no siempre conduce a buenos resultados. En muchos trabajos no se reporta la determinacin directa de saponinas, sino que sta se infiere a partir de la determinacin de las sapogeninas esteroidales, despus de una hidrlisis de las saponinas. Ya desde la dcada del 50, Wall y colaboradores /4/ reportaron un mtodo utilizando espectroscopa infrarroja, basado en la relacin existente entre la concentracin de las sapogeninas y la intensidad de una banda situada en 982-987 cm-1. Ms recientemente se han desarrollado tcnicas fotocolorimtricas en las que, despes de la hidrlisis de las saponinas, se desarrolla el color por reaccin con mezcla de cidos sulfrico y actico glacial. Otra tcnica desarrollada /5/ en la determinacin de saponinas en tubrculos de Dioscreas consiste en un proceso simultneo de hidrlisis y extraccin, as como el posterior desarrollo de un color rojo estable al tratar la muestra con SbCl5. La propiedad de las saponinas de romper la pared celular de los glbulos rojos de la sangre (hemlisis) ha servido de principio para que un gran nmero de investigadores /6/ propusiera un mtodo de determinacin directa de saponinas mediante la aplicacin de una tcnica fotocolorimtrica. Ese mtodo fue el utilizado en este trabajo. Para la determinacin de azcares se emple el mtodo fotocolorimtrico conocido como mtodo de Folin-Wu, en el cual los azcares reductores reaccionan

con una solucin alcalina cprica, formando un precipitado de xido cuproso. Este ltimo se disolvi en una solucin de cido fosfotungstomolbdico, reduciendo el molibdemo presente a cido molibdoso, el cual posee una coloracin azul cuya absorbancia se mide a 500 nm.

Parte experimental
Recoleccin y preparacin del material vegetal
El material vegetal fue colectado por el doctor Alfredo Noa (botnico) en las afueras de la ciudad de Santa Clara, en el lugar conocido como la loma de "La Melchora", situada en las inmediaciones de la Autopista Nacional en el mes de junio de 1997. Las plantas seleccionadas posean hojas de aproximadamente 1 m de longitud y 10 cm en la parte ms ancha, las cuales se encontraban sobre un tallo de 50 cm de altura y 10 cm de dimetro; para el estudio se tomaron hojas y races de la planta. De las hojas se separ la cutcula que las cubre para su estudio por separado. Cada una de estas partes se pic en finas lascas, procedindose en el caso de las hojas a un proceso de secado a la sombra hasta peso constante. Se moli el material hasta polvo fino.

Determinacin cuantitativa de saponinas

sta se realiz de acuerdo con los siguientes pasos : a) Conservacin de la sangre. En un matraz de 100 mL se aadi 10 mL solucin de citrato de sodio (36,5 g/L) y se complet con sangre de res. Esta solucin puede conservarse hasta una semana a 2 8 0C. b) Preparacin de los glbulos rojos. No obstante el paso anterior, parte de la sangre siempre se hemoliza, por lo que es necesario lavarla antes de trabajar con ella. Se tom 5 mL de la sangre preparada segn el inciso anterior y se suspendi en 50 mL de suero fisiolgico salino; se centrifug a 2 500 rpm durante 15 min; se decant el lquido sobrenadante y se repiti el proceso dos veces ms. El precipitado de glbulos rojos se resuspendi en una solucin de citrato de sodio al 3 % en proporcin 1:20.

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c) Preparacin de la curva de calibracin. Se trasvas 10 mg de saponinas qumicamente puras a un matraz de 50 mL, completndose con solucin buffer de KH2PO4 de pH = 7,4 . A partir de esta solucin madre, se prepar otras de concentracin 0,030; 0,025; 0,020; 0,015; 0,010 y 0,005 g/L, a las que se les determin el por ciento de hemlisis. d) Preparacin de las muestras. Las muestras problemas de saponinas se diluyeron en proporciones adecuadas con solucin buffer de KH2PO4 de pH = 7,4 preparndose de esta forma las soluciones de trabajo. e) Determinacin de la hemlisis. Se prepar 6 tubos de ensayos, a los cuales se les aadi 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5 y 1,8 mL de solucin de trabajo, respectivamente y se complet con agua hasta un volumen total de 6 mL. A cada tubo se le aadi tambin 6 mL de solucin de citrato de sodio al 6 % y 1 mL de la solucin de glbulos rojos (muestras para determinar la hidrlisis). Por otra parte, se prepar 6 tubos de ensayos ms, de la misma forma que los anteriores, pero se le aadi a cada uno 1 mL de solucin de citrato de sodio al 3 % en lugar de la solucin de glbulos rojos (blanco en la lectura fotocolorimtrica). Los seis primeros tubos se colocaron en un bao de agua a 35 0C durante 30 min, se centrifugaron a 2 000 rpm durante 5 min. Paralelamente, de la misma forma, se prepar controles utilizando agua destilada y citrato de sodio al 3 % (en lugar de las soluciones de saponinas) para determinar el 100 % y el 0 % de hemlisis, respectivamente. f) Clculos: El por ciento de hemlisis para todos los casos se determin segn la siguiente ecuacin:

