Medicina y Patologa Oral / Oral Medicine and Pathology

Agenesias dentarias / Tooth agenesis

Agenesias dentarias: en busca de las alteraciones genticas responsables de la falta de desarrollo

Francisco Javier Kolenc Fus (1)
(1) Asistente de la Ctedra de Bioqumica y Biofsica. Facultad de Odontologa. Universidad de la Repblica, Montevideo, Uruguay Asistente de la Ctedra de Fisiologa General y Buco-Crvico-Facial. Facultad de Odontologa. Universidad Catlica del Uruguay
Correspondencia: Grecia 3678. CP 12800. Montevideo. Uruguay. Telfono: +598-2-3118163 E-mail: kolenc@adinet.com.uy Recibido: 1-06-2003 Aceptado: 22-10-2003
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Kolenc-Fus FJ. Agenesias dentarias: en busca de las alteraciones genticas responsables de la falta de desarrollo. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2004;9:385-95.
Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1698-4447

RESUMEN
En conjunto, las agenesias dentarias son la malformacin crneofacial ms frecuente. Su prevalencia alcanza el 20% en la denticin permanente, y su expresin puede variar desde la ausencia de una sola pieza, generalmente un tercer molar, hasta la de toda la denticin. En la pasada dcada, los estudios de ligamiento gentico y biologa molecular han permitido identificar algunas mutaciones responsables de distintos patrones de agenesias dentarias sindrmicas y no sindrmicas. Dichas mutaciones se encuentran en genes clave para el desarrollo de la denticin, como los que codifican a los factores de transcripcin MSX1, PAX9 y PITX2, la protena de sealizacin EDA y su receptor EDAR. Los estudios que estn en curso podran derivar en nuevas clasificaciones que relacionen los fenotipos observados con el defecto gentico subyacente. De esta manera, se posibilitara un diagnstico previo a la aparicin del defecto somtico, que tcnicas como la terapia gnica o la ingeniera de tejidos y rganos, podran llegar a solucionar. Palabras clave: Agenesias dentarias, hipodoncia, oligodoncia, PAX9, MSX1.

INTRODUCCION
La denticin de los mamferos es un sistema segmentado, constituido por una serie de elementos homlogos, de estructura similar pero diferentes en forma y tamao (1). Es anloga a la columna vertebral, en la que una estructura modular se repite con modificaciones para constituir un sistema complejo. En este tipo de sistema, alguna de las unidades puede estar ausente por falta de desarrollo, y nos encontramos frente a una agenesia. El desarrollo de las piezas dentarias es el resultado de un complejo proceso, en el cual interacciones recprocas y secuenciales entre clulas epiteliales y mesenquimticas (2) regulan actividades celulares como la proliferacin, condensacin, adhesin, migracin, diferenciacin y secrecin que dan lugar a la formacin

de un rgano dentario funcional. A grandes rasgos, se distinguen tres etapas en la organognesis: a) la iniciacin, en la cual un conjunto de clulas reciben e interpretan informacin posicional para iniciar la formacin de un rgano en el lugar y momento correctos; b) la morfognesis, durante la cual las clulas construyen el rudimento de un rgano, y c) la diferenciacin, en la que las clulas forman las estructuras especficas de ese rgano (3). El avance realizado en los ltimos aos en el conocimiento de los aspectos moleculares de la odontognesis (2-5) permite afirmar que el desarrollo de la denticin est bajo un estricto control gentico, que determina las posiciones, nmero y formas de las diferentes piezas dentarias (6). La mayor parte de los estudios se han realizado con ratones, que son el principal modelo utilizado por los bilogos para investigar el desarrollo en los mamferos. Los escasos conocimientos directos de las bases moleculares de la odontognesis humana derivan del estudio de la patologa. Se han identificado ms de doscientos genes que participan en la odontognesis (7). Las protenas codificadas por stos pueden actuar de muchas maneras, siendo algunas de las ms importantes para el desarrollo los factores de transcripcin, las molculas de sealizacin, los receptores para stas y las molculas de la matriz extracelular. Las alteraciones en cualquiera de estas protenas podran producir, consecuentemente, alteraciones en la odontognesis. Cuanto antes cumplen estas molculas su funcin en la organognesis, ms grave puede ser la malformacin que produce su alteracin. Una alteracin en una protena necesaria en las etapas de iniciacin o morfognesis temprana puede producir una agenesia. Muchas protenas tienen funciones diferentes, tanto en las distintas etapas de la organognesis como en la formacin de distintas piezas dentarias o en el desarrollo de las denticiones primaria y permanente. As, se podra explicar la asociacin de varias anomalas dentarias como las agenesias con retrasos en la erupcin y alteraciones en el tamao, la forma y posicin de las otras piezas dentarias (6, 8-11). La ms comn de las anomalas del desarrollo dentario es la agenesia de al menos una pieza (12). La ausencia de hasta cinco

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piezas se denomina hipodoncia; la de seis o ms piezas, oligodoncia (13); y la falta de desarrollo de toda la denticin, anodoncia. La prevalencia de las agenesias en la denticin permanente vara entre 1,6% y 9,6%, segn la poblacin estudiada, llegando a 20% si se incluyen los terceros molares (12). En la denticin temporaria la prevalencia es menor se ha calculado entre 0,5% y 0,9% (12). Las piezas que se encuentran ausentes con mayor frecuencia son los terceros molares, seguidos por los incisivos laterales superiores o segundos premolares inferiores (12). Las agenesias dentarias pueden presentarse aisladas como la nica alteracin fenotpica de un individuo, o ser parte de un sndrome al estar asociadas con otras alteraciones. Las agenesias no sindrmicas pueden ser espordicas o familiares, y poseen diversas formas de herencia mendeliana: autosmica dominante, autosmica recesiva, y ligada al cromosoma X (12). La penetrancia se ha considerado tradicionalmente como incompleta pero elevada. Si bien como se ver al analizar los casos particulares, para cada defecto gentico se puede definir un fenotipo caracterstico, la expresividad de las distintas formas es tpicamente muy variable, con un amplio rango de piezas ausentes. Algunos autores consideran las alteraciones en la forma por ejemplo, la reduccin en el tamao mesiodistal o los dientes con forma de grano de arroz como parte de la expresin variable del gen afectado. Como causa de esta variabilidad, se ha postulado el efecto de genes moduladores (14) o de factores epigenticos. Debe tenerse presente que estas molculas, en general, tienen su actividad regulada por la interaccin con otras protenas, que pueden ser tejido-especficas, y de las cuales se pueden encontrar distintas variantes allicas normales, las que, al interactuar, pueden producir los diferentes fenotipos. Muchos de los genes que participan en el desarrollo dentario tambin tienen importantes funciones en el desarrollo de otros rganos; esto explica la presencia de agenesias dentarias en por lo menos 45 sndromes (15) , siendo los ms comunes las displasias ectodrmicas.

