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1. INTRODUO A lignina foi originalmente descoberta por Anselm Payen em 1838 aps tratamento da madeira com cido sulfrico concentrado. O nome lignina vem do latim "lignum" que significa madeira. Em 1897, Peter Klason estudou a composio dos lignossulfonatos, provenientes da polpao sulfito da madeira, e lanou a idia de que a lignina quimicamente relacionada com o lcool coniferlico. Em 1907, ele props que a lignina era uma substncia macromolecular, e 10 anos mais tarde, que era composta por unidades de lcool coniferlico unidos por ligaes ter. Hoje em dia, sabe-se que a lignina basicamente um polmero aromtico constitudo de um sistema heterogneo e ramificado sem nenhuma unidade repetidora definida. O sistema totalmente amorfo e ligado quimicamente as hemiceluloses. A lignina ocorre na maioria das plantas mas sua composio no idntica em todas elas. De fato, as ligninas isoladas de madeira de fibra longa (MFL), madeira de fibra curta (MFC) e gramneas possuem estruturas bsicas muito diferentes entre elas. Portanto, as ligninas podem ser consideradas como uma classe de materiais relacionados, sendo conveniente identific-las em termos da espcie de origem e com referncia ao mtodo de isolamento utilizado. O papel biolgico da lignina nas plantas vivas formar, juntamente com a celulose e outros carboidratos da parede celular, um tecido de excelente resistncia e durabilidade. A lignina tambm reduz a permeabilidade da parede celular gua, o que facilita seu transporte longitudinal na planta. Acredita-se tambm que as paredes celulares lignificadas resistem ao ataque por micrbios porque a penetrao das enzimas destrutivas liberadas pelos organismos invasores nas mesmas reduzida. O estudo da lignina de importncia considervel porque uma maior compreenso de suas propriedades e reaes pode ser de grande assistncia na implementao de processos de polpao e de branqueamento de polpa, na determinao das propriedades da madeira e das fibras e no melhor aproveitamento dos subprodutos da lignina. Este ltimo de grande importncia se for considerado que dezenas de milhes de toneladas de lignina so anualmente queimadas ou perdidas no efluente de fbricas de polpa. Isto representa uma grande fonte potencial e renovvel de subprodutos orgnicos. 2. BIOSSNTESE DA LIGNINA 2.1. Introduo Acredita-se que a sntese da lignina foi uma adaptao bsica e uma etapa fundamental na evoluo das plantas terrestres superiores. As plantas primitivas tais como fungos e algas no possuem lignina, aparentemente porque seus aglomerados de clulas no diferenciadas no requerem a ao protetora e de suporte que oferecida pela lignina. Especula-se que a lignina originou como 112
agente antimicrobial e que ao longo da evoluo a lignina comeou a desempenhar um papel no suporte mecnico e no transporte de gua na planta. Ela permitiu que as plantas aumentassem em dimetro e altura uma vez que os tecidos lignificados eram capazes de resistir s foras de compresso e curvatura. 2.2. Biossntese da Lignina e Metabolismo Secundrio na Planta A lignina compartilha rotas biossintticas comuns com uma variedade de metablitos secundrios, tais como os flavonides, a suberina, os coumaranos, os estilbenos e as lignanas (Figura 1). Todos estes compostos so derivados da fenilalanina, o precursor de todas as rotas biossintticas que partem da estrutura fenilpropanide (C9). possvel que as rotas biossintticas que partem dos intermedirios comuns lignina possam afetar a biossntese da lignina, mas no se sabe como estas rotas competidoras so reguladas, nem a extenso da especificidade por um dado tecido de vegetal das principais rotas metablicas. So necessrios mais estudos direcionados ao esclarecimento do desenvolvimento especfico dessas rotas biossintticas relacionadas na planta. cidos fenilacticos fenilalanina coumaranos cidos benzicos cidos cinmicos steres cinamlicos amidas steres cinamlicos CoA flavonoides estilbenos
lcoois cinamlicos lignanas lignina Figura 1. Rotas metablicas relacionadas sntese da lignina. 2.3. Biossntese dos Precursores da Lignina
Nas Figuras 2 a 4 mostrado um breve sumrio das rotas metablicas que conduzem formao dos precursores da lignina. A maioria dessas rotas biossintticas foram determinadas utilizando a tcnica do marcador 14C. Como a maioria dos constituintes aromticos das plantas, os precursores da lignina so formados via a rota do cido shiqumico (Figura 2). O cido shiqumico formado pela fuso do cido fosfoenolpirvico com a eritrose-4-fosfato, sendo estes intermedirios formados a partir da glicose, o produto da fotossntese na planta. O cido shiqumico se torna a pedra fundamental na sntese dos aminocidos Ltirosina e L-fenilalanina, que so formados por aminao redutiva via o cido prefnico. Os aminocidos so o ponto de partida do metabolismo enzimtico fenilpropanide (a rota do cido cinmico, Figura 3). As enzimas de desaminao (desaminases) subseqentemente convertem os dois aminocidos em seus respectivos cidos cinmicos (Figura 4). Hidroxilao passo a passo por hidroxilases e eventual metilao por 4-0-metiltransferases transformam os cidos 113
cinmicos em trs lcoois p-hidroxicinamlicos que so considerados os precursores da lignina . So eles os lcoois p-coumarlico, coniferlico e sinaplico.
CH O C OH C H C OH C OH C H2 O H
H HO H H
0H HO 0H COOH
GLUCOSE
CIDO SHIQUMICO
HO
NH 2 CH2 CHCOOH
HO
CH 2 COCOOH COOH
TIROSINA
NH 2 CH 2 CHCOOH
CIDO PREFNICO
FENILALANINA
-CH=CHCOOH
CIDO CINMICO
FENOLASES
HO
HO
-CH=CHCOOH
CIDO p-COUMRICO
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COOH CH CH
1. Fenolases 2. Metiltransferases
COOH CH CH
1. Fenolases 2. Metiltransferases
COOH CH CH
OCH3 OH OH
H3 CO OH
OCH3
CIDO p-COUMRICO
CIDO FERLICO
CIDO SINPICO
CH 2 OH CH CH
CH 2 OH CH CH
CH 2 OH CH CH
OCH3 OH OH
H3 CO OH
OCH3
LCOOL p-COUMARLICO
LCOOL CONIFERLICO
LCOOL SINAPLICO
Figura 4. Desaminao, hidroxilao e metilao dos cidos cinmicos para formar os precursores da lignina, os lcoois p-coumarlico, coniferlico e sinaplico. A extenso da hidroxilao e metilao dos cidos cinmicos tem um impacto significativo na estrutura da lignina porque ela determina se uma lignina vai ser do tipo guaiacil ou guaiacil-siringil. O lcool conferlico a base da lignina guaiacil, enquanto o lcool sinaplico a base da lignina siringil. Higuchi e colaboradores fizeram estudos extensivos sobre a extenso da substituio dos precursores da lignina por grupos de metoxila. Eles determinaram que uma das razes para a maior proporo de unidades siringil na MFC do que na MFL a maior afinidade das 4-0-metiltransferases da MFC para com o cido ferlico, o precursor do lcool sinaplico. Portanto, se torna aparente que a especificidade e atividade de enzimas so os fatores decisivos para determinar se a planta vai ser lignificada com guaiacil (lignina de MFL) ou guaiacil-siringil (lignina de MFC). Os lcoois p-hidroxicinamlicos diferem grandemente dos precursores sacardicos com respeito a composio elementar, solubilidade em meio aquoso e 115
reatividade qumica com relao a sistemas de enzimas oxidantes. A baixa solubilidade e a alta reatividade em relao a oxidantes faz com que seja crucial para a clula estabilizar os lcoois p-hidroxicinamlicos contra a polimerizao prematura e o trmino de suas atividades de sustentao da vida. Esta estabilizao conseguida atravs da formao de glicosdeos entre monmeros fenlicos e unidades de acar. A primeira elucidao estrutural do glicosdeo coniferina, o glicosdeo formado por -D-glicose e lcool coniferlico, mostrado na Figura 5, creditado a Tiemann e Mandelsohn. A coniferina caracterizada pela sua alta solubilidade em meio aquoso. Ela tambm possui uma alta estabilidade contra agentes oxidantes porque o grupo sensvel oxidao, a hidroxila fenlica, est protegida por uma ligao glicosdica. Este glicosdeo pode ser livremente armazenado e transportado pela planta sem o risco de uma polimerizao prematura da metade fenlica.
