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Un quitinasa se purific a partir del estmago de un pez, la plata corvina Pennahia argentatus, por amonio sulfato de fraccionamiento y la cromatografa

en columna usando Chitopearl bsica BL-03, CM-Toyopearl 650S, y Butil-Toyopearl 650S. La masa molecular y punto isoelctrico se estimaron en 42 kDa y 6.7, respectivamente. La secuencia N-terminal de aminocidos mostr un alto nivel de homologa con la familia 18 quitinasas. El pH ptimo de quitinasa plata corvina hacia p-nitrofenil-N acetylchitobioside (pnp-(GlcNAc) 2) y quitina coloidal se observ que eran de pH 2,5 y 4,0, respectivamente, mientras que quitinasa aumento de la actividad sobre 1,5-3-a veces con la presencia de NaCl. NAcetylchitooligosaccharide ((GlcProductos NAC) n, n = 2-6) y sus relaciones de hidrlisis formacin anmero se analizaron mediante HPLC utilizando una TSK-GEL Amida-80 en la columna. Dado que la quitinasa corvina plata hidrolizada (GlcNAc) 4-6 y produjo (GLCNAC) 2-4, se juzg que una quitinasa endo-tipo. Mientras tanto, un aumento de la b-anmeros se reconoci en los productos de hidrlisis, lo mismo que con la familia 18 quitinasas. Este enzima hidroliza (GlcNAc) 5 a producir (GlcNAc) 2 (79,2%) y 3 (GlcNAc) (20,8%). Quitinasa actividad hacia diversos sustratos en el Para pNp-(GlcNAc) n (n = 2-4) fue pNp-(GlcNAc) 2 >> pNp-(GlcNAc) 4> pNp(GlcNAc) 3. A partir de estos resultados, quitinasa corvina plata fue juzgada como una enzima que hidroliza preferentemente la segunda glicosdico enlace desde el extremo no reductor de (GlcNAc) n. La quitinasa tambin mostr especificidad de sustrato de ancho para degradar a-quitina de los camarones y el cangrejo de concha y b-quitina de la pluma de calamar. Esto coincide bien con el hbitos de alimentacin de la corvina plata, que se alimenta principalmente de estos animales.

La quitina es un polisacrido formado a partir de b-1, 4 enlaces de N-acetilDglucosamine (GlcNAc) .1 Se encuentra ampliamente distribuida en los organismos, principalmente en los componentes estructurales, como exoesqueletos de artrpodos, moluscos conchas, y las paredes celulares de los hongos. Es el segundo ms abundante biomasa prxima a la celulosa [1,2]. La mayor parte de la quitina que existe en el natural

mundo tiene una estructura cristalina o un-b quitina-[3]. Quitinasas (EC 3.2.1.14) son enzimas que hidrolizan al azar El B-1, 4 glicosdicos de la quitina y producir N-acetylchitooligosaccharides (GlcNAc) n. Quitinasas estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y cumplen importantes funciones biolgicas en actividades tales como la ingesta de nutrientes, cambios morfolgicos, de defensa y ataque [4]. Quitinasas encontrado en los estmagos de los peces [5-8] y los hgados de los calamar [9,10] quitinosos degradar sustancias ingeridas como alimento, mientras que las quitinasas presentes en insectos y crustceos [11-13] sirven para degradar las sustancias en el exoesqueleto de quitina durante el ecdisis. En las plantas, por otro lado, quitinasas actuar como protenas para la auto-defensa contra los patgenos de hongos que contienen quitina sustancias [14-16]. Finalmente, quitinasas son enzimas esenciales para la produccin enzimtica de (GlcNAc) y n GlcNAc, que son poco a poco demostrando tener una gran variedad de funciones fisiolgicas [17,18]. En consecuencia, la investigacin de quitinasas en diversos organismos se no slo aclarar sus respectivas funciones fisiolgicas, pero tambin ser de uso en la