AGENESIAS DENTARIAS NO SINDROMICAS

Oligodoncia por ausencia de molares. MIM 604625. Esta forma de oligodoncia autosmica dominante se caracteriza por la agenesia de la mayora de los molares permanentes y puede incluir eventualmente a otras piezas como segundos premolares e incisivos centrales inferiores (16-19). El fenotipo de los casos descritos se resume en las figuras 1 y 2. En las formas ms graves pueden faltar molares en la denticin primaria (17, 19). Los dientes presentes pueden presentar reduccin en el tamao mesiodistal o ser incisivos con forma de grano de arroz. Se han identificado varias mutaciones (Tabla 1) en el gen PAX9, en 14q12-q13, en las personas afectadas por esta forma de oligodoncia. Las mutaciones implicaran prdida de funcin y produciran el fenotipo por haploinsuficiencia (17, 19). El fenotipo ms grave descrito hasta el momento se debe a la delecin heterocigota del locus de PAX9 (19); lo que confirmara el mecanismo de haploinsuficiencia y podra indicar que en las otras mutaciones de sentido equivocado o con prdida

de sentido las protenas podran retener parte de su actividad biolgica. PAX9 pertenece a una familia de factores de transcripcin (20) que en los mamferos tiene nueve miembros, caracterizada por poseer un dominio par (paired domain) de unin al ADN, y en la mayora de los casos excepto PAX9 un homeodominio adicional. Son reguladores importantes de la organognesis, pueden actuar como desencadenantes de la diferenciacin celular, o como mantenedores de la pluripotencia de las poblaciones de clulas madre durante el desarrollo. Los estudios en ratones han revelado las funciones de Pax9 en el desarrollo (21). Pax9 se expresa ampliamente en el mesnquima derivado de la cresta neural, involucrado en el desarrollo de las estructuras crneofaciales, incluidas las piezas dentarias. Los ratones Pax9 -/- presentan fisura del paladar secundario junto a otras alteraciones del desarrollo esqueltico, carecen de timo, paratiroides y de todos los dientes. El desarrollo de los grmenes dentarios se detiene en el estadio de brote, en el cual Pax9 es necesario para la expresin de Bmp4, Msx1 y Lef1 por el mesnquima; por lo que su funcin sera fundamental para establecer la capacidad inductiva de dicho tejido (21). Sin embargo, los ratones Pax9 +/- son normales. En conjunto, estos datos parecen indicar que PAX9 posee una funcin dependiente de la concentracin en los humanos, y que, de alguna forma, es ms importante en el desarrollo de las piezas dentarias ms distales principalmente de aquellas derivadas de la proliferacin de la lmina dentaria que da origen a los molares permanentes. Al tener los ratones una sola denticin, sera necesario realizar estudios en primates para aclarar la expresin y funcin de este gen en el desarrollo de una denticin bifiodonte. Hipodoncia con ausencia de segundos premolares y terceros molares. MIM 106600. Los trabajos de Vastardis (22) fructificaron en 1996 con la identificacin de la causa gentica para este tipo de hipodoncia hereditaria no sindrmica de herencia autosmica dominante. Se caracteriza por la agenesia de segundos premolares y terceros molares, aunque tambin pueden estar ausentes otras piezas. En una familia holandesa, tres de los 11 miembros afectados y uno de los no afectados presentaban, adems, fisura palatina (23). En otra familia (24) los dientes presentes eran de menor tamao, los segundos molares superiores carecan de la cspide distolingual y los primeros molares inferiores carecan de la cspide distovestibular. El fenotipo de los casos descritos se resume en las figuras 3 y 4. Las mutaciones responsables (Tabla 2) se encontraron en el gen MSX1, en 4p16.1. La expresin de este gen se observa en el mesnquima odontognico desde muy temprano (7). Los ratones Msx1 -/- presentan fisura del paladar secundario, agenesia de todos los dientes cuyo desarrollo se detiene en estado de brote y defectos en el crneo, mandbula y odo medio (25). Los genes MSX codifican factores de transcripcin con homeodominio que participan en las distintas etapas del desarrollo en el diseo, morfognesis e histognesis, y funcionan como represores de la transcripcin (25). Se expresan en clulas indiferenciadas multipotenciales que estn proliferando o muriendo, confieren informacin posicional y regulan la sealizacin epitelio-mesnquima en el desarroll crneofacial

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Mutacin InsG219, exn 2 (16).

AT nt 340, exn 2 (17).

InsC793, exn 4 (18).

Efecto Desplazamiento del marco de lectura a partir del residuo 73 y terminacin prematura en el residuo 316. Mutacin con prdida de sentido, Lys114stop, protena truncada que carece de la ltima alfa hlice de la caja pareada y de toda la regin C terminal. Desplazamiento del marco de lectura a partir del residuo 264 y terminacin prematura en residuo 315. Cambia el sentido de 51 residuos y remueve los 25 residuos N terminales. No altera la caja pareada.

Mutacin GC, exn 2 (22).

CA nt 752, exn 1 (23).

Efecto Mutacin de sentido equivocado, Arg239Pro [numerada segn (23)], en el homeodominio. Mutacin con prdida de sentido, Ser104stop, protena truncada a Nterminal del homeodominio.

CA nt 605 (contado desde la A del codn de Mutacin con prdida de sentido, comienzo de la traduccin Ser202stop, protena truncada desde el en la regin codicante), homeodominio. exn 2 (14). Mutacin de sentido equivocado, TA nt 620 (24). Met61Lys. No altera el homeodominio.
Tabla 2. Mutaciones en MSX1 responsables de agenesias dentarias. Referencias entre parntesis.