Figura 5. Estrutura da coniferina, o glicosdeo do lcool coniferlico. Do ponto de vista da bioqumica, importante que todas as enzimas que participam da formao dos lcoois p-hidroxicinamlicos sejam tecido-especficos e localizados predominante ou exclusivamente nas clulas do xilema em processo de lignificao. Acredita-se que os glicosdeos encontrados na seiva do cmbio das MFL servem, portanto, como reservatrio dos cidos p-hidroxicinamlicos que so translocados at os stios de deposio da lignina nesta sua forma solvel. A liberao do lcool p-hidroxicinamlico feita pela clula em processo de lignificao atravs da enzima -glicosidase. Foi comprovada histoquimicamente pela reao colorimtrica indicadora da presena de -glicosidase presa na parede celular de clulas em processo de lignificao e sua ausncia nas clulas do cmbio. No se tem certeza ainda como os glicosdeos so transportados atravs da membrana celular para entrar em contato com a -glicosidase na parede celular, mas estudos recentes apontam para uma participao das vesculas de Golgi.
hidrognio do fenol e d partida a todo o processo de polimerizao. Os principais mecanismos da polimerizao foram elaborados por Freudenberg e seus colaboradores que produziram uma lignina in vitro, chamado de polmero de desidrogenao (DHP), por tratamento do lcool coniferlico com uma lacase fngica e com uma peroxidase de rbano e perxido de hidrognio. Embora a ao cataltica da lacase na presena de ar ou outras substncias oxidantes possa levar formao de radicais de fenxido a partir dos lcoois phidroxicinamlicos, geralmente aceito que os catalisadores responsveis pela iniciao das reaes de polimerizao in vivo so as peroxidases. Acredita-se que as peroxidases esto envolvidas na gerao de H2O2 e na polimerizao oxidativa dos lcoois p-hidroxicinamlicos. possvel que os dois mecanismos sejam controlados por peroxidases diferentes. A complexidade da estrutura da lignina resulta da existncia de vrias formas mesomricas de um radical de fenxido gerado a partir do lcool phidroxicinamlico. Estas so mostradas na Figura 6 para o lcool coniferlico. A polimerizao ocorre pela unio no-enzimtica dos radicais de fenxido nas vrias formas mesomricas. Se for assumida a existncia de 5 formas mesomricas para cada radical de fenxido, refletindo cinco stios de alta densidade de eltrons, o nmero terico de estruturas dimricas ou ligaes interunitrias entre monmeros 25. Contudo, apenas 4 radicais de fenxido participam do processo de polimerizao, uma vez que o V (Figura 6) est impedido estericamente ou desfavorecido termodinamicamente. Os principais modos de acoplamento entre radicais so apresentados na Tabela 1.
CH 2 OH HC CH
OCH OH
- (e - + H+ )
CH 2 OH HC CH
CH 2 OH HC CH
CH2 OH HC CH
CH 2 OH HC CH
CH 2 OH HC CH
OCH O
OCH 3 O
H O
OCH
3 O
OCH
O CH O
II
III
IV
Figura 6. Desidrogenao enzimtica do lcool coniferlico levando formao de 5 radicais mesomricos de fenxido.
117
Tabela 1. Modos de acoplamento de radicais de fenxido dos lcois hidroxicinamlicos mostrados na Figura 6. I I perxido instvel II -O-4 III 4-O-5 IV 1-O-4* * Outras opes possveis II -O-4 - -5 -1* III 4-O-5 -5 5-5 1-5* IV 1-O-4* -1* 1-5* 1-1*
p-
A freqncia relativa com a qual stios individuais estaro envolvidos numa reao de acoplamento fenlico depende das suas relativas densidades de eltrons . Clculos de mecnica quntica da densidade de eltrons nos radicais fenxido relacionados com a lignina so apresentados na Tabela 2. Vrias observaes podem ser feitas a partir desses dados. (1) Os radicais de fenxido tm (em todos os modelos calculados) a mais alta densidade de eltrons nos seus oxignios fenlicos. Isto resulta uma maior probabilidade de se formar ligaes ter-arila nestes tomos pelo acoplamento de radicais durante a lignificao do que qualquer outro tipo de ligao interunitria. (2) A presena de substituintes de alcoxila, aroxila e arila na posio orto ao grupo OH fenlico parece desativar as posies meta respectivas, resultando em reduzida densidade de eltrons naqueles stios em favor de uma alta densidade de eltrons nos pontos onde esto os substituintes. Entretanto nas reaes de acoplamento de fenis, essas posies de alta densidade de eltrons (orto) parecem ser relativamente no reativas. Isto pode ser explicado por impedimento estrico ou pela relativa instabilidade de produtos de acoplamentos primrios (razes termodinmicas). Connors et al. demonstraram que as configuraes dimricas termodinamicamente desfavorveis no so inteiramente imunes a rotas alternativas de estabilizao atravs do isolamento de estruturas tipo catecol. Os acoplamentos de radicais que levam a formao de dmeros so mostrados para 3 tipos importantes de ligaes interunitrias na Figura 7. Todos trs mecanismos so caracterizados pela existncia de estruturas intermedirias e transitrias de quinonametdeos que se estabilizam atravs da adio intramolecular ou externa de metades contendo grupos de hidroxila. No caso das ligaes -0-4, essas adies podem ser na forma de gua ou grupos de hidroxila. Grupos de hidroxilas fenlicas foram mostrados adicionar a uma taxa maior que grupos de hidroxilas alifticas e gua. A adio de substncias contendo grupos de hidroxila aos quinonametdeos envolve um mecanismo de polimerizao que no baseado em desidrogenao. um mecanismo que torna possvel a incorporao de compostos no fenlicos sem que eles tenham que passar pela formao de radicais. O contato ntimo entre intermedirios quinonides dimricos e oligomricos, com substncias celulsicas e hemicelulsicas na parede celular torna provvel que um certo nmero de grupos de carboxila de hidroxila primrios e secundrios provenientes dos carboidratos se tornem ligados covalentemente lignina da madeira. Estas ligaes podem ser do tipo ter ou ster.
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Tabela 2. Distribuio de densidades dos eltrons nos radicais de fenxido relacionados a lignina.