produccin de (GlcNAc) y n GlcNAc. Las quitinasas se clasifican en dos familias de glicosil hidrolasas familias 18 y 19, sobre la base de la homologa de su amino secuencias de cido [19] y sus mecanismos catalticos [20,21]. Familia 18 quitinasas estn ampliamente distribuidos entre los microbios, animales, plantas y otros organismos [19]. Familia 19 quitinasas, por el otro mano, existen principalmente en las plantas de orden superior y se inform de que fuertes propiedades antibacterianas [22]. Quitinasas Fish estmago tienen la funcin fisiolgica del degradacin de las sustancias ingeridas quitinosos como alimento. Han sido purificada a partir de los estmagos de varios peces, y sus propiedades Se han aclarado [7,8,23-25]. Estos informes sugieren que el nmero de isoenzimas y especificidad por el sustrato del estmago de pescado quitinasas difieren dependiendo de las especies de peces, en relacin con sus hbitos de alimentacin [7]. El estmago del greenling, por ejemplo, Se ha informado que contienen isoenzimas quitinasa con alto hidrolizando actividad hacia slo una de una de quitina o b-quitina, mientras que la de la caballa comn tiene una quitinasa con hidrolizar actividad tanto hacia una quitina y b-quitina-[7]. En este estudio, por lo tanto, el objetivo era purificar quitinasa de la el estmago de la plata corvina Pennahia argentatus, un hasta entonces unresearched peces demersales de la familia que se alimenta de Percichthyidae

camarones, cangrejos, y los calamares, y caracterizar sus diversas propiedades. Mediante el anlisis de la secuencia N-terminal de aminocidos de la purificada quitinasa y las proporciones de formacin de su anmero (GlcNAc) n (n = 2-6) productos de hidrlisis, se hizo un intento de identificar la familia glicosil hidrolasas de la quitinasa corvina plata. adems de esto, el objetivo era aclarar las propiedades enzimticas para para estudiar su potencial para el uso de quitinasa corvina plata como (GLCNAC) n producir la enzima. Pez de Plata corvina son capturados en grandes nmeros como una materia prima para kamaboko y otros productos de pasta pescado, pero sus rganos se desechan. Este estudio tambin podra servir como investigacin bsica para la utilizacin eficaz de procesamiento de la pesca los residuos.

Materiales y mtodos Materiales Corvina Plata (P. argentatus) se adquiri de la Tsukiji Mercado en Tokio, Japn (nmero: 29, un peso promedio de 219 g, el peso promedio de estmago: 1,39 g). Glicol quitina, p-nitrofenil N-acetylchitooligosaccharides (PNP-(GlcNAc) n, n = 1-4), y N-(acetylchitooligosaccharides (GlcNAc) n, n = 2-6) fueron adquiridos de Seikagaku Corp. (Tokio). Cangrejo de concha de quitina (un-quitina) fue adquirido de Tokyo Kasei (Tokio). Camarones concha de quitina (un-quitina, quitina EX) se adquiri de Funakoshi (Tokio). Gusano de Seda cutcula quitina (un-quitina) fue suministrado generosamente por el Dr. A. Haga. Calamar pluma de quitina (b-quitina) fue suministrado generosamente por Kyowa Technos Co., Ltd. Las microalgas quitina (b-quitina) fue suministrado generosamente por El Dr. K.J. Kramer. Quitina coloidal se prepar por el mtodo de Shimahara y Takiguchi [26]. Microbio Streptomyces griseus quitinasa fue comprado a Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EE.UU.). La purificacin de la quitinasa corvina plata A menos que se indique lo contrario, todos los procesos se llevaron a cabo a temperaturas de 0-4 C. Los estmagos de pjaros de mal agero de plata fueron cortadas frescas abierto, el contenido eliminado, y las paredes interiores se lav con agua destilada fra. Los estmagos se homogeneizaron con cinco volmenes de 50 mM de tampn de acetato sdico (pH 5,5) y se centrifug a 13.000 g durante 20 min. Se aadi sulfato amnico al sobrenadante para dar 70% de saturacin, y la preparacin se dej reposar durante 2 h. Precipitado se recogi por centrifugacin a 14.000 g

