INMUNOLOGIA

Profesora Myriam Navarrete

Profesora Sandra Henao
Profesor Miguel Guzmn M.D.
AGLUTINACIN

Es la interaccin entre un anticuerpo y una partcula antignica que se visualiza por la
formacin de agregados o grumos macroscpicos. En este proceso, el anticuerpo es
conocido como aglutinina y el antgeno como el aglutingeno.

Las reacciones de aglutinacin utilizan el mismo principio de las reacciones de
precipitacin. Cuando el anticuerpo est en exceso inhibe la reaccin de precipitacin,
lo mismo ocurre en las reacciones de aglutinacin. Esta inhibicin es llamada el efecto
prozona.

Esta tcnica es ampliamente usada para la identificacin rpida de bacterias, hongos,
grupos sanguneos y otros antgenos; tambin es utilizada para la deteccin de
anticuerpos que pueden ser indicativos de un estado de enfermedad.

La temperatura, el pH , la concentracin de electrolitos, son importantes para la
realizacin de la prueba . La reaccin final se evidencia por la formacin de malla o
grumos visibles macroscpicamente .


Hemaglutinacin

Las reacciones de aglutinacin son realizadas para la tipificacin de clulas
sanguneas. En la tipificacin de los antgenos del sistema ABO, las clulas
sanguneas son mezcladas en una placa con un antisuero especifico para los
antgenos A y B del grupo sanguneo.

Si el antgeno est presente en las clulas, stas se aglutinaran, formando agregados
visibles en la placa.

La determinacin de los antgenos que estn presentes en las clulas sanguneas de
un donador es bsico para clasificar el tipo de sangre para las transfusiones.

Hemoclasificacin

Antgeno
Glbulos Rojos
Anti A Anti B Rho (Anti - D)
A + - + o -
B - + + o -
AB + + + o -
O - - + o -




























Aglutinacin Bacterial

Una infeccin bacterial conlleva a la produccin de anticuerpos especficos contra los
antgenos de superficie de la bacteria. La presencia de estos anticuerpos se puede
detectar por reacciones de aglutinacin bacterial.

Se toma el suero de un paciente que ha tenido contacto con una bacteria y se realizan
diluciones seriadas en tubos, a los que se les adiciona la bacteria. El ltimo tubo que
presente aglutinacin visible, refiere el titulo de anticuerpos en el suero del paciente.

El titulo de aglutinina es definida como el reciproco de la ultima dilucin del suero que
presenta una reaccin de aglutinacin positiva. Por ejemplo: se preparan diluciones
seriadas en base dos del suero de un paciente, si la dilucin 1/640 muestra
aglutinacin pero la dilucin 1/1280 no muestra aglutinacin, se deduce que el titulo de
anticuerpos en suero del paciente es 640.

El titulo de aglutinina de un antisuero puede usarse para el diagnstico de una
infeccin bacterial.


Aglutinacin En Ltex

Los anticuerpos o antgenos conocidos son unidos a partculas de ltex, con el objeto
de facilitar la visualizacin de la prueba. Se pueden emplear otras partculas
insolubles como el poliestireno o la bentonita.









POSITIVO NEGATIVO
Clula
Antgeno
Clula
Antgeno
Anticuerp
o
Anticuerpo


Algunas determinaciones que se realizan con esta prueba son la la determinacin de
la protena C reactiva (PCR), Factor Reumatoideo (FR), Antiestreptolisinas (ASTOS),
Staphylococccus aureus (protena A), Haemophilus influenzae (antgeno capsular),
Toxoplasma gondii (IgG), etc.


Factor Reumatoideo (FR)

En 1937 Erik Waaler descubri el Factor Reumatoideo (FR) y sus estudios fueron
reproducidos por Rose en 1948.

El Factor Reumatoideo son autoanticuerpos circulantes de la clase IgG, IgA, IgM, IgD
e IgE, siendo los mas comunes de la clase IgG e IgM con especificidad por epitopes
del fragmento Fc de la IgG propia. El factor reumatoideo ms comn es de la clase
IgM, est dirigido contra varios determinantes en los dominios CH2 y CH3 de la
fraccin Fc de la IgG. El FR se encuentra positivo en el 80% en pacientes con
manifestaciones articulares como en la Artritis Reumatoide y en un 20% en la Artritis
Juvenil. Otras entidades con FR positivo son algunas enfermedades autoinmunes
como son el Lupus Eritematoso Sistmico, Sndrome de Sjogrn, Escleroderma, etc.
Tambin se puede encontrar positivo en bajos ttulos en adultos mayores normales.
Existen varias tcnicas para detectarlos las ms comunes son utilizando glbulos
rojos de carnero recubiertos con IgG humana (Tcnica de Waaler Rose) y la
aglutinacin con partculas de ltex de poliestireno recubiertas con IgG humana.