1 6 5 4 2 3 6 5 4
O
6 5
O
1 2 3 6 5 2 3 4
O I
O II
O III
Posio Oxignio fenlico 1 2 3 4 5 6 Oxignio de carbonila Oxignio de aroxila Oxignio de metoxila Carbono de metoxila
III 0,22 0,19 0,02 0,14 0,04 0,14 0,01 0,02 0,16 0,01 0,08 -
Em contraste s combinaes -0-4, que levam principalmente formao de ligaes ter guaiacil-glicerol--arila, a combinao -5 leva quase que inteiramente adio intramolecular interna de grupos de hidroxila fenlicas. Deste acoplamento resulta a estrutura tipo fenilcoumarano mostrada na Figura 7. Uma estabilizao intramolecular similar de intermedirios de quinonametdeo ocorre no caso das combinaes - que leva formao de pinoresinis (Figura 7). Uma certa complicao resulta da alta densidade de eltrons na posio 1 (Tabela 2) de anis aromticos de estruturas de fenilpropano no-vinlicas saturadas. Seguindo o acoplamento na posio 1, o intermedirio quinonide pode se estabilizar em duas rotas alternativas que esto demonstradas na Figura 8. O resultado desta estabilizao depende do substituinte na posio do composto que ir sofrer o ataque na posio 1. Se este substituinte for um grupo de hidroxila, a cadeia lateral ser deslocada. Se o substituinte for algo diferente de um hidroxila, ocorrer um rearranjo do tipo fenol-dienona evitando a fratura 119
da molcula C9; o resultado uma ligao -6. O deslocamento da cadeia lateral mais freqentemente conduzir a ligao -1 mostrada na Figura 8. Com relao desidrogenao enzimtica, interessante mencionar que nesse caso ela no leva polimerizao, mas antes leva fragmentao do polmero. Mesmo no caso de fragmentao, pouco provvel que qualquer parte da molcula seja perdida do sistema polimrico; mesmo as cadeias laterais deslocadas permanecem presas a outras molculas. Portanto, em resumo, pode se dizer que a desidrogenao pode levar polimerizao ou fragmentao do polmero durante a formao da lignina; existem polimerizaes que no so baseadas em desidrogenao mas sim na adio quinonametdeos intermedirios.
OH OC H 3
. CH
CH
C H 2 OH
. CH
CH
+
OC H 3 O O C H 3O OC H 3
OH C H 2 OH CH C H 2 OH CH CH
. CH
CH
C H 2 OH
CH
C H 2 OH
OC H 3 O [2]
HC C H OR OC H 3 O
OC H 3
OH C H 2 OH CH C H 2 OH CH
. CH
CH
C H 2 OH CH CH C H 2 OH HC
OC H 3 O
[3]
.
OC H 3 O OH
HC OC H 3
OC H 3 OH
Figura 7. Formao de trs dilignis a partir do lcool coniferlico. (1) - Dilignol com ligao -, pinoresinol; (2) dilignol com ligao -O-4, ter arilglicerol -arila; (3) - dilignol com ligao -5, fenilcoumarano.
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C C
.CH
CH
C H 2 OH
C C OH B-1
OC H 3
.CHR
+
OC H 3 OC H 3 O
R = OH R OH
C C CHR C H 2 OH CH CHR' C H 3O OH OH OC H 3 e /o u C H 3O
C C CH O CH2 CH CHR' OH OC H 3 OH
O mecanismo de polimerizao descrito acima se refere s reaes entre os monmeros precursores da lignina. A grande diferena no acoplamento entre monmeros e entre oligmeros que no ltimo caso existe um nmero menor de stios dentro da molcula de fenilpropano disponveis para a formao de ligaes interunitrias. Alm disso, os oligmeros possuem uma menor solubilidade e difusibilidade por causa do tamanho de suas molculas. Portanto, o acoplamento entre oligmeros parece ser muito pouco provvel. Se esse tipo de acoplamento ocorresse ("bulk polimerization") era de se esperar a existncia de um grande nmero de cadeias laterais insaturadas na lignina. Entretanto, a quantidade dessas cadeias na lignina bastante baixa. Acredita-se que a reao ocorre via deposio passo a passo ("endwise polimerization") de monmeros a extremidades de um polmero em crescimento em vez da combinao entre oligmeros. A polimerizao passo a passo se torna mais provvel ainda, quando se leva em conta que a concentrao de monmeros na zona de reao muito baixa. A combinao de radicais monomricos com os grupos terminais fenlicos somente atravs de acoplamentos -0-4 e -5 levaria formao de um polmero linear. Entretanto, a formao de ramificaes pode ocorrer atravs da formao de estruturas do tipo benzil-aril-ter. Adicionalmente, o acoplamento 5-5 que forma estruturas de bifenila e 5-0-4 que forma estruturas de ter-diarila produzem ramificaes adicionais. A formao de estruturas de bifenila e ter-diarila ocorre no acoplamento entre 2 radicais das extremidades do polmero em vez do acoplamento entre um radical monomrico e um radical da extremidade do polmero.
parede celular. A incorporao da lignina de natureza hidrofbica leva ao desinchao da parede celular. Resultados obtidos de estudos de microscopia ultravioleta, de flourescncia e eletrnica, tm confirmado que a lignina se deposita inicialmente nos cantos das clulas aps o trmino do alargamento da clula e antes do incio do espessamento da parede secundria (S1). A lignificao prossegue na lamela mdia (LM) e parede primria (P), comeando nas paredes tangenciais e se espalhando centripetalmente. A lignificao da lamela mdia composta (M+P) continua durante a diferenciao das camadas S1 e S2 e at a formao da parede secundria, o que indica que a lignificao um processo permanente durante a diferenciao da parede celular, com um atraso em relao sntese da celulose e das hemiceluloses. Hoje em dia considera-se a lignificao um processo controlado pelas clulas individuais do xilema, i.e. um processo intracelular, sem a participao das clulas do cmbio (exceto no papel de armazenamento dos precursores). Esta suposio pode explicar a descoberta de fibras e esclerdeos em processo de lignificao muito tempo depois destas clulas terem sido produzidas pelo cmbio. Outros fatos que sugerem um processo intracelular so a existncia de tipos diferentes de lignina em clulas diferentes do mesmo tecido vegetal e a existncia da enzima fenilalanina amnia liase (PAL), uma enzima da rota do cido shiqumico, na parede celular de uma clula de xilema em processo de lignificao mas sua ausncia no cmbio da mesma planta. No se sabe ainda como os precursores da lignina chegam at a LM e regies externas da parede celular. Aparentemente, os precursores so sintetizados e armazenados em vesculas derivadas principalmente das vesculas de Golgi, parcialmente do retculo endoplasmtico, e, finalmente, supridos parede celular. O mecanismo de transporte dentro da parede celular desconhecido.
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LIGNIN
o 1. KOH, 170 C 2. Metilao A 3. KMnO 4
COOH
COOH
COOH
COOH
OCH H CO 3 3
OCH 3 [3]
OCH 3
OCH 3
H , cat. 2
CH OH [CH ] 2 3 CH 2 CH 2
[OH] OH [7]
CH 3 HCOC H 2 5 C=O
CH 3 C=O CH 2
CH 3 C=O C=O
OH [8]
OCH 3
OH [9]
OCH 3
OCH OH [10]
OH [11]
OCH 3
Figura 9.
Exemplos dos mtodos de qumica clssica que indicaram uma estrutura fenilpropanide para a lignina. (A): Oxidao com permanganato produz o cido vertrico (1) e quantidades dos cidos isohemipnico (2) e desidrovertrico (3). (B): Oxidao com nitrobenzeno em lcali leva formao de vanilina (4) nas MFL, siringaldedo (5) nas MFC e phidroxibenzaldedo (6) nas gramneas. (C): A hidrogenlise produz derivados do propilciclohexano (7). (D): A etanlise leva formao das cetonas de Hibbert (8-11).