durante 20 minutos, y se dializ en 20 mM de tampn fosfato sdico (pH 7,2). La solucin dializada se centrifug a 13.000 g durante 20 min, se despus de lo cual se aadi NaCl para llevar la concentracin de 1 M. Esta solucin se aplic a una Chitopearl bsica BL-03 en la columna (1,6 cm? 30 cm) previamente equilibrada con 20 mM de sodio tampn fosfato (pH 7,2) que contena NaCl 1 M, y la no adsorbida fracciones se eluyeron con el mismo tampn. Fracciones adsorbidas Se eluy con 0,1 M de cido actico. Las fracciones activas fueron recogi y se dializ con 20 mM de tampn de acetato sdico (pH 4,5), luego se aplican a una columna de CM-Toyopearl 650S (1,6 cm? 30 cm) previamente equilibrada con el mismo tampn. Las enzimas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,7 M en el mismo tampn. Las fracciones activas se recogieron y se dializa con 20 mM de sodio tampn de acetato (pH 4,5), a continuacin, sulfato de amonio se aplic a la solucin de enzima para llevar la concentracin de 0,8 M. Este solucin de enzima se aplic a una columna de Butyl Toyopearl-650S (1,6 cm? 30 cm) previamente equilibrada con 20 mM de acetato sdico tampn (pH 4,5) que contena 0,8 M de sulfato de amonio. Quitinasas se eluyeron con un gradiente lineal de sulfato de amonio a partir 0,8 a 0 M en el mismo tampn, y las fracciones activas se recogieron y se almacen a? 80? C. Ensayo de la actividad de quitinasa Actividad quitinasa se midi utilizando diversos sustratos. En primer lugar, pNp-(GlcNAc) 2 fue utilizado como un sustrato para medir la actividad enzimtica durante la purificacin quitinasa. Cuando se utiliza pNp-(GlcNAc) n (n = 1-4) como un sustrato, la actividad enzimtica se midi por el mtodo de Ohtakara [27]. A saber, 25 ll de solucin de enzima y 10 de LL 4 mM pNp-(GlcNAc) n se aadieron a 25 ll de 0,2 M de fosfato sdicoCtrico 0,1 M tampn de cido (pH 4,5), y luego se incubaron a 37 C durante 10 min. Despus de la incubacin, 100 ll de 0,2 M de carbonato de sodio Se aadi, y la absorbencia de la p-nitrofenol liberado Se midi a 420 nm. Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima liberando 1 lmol de p-nitrofenol por min a 37 C. Cuando se utiliza 0,5% de quitina coloidal o, uno o-b-quitina, enzima Se midi la actividad mediante el mtodo de Ohtakara [27]. A saber, 250 ll de solucin de enzima y 250 ll de cada sustrato (0,5%) se aadieron a 500 ll de sodio 0,2 M ctrico fosfato 0,1 M cido (pH 4,5), y la mezcla se incub mientras se agit a 37 C durante 2 h. Despus de la incubacin, la reaccin fue detuvo por calentamiento de la mezcla con agua hirviendo durante 3 minutos. La solucin reaccionante se centrifug, y 375 LL del sobrenadante Se tomaron muestras. Para medir la cantidad de azcar reductor producido por la reaccin enzimtica, 500 ll de reactivo Schales se aadi a la solucin reaccionante y se midi la absorbencia a 420 nm. Despus de esto, la solucin reaccionante se calent en ebullicin agua durante 15 minutos, y despus de enfriar el agua que fluye en su,