Delecin en 14q de 44 100 kb, abarcando el locus Haploinsuciencia por prdida de uno de PAX9. Heterocigota. de los alelos del gen. (13). Leu21Pro, mutacin de sentido TC nt 62, exn 2 (19). equivocado en el dominio pareado. Lys91Glu, mutacin de sentido AG nt 271, exn 2 (19). equivocado en el dominio pareado. Produce un desplazamiento del marco Insercin de 288-bp en el de lectura a partir del residuo 58, y exn 2 (19). terminacin prematura en el residuo 177.
Tabla 1. Mutaciones en PAX9 responsables de agenesias dentarias. Referencias entre parntesis.

(25). Se ha demostrado que MSX1 inhibe la diferenciacin celular al mantener elevados los niveles de la ciclina D1 y la actividad de Cdk4, necesarios para evitar la salida del ciclo celular y mantener a las clulas con capacidad de responder a los factores proliferativos (26). Las mutaciones con prdida de funcin permitiran a las clulas diferenciarse tempranamente y dejar de proliferar, con la consiguiente falla en la morfognesis (26). La mutacin identificada por Vastardis et al. (22) implica una sustitucin de un residuo clave en el homeodominio y produce una protena menos estable, con poca o nula capacidad de unirse al ADN y que pierde su funcin biolgica (27); por lo cual el mecanismo de patogenicidad sera la haploinsuficiencia. Una mutacin identificada fuera del homeodominio (24) indicara la importancia de la regin N-terminal para la interaccin de MSX1 con otras protenas necesarias para la transcripcin. La selectividad para producir su efecto en determinadas piezas dentarias puede explicarse: por una distinta sensibilidad a la concentracin de la protena en los tejidos de las distintas piezas en desarrollo (27); por la cronologa de la expresin del gen y del desarrollo de las distintas piezas en combinacin con la presencia o ausencia de redundancia con otros genes durante la morfognesis dentaria (14) ; o por mecanismos genticos de la odontognesis no necesariamente idnticos en los distintos grupos dentarios en los primates. Deficiencia He-Zhao. MIM 604625. Esta afeccin fue descrita en una familia del noroeste de China, en la que, de 328 miembros estudiados, 52 pertenecientes a 6

generaciones estaban afectados (28). La herencia es autosmica dominante, con una penetrancia estimada de 88%, y de expresividad muy variable. La denticin primaria es normal. El nmero de piezas permanentes ausentes es muy variable; implica principalmente a los terceros molares, segundos premolares e incisivos laterales superiores y puede alcanzar a toda la denticin. El gen responsable ha sido mapeado a una regin de 5.5cM en 10q11.2 (29), en la cual existen varios genes. Los principales candidatos son: Dkk-1, que codifica una protena antagonista de la sealizacin por Wnt; PRKG1B, que produce una proteinquinasa cGMP-dependiente; y un conjunto de factores de transcripcin de dedos de zinc KOX (29). Actualmente, se estn desarrollando estudios de secuenciacin para detectar mutaciones en estos genes. Hipodoncia con ausencia de incisivos y premolares (IPH, Incisor-premolar hypodontia). MIM 150400. Es la forma ms comn de hipodoncia hereditaria. Un equipo de trabajo finlands estudia su base gentica desde hace casi una dcada (6, 30). El promedio de piezas ausentes entre los afectados es 2,3. Las piezas ausentes con mayor frecuencia son los segundos premolares inferiores (47%), segundos premolares superiores (30%), incisivos laterales superiores (17%) e incisivos centrales inferiores (4,2%) los terceros molares fueron excluidos del estudio. La denticin primaria no est afectada. La penetrancia calculada es de 97%, y su herencia es autosmica dominante. Los autores consideran a los dientes con coronas con forma de grano de arroz como parte de la variabilidad en la expresividad; varias anomalas de la denticin aparecen asociadas a esta forma de hipodoncia: caninos superiores ectpicos desplazados hacia palatino, premolares rotados, y taurodontismo (6). Todava no se ha podido encontrar la causa de esta afeccin, aunque se han descartado mutaciones en MSX1, MSX2, EGF, EGFR y FGF-3 (30, 31) todos con participacin demostrada en el desarrollo dentario (7) . Hipodoncia autosmica recesiva. MIM 602639. Ahmad et al. (32) describieron esta afeccin de expresividad variable en una familia con alta consanguinidad en Pakistn. La hipodoncia aparece asociada a un incompleto desarrollo de casi todas las piezas dentarias, a la malformacin de las coronas, a

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Fig. 1. Patrn de agenesias dentarias en el maxilar superior, en mutaciones de PAX9. Para cada pieza dentaria, se calcul el porcentaje P = E/(E+A) x 100, donde E es el nmero de dientes presentes y A el nmero de dientes ausentes en la denticin. El P se calcul para cada caso familiar descrito hasta el momento. Para cada pieza dentaria (TP), se grafic el P mximo, el mnimo, y la media (-s-), como indicador de la tendencia. Para realizar los clculos se utilizaron los datos publicados en las referencias 13 y 16 19. La idea de los grficos est basada en los estudios de campos morfogenticos relativos de Line (48). Fig. 2. Patrn de agenesias dentarias en la mandbula, en mutaciones de PAX9. Ver leyenda de Fig. 1 para interpretacin. Para realizar los clculos se utilizaron los datos publicados en las referencias 13 y 16 19. Fig. 3. Patrn de agenesias dentarias en el maxilar superior, en mutaciones de MSX1. Ver leyenda de Fig. 1 para interpretacin. Para realizar los clculos se utilzaron los datos publicados en las referencias 14 y 22 24. Fig. 4. Patrn de agenesias dentarias en la mandbula, en mutaciones de MSX1. Ver leyenda de Fig. 1 para interpretacin. Para realizar los clculos se utilizaron los datos publicados en las referencias 14 y 22 24. Fig.1. Pattern of tooth agenesis in the maxilla, in PAX9 mutations. A percentage P = E/(E+A) x 100, was calculated for each tooth piece, where E is the number of existing teeth and A is the number of absent teeth in the dentition. P was calculated for every familiar case described to date. For each tooth piece (TP), maximum, minimum and media (-s-) as an index of tendency, were plotted. Calculations were based on references 13, 16 19. The plot idea is based on Lines studies of relative morphogenetic fields (48). Fig. 2. Pattern of tooth agenesis in the mandible, in PAX9 mutations. See legend of Fig. 1 for interpretation. Calculations were based on references 13, 16 19. Fig. 3. Pattern of tooth agenesis in the maxilla, in MSX1 mutations. See legend of Fig. 1 for interpretation. Calculations were based on references 14, 22 24. Fig. 4. Pattern of tooth agenesis in the mandible, in MSX1 mutations. See legend of Fig. 1 for interpretation. Calculations were based on references 14, 22 24.