Protena C Reactiva (PCR)

En 1930 se descubri la protena C reactiva, Inicialmente se detect en el suero de
pacientes con neumona aguda, que formaban una reaccin de precipitacin con el
polisacrido C de ciertos grupos de Neumococo.

La PCR pertenece a la familia de las pentraxinas, protenas plasmticas que participan
en las respuestas innatas a las infecciones bacterianas. Hace parte del grupo de
reactantes de fase aguda, que se une al C1q (protena del complemento) y puede de
esta forma activar el complemento o actuar como opsonina mediante la interaccin
con los receptores C1q de los fagocitos. Normalmente se encuentra en pequeas
cantidades en sangre, se eleva en procesos infecciosos, inflamatorios o traumticos.
Su concentracin aumenta entre las 24 a 48 horas despus del estimulo inflamatorio;
es una ayuda diagnstica y en la evaluacin teraputica debido a que tambin
disminuye rpidamente. Valores menores a 6 mg/L se consideran normales.

El diagnostico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico
ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.










ELECTROFORESIS

La electroforesis es una tcnica de laboratorio en la cual el suero sanguneo se coloca
en un papel especialmente tratado y luego se expone a una corriente elctrica. Las
diferentes protenas migran o se mueven en el papel con el fin de formar bandas que
indican la proporcin relativa de cada fraccin de protena. Este examen cuantifica
aproximadamente las diversas fracciones de protena en la porcin srica de una
muestra de sangre.
Las protenas son constituyentes importantes de todas las clulas y los tejidos y estn
hechas de aminocidos. Existen muchas clases de protenas en el cuerpo, con
muchas funciones diferentes; por ejemplo, las enzimas, algunas hormonas, la
hemoglobina, el fibringeno, el colgeno, las inmunoglobulinas (anticuerpos), entre
otras.
Las protenas sricas estn separadas aproximadamente en albminas y globulinas,
es decir, la protena total = albmina + globulina. La albmina es la protena de mayor
concentracin en el suero que sirve para trasportar muchas molculas pequeas, pero
tambin juega un papel decisivo en el mantenimiento de la presin onctica de la
sangre, es decir, impedir que el lquido se filtre a los tejidos.
Las globulinas se dividen a grandes rasgos en globulinas alfa-1, alfa-2, beta y
gammaglobulinas, las cuales se pueden separar y cuantificar en el laboratorio
mediante la electroforesis y la densitometra.
Los niveles de protenas alfa-1 y alfa-2 aumentan en presencia de inflamacin. La
fraccin beta incluye la transferrina, el plasmingeno y las beta lipoprotenas. La
fraccin gamma incluye los diferentes tipos de anticuerpos (IgM, IgG e IgA).
Valores normales
Protena total: 6,4 a 8,3 g/dl
Albmina: 3,5 a 5,0 g/dl
Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dl
Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dl
Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dl
Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dl
Significado de los resultados anormales
1. La disminucin de la protena total puede indicar:
Desnutricin
Sndrome nefrtico
Enteropata por prdida de protenas gastrointestinal
2. El aumento de las protenas alpha-1 globulina puede indicar:
Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)
Malignidad
Enfermedad inflamatoria aguda
3. La disminucin de las protenas alfa-1 globulinas pueden indicar:
Deficiencia de alfa-1 antitripsina
4. El aumento de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:
Inflamacin aguda
Inflamacin crnica
5. La disminucin de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:
Hemlisis
6. El aumento de las protenas beta globulinas puede indicar:
Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar)
Terapia de estrgenos
7. La disminucin de las protenas beta globulinas puede indicar:
Trastorno de coagulacin congnito
Coagulopata de consumo
Coagulacin intravascular diseminada
8. El aumento de las protenas gama globulinas puede indicar:
Mieloma mltiple
Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)
Hiperinmunizacin
Infeccin aguda
Macroglobulinemia de Waldenstrom
Enfermedad heptica crnica
Los medicamentos que pueden afectar la medicin de las protenas totales incluyen
clorpromazina, corticosteroides, isoniazida, neomicina, fenacemida, salicilatos,
sulfonamidas y tolbutamida.
Tipos de soportes para electroforesis de zona

Se han empleado varios tipos de soporte para la electroforesis de zona:

1) PAPEL. Aunque no es exactamente un gel, se puede considerar similar ya que
realmente es una malla de fibras de celulosa. Es poco restrictivo, pero es difcil de
obtener en tamaos de poro y espesores totalmente homogneos. Adems, muchas
macromolculas se adsorben a las fibras que lo forman, lo que da lugar a artefactos y
separaciones defectuosas. Se emplea fundamentalmente para molculas pequeas,
como pptidos y aminocidos.