absorbencia se midi de nuevo a 420 nm. Cuando glicol quitina se utiliz como sustrato, la actividad enzimtica se midi por el mtodo de Imoto y Yagishita [28]. A saber, 100 ll de tampn acetato 0,1 M de sodio (PH 4,0), 50 ll de solucin de enzima, y 100 LL de 0,05% de glicol quitina se incubaron a 37 C durante 2 h, y la cantidad de azcar reductor producido como resultado se midi mediante el reactivo de Schales. Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima liberando 1 lmol de GlcNAc por minuto a 37 C. El anlisis por HPLC de los productos de hidrlisis de (GlcNAc) n (n = 2-6) por quitinasa Los productos de hidrlisis de (GlcNAc) n (n = 2-6) producido por plata quitinasa corvina y sus ratios de formacin anmero se analizaron por el mtodo de Koga et al. [21]. Es decir, 5 ll de enzima solucin y 25 ll de 0,22 mM (GlcNAc) n se aadieron a 25 ll de Sdico 0,1 M tampn de acetato (pH 4,0) y se incubaron a 25 C durante 10 min. La reaccin se detuvo por enfriamiento a 0 C en un bao de hielo, y la solucin reaccionante se analiz mediante HPLC utilizando una TSK-GEL Amida-80 en la columna (4,6 mm? 250 mm). (GlcNAc) n se eluy con 70% de acetonitrilo a un caudal de 0,8 ml / min, y la absorbencia era detect a 210 nm. Caracterizacin de quitinasa purificada El pH ptimo cuando se utiliza pNp-(GlcNAc) 2 y pnp (-GlcNAC) 3 como sustratos se midi mediante la incubacin a 37 C durante 10 min, utilizando una de sodio 0,2 M de fosfato 0,1 M tampn de cido ctrico (PH 2,0-8,0) como un mtodo para medir la actividad enzimtica. El ptimo pH utilizando coloidal quitina y el glicol de quitina como sustratos Se midi mediante la incubacin a 37 C durante 2 horas, utilizando una sdico 0,2 M fosfato-cido ctrico 0,1 M (pH 2,0 a 8,0) como un mtodo de midiendo la actividad enzimtica. Para la estabilidad del pH, la solucin de enzima Se incub a pH 2,0 a 8,0 (0,2 M de fosfato sdico 0,1 M-ctrico tampn de cido) a 60 C durante 10 min, y la actividad de la enzima remanente se midi utilizando pNp-(GlcNAc) 2 como un sustrato, como un mtodo de midiendo la actividad enzimtica. La temperatura ptima se midi mediante la incubacin a 10-80 C durante 10 min, utilizando pNp-(GlcNAc) 2 como una sustrato, como un mtodo para medir la actividad enzimtica. Para la temperatura la estabilidad, la solucin de enzima se incub a pH 4,0 (0,2 M fosfato de sodio 0,1 M-tampn de cido ctrico) a 10-90 C durante 10 min, se y la actividad de la enzima remanente se midi utilizando pNp-(GlcNAC) 2 como un sustrato, como un mtodo para medir la actividad enzimtica. Por el efecto de NaCl sobre la actividad de quitinasa, se midi la actividad mediante el uso de pnp (GlcNAc) 2, la quitina coloidal, un cangrejo de conchaquitina, el camarn

una concha-quitina, y la pluma de calamar b-quitina como sustrato y NaCl fue aadido a la solucin reaccionante a una concentracin final de 0-1 M como un mtodo para medir la actividad enzimtica. Por comparacin, el efecto de NaCl se midi de manera similar mediante el uso de la quitinasa de S. griseus. La protena de medicin La concentracin de protenas se midi por el mtodo de Bradford, con disco de suero bovino como protena estndar [29]. La electroforesis en gel Sodio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDSPAGE) se llev a cabo en gel de poliacrilamida al 12,5% (e-Pagel, ATTO, Tokio) despus de Laemmli [30]. Las muestras se mezclaron Aplicar con Ez (ATTO, Tokio) y se calienta durante 5 minutos. protenas de gel se tieron con azul brillante de Coomassie R-250. isoelctrico electroforesis de poliacrilamida centrndose (IEF-PAGE) se llev a cabo utilizando pI 3,0-9,0 capa fina de gel de poliacrilamida (Phast