la falta de desarrollo radicular, a la hipoplasia del esmalte y a una falla en la erupcin. El gen responsable se ha mapeado en 16q12.1, pero todava no se ha identificado. Hipodoncia autosmica recesiva con ausencia de incisivos inferiores (RIH, Recessive incisor hypodontia). Pirinen et al. (11) caracterizaron esta afeccin en individuos de 34 familias finlandesas. Se caracteriza por la ausencia de varios incisivos inferiores y de incisivos laterales superiores

permanentes; y en menor medida, afecta a todas las piezas, principalmente a los segundos premolares. En la mitad de los pacientes, las piezas caducas correspondientes tampoco se haban desarrollado o tenan forma de grano de arroz. Aparece asociada a otras anomalas, como taurodontismo, retrasos en la erupcin, y atopas. Los autores consideran que esta afeccin podra ser la misma anteriormente descrita por otros en varios pases. Su alta prevalencia en Finlandia se debera al aislamiento

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gentico de la poblacin de este pas, que posee un conjunto de unos 40 desrdenes genticos caractersticos, principalmente de herencia recesiva.

AGENESIAS DENTARIAS SINDROMICAS

El hecho de que numerosos genes que participan en el desarrollo dentario sean necesarios tambin para el desarrollo de otros rganos, hace que las agenesias dentarias aparezcan asociadas a otras alteraciones en numerosos sndromes. Se destacarn aqu tres de ellos cuyas bases moleculares se establecieron recientemente. Displasia ectodrmica anhidrtica (DEA). MIM 305100. Las displasias ectodrmicas son un conjunto de aproximadamente 150 afecciones que incluyen alteraciones de al menos dos de las estructuras derivadas del ectodermo como el pelo, la piel, las uas y los dientes (33) . La displasia ectodrmica anhidrtica se caracteriza por hipohidrosis, hipotricosis e hipodoncia. Se observa una oligodoncia grave en la denticin temporaria y permanente. Los dientes presentes suelen ser coniformes. Puede haber taurodontismo. La herencia est ligada al cromosoma X, por lo que afecta principalmente a los hombres, aunque las mujeres heterocigotas tambin presentan alteraciones (34). Las mutaciones puntuales, deleciones o translocaciones que afectan al gen ED1 (=EDA), en Xq12-q13.1, producen la enfermedad (35, 36). ED1 codifica a la ectodisplasina-A, una protena de 391 aminocidos perteneciente a la familia de ligandos del TNF (factor de necrosis tumoral). sta posee un dominio citoplasmtico, uno transmembrana y otro extracelular. Dentro de ste se encuentran: una regin con una secuencia repetitiva Gly-x-y caracterstica del colgeno que permite la trimerizacin; varias regiones altamente conservadas en la familia del TNF; y una secuencia para la escisin proteoltica por la furina (36). Esta escisin le permitira actuar a distancia como una seal difusible. Se expresa en el desarrollo de los folculos pilosos, glndulas sudorparas y dientes, y es importante en la sealizacin epitelio-mesnquima. Se han encontrado mutaciones en el gen de su receptor DL (=EDAR), en 2q11-q13, que producen formas de DEA autosmicas recesivas o dominantes con un fenotipo indistinguible de la forma ligada al cromosoma X (37). La sealizacin EDA/EDAR activa el factor de transcripcin NFkappaB mediante el complejo de la IKK (IkappaB quinasa) (38). En los ratones, el homlogo de ED1 (Ta) se expresa durante la odontognesis en el epitelio oral y en el epitelio externo del rgano del esmalte; mientras que el homlogo de DL (Dl) lo hace primero en el epitelio oral y luego se restringe al nudo del esmalte centro de sealizacin que controla la proliferacin y apoptosis, y dirige el desarrollo de las cspides (39). En los ratones con mutaciones en Ta, el nudo del esmalte posee un menor tamao y la expresin de los genes marcadores caractersticos (Shh, Fgf-4, Bmp-4 y Wnt10b) necesaria para la sealizacin es dbil (39). En cambio, las mutaciones en Dl producen fallas en el desarrollo del nudo, apareciendo como una banda de clulas desorganizadas, aunque manteniendo su actividad sealizadora (39). Estos datos muestran la importancia de la va de sealizacin en la que participan estas molculas para la organizacin del nudo del esmalte como centro de sealizacin y su funcin en la

morfognesis dentaria, principalmente del patrn cuspdeo. Sndrome Witkop de dientes y uas. MIM 189500. Es tambin una displasia ectodrmica, caracterizada por hipodoncia u oligodoncia y por disgenesia ungueal. Los dientes presentes pueden ser coniformes, con races cortas o molares taurodontiformes. Puede afectar a la denticin primaria. La herencia es autosmica dominante. Las uas son hipoplsicas y con forma de cuchara, principalmente las de los pies (14, 34). La expresividad es muy variable. Se ha identificado una mutacin con prdida de sentido en el homeobox de MSX1 (4p16.1) como responsable de este desorden (14). La protena producida a partir del alelo mutado estara truncada, carente de toda su regin C terminal y de las hlices II y III del homeodominio necesarias para la estabilidad y la unin al ADN. Esto determinara la prdida de funcin de la protena, lo que permite proponer la haploinsuficiencia como mecanismo de la patogenia (14). Estudios realizados en ratones han demostrado la necesidad de la expresin de Msx1 en el mesnquima para el desarrollo normal de las uas y de los dientes (14, 40); lo que indicara una funcin o mecanismo comn de este factor de transcripcin en el desarrollo de ambas estructuras. El fenotipo dentario es ms grave en este sndrome que en las otras mutaciones que afectan a MSX1 y producen agenesias no sindrmicas (figuras 3 y 4), aunque el patrn es coincidente y evidencia la selectividad de la funcin de MSX1 en la odontognesis humana. Sndrome Rieger Tipo 1. MIM 180500. Se caracteriza por hipodoncia, malformacin de la cmara anterior de los ojos y anomalas umbilicales. El tercio medio de la cara, incluyendo la premaxila, est poco desarrollado. Hay agenesia de los incisivos superiores temporarios y permanentes, y de los segundos premolares superiores. Las piezas inferiores anteriores suelen ser coniformes, y puede haber fisura palatina. La herencia es autosmica dominante, con penetrancia casi completa y expresividad variable (34). Las mutaciones responsables de esta malformacin se encontraron en el gen PITX2 (=RIEG1), en 4q25q26, que codifica a un factor de transcripcin con homeodominio, relacionado con bicoid (41). La expresin de PITX2 es uno de los primeros marcadores del desarrollo dentario durante la iniciacin (2), previo a cualquier manifestacin morfolgica. Se observa en el epitelio oral en las reas odontognicas, en el mesnquima periocular y en la zona umbilical (41). La sealizacin por Wnt induce la expresin de PITX2. ste, junto con otros cofactores especficos de determinados tipos celulares y actuando sinergsticamente con las vas de sealizacin activadas por factores de crecimiento, promueve la proliferacin celular al regular la expresin de varios genes que controlan el ciclo celular en G1, como la ciclina D2 (42). PITX2 tambin aumenta la expresin de DLX2 otro factor de transcripcin importante en el desarrollo dentario, unindose a su promotor (43). Las mutaciones responsables del sndrome implicaran prdida de funcin de la protena derivada de ese alelo y el mecanismo de la patognesis sera la haploinsuficiencia (43).