2) ACETATO DE CELULOSA. Este derivado de la celulosa forma un gel de poro grande,
muy poco restrictivo para las protenas de tamao corriente. A diferencia del papel, es
inerte frente a la mayor parte de las protenas y se puede conseguir en lminas de
caractersticas estructurales constantes y definidas. Esto, junto con su facilidad de
manejo, costo relativamente bajo y la rapidez y reproducibilidad con que se pueden
efectuar separaciones hace que este tipo de gel tenga utilidad en los laboratorios de
anlisis clnicos (protenas sricas).

3) ALMIDON. Se emplean geles formados con almidn parcialmente hidrolizado
procedente de diversas fuentes naturales. El poro es menor que para el caso del acetato
de celulosa, y se suelen obtener mejores separaciones que con ste ltimo, ya que la
difusin es menor. Sin embargo, y a pesar de haber sido muy utilizados hasta hace algn
tiempo, han sido sustituidos por geles de poliacrilamida debido a la dificultad que supone
el obtener resultados reproducibles empleando un producto de origen natural.


Electroforesis de protenas sricas en almidn, teidas con Amido Black. Aunque la
separacin es algo mejor que en acetato de celulosa, el nmero de protenas que se
pueden diferenciar es muy pequeo.

4) AGAROSA. Uno de los dos componentes del agar. Es un polisacrido lineal que forma
geles de tamao de poro muy grande. Se usa fundamentalmente para la separacin de
cidos nucleicos y para inmunoelectroforesis.

5) POLIACRILAMIDA. A diferencia de los anteriores, el gel se forma "in situ" por la
polimerizacin de una disolucin del monmero. Es posible controlar el tamao del poro
de una forma muy reproducible. Es el tipo de gel ms empleado para la electroforesis de
protenas de tamao comprendido entre 10.000 a 250.000 dalton, y de otras molculas
de tamaos similares, incluyendo cidos nucleicos. Son geles completamente inertes,
mecnicamente estables y transparentes, lo que facilita tanto su manejo como la
deteccin de las molculas separadas en ellos. La tcnica se conoce como PAGE
(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).






PRUEBAS DE DIAGNOSTICO EN LA DETERMINACION DE COMPLEMENTO


La determinacin de Complemento hemoltico en unidades de CH50 es un bio-ensayo
que permite valorar in toto la actividad de este sistema.

El complemento es un sistema que constituye la columna vertebral de los mecanismos
humorales de defensa inespecfica del husped. En el hombre, este sistema est
integrado por un grupo de protenas plasmticas de caractersticas fsico qumicas
diferentes que permiten individualizar once factores principales ms el nmero de
factores que cooperan en la activacin y en la regulacin. El complemento se designa
con la letra mayscula C y un sufijo que designa el factor individualizado as: C1,
constituido por los subfactores C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 y C9. Estos
factores circulan en el plasma en su forma inactiva y slo entran en actividad cuando
el husped lo requiere, para lo cual se necesita una secuencia de reacciones, cuyo
efecto final, es la alteracin irreversible, estructural y funcional de las membranas
biolgicas. Si tales membranas se encuentran en bacterias, hongos, virus o parsitos,
el resultado lgicamente es la muerte de estos organismos. Bsicamente se
reconocen en la actualidad 3 patrones de activacin del sistema: la va clsica, que
involucra la interaccin de un anticuerpo preexistente contra un antgenos localizados
en una membrana, esta reaccin se precipita como una cascada a travs de una serie
de reacciones enzimticas irreversibles en las cuales el factor activado acta como
una enzima que tiene cono substrato al factor siguiente y en tal forma se llega al efecto
final de la citlisis. Igual efecto se puede lograr por un proceso de activacin alterna,
mucho ms eficiente, que ocurre a partir del factor C3, sin la activacin de los factores
iniciales C1, C2 y C4 y que adems no requiere de la preexistencia de anticuerpos, ya
que, compuestos tales como los polisacridos (liberados durante la muerte bacteriana)
pueden inducir esta va. El tercer mecanismo se conoce como la ruta de las lectinas,
se inicia sin la presencia de anticuerpos, involucra una protena que se liga a mananos
(MBP), preferiblemente se une a manosa, fucosa y glucosamina de polisacridos,
lipopolisacridos o glicoprotenas de la pared bacteriana.