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3.1.1.1. Oxidao A degradao oxidativa da lignina deve preservar o anel aromtico para ser til na caracterizao estrutural das ligninas. Mtodos adequados so a oxidao com permanganato aps hidrlise e metilao, a oxidao com nitrobenzeno e a oxidao com xidos metlicos (principalmente CuO), todas em combinao com lcali. Os cidos carboxlicos mono e dimricos formados proporcionam informaes sobre a estrutura da lignina; por exemplo a existncia de grupos fenlicos livres e eterificados. Freudenberg aqueceu a lignina ou madeira de abeto com hidrxido de potssio 70% para hidrolisar ligaes ter e subseqentemente protegeu os grupos fenlicos liberados por metilao. A oxidao com permanganato do produto metilado em pH 6-7 produziu cido vertrico num rendimento de 8% base lignina e quantidades menores dos cidos isohemipnico e desidrovertico (Figura 9 - rota A). A formao do cido isohemipnico parecia suportar a existncia de estruturas condensadas -5 ou -5 mas o rendimento comparativamente alto de cido vertrico indicava a importncia de pontes no cclicas entre grupos de hidroxilas de cadeias laterais e grupos de hidroxilas fenlicas da unidade adjacente. A presena da estrutura de cido vertrico entre os produtos de degradao estava, no entanto, de acordo com o conceito de uma estrutura de guaiacilpropano. Informaes similares s anteriores foram obtidas a partir da degradao oxidativa da lignina com nitrobenzeno na presena de lcali quente (Figura 9 rota B). A lignina de abeto gerou 25% de vanilina, baseado no contedo de lignina Klason da madeira, enquanto misturas de vanilina e aldedo siringlico foram obtidos das MFC. Adicionalmente a esses dois aldedos, gramneas produziram tambm aldedo p-hidroxibenzlico. Mais tarde, foi encontrado pequenas quantidades do aldedo p-hidroxibenzlico tambm durante a oxidao de MFL e MFC e traos de aldedo siringlico durante a oxidao de MFL. A oxidao com nitrobenzeno e lcali produzindo vanilina, aldedo siringlico e aldedo phidroxibenzlico o meio mais efetivo para obteno de grandes quantidades de produtos de degradao da lignina. Conseqentemente, este mtodo tem sido usado extensivamente como um diagnstico. Os rendimentos combinados dos 3 aldedos pode chegar a 65% de algumas ligninas. Todas as unidades estruturais da lignina, exceto aquelas contendo ligaes carbono-carbono ou ligaes de ter acopladas s posies 5 e 6 so convertidas aos aldedos correspondentes, embora em rendimento diferente. Conseqentemente, tanto o rendimento total dos 3 aldedos quanto as suas quantidades relativas fornecem informaes importantes para a caracterizao de derivados da lignina. Como um teste diagnstico para a presena de lignina, a identificao de qualquer um dos trs aldedos aromticos derivados da oxidao com nitrobenzeno no to conveniente como o isolamento das cetonas de Hibbert (veja 3.1.1.3.). Por exemplo, a presena de vanilina e aldedo p-hidroxibenzlico pode no ser prova conclusiva da existncia de lignina uma vez que steres do cido ferlico e p-coumrico, nem sempre associados com a lignina, podem resultar naqueles compostos, quando oxidados com nitrobenzeno. 3.1.1.2. Hidrogenlise O primeiro isolamento de produtos de degradao da lignina que continha o esqueleto C3-C6 completo foi relatado por Harris e Adkins (1938). Esses autores 124
obtiveram rendimentos razoveis de derivados de propilciclohexano quando submeteram uma lignina-metanol de aspen hidrogenao cataltica em condies drsticas (Figura 9 - rota C). Hibbert, Pepper e Schuerch obtiveram mais tarde derivados de guaiacil e siringilpropano por hidrogenlise em uma variedade de condies. 3.1.1.3. Etanlise As "cetonas de Hibbert" (Figura 9 - rota D) que so produzidas de madeira de fibra longa e HCl 2% em etanol em refluxo, foram os primeiros produtos de degradao com uma estrutura de guaiacilpropano. Embora os rendimentos desses compostos tenham sido menos de 10% da lignina, o isolamento deles fortaleceu a hiptese que a unidade fundamental da lignina era do tipo C3-C6. Maiores quantidades de cetonas de Hibbert foram obtidas das MFC, incluindo os anlogos de siringil. As fontes exclusivas dessas cetonas so as estruturas de arilglicerol--aril-ter da lignina. Elas so formadas atravs de um processo complexo de despolimerizao. Cada estrutura guaiacil, siringil e p-hidroxifenilglicerol -ter produz um grupo distinto de cetonas Hibbert que so comumente convertidas para compostos e dicarbonilas, atravs de oxidao com perxidos, para serem identificadas. As cetonas de Hibbert podem ser utilizadas tambm para determinar a participao das unidades de guaiacil, siringil e p-hidroxifenilpropano na construo do esqueleto da lignina. Em adio etanlise clssica, a acidlise foi utilizada para degradar a lignina, aplicando misturas acidificadas de dioxano:H2O (9:1) a compostos modelos e ligninas isoladas. Alm das cetonas de Hibbert, diversos outros produtos de degradao mono e dimricos (principalmente hidroxiguaiacilacetona), foram isolados e caracterizados. Essas preparaes aparentam ser razoavelmente livres de impurezas. O rendimento depende largamente das condies e tempo da hidrlise. Durante a hidrlise sabe-se que ocorre tanto reaes de despolimerizao quanto de condensao da lignina. 3.1.1.4. Tioacetlise Uma tcnica especial de degradao da lignina foi elaborada por Nimz. O tratamento da madeira com cido tioactico na presena de trifluoreto de boro e a subseqente hidrlise alcalina rendeu misturas de produtos de degradao mono a tetramricos. A maior vantagem desta degradao sua seletividade na ruptura das ligaes ter - e -arila (Figura 10).
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HC2 O COCH 3 HC2 O HC2 S COCH3 CH2OH OCH3 NaOH OCH3 OH HO OCH3 O
-
CH CH
OCH3 OH
OCH3 OH
OCH3
Figura 10. Reaes de degradao de lignina com cido tioactico A maioria dos mtodos de caracterizao da lignina discutidos nos pargrafos anteriores so comumente aplicados madeira livre de extrativos em vez da lignina isolada e pura. Normalmente, evita-se utilizar a lignina isolada porque esta no possui as mesmas caractersticas qumicas da lignina original e, alm disso, representa somente uma parte da lignina total. De fato, a disponibilidade de amostras representativas de lignina tem sempre sido um dos grandes bloqueios aos progressos no seu estudo.