CONCLUSIONES
El descubrimiento de los genes que participan en los programas de desarrollo dentario y la identificacin de mutaciones que

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producen malformaciones crneofaciales, nos permite empezar a comprender la etiologa y la patogenia de estas afecciones. Las agenesias dentarias son un carcter complejo, con una expresividad variable y que aparecen asociadas a otras alteraciones de la denticin. Las mutaciones encontradas hasta ahora pueden explicar slo un pequeo porcentaje de la prevalencia observada (44). El hecho de que mutaciones en un solo gen, como se observa en MSX1, puedan producir agenesias aisladas o una forma sindrmica como extensin del fenotipo, permite suponer que el descubrimiento del defecto gnico responsable de los sndromes que incluyen anormalidades dentarias llevara a identificar genes que expliquen las formas aisladas (44). El hallazgo de que las mutaciones en determinados genes afectan selectivamente el desarrollo de ciertas piezas dentarias, sustenta las conclusiones desprendidas de los estudios con ratones modificados genticamente, de que habra mecanismos genticos bsicos diferentes para distintos grupos dentarios. Estos datos apoyaran la existencia del cdigo de homeoboxes odontognico postulado por Sharpe (45), equivalente al que existe para la especificacin de los huesos de los miembros (46). Nuevas tcnicas permiten ya realizar diagnsticos tempranos de mutaciones que implican un riesgo de desarrollar enfermedades de base gentica. La combinacin de los estudios genticos y clnicos podra, en el futuro, permitir elaborar clasificaciones satisfactorias de estas anomalas que combinasen los fenotipos con los defectos genticos subyacentes. Esto traera nuevas posibilidades de diagnstico temprano y previsin del tratamiento ortopdico/ortodncico, quirrgico o protsico. Los avances en la ingeniera de rganos y tejidos y la terapia gnica podran llegar incluso a permitir la implantacin de grmenes de cultivo o a subsanar el defecto gentico tempranamente y permitir un desarrollo normal (47). Es necesario destacar la importancia del registro de casos por parte de los clnicos para el desarrollo de futuras investigaciones. El estudio apropiado de las agenesias dentarias familiares hereditarias y espordicas es imprescindible para seguir descubriendo mutaciones en genes responsables de estas anomalas. Frente a la presencia de agenesias dentarias, debera consultarse y estudiarse la existencia de la anomala en los otros miembros de la familia; y previo a cualquier tratamiento quirrgico u ortodncico, debera registrarse el caso con una completa historia clnica que permitiera caracterizar el fenotipo incluyendo ortopantomografas y modelos. Es necesario caracterizar no slo las agenesias, sino tambin cualquier alteracin de tamao, forma, posicin, erupcin o estructural de las piezas presentes; as como la bsqueda de alteraciones en otros rganos y sistemas. Los mtodos actuales permiten obtener ADN para estudios moleculares con mtodos no invasivos -como un simple raspado de la mucosa oral-, presentando mnimas molestias para el paciente. Ser mediante la conjuncin de los estudios clnicos y los moleculares que, acertadamente, podremos avanzar en el conocimiento de las causas de estas alteraciones.

Tooth agenesis: in search of mutations behind failed dental development

KOLENC-FUS FJ. TOOTH AGENESIS: IN SEARCH OF MUTATIONS BEHIND FAILED DENTAL DEVELOPMENT. MED ORAL PATOL ORAL CIR BUCAL 2004;9:385-95.

ABSTRACT
Tooth agenesis are the most common craniofacial malformations. Its prevalence in permanent dentition reaches 20% and its expressivity ranges from only one tooth, usually a third molar, to the whole dentition. Genetic linkage and molecular biology studies have allowed, in the last decade, the identification of mutations responsible for some patterns of syndromic and nonsyndromic tooth agenesis. The mutated genes are key genes for the development of dentition, like the ones that encode the transcription factors MSX1, PAX9 and PITX2, the signalling protein EDA and its receptor EDAR. Current research would lead to the development of new classifications of tooth agenesis that took into account both the phenotypes and the genetic background. This would allow an early diagnosis of the condition, before the development of the somatic defect, that could eventually be repaired with gene therapy or tissue and organ engineering. Key words: Tooth agenesis, hypodontia, oligodontia, PAX9, MSX1.

INTRODUCTION
Mammalian dentition is a segmented system, composed of a series of homologous elements, sharing a similar structure but different in shape and size (1). It is analogous to the vertebral column in that a modular structure repeats itself with modifications to constitute a complex system. In this kind of system, some units can be absent due to lack of development, and that is what is called an agenesis. Tooth development is a complex process, in which reciprocal and sequential interactions between epithelial and mesenchymal cells (2) regulate cell activities like proliferation, condensation, adhesion, migration, differentiation and secretion, that lead to the formation of a functional tooth organ. Organogenesis involves three fundamental processes: a) initiation, in which a group of cells interprets positional information provided by other cells to initiate organ formation at both the right place and time, b) morphogenesis, in which the cells build up an organ rudiment and c) differentiation, in which cells build up organ-specific structures (3). Recent advances in our understanding of molecular aspects of odontogenesis (2-5) indicate that the development of teeth is under strict genetic control, which determines the positions, numbers and shapes of different types of teeth (6). Most studies have been done using mice as models. The scarce direct knowledge on the molecular basis of human odontogenesis derives from the study of pathological cases. More than 200 genes are known by now to have a role in odontogenesis (7). Proteins coded by these genes have many functions, being transcription factors, signalling molecules