En la valoracin clnica de algunos pacientes es necesario conocer como se encuentra
el sistema, lo cual se hace cuantificando algunos de sus componentes, o valorando in
toto la actividad del mismo. Bsicamente cuando el sistema se est consumiendo por
algn proceso patolgico los niveles individuales de sus factores estn por debajo de
los niveles normales y por tanto ste no est operando bien.

La actividad biolgica del complemento se determina en el laboratorio midiendo su
actividad hemoltica en trminos de la llamada Unidad hemoltica CH50, que es la
mnima cantidad de complemento necesaria para producir la hemlisis del 50% de una
suspensin de glbulos rojos de carnero en este caso, previamente sensibilizados con
anticuerpos anti-glbulos rojos de carnero.

El clnico tendr que utilizar este procedimiento y deber saberlo interpretar
correctamente.

El complemento debe investigarse en clnica en aquellas situaciones que promueven
su consumo, como por ejemplo anemias hemolticas autoinmunes, glomerulonefritis
post-estreptoccica, lupus eritematoso sistmico, inmunodeficiencias primarias;
aunque existen algunas situaciones clnicas que aumentan sus niveles circulantes. Su
utilidad clnica es mayor en aquellas que lo disminuyen y en donde la recuperacin del
proceso patolgico conlleva la normalizacin de los niveles de complemento.

El informe del Complemento Hemoltico CH50 se hace en UCH50/ml siendo el valor
de referencia 100 200 UCH50/ml.


RESPUESTA INMUNE CELULAR

Los leucocitos comprenden diferentes tipos de clulas maduras: granulocitos,
megacariocitos, monocitos, macrfagos, linfocitos y plasmocitos. Estas clulas se
pueden diferenciar fcilmente al microscopio por la relacin ncleo/citoplasma que
presenta cada una de ellas.

- FAGOCITOSIS

Un aspecto de la fagocitosis se estudia mediante la evaluacin de la actividad
bactericida de los leucocitos. Para esta prueba se mezclan leucocitos de sangre
perifrica con una suspensin bacteriana y anticuerpos especficos permitiendo bajo
condiciones adecuadas de medio, temperatura y tiempo, el proceso fagoctico.
Aunque la tcnica es compleja, el estudio opsnico puede ser utilizado en el
diagnstico de enfermedades asociadas a deficiencias del sistema inmune y en la
medicin de las defensas orgnicas desde el punto de vista inmunolgico. As como
tambin forma parte del perfil inmunolgico de pacientes inmunocomprometidos.

Experimentalmente se puede establecer la mayor eficiencia del proceso fagoctico
cuando el antgeno esta recubierto por anticuerpos especficos y se determina el
ndice opsono-citofgico relacionando el porcentaje de fagocitosis obtenido cuando
el antgeno est opsonizado y cuando no lo est.

La capacidad funcional de los monocitos y de los neutrfilos se mide en el laboratorio
clnico como la fagocitosis de partculas o microorganismos cubiertos por anticuerpos y
muertos por calor (valoracin de la inmunidad celular inespecfica). La mayora de
los individuos normales desarrollan una serie de anticuerpos frente a antgenos
ambientales. Estos surgen a partir de infecciones clnicas o contactos subclnicos con
diferentes microorganismos. Los pacientes con defectos en la primera barrera inmune
celular sufren frecuentes infecciones por bacterias pigenas, normalmente pueden
deberse a un defecto en el nmero de clulas a defectos funcionales en las mismas.