De la curva de calibracin (% de hemlisis contra concentracin de saponinas) se determin el valor de K que es la concentracin de saponinas, para la cual ocurri el 50 % de la hemlisis. En el caso de las soluciones de trabajo se grafic el por ciento de hemlisis contra el inverso de las diluciones a las que se prepararon y se determin el valor de 1/dil que es el inverso de la dilucin a la que ocurri el 50 % de hemlisis. La concentracin de saponinas en la muestra se determin mediante la ecuacin:
C sap = 2. K . Fd .1 / dil

b g

Fd:factordedilucin

Determinacin cuantitativa de azcares reductores

Para esta determinacin se dio los siguientes pasos : a) Preparacin de la curva de calibracin. Se pes 50 mg de glucosa y se trasvas a un matraz de 100 mL que se complet con agua. A partir de esta solucin madre , se prepar otras de concentraciones 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 y 0,6 mg/L, con las que se confeccion la curva de calibracin. b) Preparacin de las muestras. Las muestras a las que se les determin el contenido de azcares reductores se diluyeron en agua en proporciones adecuadas, obtenindose as las soluciones de trabajo. c) Determinacin de los reductores. A 1 mL de la solucin de trabajo se le aadi 7 mL de agua, 1 mL de cido sulfrico de concentracin molar equivalente 0,66 mol/L y 1 mL de solucin de tungstato de sodio 10 %; se agit y se centrifug. Del sobrenadante se tom 1 mL y se le aadi 1 mL de solucin alcalina de tartrato de cobre 10 %; se mantuvo 8 min en bao de agua. A esta solucin se le aadi 1 mL de solucin fosfotngstica molbdica y se mantuvo a ebullicin durante 2 min; se enfri posteriormente a temperatura ambiente. En el tubo folin se diluy con agua destilada hasta 25 mL, leyndose en el fotocolormetro a 500 nm.

% hem = A

A .100 / A A CTS AGUA CTS

donde AM : Absorbancia de cada muestra ACTS : Absorbancia del control con solucin del citrato de sodio AAGUA : Absorbancia del control con agua destilada.

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Resultados y discusin

el epgrafe 3.4, se obtuvo los resultados que aparecen en la tabla 2.

TABLA 2: RESULTADOS EN LA DETERMINACIN DE SAPONINAS

Determinacin cuantitativa de saponinas

Para la confeccin de la curva de calibracin se determin el por ciento de hemlisis de la muestra de saponinas patrn a diferentes concentraciones obtenindose los resultados que se muestran en la tabla 1.
TABLA 1: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRACIN

Crudo de saponinas (g saponinas /100 g crudo de glicsidos) X X1 X2 X3 X4 X5 Prom. S S

2

JUGO (g/L) 41,00 41,10 41,12 41,15 40,93 41,02 0,09192 0,00845 22,4 % 0,1141

HOJAS 4,58 4,61 4,67 4,68 4,55 4,62 0,0563 0,00317 1,22 % 0,069897

RAICES 1,15 1,18 1,20 1,21 1,17 1,18 0,0238 0,00057 2,02 % 0,02964

Punto No. 1 2 3 4 5 6

Concentracin saponinas ( g/L) 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005

de

% hemlisis 99,60 81, 24 60,87 42,10 22,12 7,20

de

C.V. Int. Conf.

Estos valores corresponden a una recta que fue ajustada a los mismos por el mtodo de los mnimos cuadrados. El coeficiente de correlacin obtenido fue de 0,999 y la ecuacin de la misma es: C(sap) = 0,0043 + 0,00026 . % Hem donde C(sap) = concentracin de saponinas en g/L % Hem = por ciento de hemlisis Con esta ecuacin se calcul el valor de K (concentracin de saponinas a la que ocurri el 50 % de la hemlisis) que result ser 0,0173 g/L. Teniendo en cuenta que en este mtodo la zona de mnimo error se encuentra alrededor del 50 % de la lectura fotocolorimtrica, a este valor se ajustaron todas las mediciones realizadas. Para conocer el contenido de saponinas en el jugo y crudos, se determin el factor de dilucin a la que cada muestra provoc el 50 % de hemlisis, y con este resultado y aplicando la frmula que se explic en