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and its receptors and extracellular matrix molecules some of the more relevant for tooth development. Mutations in any of these genes could eventually lead to failures in odontogenesis. The earlier these proteins are needed for the development, the worse the malformation derived from their altered function may be. An alteration in the function of a protein needed for the initiation or early morphogenesis could lead to agenesis. Many proteins can have different functions during the various processes of organogenesis, during the development of the different kinds of teeth or during the development of primary and permanent dentitions. This could explain the association between different dental anomalies like agenesis and delayed eruption and alterations in shape, size and position of the other teeth (6, 8-11). Agenesis of at least one tooth is the most common anomaly of dental development (12). Lack of up to five teeth is called hypodontia; lack of six or more teeth is called oligodontia (13), and anodontia is the failure of development of the whole dentition. The prevalence of permanent tooth agenesis ranges between 1.6% and 9.6%, depending on the studied population and it reaches 20% if third molars are considered (12). The prevalence in primary dentition is lower, ranging between 0.5% and 0.9% (12). The most common missing teeth are third molars, followed by lateral maxillary incisors or second mandibular premolars (12). Tooth agenesis can be isolated, as the only phenotypic alteration in a person, or associated to other alterations as part of a syndrome. Isolated, non-syndromic agenesis can be sporadic or familiar; and may be inherited in mendelian dominant or recessive autosomic mode, or X-linked (12). Penetrance has been traditionally considered as incomplete but high. The expressivity of the various forms is quite variable, with a wide range of missing teeth, despite the fact that a typical phenotype can be defined for each known genetic defect. Some researchers consider the alterations in shape, like mesio-distally reduced or peg-shaped teeth, as a variation in the expression of the mutated genes. Effects of modifying genes (14) or epigenetic factors could explain this variation. It should be taken into account that the activity of these molecules is regulated by the interaction with other molecules that can be tissue-specific and have allelic variants, and the interplay between them could result in different phenotypic outcomes. Many of the genes with a role in tooth development also have important functions in the development of other organs. This explains the finding of tooth agenesis in at least 45 syndromes (15)

NON-SYNDROMIC TOOTH AGENESIS

Molar oligodontia. MIM 604625. This form of autosomal dominant oligodontia is characterized by agenesis of most permanent molars, and can eventually involve other teeth like second premolars and central mandibular incisors (16-19). Figures 1 and 2 summarize the phenotype of published cases. Primary molars can be missing in the more severe cases (17, 19). The existing teeth can show a mesio-distal reduction in size, or be peg-shaped incisors. Many mutations in the PAX9 gene, mapped to 14q12-q13, were found in patients affected by

this form of oligodontia (Table 1). The mutations would lead to a loss of the protein function, and haploinsufficiency would be the pathogenic mechanism (17, 19). The most severe phenotype published to date is due to a heterozygous deletion of PAX9 locus (13), supporting the haploinsufficiency mechanism proposed, and indicating that in the other mutations, like the missense or nonsense ones, some biological activity of the proteins could remain. PAX9 belongs to a transcription factor family (20) with nine members in mammals, characterized by a DNA-binding domain called paired domain and an additional homeodomain in most members (but not in PAX9). They are important regulators of organogenesis that can trigger cellular differentiation or maintain the pluripotency of cell populations in development. The functions of Pax9 in development have been studied in mice (21). Pax9 is widely expressed in the neural crest-derived mesenchyme involved in craniofacial and tooth development. Pax9 -/- mice show cleft secondary palate -besides other skeletal alterations-, lack thymus and parathyroid glands and all teeth are absent. Tooth development is arrested at the bud stage. At this stage Pax9 is required for the mesenchymal expression of Bmp4, Msx1 and Lef1, suggesting that its function is essential to establish the inductive capacity of this tissue (21). Nevertheless, Pax9 +/- mice are normal. Taken together, these findings suggest that PAX9 is a dosage-sensitive gene in humans, and that somehow its function is more important in the posterior teeth, especially in those derived from the proliferation of the dental lamina that gives origin to the permanent molars. Research in primates is needed to clarify the expression and function of this gene in a bifiodontic dentition. Second premolar and third molar hypodontia. MIM 106600. Vastardiss work fructified in 1996 with the identification of the underlying genetic cause for this form of dominantly-autosomic inherited non-syndromic hypodontia (22). It is characterized by second premolars and third molars agenesis, involving also other teeth. In a Dutch family, three of the 11 affected members had also cleft palate (23). In another family (24), existing teeth were smaller, second upper molars lacked the distal lingual cusp and mandibular first molars lacked the distal buccal cusp. Phenotype of published cases is summarized in figures 3 and 4. The responsible mutations (Table 2) were found in the MSX1 gene, mapped to 4p16.1. The expression of this gene is observed very early in odontogenic mesenchyme (7). Msx1-/- mice have cleft secondary palate, lack all teeth whose development is arrested at bud stage- and have skull, jaw and middle ear defects (25). MSX genes encode a group of homeodomain transcription factors required in different stages of development, like patterning, morphogenesis and histogenesis, and they function as transcriptional repressors (25). They are expressed in undifferentiated multipotential cells that are proliferating or dying; provide positional information and regulate epithelial-mesenchymal signalling in craniofacial development (25). It has been shown that MSX1 inhibits cell differentiation by maintaining high levels of cyclin D1 expression and Cdk4 activity, thus preventing the exit from the cell cycle and keeping the cells able to respond to proliferative factors (26). The loss-of-