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A anlise da composio elementar da lignina Bjorkman, de madeira de abeto Noruegus sugere a seguinte frmula elementar baseada no C9: C9H7,92O2,40(OCH3)0,92 Considerando-se que o material de origem, o lcool coniferlico, tem 2 tomos de oxignio, o excesso de oxignio pode ser escrito como pertencente s molculas de gua adicionadas durante a polimerizao: C9H7,12O2(H2O)0,40(OCH3)0,92 (Frmula A) O fato do contedo de grupos de metoxila ser menor que 1,0 pode ser atribudo copolimerizao do lcool coniferlico com quantidades menores de lcool p-coumarlico que no possui grupos de metoxila. Adicionalmente, uma pequena frao de lcool sinaplico com 2 Grupos Metoxilcos (CH3O-) pode tambm ser incorporada. Freudenberg assumiu que a relao entre esses lcoois na formao da lignina de abeto era de 80:14:6, que corresponde a 0,8 + 2(0,06) = 0,92 OCH3. O contedo de hidrognio para tal mistura seria 10 - 0,92 = 9,08 e a composio ficaria ento: C9H9,08O2(OCH3)0,92 (Frmula B) A subtrao entre B e A indica que ocorre uma perda de 1,96 H e a adio de 0,40 molculas de gua durante a formao da lignina de abeto. Estes resultados esto em acordo com a j consagrada teoria de que a lignina formada por uma polimerizao desidrogenativa de uma mistura de 3 lcoois p-hidroxicinamlicos e que uma certa quantidade de gua adicionada durante o processo. Para a lignina Bjorkman de uma madeira de folhosa (Fagus silvatica) foi determinada a frmula mnima C9H6,43O2(H2O)0,53(OCH3)1,39 que corresponde perda de 2,18 tomos de hidrognio durante a polimerizao. Para uma gramnea (Medicago sativum, alfalfa) a frmula molecular foi determinada ser C9H7,22O2(H2O)0,41(OCH3)0,84, indicando uma perda de 1,94 H durante a polimerizao desidrogenativa.
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Tabela 4. Grupos funcionais da lignina por 100 unidades C9 Grupo Funcional Metoxila Hidroxila fenlica livre Hidroxila benzlica Hidroxila aliftica Hidroxila + ter benzlicos ter fenlico Oxignio fenlico Carbonila Aldedo coniferlico Lignina de Abeto 90 20 20 90 40 80 100 20 5
A determinao dos grupos funcionais pode ser feita por uma variedade de mtodos qumicos e fsicos ou uma combinao dos dois. Uma descrio dos principais grupos funcionais e mtodos para identific-los apresentada a seguir. 3.1.3.1. Grupos fenlicos livres e eterificados
OCH3 OR ETERIFICADO
OH LIVRE
OCH 3
Esses grupos so separados pelas diferenas que eles apresentam no espectro ultravioleta. Todos os grupos fenlicos so cidos. Quando eles so tratados com bases, o comprimento de onda de mxima absoro dos grupos fenlicos livres modificado:
NaOH OCH -+ 3 O Na +H2 O
OH
OCH 3
tambm possvel identificar os grupos livres atravs da metilao com diazometano (CH2N2):
+CH2 N 2 OCH3 OH OCH3 + N2 OCH3
Outros mtodos de identificao dos grupos fenlicos livres incluem as titulaes potenciomtrica e condutomtrica e a oxidao com periodato (HIO4).
+HIO4 OH OCH3 O
+CH3OH O
+HIO 3
3.1.3.2. Unidades condensadas e no-condensadas Para as ligninas do tipo guaiacil, uma estrutura dita condensada quando o C5 possui qualquer tipo de ligao. Normalmente, as estruturas condensadas tm o C5 ligado a outro C5, ao C4-O ou ao C de outra unidade guaiacil. Se o C5 estiver livre a lignina dita no-condensada.
C5 C4-O C
O-
OCH 3
Somente 50% da lignina condensada, o que indica que ela no completamente polimerizada. Se a lignina fosse completamente polimerizada ela seria muito rgida. A lignina de madeira de compresso mais condensada que a de madeira normal e por isso esse tipo de madeira mais rgido. O mtodo para a identificao de estruturas condensadas e nocondensadas atravs da reao da lignina com o sal de Fremy, nitrodissulfonato de potssio [ON(SO3K)2]. A presena da ortoquinona indica que a estrutura da lignina apresenta alguns grupos C5 livres.
+ ON(SO K) 3 2 OCH3 OH O O
OCH3
OR
OCH3 OR
OCH3
OR
OCH3
alfa
aldedo
beta
O aldedo coniferlico fortemente colorido e por isso forma a base para os testes de cor da lignina tais como fluoroglucinol e safranina. Estes grupos so determinados pela reao da lignina com boroidreto de sdio. Nesta determinao, reage-se a lignina com o NaBH4 para reduzir os grupos de carbonila a lcoois. Depois de um determinado tempo, adiciona-se cido sulfrico para liberar hidrognio do boroidreto que no foi consumido. O hidrognio medido volumetricamente e a quantidade de grupos de carbonila indiretamente quantificada.
129
Outro mtodo para se determinar grupos de carbonila emprega a espectrofotometria ultravioleta diferencial. Espectros de amostras de lignina reduzidas com borohidreto so subtrados dos espectros de solues das amostras originais. Atravs da comparao desses espectros de diferena com aquelas de compostos modelos, pode-se calcular a quantidade de grupos de carbonilas conjugadas e no-conjugadas. 3.1.3.4. Grupos alcolicos
O OCH 3 C C CH OH 2
3.1.3.5. Grupos de hidroxila e ter benzlicos Existem quatro tipos de grupos de hidroxila e ter benzlicos:
C C C OH C C C OH C C C O C C C C O C
O C
OCH 3
OH
OCH 3
OH
OCH 3
O C
OCH 3
-OH/4-O-C
-OH/4-OH
-O-C/4-OH
-O-C/4-O-C
A ordem de reatividade dos diferentes grupos : -OH/4-OH > -O-C/4-OH > -OH/4-O-C > -O-C/4-O-C Um mtodo para determinar grupos de hidroxila benzlica se baseia no fato de que esses lcoois so facilmente oxidados por 2,3-dicloro-5,6-dicianobenzoquinona aos compostos -carbonila correspondentes, que so determinados por cromatografia gasosa.
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C C C C C O C O C O C C C C O C
ter arilglicerol--arila
C C C O
ter gliceraldedo-2-arila
C C C C C C C
ter benzil-arila
C C C
Bifenila
C C C
C C C
ter diarila
Figura 11. Principais subestruturas da lignina. (Veja Tabela 5 para uma descrio das estruturas).
Tabela 5. Percentagem dos diferentes tipos de ligaes em lignina isolada (MWL) de abeto (Picea abies)a Percentagem Tipo de ligaob A 48 ter arilglicerol--arila B ter gliceraldedo-2-arila 2 C ter benzil-arila cclico 6-8 D Fenilcoumarano 9-12 E Estruturas condensadas nas posies 2 e 6 2,5-3 F Bifenila 9,5-11 G ter diarila 3,5-4 H 1,2-diarilpropano 7 I 2 Estruturas -
a Fonte: Adler, 1977 bLetras de A at I so definidas na Figura 11
131
Tabela 6. Percentagens dos diferentes tipos de ligaes com lignina isolada (MWL) de btula (Betula verrucosa)a Tipos de ligaesb A B C D E F G H I Guaiacil 22-28 Siringil 34-39 Total 60 2 6-8 6 1,5-2,5 4,5 6,5 7 3
1-1,5 4,5 1
0,5-1 5,5
com cido tioactico. Os resultados dessa comparao so apresentados na Tabela 7. bvio que existem diferenas entre os trs grupos de dados; entretanto, difcil avaliar o significado dessas diferenas sem dados adicionais que mostrem o quanto cada modelo representa melhor os comportamentos analtico e de reao de cada uma das ligninas. Deve ser mencionado que a razo entre o nmero total de ligaes e o nmero total de unidades sempre ser maior que um devido a presena de configuraes macrocclicas no modelo de lignina alm do nmero de ligaes interunitrias que do origem a fratura do esqueleto C9. Por isso, o nmero mdio de ligaes por C9 deve exceder a 1,0 a despeito do fato de que o grau de desidrogenao por unidade de C9 pouco menor que 2,0.