donde Prom: Valor promedio S: Desviacin tpica S2 : Varianza Si bien estos valores no pueden interpretarse como resultados absolutos, nos sirven para poder comparar el contenido relativo de saponinas entre distintas partes de una planta, variacin de este metabolito con la poca del ao, con el tipo de suelo, etctera, o la comparacin con otro tipo de plantas siempre que las determinaciones se hayan realizado por el mismo mtodo. Se observ que el contenido de saponinas de este agave es mayor que el reportado para el henequn (66,67) que es del orden de 2-3 g/L. Tambin se apreci cmo en las hojas la concentracin de saponinas es aproximadamente 4 veces mayor que en las races. C. V.: Coeficiente de variacin Int. Conf.: Intervalo de confianza

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Determinacin cuantitativa de azcares reductores

Inicialmente se determin la absorbancia utilizando solucin patrn de glucosa a distintas concentraciones, aprecindose los resultados en la tabla 3
TABLA 3: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRACIN
Punto No. 1 2 3 4 5 6 Concentracin de glucosa (mg/L) 10 20 30 40 50 60 0,15 0,27 0,40 0,53 0,66 0,78 Absorbancia

Estos valores corresponden a una recta que fue ajustada a los mismos por el mtodo de los mnimos cuadrados. El coeficiente de correlacin obtenido fue de 0,997 y la ecuacin de la misma es: Abs= 0,0202 + 0,0127. Conc(Az. Red.) donde Abs= Absorbancia Conc (Az. Red.)= Concentracin de azcares reductores Se determin el contenido de azcares reductores en el jugo y extractos n-butanlicos de las hojas. Se obtuvo los resultados que se muestran en la tabla 4.
TABLA 4: RESULTADOS DE LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES

X X1 X2 X3 X4 X5 Prom. S S
2

Jugo (mg/100 mL) 47,22 47,27 47,31 47,20 47,15 47,23 0,062048 0,00385 1,31.10 % 0,077
-1

Crudo (mg/g) (Hojas) 329,1 328,7 331,0 331,2 330,2 330,04 1,1149 1,2430 3,38 . 10 % 1,3841
-2

C.V. Int. Conf.

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donde Prom es el valor promedio; C.V. el coeficiente de variacin; S: Desviacin tpica; Int. Conf.: Intervalo de confianza; S2: Varianza. Estos valores resultaron menores que los resportados para el jugo de henequn (ms de 200 mg/L) [66, 67], lo cual, junto al alto contenido de saponinas, favorece los procesos de extracin y purificacin de estas ltimas.

Conclusiones
Se estableci las condiciones adecuadas para la determinacin del contenido de saponinas por la tcnica de hemlisis y del contenido de azcares reductores por la tcnica de Folin-Wu en productos derivados de la planta denominada Agave brittoniana T. El contenido de azcares reductores result ser muy bajo respecto al de saponinas, aspecto que favorece la extraccin de estas ltimas. Este mtodo puede ser de gran utilidad en la cuantificacin del principio activo durante la preparacin de formas farmacuticas a partir de la droga seca o de extractos de la planta, dadas las propiedades bioactivas reportadas para las saponinas esteroidales.

Bibliografa
1. Rishi A. K., Kapoor R., Vakhlu, V. K., "Un mtodo espectrofotomtrico rpido para la determinacin cuantitativa de diosgenina en tubrculos de Dioscoreas", en Curr. Sci. vol. 45, nm. 9., 1974, pg. 327. 2. Frank, H. P., "Qualitative and Cuantitative Analisys of Saponins", en Dtsch. Apoth. Ztg., vol. 115, nm. 33, 1975, pg. 1206. 3. Slakanin, I., Marston, A., "HPLC of Determinacion of Mulluskicidad from Phitolacca Dodecandra (Phytolaccaceae)", J. Chromatography, vol. 10, 1981. 4. Sotheeswaran, S.; "Screening for saponins using the blood hemolisys test. An undergraduated laboratory experiment", en J. Chem Education. vol. 65, nm. 2, 1988, pg. 161. 5. Schelemmer, W., Kerr D., "Automated determination of the hemolytic activity of saponins", Sci. Pharm. vol 38. nm. 4., 1970, pg. 244. 6. Aguiar, T., "Un nuevo mtodo para la determinacin de saponinas y su aplicacin a diversas variedades de quinua peruana", en Acta Cientfica Venezolana, vol 30, 1979, pg. 167.

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