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function mutations would lead these cells to differentiate earlier and stop proliferating, producing impaired morphogenesis (26). The mutation identified by Vastardis et al. (22) involves the substitution of a key aminoacid residue within the homeodomain and leads to a less stable protein, with little or no ability to bind DNA and lacking biological activity (27); accordingly, the phenotype is due to haploinsufficiency. A mutation found outside the homeodomain (24) remarks the role of the N-terminal region for the interaction of MSX1 with other proteins needed for transcription. The selective effect on specific types of teeth can be explained by a different sensitivity to the protein concentration in the tissues of the different developing types of teeth (27); by the timing of expression of MSX1; in combination with the presence or absence of functional redundancy from other genes during tooth morphogenesis (14); or by different genetic mechanisms for the development of the different tooth types in primates. He-Zhao deficiency. MIM 604625. This condition was characterized in a kindred from northwest China, in which 52 out of 328 members, belonging to six generations, were affected (28). The mode of inheritance is autosomal dominant, with an estimated penetrance of 88% and very variable expressivity. Primary dentition is not affected. The number of absent permanent teeth is very variable, eventually reaching the whole dentition, being the most commonly missing teeth the third molars, second premolars and lateral upper incisors. The disease locus has been mapped to a 5.5 cM region on 10q11.2 (29). Several genes in this region can be considered as candidates, such as Dkk-1, that codes a protein which is an antagonist to Wnt signalling; PRKG1B, that produces a cGMPdependent protein kinase; and a KOX zinc finger gene cluster (29). Researches are currently conducted to detect mutations in this genes. Incisor-premolar hypodontia (IPH). MIM 150400. This is the most common form of inherited hypodontia. A Finnish research team has been studying its genetic basis for a decade (6, 30). The mean number of missing teeth in probands is 2.3. The most frequently teeth missing are lower second premolars (47%), upper second premolars (30%), upper lateral incisors (17%), and lower central incisors (4.2%) third molars were excluded from the study-. Primary dentition is not affected. Calculated penetrance is 97%, and it is transmitted in an autosomal dominant manner. The authors considered pegshaped teeth as a variation in expression. Many dental anomalies are associated with this form of hypodontia: ectopic palatally displaced upper canines, rotated premolars and taurodontism (6). The genetic cause for this condition has not been found yet, but mutations in MSX1, MSX2, EGF, EGFR and FGF-3 all of them with roles in dental development (7)- have been excluded (30, 31). Autosomal recessive hypodontia. MIM 602639. Ahmad et al. (32) characterized this condition of variable expressivity from a highly consanguineous family from Pakistan. Hypodontia is associated with incomplete development of almost all teeth, malformation of crowns, lack of root development, enamel hypoplasia and failure of eruption. The disease locus has

Effect Frameshifted aminoacid sequence starting InsG219, exon 2 (16). at residue 73 and premature truncation of the protein at residue 316. Nonsense mutation, Lys114stop, truncated protein that lacks the last alpha-helix of AT nt 340, exon 2 (17). the paired-box and the entire C-terminal region. Frameshifted aminoacid sequence starting at residue 264 and premature truncation of the protein at residue 315. Add 51 InsC793, exon 4 (18). nonsense aminoacids and remove 25 Nterminal aminoacid residues. Paired-box is not altered. 14q deletion of 44 -100 Haploinsufciency, one of the alleles is kb, including the PAX9 deleted. locus. Heterozygous.(13). Leu21Pro, missense mutation within TC nt 62, exon 2 (19). paired box. Lys91Glu, missense mutation within AG nt 271, exon 2 (19). paired box. The inserted sequence results in a shift Insertion of 288-bp within in the reading frame at aa 58, and in exon 2 (19). premature truncation at residue 177.
Table 1. PAX9 mutations responsible for human tooth agenesis. References in brackets.

Mutation

Effect Missense mutation, Arg239Pro [numeration follows (23)], within the GC, exon 2 (22). homeodomain. Nonsense mutation, Ser104stop, protein CA nt 752, exon 1 (23). truncated at N-terminal of homeodomain. CA nt 605 (counted from the A of the translaNonsense mutation, Ser202stop, protein tional start codon within truncated by the homeodomain. the coding region), exon 2 (14). Missense mutation, Met61Lys. TA nt 620 (24). Homeodomain is not altered.
Table 2. MSX1 mutations responsible for human tooth agenesis. References in brackets.

Mution

been mapped to a yet unidentified gene in chromosome 16q12.1. Recessively inherited lower incisor hypodontia (RIH). Pirinen et al. (11) described this condition in patients from 34 Finnish families. It is characterized by the absence of several lower incisors and upper lateral permanent incisors, also involving other teeth, particularly second premolars. In half of the patients, the corresponding deciduous teeth had either been missing or peg shaped. It is associated with other anomalies, like taurodontism, eruption delays and atopic conditions. The authors believe this

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Agenesias dentarias / Tooth agenesis

condition can be the same formerly reported by others from various countries. Its high prevalence in Finland may be explained by the genetic isolation of the population of this country, and RIH can belong to the Finnish Disease Heritage, a collection of some 40 rare disorders, many of them recessive.

SYNDROMIC TOOTH AGENESIS

Tooth agenesis is commonly associated with other abnormalities in many syndromes, because many genes take part in common molecular mechanisms between tooth and other organs development. We will now describe the recent findings into the molecular basis of three of these syndromes. Anhydrotic ectodermal dysplasia (EDA). MIM 305100. Ectodermal dysplasias are a group of some 150 conditions that involve anomalies in at least two of the following ectodermalderived structures: hair, skin, nails, and teeth (33). Anhydrotic ectodermal dysplasia is characterized by hypohidrosis, hypotrichosis and hypodontia. The absence of most primary and permanent teeth is a characteristic finding. Present teeth usually have a conical crown shape. Taurodontism can be present. This syndrome has X-linked inheritance, so it occurs mostly in males, although heterozygous women may express the condition (34). The disease is produced by point mutations, deletions or translocations in the ED1 (=EDA) gene, mapped to Xq12-q13.1 (35, 36). ED1 encodes ectodysplasin-A, a 391 aminoacid protein, that belongs to the TNF-ligand family. It has a cytoplasmic, a transmembrane and an extracellular domain. Within the last domain are: a region with a repetitive collagen-like sequence Gly-x-y needed for the trimerization of the protein; various sequences highly conserved in TNF family; and a site for furin proteolitic cleavage (36). This cleavage would allow the protein to act as a diffusible signal. ED1 is expressed in the developing hair follicles, sweat glands and teeth, and it plays an important role in epithelial-mesenchymal signalling. Mutations have been found in DL (=EDAR), mapped to 2q11-q13, the gene that codes the ED1 receptor, that produces recessive or dominant autosomic forms of EDA whose phenotype is indistinguishable from the X-linked form (37). EDA/EDAR signalling activates transcription factor NF-kappaB through IKK (IkappaB kinase) complex (38). In mice, Ta (the homologue of ED1) is expressed in the oral epithelium and in the outer enamel epithelium during tooth development; while Dl (the homologue of DL) is expressed first in the oral epithelium and then it is restricted to the enamel knot a signalling center that controls proliferation and apoptosis, and regulates cusp development- (39). In mice with mutations in Ta, the enamel knot is smaller and the expression of the marker genes needed for signalling (Shh, Fgf-4, Bmp-4 and Wnt10b) is weak (39). Instead, mutations in Dl lead to failure in enamel knot development, that appears as an elongated band of disorganized cells, though signalling activity is retained (39). These facts remark the role of the EDA/EDAR signalling pathway in enamel knot organization as a signalling center, and its function in tooth morphogenesis, especially in the cusp patterning. Witkop tooth and nail syndrome. MIM 189500. This syndrome is also an ectodermal dysplasia. It is characterized

