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Chapitre 1 Introduction
"Things should be made as simple as possible, but no simpler" Albert Einstein (1879-1955)

Les organismes vivants sont capables de produire des substances naturelles que lhomme exploite pour diverses raisons. Les plantes sont elles seules une source immense de molcules chimiques complexes utilises dans les fragrances, lagroalimentaire, et lindustrie pharmaceutique. Dans beaucoup de cas, la production par voie de synthse chimique de ces molcules nest pas possible ou conomiquement non rentable. Les biotechnologies connaissent un essor formidable depuis une vingtaine dannes, tant leur dveloppement semble prometteur pour la production rentable de molcules complexes ou pour la dcouverte de nouveaux principes actifs. Ces techniques utilisent la machinerie cellulaire performante de microorganismes pour synthtiser des produits chimiques. Si la culture en bioracteurs de levures et de bactries a prouv son efcacit pour de nombreux procds industriels, lutilisation de cellules de plantes lchelle industrielle reste trs marginale.

1.1

Problmatique

Actuellement, la majorit des molcules synthtises par les plantes dintrt pharmaceutiques sont extraites directement de la plante entire cultive en serre ou en champs. Ces

molcules, appeles mtabolites secondaires, ne constituent pas des espces chimiques impliques dans la croissance ou la respiration des plantes. En fait, aucun role gnrique pour la plante ne leur a t assign, car elles englobent des molcules qui peuvent agir dans la protection contre les pathognes et les ruminants, comme signal chimique, ou qui sont des pigments responsables de la coloration des eurs et des fruits. Malgr la grande diversit de mtabolites secondaires, les voies de biosynthse de ces molcules sont connectes au mtabolisme primaire de la plante par trs peu de chemins mtaboliques qui ne sont pas toujours compltement connus. Ainsi, loptimisation de production de mtabolites secondaires passe par la connaissance non seulement des chemins mtaboliques secondaires, mais aussi des interactions entre mtabolismes primaire et secondaire. La culture in vitro de cellules vgtales ou de tissus vgtaux diffrencis permet de contrler une large gamme de paramtres contrairement une culture en serre ou en champ ouvert. Elle permet en outre une culture axnique grce au maintient de la strilit des cultures in vitro. La recherche sur le mtabolisme des plantes est ainsi facilite et la mise au point de procds industriels en bioracteurs visant des hauts rendements en mtabolites secondaires devient thoriquement possible. Le problme de la grande sensibilit au cisaillement des cellules vgtales a t rsolu par la mise au point dun bioracteur muni dagitateurs compos de rubans hlicodaux (Jolicoeur et al., 1992). Nanmoins, lutilisation de cultures in vitro de cellules ou de tissus de plantes apporte des difcults supplmentaires. Le mtabolisme secondaire change et parfois, les voies de biosynthse menant aux mtabolites secondaires attendus sont dvies vers la production dautre mtabolites secondaires aux proprits souvent moins intressantes. Cependant, il arrive que les nouveaux produits prsentent des proprits pharmacologiques utiles, comme la sanguinarine synthtise par des cellules de Papaver somniferum en suspension et qui est un antibactrien non produit naturellement dans la plante. Certaines compagnies pharmaceutiques misent sur ce phnomne pour dcouvrir de nouvelles molcules actives. Dans certains cas, il est utile de transformer gntiquement les cellules vgtales laide de la bactrie Agrobacterium rhizogenes. Les cellules transformes poussent alors sous la forme dun tissu racinaire capable de crotre sans les parties ariennes

de la plante. Un tel tissu est diffrenci et possde parfois un mtabolisme secondaire diffrent de celui de celui des cellules en suspension. La pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus) est une plante vivace de la famille des Apocynaceae qui produit de nombreux alcalodes noyau indole, dont deux agents antimitotiques : la vinblastine et la vincristine. Ces molcules ont un intrt pharmaceutique considrable, car elles sont utilises pour le traitement de certains cancers (maladie de Hodgkin, diffrents lymphomes, sarcome de Kaposi). Le prix de ces molcules est de lordre du million de dollars par kilogramme. Cette plante synthtise galement naturellement lajmalicine et la serpentine qui ont une action hypertensive. Elle remplit parfaitement les critres qui justient le dveloppement accru de la recherche scientique pour la comprhension de son mtabolisme : les mtabolites quelle produit ont une valeur conomique et pharmaceutique norme; ces mtabolites peuvent tre produit par voie de synthse classique en chimie organique mais un cot prohibitif; lutilisation de cellules de C. roseus cultives in vitro ne donne pas de rendements sufsants pour envisager un procd industriel; le mtabolisme secondaire observ est diffrent de celui connu dans la plante entire et sa connaissance reste limite. A ce titre, elle considre comme une plante modle pour la production dalcalodes noyau indole. La plupart des travaux de recherche au laboratoire BIOPRO de lcole Polytechnique de Montral ont port sur des cellules vgtales en suspension de Papaver somniferum et sur des racines transformes de carotte. Ce dernier systme a t caractris sur le plan nutritionnel, ce qui a permis le dveloppement dun modle biocintique structur bas sur des dynamiques entre diffrents bassins intracellulaires de nutriments et capable de prdire la croissance des racines transformes de carotte (Bouchard-Marchand , 2000). Nanmoins, la carotte ne produit pas de mtabolites secondaires haute valeur ajoute. Les racines transforme de C. roseus ont t choisies comme nouveau systme dtude, vu leur importance conomique et scientique. Elles prsentent un potentiel conomique norme, bien quil soit prouv que la production de vincristine et de vinblastine dans les