Gel, GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Suecia). N-terminal de aminocidos anlisis de la secuencia La secuencia N-terminal de aminocidos se analiz mediante el uso de un secuenciador de protenas (PE Applied Biosystems 447/120A, Foster City, CA). Resultados La purificacin de la quitinasa corvina plata Como se indica en Materiales y mtodos anteriores, la solucin de enzima fue aadi a una Chitopearl bsico BL-03 en la columna despus de sulfato de amonio fraccionamiento. Quitinasas adsorbidos a una columna de afinidad quitina fueron eluy con cido actico 0,1 M (fig. 1A). A continuacin, estos quitinasa activo fracciones se purific adicionalmente mediante un CM-Toyopearl 650S intercambio inico columna (Fig. 1B). Cuando las protenas adsorbidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,7 M en el mismo tampn, la quitinasa se eluy a alrededor de 0,55 M de NaCl. La pureza del la quitinasa se estudi mediante EGPA-DSS. Como se muestra en Fig. 2B, las fracciones activas obtenidas de quitinasa CM-Toyopearl Cromatografa en columna 650S contena dos tipos de protenas (Masa molecular 50 y 42 kDa) eluida a la concentracin de NaCl mismo. As, estas fracciones activas se aplica adems a ButilToyopearl 650S cromatografa en columna hidrfoba, y las protenas adsorbidas se eluyeron con un gradiente lineal de amonio

sulfato de 0,8 a 0 M en el mismo tampn (Fig. 1C). El pico en la que la actividad de quitinasa y la elucin de las protenas coincidi era obtenido en una concentracin de sulfato amnico de alrededor de 0,1 M. En SDS-PAGE, la quitinasa purificada mostraron una sola banda, y la masa molecular se estim en 42 kDa (Fig. 2C). La masa molecular de 42 kDa de esta enzima se extenda entre el 46 kDa para el pargo rojo [23] y la 38-kDa de caballa comn [25] (Tabla 1). El punto isoelctrico de esta enzima se estim por IEF-PAGE para ser 6,7. Se ha informado de que el punto isoelctrico de quitinasas estmago de peces es 5.7 a 8.8 (Tabla 1), y el 6,7 pI de esta enzima fue dentro de ese rango. La Tabla 2 muestra la actividad total, protenas totales, la actividad especfica, y otros datos obtenidos durante la purificacin de esta quitinasa. La actividad especfica de CM-Toyopearl 650S fracciones eluidas que contienen los dos tipos de protena fue de 6,14 U / mg, pero la actividad especfica de quitinasa purificada utilizando el butil-Toyopearl 650S disminuy a 3,33 U / mg. Estos resultados sugieren que los CM-Toyopearl 650S fracciones activas contenidas tanto la enzima purificada (42 kDa) y una quitinasa (50 kDa) con mayor actividad especfica hacia pNp-(GlcNAc) 2 de la purificada enzimas (42 kDa), y que la actividad especfica disminuy como un resultado de separar la enzima (50 kDa) utilizando butil-Toyopearl Cromatografa en columna 650S. Mientras tanto, la estabilidad del 50 enzimas kDa fue notablemente baja, y estas enzimas inactivan se por butil-Toyopearl 650S cromatografa en columna. la recuperacin de la final quitinasa purificado fue de 3,3%, y la purificacin fue 49,0 veces (Tabla 2). Secuencia N-terminal de aminocidos de quitinasa corvina plata La secuencia N-terminal de aminocidos de la quitinasa corvina plata Se analiz el residuo hasta 25a, y en comparacin con los de otras familias 18 y 19 quitinasas (Fig. 3). La N-terminal secuencia de aminocidos de esta enzima fue consistente con los de chi 1 de la platija de oliva estmago quitinasa [31]. Adems, la consistencia se observ en 13 de los 23 restos en el aminocido N-terminal secuencia de quitinasas estmago de peces. El aminocido N-terminal secuencia de esta enzima mostr una alta homologa con los de familiares 18 quitinasas (Fig. 3). Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de quitinasa plata corvina El pH ptimo de quitinasa plata corvina hacia pNp-(-Glc NAC) 2 y pnp-(3 GlcNAc) se observ que eran de pH 2,5 y 4,5, respectivamente, y no ms de 20% de la actividad mxima fue se muestra a pH 8,0 (Fig. 4A). Por otro lado, la actividad mxima hacia