by hypo or oligodontia and nail dysgenesis. The existing teeth may be cone-shaped, with short roots or taurodontiform molars. Primary dentition can be affected. The mode of inheritance is autosomal dominant. Nails are hypoplastic, spoon-shaped, being the toenails more severely affected than fingernails (14, 34). The expressivity is quite variable. A nonsense mutation within MSX1 homeobox (4p16.1) has been identified as responsible for this disorder (14). The protein produced from the mutated allele would be truncated, and lacking the entire C-terminal region and the II and III homeodomain helixes, that are important for protein stability and DNA binding. The mutant protein would have no biological function, and haploinsufficiency is probably the pathogenic mechanism (14). Msx1 mesenchymal expression is important for both normal nail and tooth development in mice (14, 40); this data suggests that this transcription factor shares a common function or mechanism in the development of those structures. The tooth phenotype is more severe in this syndrome than in other non-syndromic tooth agenesis produced also by MSX1 mutations (figs. 3 and 4), although the pattern of missing teeth is coincident and shows the selectivity of the MSX1 function in human odontogenesis. Rieger syndrome Type 1. MIM 180500. It is characterized by hypodontia, malformation of the anterior chamber of the eyes and umbilical anomalies. There is midfacial hypoplasia and underdevelopment of the premaxillary area. The upper maxillary deciduous and permanent incisors and second upper premolars are most commonly missing. The lower anterior teeth have usually conical crowns, and cleft palate may be present. The mode of inheritance is autosomal dominant, with almost complete penetrance and variable expressivity (34). Mutations responsible for this malformation have been found in PITX2 (=RIEG), a gene mapped to 4q25-q26, that encodes a bicoid-related homeodomain transcription factor (41). Pitx2 expression is one of the first markers of tooth development at the initiation stage (2), previous to any morphological manifestation. It is expressed in the odontogenic areas of oral epithelium, in the periocular mesenchyma and the umbilicus (41). Wnt signalling induces PITX2 expression. PITX2 promotes cell proliferation by regulating the expression of genes that control cell cycle at G1 stage, like cyclin D2; and provides a link between Wnt and growth factor pathways in synergistically mediating cell type-specific regulation of growth control gene expression (42). PITX2 also upregulates DLX2 expression another transcription factor with a role in tooth development by binding to its promoter (43). The mutations responsible for this syndrome would be loss-of-function ones, supporting haploinsufficiency as the proposed pathogenic mechanism (43).

CONCLUSIONS
The discovery of genes that take part in tooth development programs and the identification of mutations responsible for craniofacial malformations, allow us to start understanding the ethiology and pathogenic mechanisms of these conditions. Tooth agenesis is a complex trait, with variable expressivity, and it appears associated with other tooth alterations. Mutations found

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Agenesias dentarias / Tooth agenesis

by now can explain only a little percentage of the observed prevalence (44). The fact that mutations in a single gene, like MSX1, produce either an isolated or a syndromic as extension of the phenotype form of tooth agenesis, supports the assumption that the discovery of mutations responsible for syndromes that have tooth abnormalities, could be a tool to identify genes whose mutations explain the isolated forms (44). The finding that mutations in certain genes selectively affect the development of only some kind of teeth, supports the conclusions of the studies made with genetically altered mice, that there would be different underlying genetic mechanisms for the different kind of teeth. They also support the existence of the odontogenic homeobox code proposed by Sharpe (45), equivalent to the one that determines the identity of the limb bones (46). New techniques are already available for the early diagnosis of mutations that imply a risk of developing genetic diseases. The combination of genetic and clinic studies could lead to satisfactory classifications of these anomalies, that combine the phenotypes with the underlying genetic defects. This would bring new possibilities of early diagnosis and the foresight of orthodontic, surgical or prosthetic treatment. Recent advances in tissue and organ engineering and gene therapy, could even allow the implantation of cultured tooth germs or the early repair of the genetic defect, leading to normal development (47). The recording of cases by clinicians is of great importance for future research. The proper study of familial hereditary and sporadic forms of tooth agenesis is essential for the discovery of new gene mutations that cause these anomalies. When a case of tooth agenesis is seen, the presence of the anomaly should be investigated in the other family members; and the case should be recorded with a complete clinical history including panoramic radiographs and models, for proper phenotype characterization prior to any surgical or orthodontic treatment. A precise description of missing teeth and any other tooth malformation of size, shape, position, eruption or even structural- is needed, as well as the search for alterations in other organs and systems. Current methods allow taking DNA samples by non-invasive methods like a swab of the oral mucosa, with minimum discomfort for the patient. The conjunction of clinical and molecular studies is the right way to improve our understanding of the causes of these alterations.

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AGRADECIMIENTOS. El autor agradece a Mariana Juambeltz, Claudio Martnez Debat y Enrique Zinemanas por la revisin del manuscrito en sus distintas versiones y las valiosas sugerencias y correcciones; a Natalia Acevedo y Graciela Duarte, quienes realizaron aportes que mejoraron el texto; a Clare Rymer, por su apoyo en la hemeroteca de la Facultad de Odontologa de la UDELAR; a Elizabeth Lettier por corregir la versin inglesa del texto; y a un conjunto de orientales dispersos por el mundo que aportaron valiosos artculos sin los cuales esta revisin no hubiera sido posible.

AKNOWLEDGEMENTS The author wants to thank Mariana Juambeltz, Claudio Martnez Debat and Enrique Zinemanas who reviewed the various versions of the manuscript and made valuable suggestions and corrections; Natalia Acevedo and Graciela Duarte made suggestions that improved the text; Clare Rymer for her support in the library of the Faculty of Dentistry/UDELAR; Elizabeth Lettier for the correction of the English version of the text; and a lot of compatriots scattered around the world who supplied valuable papers that made possible this review.

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