racines transformes soit actuellement impossible car certaines enzymes clefs participant la biosynthse de ces composs ne sont pas exprimes. La communaut scientique, incluant le laboratoire BIOPRO, sactive lever les inhibitions qui bloquent pour le moment les voies mtaboliques. Misant sur la rsolution de ce problme dans un futur proche, lextension du modle biocintique dvelopp par Bouchard-Marchand (2000) aux mtabolismes primaire et secondaire des racines transformes de C. roseus permettrait de mieux comprendre linuence de la nutrition sur la production des alcalodes de type indole. Une approche de gnie mtabolique permettrait de vrier des hypothses quant aux liens entre ltat nutritionnel et les chemins mtaboliques impliqus. Une connaissance approfondie du mtabolisme secondaire de C. roseus permettrait doptimiser la production en mtabolites secondaire puis denvisager un procd lchelle industrielle.

1.2

Objectifs de recherche

Dans ce contexte, le projet a pour objectif principal de dvelopper la structure dun modle cintique structur prdisant les mtabolismes primaire et secondaire des racines transformes de C. roseus tenant compte de ltat physiologique des racines. Pour raliser cet objectif, les sous objectifs suivants ont t poursuivis: tablissement des lignes de racines transformes de C. roseus, dveloppement des mthodes exprimentales permettant lobservation des phnomnes intracellulaires impliquant les mtabolismes primaire et secondaires, tudes des dynamiques nutritionnelles mettant en jeu des nutriments clefs et celles du mtabolisme secondaire, ainsi que les liens entre les deux dynamiques, tude de linuence dune phase organique extractive slective non miscible avec le milieu de culture sur le mtabolisme secondaire des racines an de dterminer si la production dalcalodes est limite par un seuil maximum daccumulation dans les racines, dveloppement dun modle cintique structur reliant la croissance et la production de mtabolites secondaires aux dynamiques nutritionnelles observes, partir du modle

de Bouchard-Marchand (2000).

1.3

Mthodologie

Les racines transformes de C. roseus ont t tablies selon les diffrentes mthodes dcrites dans la littrature. Ces protocoles sont tests sur dautres espces de plantes ayant un potentiel pharmaceutique, ceci an dtablir un protocole standardis de transformation gntique de plantes par Agrobacterium rhizogenes. Une conrmation de la transformation gntique des racines est faite par la Polymerase Chain Reaction (PCR). Les paramtres choisis pour caractriser ltat nutritionnel des racines sont les sources de carbone, dazote et de phosphore. Plusieurs mthodes dextraction des espces ioniques des racines ont t testes et compares. Les artefacts associs aux diffrentes mthodes sont discuts. Le protocole nal choisi est celui qui minimise lerreur exprimentale. La quantication des alcalodes de type indole prsents dans les racines transformes de C. roseus est effectue par chromatographie liquide a haute performance (HPLC). La mthode HPLC est dveloppe dans le but dobtenir une sparation sufsante permettant la quantication able des alcalodes et de leurs prcurseurs. Les lignes de racines transformes ont t caractrises sommairement par la mesure de leur taux de croissance et ltude de leur mtabolisme secondaire au cours de cultures en mode cuve en milieu liquide. Deux lignes ont t choisies pour caractriser les paramtres cintiques ncessaires au fonctionnement du modle mathmatique en cultures en mode cuve et en mode semi-continu. Ltude de leffet dune phase extractive sur le mtabolisme secondaire des racines est ralise sur une ligne de racines en bioracteurs de 500 ml (volume utile). Le design exprimental permettra la circulation de la phase extractive sur un lit de racines transformes. Le modle cintique est dveloppe partir du modle de Bouchard-Marchand (2000). La description du mtabolisme primaire est prcise en termes de ux mtaboliques et de

stratgies cellulaires pour la rgulation de ces ux. Un tat physiologique des racines est dni et est fonction des concentration en nutriments et en intermdiaires ractionnels clefs. La description cintique du mtabolisme secondaire est ajoute et prvoit linuence de ltat physiologique sur la capacit synthtiser les diffrents alcalodes. Les diffrents types de cultures (mode cuve, semi-continu et continu) ainsi que lextraction de mtabolites secondaires par une phase organique sont intgrs au modle. Ainsi, une revue de la littrature sur les diffrents sujets abords dans le projet est prsente au chapitre 2. Les troisime et quatrimes chapitres sont consacrs au dveloppement des mthodes analytiques utilises dans ces travaux : lanalyse dions intracellulaires et le dveloppement des mthodes HPLC permettant la quantication des alcalodes et de leur prcurseurs, publication soumise la revue Journal of Chromatography A. Le cinquime chapitre dcrit ltablissement des lignes de racines transformes et les diffrentes tudes nutritionnelles et mtaboliques ralises sur ces lignes. Ltude de linuence dune phase organique sur le mtabolisme secondaire des racines transformes est prsente au sixime chapitre sous forme de publication soumise la revue Biotechnology Progress. Le septime chapitre propose la structure du modle cintique structur.