quitina coloidal, un sustrato largo insoluble, se observ a ser 4,0, e incluso a pH 8,0 era slo el 50% de la actividad mxima muestra (Fig. 4B). El pH ptimo de pargo rojo [23] y la anguila estmago [24] quitinasas hacia la quitina coloidal se ha informado en la regin cida de pH 5,5 y 4,4, respectivamente, y el valor quitinasa de plata corvina estaba cerca de ellos. Mientras tanto, mxima actividad de esta enzima hacia glicol quitina, una soluble en agua sustrato de largo, se detect a pH 8,0, y ms del 70% del mximo Se observ actividad a pH 4.0-7.5 (fig. 4B). A partir de estos resultados, se hizo evidente que la quitinasa plata corvina es una enzima que muestra la actividad hacia sustratos cortos slo en el cido regin, pero muestra la actividad hacia sustratos largas en una amplia gama el pH desde cido a neutro. Tambin, como se muestra en la fig. 4C, corvina plata quitinasa se reconoci a ser estable en las regiones cidas de pH 3.0-5.0 cuando la incubacin a 60? C durante 10 min. A partir de estos resultados, se qued claro que la enzima sea estable en la regin cida, y que, adems, la quitinasa muestra la actividad tanto a corto como a y sustratos largos en la regin cida. Como se muestra en la fig. 5A, la temperatura ptima de corvina plata quitinasa hacia pNp-(GlcNAc) 2 con un tiempo de reaccin de 10 min Se observ que 60? C. La temperatura ptima de ambos greenling estmago quitinasa isoenzimas (HoChiA) [7] y la caballa comn estmago quitinasa (SjChi) [25] Se ha informado que 60 C, y la de plata quitinasa corvina fue consistente con valores para esta quitinasa. Quitinasa corvina de plata se mantuvo estable hasta la incubacin a 40 C durante 10 min, pero incubando a 60 C durante 10 minutos caus el actividad a caer a 70%, y la actividad ms o menos ces cuando incubando a 80 C durante 10 min (Fig. 5-B). Efecto del NaCl sobre la actividad de la plata quitinasa corvina Cuando se utiliza pnp (GlcNAc) 2 como un sustrato, quitinasa actividad se activ por la presencia de NaCl y 298% de la relativa Se observ actividad con la presencia de 0,9 M de NaCl (Fig. 6A). Por otro lado, la quitinasa tambin fue activado, dependiente en la concentracin, cuando se utiliza la quitina coloidal como un sustrato, que muestra 208% de actividad con la presencia de 0,8 M de NaCl. Sin embargo, el velocidad de disminucin de la activacin con la adicin de 0,9 M de NaCl o ms, mostrando 125% con la adicin de 1 M (fig. 6B). En el S. griseus quitinasa estudiado para la comparacin, se observ ninguna activacin en la medicin de la actividad de cualquiera de sustrato con la adicin