Tabela 7. Freqncia de ligaes interunitrias em ligninas contendo 100 unidades de fenilpropano Ligaes interunitrias -0-4 -0-4 -5 -1 Todas -, exceto THFa Dibenzil-THFa 5-5 4-0-5 - -6 1-5,6-5,1-0-4 Total Lignina de MFL (Glasser) 41 14 11 11 16 12 4 5 119 Lignina de MFL (Mikshe) 49-51 6-8 9-15 2 2 9,5 3,5 4,5-5 85,-5-96 Lignina de MFC (Nimz) 65 6 15 5,5 2 2,3 1,5 2,5 99,8
133
134
A avaliao estrutural da lignina baseada no mtodo Rydholm mostrada na Tabela 8. Este mtodo baseia-se nos tipos e freqncias das ligaes interunitrias bem como na concentrao dos grupos funcionais. Algumas estatsticas vitais a respeito das estruturas podem ser facilmente detectadas, tais como o nmero de grupos de hidroxila fenlica, grupos de carbonila, teres totais, unidades condensadas versus no-condensadas, etc. Outras caractersticas estruturais importantes so, entretanto, ignoradas nesse tipo de avaliao, incluindo a concentrao de radicais livres e o nmero de unidades de arilglicerol. Tabela 8. Estrutura de um modelo de lignina de acordo com o mtodo de avaliao de Rydholm Posio C- Configurao CH2OH CHO CH2OH CH2OR CO CH2 CH CH CH CH CH CHO CHOH CH CH CHO-aril CHO-acares CO CHO CHO C C C C CH C-O-CH3 CH C C CH C C Descrio lcool coniferlico aldedo coniferlico hidroxilas primrias pinoresinis lactonas condensao -6 teres condensao -6 fenilcoumaranos pinoresinis condensao -1 grupos terminais lcool benzlico pinoresinis fenilcoumaranos -aril-ter ligao liginina-CH2O -carbonila aldedo glicrico grupos terminais condensao 5-1 condensao -1 condensao bifenil-ter cadeias laterais grupos de metoxila Contedo 0,06 0,02 0,69 0,17 0,04 0,01 0,41 0,04 0,14 0,22 0,11 0,09 0,29 0,21 0,10 0,05 0,06 0,06 0,15 0,09 0,01 0,11 0,02 0,85 1,00 0,85 0,10 0,05 1,00 0,38 0,28 0,12
C-
C-
1-Anel aromtico
Posio
6-Anel aromtico
Hidroxila fenlica
Descrio coumaranos condensao 5-1 condensao 5-6 unidades de siringil unidades no- condensadas condensao 6-5 condensao -6 condensao bifenil-ter ter--arila ter--arila bifenil-teres fenilcoumaranos hidroxilas fenlicas
Contedo 0,14 0,01 0,01 0,06 0,95 0,01 0,04 0,02 0,41 0,05 0,12 0,10 0,30
estabilidade contra ruptura oxidativa. As provveis ligaes entre ligninas e polissacardeos nos CLC so ilustradas na Figura 13. Alm das ligaes covalentes, existem pontes de hidrognio formadas entre os grupos de hidroxila e de carboxila das hemiceluloses e os grupos alcolico, de hidroxila fenlica, de carbonila e de oxignio eterificado da lignina.
O CH OH 2 CH HC O C=O O OH OH Xyl-Xyl-Xyl O H CO 3 O
CH OH 2 CH HC O H 2 C OH OH O O O Xyl-Xyl-Xyl
H CO 3
H CO 3 O
I
O CH OH 2 CH HCOH CH OH 2 O O O Man-Glu-Man OH OH
II
OCH 3
III
Figura 13. Possveis ligaes nos complexos lignina-carboidratos. I - ligao de ster benzlico; II - ligao de ter benzlico; III - ligao de fenilglicosdeo.
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condensao com a lignina durante o procedimento. Pela mesma razo, deve-se remover completamente solventes orgnicos da madeira extrada. Tabela 9 - Mtodos de isolamento de lignina e os preparos resultantes CONCEITO TRATAMENTO Lignina como resduo H2SO4 H2SO4/HBr HCl HCl/H2SO4 HF CF3COOH Na3H2IO6 NaOH/H2SO4/Cu(NH3)4(OH)2 PREPARO Lignina Klason Lignina Runkel Lignina Willstatter Lignina Halse Lignina de cido hidroflurico Lignina de cido trifluoroactico Lignina periodato Lignina cuoxam Lignina cuproxam Lignina cupramoniacal
Lignina Brauns (lignina nativa) Moagem em moinho vibratrio - Lignina Bjorkman/ Lignina de extrao em dioxano/H2O Madeira Moda (MWL) Moagem em moinho de bolasLignina de Madeira Moda extrao-dissoluo em H2Oem Moinho de Bolas (BMWL) NaSCNC6H5CH2OH-DMF Tratamento por fungos de Lignina liberada podrido marrom enzimaticamente (ELL, EIL) Moagem, tratamento Lignina de enzimas enzimtico-extrao em celulolticas (CEL) solvente Ligninas Organosolv lcool/HCl Lignina alcolica Dioxano/HCl Lignina de acidlise/dioxano CH3COOH/MgCl2 Lignina de cido actico HSCH2COOH/HCl Lignina de cido tiogliclico Fenol/HCl Lignina fenlica Hidrogenao suave Lignina de hidrogenlise Solvente hidrotrpico Lignina hidrotrpica Derivados de reagentes inorgnicos Sulfito/bissulfito Lignossulfonatos NaOH Lignina alcalina Na2S/NaSH Tiolignina NaOH/Na2S Lignina kraft/sulfato
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Todos os preparos de lignina obtidos por hidrlise cida so modificados estruturalmente, devido predominantemente s reaes de condensao. A degradao oxidativa evita a condensao mas leva a alguma modificao oxidativa da lignina. Outra maneira de se evitar reaes de condensao pela preparao de lignina por dissoluo. Embora a lignina ainda apresente algumas modificaes estruturais, considera-se a lignina de moagem de madeira (MWL) o melhor mtodo de isolamento para subseqentes estudos estruturais da lignina.
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silvatica) foi demonstrada possuir mais unidades guaiacil que a do xilema da mesma rvore. As ligninas da casca das MFL so basicamente do tipo guaiacil mas elas contm maior proporo de unidades p-hidroxifenil que a lignina da madeira correspondente. As ligninas da casca das MFC so basicamente do tipo guaiacilsiringil mas o contedo de siringil muito mais baixo que aquele encontrado na madeira correspondente. Um aspecto importante da heterogeneidade da lignina foi elaborado por Fergus e Goring que foram os primeiros a mostrar que a lignina de btula difere com sua posio na clula. Estudos de microscopia ultravioleta em sees ultrafinas de madeira revelaram que a lignina nas paredes secundrias dos vasos e da lamela mdia principalmente lignina tipo G. A lignina da parede secundria das fibras e dos raios de parnquima, composta principalmente de unidades de siringilpropano. A lignina da lamela mdia e cantos de clulas de fibras e clulas de raio uma mistura tpica de lignina tipo G-S (Tabela 10). O mtodo proposto por Whiting e Goring para se fazer a separao das ligninas das lamela mdia e parede secundria o seguinte: 1) transformar a madeira em finas partculas, 2) suspender a serragem em soluo de CCl4dioxano, 3) centrifugar a mistura em 10000 rpm, 4) a lignina da lamela mdia flutua e a da parede secundria submerge no solvente. O princpio desse mtodo baseia-se na menor densidade da lignina comparado com a dos carboidratos. A parede celular submerge porque ela contm muitos carboidratos e baixa concentrao de lignina (20-25%). Usando a tcnica de separao de camadas da parede celular elaborada por Whiting e Goring, fizeram as seguintes observaes: 1) a lignina da parede secundria possui duas vezes mais grupos fenlicos que a da lamela mdia composta (M+P), 2) a lignina da M+P tem mais alto contedo de p-hidroxifenilpropano e, conseqentemente, mais condensada e menos reativa, 3) a lignina da M+P reage mais devagar durante a polpao e branqueamento do que a lignina da parede secundria.