- LINFOCITOS

Los linfocitos presentan una estructura microscpica homognea, pero comprenden a
su vez un grupo heterogneo de clulas. Se logr dividir este tipo leucocitario en dos
grandes grupos: los linfocitos B (que presentan Inmunoglobulinas en su membrana) y
los linfocitos T (que hacen rosetas en presencia de glbulos rojos de carnero). Los
linfocitos son semejantes morfolgicamente, pero son heterogneos en cuanto a
densidad, su movilidad electrofortica, vida media y respuesta a mitgenos. A nivel
funcional existen varias subpoblaciones que participan por separado o en conjunto en
la respuesta inmune.
Con la aparicin de los anticuerpos monoclonales, que son capaces de reconocer
marcadores moleculares mono-especficos, se confirmaron las poblaciones
leucocitarias descritas con base en su morfologa. Esto quiere decir, que los diferentes
linajes leucocitarios poseen, adems de una morfologa microscpica diferente,
marcadores de membrana diferentes. Sin embargo, se encontr que los linfocitos
presentaban marcadores intralinfocitarios exclusivos. Tal es el caso de las molculas
CD4 y CD8 expresadas por sub-poblaciones diferentes de Linfocitos T. Estos
marcadores de sub-poblacin se encuentran respectivamente en 60% y 30% de los
Linfocitos T (solamente 3-5% de los Linfocitos T co-expresan CD4 y CD8 en su
membrana a nivel de sangre perifrica). Se describieron tambin anticuerpos
monoclonales que definen globalmente a los Linfocitos T (CD3 CD2), y otros que
definen globalmente a los Linfocitos B (CD19,CD22 CD37).

La importancia clnica de estas determinaciones estriba en que las diferentes
subpoblaciones linfocitarias ejercen a "grosso modo" funciones diferentes. La
alteracin de la proporcin de referencia 2/1 para CD4/CD8, puede llevar a estados
de deficiencia inmunitaria.

Los LT se pueden distinguir segn sus diferentes receptores de antgeno (TCR) que
caracterizan a las subpoblaciones de las clulas T, aunque tambin existen ciertas
molculas de superficie que se expresan en todas las clulas T (marcadores pan-T) y
en algunos casos en otros tipos de clulas (por ejemplo, clulas asesinas naturales
NKC), un buen ejemplo de los mismos es CD
2,
como receptor para glbulos rojos de
carnero, permitindoles que in vitro formen rosetas espontneas, in vivo y en
circunstancias normales, esta molcula junto con el complejo TCR-CD
3
y otras
glicoprotenas de membrana, colabora con la activacin de las clulas T.
Los LB presentan inmunoglobulinas de membrana que son sintetizadas por la misma
clula y se encuentran insertadas en la membrana celular en donde actan como
receptores de antgeno especficos. Estos receptores pueden ser detectados en la
superficie de las clulas maduras mediante anticuerpos marcados con sustancias
fluorescentes y especficos de la inmunoglobulina en cuestin.
Cuando las clulas se tien en fro, se observa sobre la clula B una fluorescencia con
aspecto anular. Los anticuerpos divalentes frente a las inmunoglobulinas de superficie
se unen a los receptores de superficie y los entrelazan, dando lugar a parches de
inmunoglobulinas distribuidos por la superficie celular. Cuando las clulas son
sometidas a calentamiento, la mayora de estos complejos se desplaza a lo largo de la
superficie celular y se acumula en un extremo de la clula, observndose entonces
una especie de caperuza. Una vez formada esta caperuza, la inmunoglobulina
penetra en el interior de la clula donde es degradada. El CAP es una tcnica
inmunolgica en la cual se utiliza una inmunofluorescencia directa para identificacin
de la poblacin de linfocitos B.
De la poblacin linfoide perifrica humana, 50-80% forman rosetas espontneas, 15-
20% exhiben Ig de superficie de la clase IgM e IgD y 2-10% no tienen marcadores ni
para T ni para B, esta poblacin corresponde a los linfocitos "nulos" que podran
comprender la poblacin celular implicada en linfocitotoxicidad y/o clulas precursoras
de LT y/o LB.
Citometra de Flujo
Es una tcnica que permite obtener informacin sobre poblaciones celulares a partir
de clulas en suspensin (solucin isotnica), que interfieren de forma individual con
una fuente de luz. La interseccin de cada clula con la luz lser provoca la emisin de
una serie de seales luminosas que permite diferenciar poblaciones celulares dentro
de la muestra analizada, por su tamao relativo, por sus granulaciones o bien por su
reactividad con fluorocromos previa incubacin con diversos anticuerpos
monoclonales.
Es un mtodo de lectura rpido, que permite analizar un elevado nmero de clulas
(de 10.000 a 50.000 para cada anticuerpo monoclonal) y proporciona un registro
computarizado de los resultados. La citometra de flujo permite la determinacin de
antgenos celulares de superficie, y por tanto, tiene utilidad en el inmunotipaje de
leucemias agudas y sindromes linfoproliferativos crnicos. As mismo, permite la
cuantificacin del ADN y la determinacin de la actividad proliferativa de la poblacin
celular. La cuantificacin de ARN celular se aplica al recuento de reticulocitos.