de NaCl, y la actividad era inhibida por la presencia de 0,8 M de NaCl (Fig. 6A y B). Adems, cuando el efecto de NaCl se midi utilizando cristalino quitina sustratos (es decir, un cangrejo de concha-quitina, el camarn, la concha de un quitina, y la pluma de calamar b-quitina), quitinasa plata corvina fue activado para aproximadamente 145-190% en ambos sustratos con la adicin de 0,5 o 0,8 M de NaCl (fig. 7). Comparado con esto, la actividad de S. griseus quitinasa hacia estos sustratos se inhibi con la presencia de NaCl, mostrando 34-76% de actividad. Como se muestra en lo anterior, se hizo claro que a corto y largo sustratos actividad de corvina plata quitinasa se activ con la presencia de NaCl. Sustrato especificidad de quitinasa de plata hacia la corvina pnp (GlcNAc) n (n = 1-4) A pesar de la quitinasa plata corvina lanzado PNP de pnp (GLCNAC) n (n = 2-4), que no exhibi actividad hacia pNp-(GlcNAc) (Tabla 3), lo que sugiere que esta enzima no tiene tipo exo actividad quitinoltica. La enzima mostr actividad alta (0.974 U / mg) hacia pNp-(GlcNAc) 2, pero su actividad hacia pNp-(GlcNAc) n (n = 3, 4) disminuy notablemente. El anlisis por HPLC de los patrones de escisin y formas anomricas de productos en la reaccin hidroltica de (GlcNAc) n (n = 2-6) por corvina plata quitinasa Fig. 8 muestra los resultados del anlisis por HPLC de los productos en el reaccin hidroltica de (GlcNAc) n (n = 2-6) por quitinasa corvina plata. La enzima mostr ninguna actividad hidroltica hacia (GlcNAC) 2,3, pero hidrolizada (GlcNAc) 4-6 y produjo (GlcNAc) 2-4 con un aumento de b-anmeros, de la misma manera como la familia 18 quitinasas. Adems, GlcNAc no se detect en los productos de hidrlisis. Como muestran en la Tabla 4, la enzima hidroliza (GlcNAc) 4 para producir dos molculas de (GlcNA) 2, y sus hidrolizados (GlcNAc) 5 para producir (GlcNAc) 2 (79,2%) y 3 (GlcNAc) (20,8%). Adems, se hidroliza (GlcNAc) 6 para producir dos molculas de (GlcNAc) 3 (23,2%) y (GlcNAc) 2 + (GlcNAc) 4 (76,8%, n = 2 >> 4). El anlisis cintico de la quitinasa corvina plata Corvina plata actividad quitinasa se midi mediante el uso de glicol quitina (0,2-2 mg / ml) y (GlcNAc) 4 (0,15 a 1 mg / ml), y cintica parmetros fueron obtenidos por Lineweaver-Burk doble recproco parcela. El resultado hacia glicol quitina se muestran en la Tabla 5. Se convirti

claro que la enzima tena un valor Km de 0.521 (mg / ml), superior otros tipos de peces, y su afinidad hacia el sustrato era bastante bajo. A la inversa, el valor Kcat de 2,33 (1 / S) era similar al 2,21 (1 / S) de la caballa comn quitinasa estmago [7]. El valor Kcat / Km de la enzima fue 4,47 (ml / mg / s), aproximadamente un tercio de la caballa comn el estmago y la quitinasa greenling estmago quitinasa isoenzima HoChiA pero 1,2-2 veces mayor que la quitinasa estmago greenling isoenzimas HoChiB y HoChiC [7]. El valor de Km, el valor Kcat, y Kcat / Km valor hacia (GlcNAc) 4 fueron 0.189 (mg / ml), 0,0192 (1 / S), y 0,102 (ml / mg / s), respectivamente. La inhibicin de sustrato reportado en el besugo del mar [33] no se observ. Sustrato especificidad de quitinasa corvina plata hacia insolubles sustratos La especificidad de sustrato de plata hacia la quitinasa corvina sustratos insolubles se midi mediante el uso de un cristalino-quitina (Cangrejo de concha de quitina, el camarn concha de quitina, la cutcula del gusano de seda y quitina), cristalina b-quitina (la quitina del calamar pluma y quitina microalgas), y no cristalino quitina coloidal (fig. 9). De estos sustratos insolubles, la enzima degrada la quitina coloidal no cristalino el ms eficiente (0.496 U / mg). Esto fue seguido por b-quitina (Calamares quitina quitina pluma y microalgas). Las actividades de la enzima hacia una quitina, que tiene la estructura cristalina ms robusto, fueron 0.149 U / mg de camarones hacia la concha de un-quitina y 0,116 U / mg hacia la cutcula del gusano de seda a-quitina, pero la actividad