Tabela 10. Tipo de lignina de acordo com o tipo de clula numa MFC Tipo de clula Parede celular . Fibras, clulas do raio . Vasos M+P . Entre fibras e raios . Entre vasos Tipo de lignina S G G-S G
Os resultados experimentais parecem deixar pouca dvida a respeito da heterogeneidade da lignina, o que leva a crer que a ao enzimtica durante o processo de lignificao se estende alm da gerao de radicais de fenxido por desidrogenao. As comprovadas diferenas de composio da lignina de certas clulas e camadas de paredes celulares tambm sustentam a idia de uma biossntese intracelular da lignina.
141
6. DISTRIBUIO DAS LIGNINAS 6.1. Mtodos para a Identificao de Ligninas em Tecidos Vegetais
A identificao da lignina em tecidos vegetais no muito difcil, exceto quando o tecido contm certos polifenis insolveis, freqentemente relacionados com os taninos e flavonides. Esses constituintes tm certas caractersticas semelhantes s ligninas e, conseqentemente, so confundidos com ela. Tais materiais fenlicos so encontrados, por exemplo, nas cascas das rvores (chamados cidos fenlicos das rvores), na madeira de espcies do gnero Eucalyptus (Kino), em espcies de plantas primitivas tais como musgos, e no crtex de plantas tropicais.
142
Figura 14. Espectro ultravioleta de lignina MWL (A) e lcool coniferlico (B) O mtodo de microscopia ultravioleta, originalmente idealizado por Fergus e aperfeioado por Goring, talvez um dos mais eficientes para se identificar a lignina guaiacil e siringil pela intensidade e localizao da absoro mxima no espectro. Essa tcnica envolve a medio da luz ultravioleta transmitida atravs de sees ultrafinas de madeira na faixa de comprimento de onda onde a lignina absorve luz (240-320nm). Conhecendo-se as dimenses da parede celular e as absorvncias, possvel determinar a concentrao de lignina nas diferentes regies da clula. A separao entre ligninas guaiacil e guaiacil-siringil por essa tcnica feita com base nas diferenas de absortividade do guaiacil e do siringil. O composto modelo do tipo guaiacilpropano (4-propilguaiacil) apresenta mxima absoro de luz, mx., na faixa de 280-282 nm com coeficiente de extino
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(absortividade) = 19 cm-1.L. g-1 enquanto o composto modelo do tipo siringilpropano (2,6-dimetoxi-4-propilfenol) apresenta mx de 270-273 nm com = 6 cm-1.L.g-1. Portanto, de se esperar que uma lignina do tipo siringil pura apresente mx em comprimentos de onda mais baixos e com absoro 3 vezes mais fracas que a lignina do tipo guaiacil.
Figura 15. Espectro infravermelho de lignina do hemlock do oeste. indicam as regies de absoro da lignina.
As cetas
A espectroscopia infravermelha tem sido usada principalmente para caracterizar ligninas isoladas e verificar modificaes produzidas em ligninas aps diversos tratamentos qumicos da madeira.
144
6.1.4. Eletromicroscopia
Nesse mtodo a madeira tratada com permanganato com conseqente gerao de dixido de mangans como resultado da oxidao da lignina. O MnO2 fica depositado nas regies onde havia lignina e identificado nas eletromicrografias.
6.1.6. Autoradiografia
Administra-se planta um precursor de lignina tratado com tritio. A lignina tritiada (lignina-H) posteriormente identificada.
6.2. Distribuio das Ligninas nos Tecidos Vegetais e Nas Paredes Celulares
A quantidade de lignina nas MFL pode ser determinada gravimetricamente pelo mtodo de Klason. A chamada "lignina Klason" obtida depois da remoo dos polissacardeos da madeira livre de extrativos pela hidrlise com cido sulfrico 72%. Outros cidos tais como HCl 36% e H3PO4 80% podem tambm ser utilizados para a hidrlise. O grande defeito do mtodo de Klason que a lignina extensivamente modificada durante a hidrlise, tornando-a imprpria para anlises qualitativas. Do ponto de vista quantitativo, o mtodo de Klason muito adequado para MFL. A lignina altamente condensada das MFL quantificada quase que em sua totalidade por esse mtodo. Maiores perdas de lignina por solubilizao (10-20%) so observadas quando o mtodo aplicado para MFC. No caso de plantas anuais, as protenas tendem a condensar com a lignina se no forem removidas previamente por hidrlise. Constituintes polifenlicos tambm so includos como lignina Klason se no removidas previamente por extrao. Nesse caso a lignina Klason chamada de "lignina Klason aparente". As MFL normais contm de 26-32% de lignina enquanto as madeiras de compresso possuem teores de lignina variando entre 35-40%. As ligninas presentes nas MFC so parcialmente dissolvidas durante a hidrlise cida e por isso, os valores gravimtricos devem ser corrigidos para a lignina solvel em cido usando mtodos de espectrofotometria de ultravioleta. As MFC normais contm 20-28% de lignina, embora MFC tropicais possam ter contedos de lignina acima de 30%. A madeira de tenso das MFC contm somente 20-25% de lignina. A concentrao da lignina alta na lamela mdia e baixa na parede secundria. Por causa da sua espessura, pelo menos 70% da lignina nas MFL , entretanto, localizada na parede secundria como foi mostrado por microscopia de ultravioleta quantitativa (Fig. 16 e Tabela 11). De acordo com Goring et al. a
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parede secundria das madeiras de compresso das conferas pode apresentar concentrao de lignina entre 55 e 58%. Os resultados so bastante similares para as MFC (Tabela 12) embora neste caso exista maiores incertezas analticas por causa da natureza mais heterognea da madeira e da presena de unidades guaiacil e siringil na lignina. Muitos pesquisadores acreditam que a lignina isolada pelo mtodo de Bjorkman (MWL) origina principalmente da lamela mdia. De acordo com os estudos de Musha e Goring, a lignina da lamela mdia de MFC principalmente do tipo guaiacil. Esses autores demonstram tambm que a relao guaiacil:siringil na lignina das MFC somente um pouco maior que a relao encontrada na MWL, sugerindo que esse tipo de separao da lignina na verdade contm tambm larga proporo da lignina da parede secundria das fibras. Tabela 11. Distribuio da lignina no traquedeo da madeira de abeto preto (Picea mariana). Madeira Regio Volume do Lignina Concentrao a morfolgica tecido, % (% do total) da lignina, % Lenho de S 87 72 23 Incio de ML 9 16 50 Estao CC 4 12 85 Lenho de Fim de Estao S ML CC 94 4 2 82 10 9 22 60 100
Figura 16. Seo transversal de um traquedeo de abeto fotografado na luz ultravioleta. A medio do densitmetro foi feita atravs da parede do traqudeo na linha tracejada. (S=parede secundria; ML=lamela mdia; CC=canto de clula)
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Tabela 12. Distribuio da lignina no xilema de btula branca (Betula papyrifera) Clula Fibra Vaso Clula do Raio Regio Morfolgicaa S ML CC S ML CC Tipo de lignina S G-S G-S G G S Volume do tecido 73 5 2 8 1 11 Lignina (% do total) 60 9 9 9 2 11 Concentrao da lignina, % 19 40 85 27 42 27
Kirk et al. demonstraram que na fase inicial de decomposio da madeira inteira por fungos de podrido branca, so removidas preferencialmente as unidades de lignina siringil enquanto que no caso de madeira moda a remoo ocorre de maneira similar. Os autores concluram que, no caso da madeira inteira, os fungos atacam a partir do lmen da clula e encontra primeiro a lignina rica em siringil. Esse tipo de ocorrncia pode ser previsto pelos resultados de Goring e Musha.
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Devido aos fatos acima mencionados, uma comparao de dados de peso molecular na literatura se torna difcil e at de valor duvidoso. A polidispersidade uma propriedade apresentada por todas as ligninas isoladas. A explicao mais provvel deste fenmeno a degradao ao acaso da lignina nativa na parede celular pelo ataque qumico durante o isolamento, que leva formao de fragmentos de tamanhos diferentes, mas de composio qumica uniforme. Do ponto de vista experimental, a polidispersidade faz com que seja necessrio considerar ambos o peso molecular ponderal e numrico (Mw e Mn), sendo a razo Mw/Mn uma expresso do grau de polidispersidade. Valores de Mw e Mw/Mn para ligninas de madeira moda (MWL) so dados na Tabela 13. Comparado com a celulose e seus derivados, a polidispersidade da lignina alta, chegando a 2,5 para MWL de MFL. Tem sido observado que a polidispersidade de polmeros obtidos por desidrogenao do lcool coniferlico (DHP) aumenta com o aumento do peso molecular e da mesma magnitude (3,0) que aquela da MWL de MFL no peso molecular ponderal de 20000. Tabela 13. Peso molecular e polidispersidade de preparaes de MWL e polmeros de desidrogenao do lcool coniferlico (DHP) Polmeros Abeto do Leste Hemlock do Oeste DHP1 DHP2 Mw 20 600 22 700 11 000 31 400 Mw/Mn 2,6 2,4 2,2 3,7
Vrios estudos realizados com preparaes de lignina tais como Bjorkman, lignina kraft ou lignossulfonato demonstram que o peso molecular da lignina pode variar desde 20.000 at 1.000.000. Comparado com a celulose, a lignina produz solues de baixas viscosidades, sugerindo uma estrutura compacta e esfrica para as molculas de lignina dissolvidas. Como pode ser visto na Tabela 14, a viscosidade da lignina apenas 1/40 daquela dos polissacardeos e 1/4 daquela de polmeros sintticos lineares. Tabela 14. Exemplos de viscosidades intrnsecas correspondentes a um peso molecular (Mw) de 50 000 para vrias macromolculas. Macromolcula Lignina dioxano-HCl Lignossulfonato Lignina kraft Lignina alcalina Polimetacrilato Polimetilestireno Xilana Celulose Solvente piridina NaCl 0,1M dioxano tampo 0,1M benzeno tolueno CED CED
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importante ter uma noo da solubilidade da lignina em diferentes solventes porque determinaes do peso molecular e estudos de espectrometria ultravioleta dependem de amostras de lignina totalmente dissolvidas. Devido ao grande nmero de tipos de ligninas isoladas, se pode fazer apenas algumas colocaes gerais sobre a solubilidade da lignina. Solventes adequados para ligninas analticas e isoladas com solventes orgnicos so: o dioxano, dimetilsulfoxido (DMSO), formamida, dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF), piridina, dicloroetano e etilenoglicol-monometilter. Outros solventes adequados so brometo de acetila em cido actico e hexafloropropanol. A escolha do solvente restringida nos estudos de espectrometria ultravioleta devido absoro da maioria dos solventes nos comprimentos de onda mais baixos.
8. REAES DE LIGNINA
A reatividade da lignina tem sido intensivamente estudada por dois motivos: elucidar sua estrutura qumica e descobrir as suas reaes nos processos de polpao e branqueamento. A degradao da lignina atravs de reaes solvolticas suaves a melhor ferramenta analtica disponvel para estudos estruturais das ligninas. Os procedimentos mais importantes so: a hidrlise suave, a acidlise, a etanlise e a tioacetlise, conforme foi discutido na seo 3.1. Nesta seo ser apresentado um breve sumrio das reaes de deslignificao de importncia comercial (i.e. na polpao e no branqueamento) baseado no conceito de Gierer.
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C C C 1 6 5 4 [OH] O 2 3
OCH
H C R 2 HC HC :
H C R 2 HC HC +H+ , - RH
H C + 2 HC HC + + +
OCH O R'
3 O R'
OCH 3 O R'
OCH
Figura 18. Stios de alta e baixa densidade de eltrons nas unidades de fenilpropano da lignina
As posies com alta densidade de eltrons (-) sofrem ataques por eletrfilos enquanto as posies com baixa densidade de eltrons (+) sofrem ataques por nuclefilos. As reaes de deslignificao durante a polpao se devem exclusivamente a reaes nucleoflicas (Tabela 15) enquanto a deslignificao durante o branqueamento se inicia por reaes eletroflicas (Tabela 16) que podem ser seguidas de reaes nucleoflicas (Tabela 17).
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HS-
R representa uma estrutura de ter -arila ligada a O-, S- ou resduo fenolato na posio (ou )
151
C- em olefinas C- em fenlicos livres e eterificados ligaes duplas em aromticos e olefinas ligaes duplas em olefinas ligaes C-H em lcoois , teres e aldedos C- em fenlicos livres e eterificados C- em estruturas conjugadas (C) C- em olefinas
-O-O-O+ (ozone)
152
abstrao do hidrognio abstrao do eltron adio eletroflica abstrao do hidrognio abstrao do eltron adio eletroflica
hidroxilas fenlicas ons de fenolato C- em radicais fenxidos e ciclohexadienonlicos mesomricos hidroxilas fenlicas ons de fenolato C- em radicais fenxidos e ciclohexadienonilas mesomricas hidroxilas fenlicas ons de fenolato C- em radicais fenxidos e de ciclohexadienonilas mesomricas radicais
radicais fenoxi- e ciclohexadienonila mesomricos radicais fenoxi- e ciclohexadienonila mesomricos ciclohexadienonas e quinonametdeos substitudos com OOH radicais fenoxi- e ciclohexadienonila mesomricos radicais fenoxi- e ciclohexadienonila mesomricos ciclohexadienonas substitudas com OOH ou OH quinonametdeos substitudos na posio com OH ou OOH Intermedirios ou Produtos radicais fenoxi- e ciclohexadienonila mesomricos steres - e -quinol do cido cloroso
Reagente (Eletrfilo)
ClO2
Tipo(s) de Reao
abstrao do hidrognio adio eletroflica
Stios de Ataque
hidroxilas fenlicas C- em radicais fenxidos e de ciclohexadienonilas mesomricas
153
Cl-
ClO-
adio nucleoflica
HOO-
adio nucleoflica
154
OH
OCH3
Aldedo coniferlico
R
O H CO 3
O OCH3 O
OCH 3
O O
OCH3
Quinonas conjugadas
Quinonas no-condensadas
155