hacia el caparazn del cangrejo una quitina-fue baja en 0.038 U / mg. A partir de estos resultados, se hizo evidente que la especificidad de sustrato de la enzima hacia sustratos insolubles estaba en el orden no cristalino quitina> b-quitina> un-quitina. Entre la A-quitinas, cscara de camarn y de gusanos de seda una cutcula de quitinase degradaron ms eficiente que un cangrejo de concha-quitina. Discusin Quitinasas de pescado de estmago tienen los papeles fisiolgicos de la digestin sustancias quitinosos ingerido como alimento. Estas quitinasas tienen sido purificado a partir de los estmagos de diferentes peces varios, y su propiedades han sido aclarados [7,8,23-25]. En este estudio, quitinasa se purific a partir del estmago de una especie hasta ahora no se, la plata corvina P. argentatus, y sus caractersticas eran investigado. Especialmente, especificidad por el sustrato se investig en

detalle particular con el fin de determinar el potencial de esta enzima para su uso como un (GlcNAc) n enzima que produce. Para tratar de identificar a la familia glicosil hidrolasas de la plata quitinasa corvina, la secuencia N-terminal de aminocidos de purificada quitinasa se analiz, junto con las proporciones de formacin anmero (GlcNAc) n (n = 2-6) de productos de hidrlisis formado a partir de la quitinasa. Aunque la secuencia N-terminal de aminocidos de esta enzima mostr un alto nivel de homologa con los de la familia 18 quitinasas, que difieren marcadamente de los de la familia 19 quitinasas (fig. 3). En la degradacin del sustrato, de la familia 18 quitinasas se inform a hidrolizar el substrato por un mecanismo de retencin, produciendo banomers. A la inversa, la familia 19 quitinasas hidrolizar el substrato por un mecanismo inversor, produciendo un anmeros-[20,21]. La enzima hidrolizada (GlcNAc) 4-6 y produjo (GlcNAc) 2-4 con un aumento de b-anmeros, en la misma forma que la familia 18 quitinasas (Fig. 8). Estos resultados sugieren que la quitinasa corvina plata debe ser clasificado como una familia de 18 glicosil hidrolasas. Quitinasa comn estmago caballa muestra la actividad y la estabilidad en las regiones cidas [25]. Esta caracterstica se piensa para adaptarse a la papel de esta enzima en la digestin de las sustancias ingeridas, como quitinosos los alimentos en condiciones en las que el cido gstrico existe [34]. La enzima era estable en las regiones cidas de pH 3.0-5.0, y mostr actividad hacia los sustratos de corta duracin en las regiones cidas solamente, pero hacia mucho tiempo sustratos en una amplia gama de regiones de pH desde cido a neutro (Fig. 4). A partir de estos resultados, se hizo evidente que la quitinasa corvina plata tiene la actividad a hidroliza tanto a corto como a largo sustratos en un regiones cidas. Por otra parte, la corvina plata actividad quitinasa hacia la pnp (GlcNAc) 2, la quitina coloidal, un cangrejo de concha-quitina, el camarn una concha-quitina, la pluma y el calamar b-quitina se activ notablemente por la presencia de NaCl (figs. 6 y 7). Por otro lado, S. griseus quitinasa medido bajo las mismas condiciones que no se activ por la presencia de NaCl, y A y B-cristalina quitina degradantes actividad era inhibida. La activacin de la degradacin de corto y sustratos largos en presencia de NaCl se ve por tanto como una caracterstica de quitinasa plata corvina. Esta caracterstica fue cree que se corresponden bien con el papel de esta enzima en la digestin

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