Las clulas teidas entran en la cmara de flujo de una en una y al pasar por delante
de un haz de luz de lser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada
de acuerdo a su longitud de onda por filtros apropiados y espejos. Estas seales
luminosas son recogidas por detectores y la informacin se integra y analiza
adecuadamente por un sistema informtico.
Aplicaciones de la Citometra de Flujo
- Deteccin y cuantificacin de antgenos: La identificacin de antgenos mediante
anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos, que permiten la
identificacin y clasificacin de diferentes clulas tanto normales como patolgicas. El
isotiocianato de fluorescena (FITC), la ficoeritrina y el PerCP son los fluorocromos
ms empleados en el marcaje de anticuerpos monoclonales.
En otras reas tambin se ha demostrado su utilidad, como en la deteccin de
autoanticuerpos e inmunocomplejos, en el diagnstico de trombocitopatas adquiridas
y en la realizacin del test cruzado linfocitario.
La citometra de flujo, utilizando yoduro de propridio, tambin permite realizar
cuantificacin de clulas en apoptosis (muerte celular inducida). Esta tcnica se ha
utilizado para estudiar clulas CD4+ de pacientes VIH+ con una alta tasa de apoptosis




PRUEBAS INTRADERMICAS

La posibilidad de conocer en un husped un estado de hipersensibilidad ante una
sustancia extraa mediante la provocacin de un fenmeno local introduciendo
intradrmicamente una mnima cantidad de dicha sustancia ha sido ampliamente
estudiada investigada y utilizada como herramienta inmunolgica.

Determinados compuestos integrantes de agentes biolgicos pueden causar en el
husped un proceso que sigue exactamente el patrn normal de la respuesta inmune
bien sea esta una respuesta humoral o celular pero cuyo resultante final al confrontar
de nuevo la sustancia que origin el proceso es exagerada y en ciertos casos nociva
para el husped cayendo en un proceso que se denomina hipersensibilidad, dentro de
la cual hay varias categoras, siendo la de tipo I o inmediata y la de tipo IV o retardada
las que pueden investigarse por tal procedimiento.

Las pruebas intradrmicas que investigan la hipersensibilidad Tipo I que est mediada
por anticuerpos tipo IgE citotrpicos, se realizan con extractos derivados de cientos de
productos que puedan haber sensibilizado al husped y que al ser identificado puede
utilizarse para desensibilizarlo.

Las pruebas intradrmicas que investigan la hipersensibilidad retardada tipo IV ponen
en evidencia un fenmeno celular mediado por Linfocitos T que reconocen
especficamente la sustancia extraa y que se evidencia 48 horas despus de que
sta ha sido inoculada. Este proceso que fue descubierto por Koch en la infeccin
tuberculosa se presenta como consecuencia de algunas infecciones bacterianas,
parasitarias, micticas y algunas virales e implica un complejo proceso inmunolgico.
Koch utiliz para sus estudios un producto derivado de los cultivos del Mycobacterium
tuberculosis denominado por l Tuberculina que fue posteriormente purificado y que
se conoce como PPD (Purified Protein Derivative) por contraposicin al producto de
Koch llamado 0T (Old Tuberculine).

Una tercera categora de pruebas intracutneas la constituye las pruebas de
neutralizacin, cuyo ejemplo tpico es la prueba de Shick para la difteria. Consiste en
aplicar 1/50 de dosis mnima letal (DML) de toxina diftrica intracutneamente para
determinar si un paciente tiene o no anticuerpos anti-toxina diftrica y saber, en
consecuencia, si es susceptible o no a la difteria. En caso de tener anticuerpos y ser
resistente a la difteria, los anticuerpos neutralizan la toxina y no hay ningn fenmeno,
el paciente es Schick positivo no requiriendo por tanto vacuna; en caso contrario, la
toxina no es neutralizada produciendo a las 96 horas una pequea ulceracin. El
paciente es Schick negativo debe por tanto vacunarse. Esta prueba ya no se utiliza.

Las pruebas intradrmicas que investigan la hipersensibilidad tipo IV tienen 2 grandes
campos de aplicacin: el primero, es dentro de los estudios inmunolgicos tendientes
a establecer una adecuada respuesta celular, para ello se utilizan antgenos derivados
de los agentes con los cuales un husped ha estado normalmente en contacto y por
tanto un 70-90 de las personas daran una reaccin positiva, esas sustancias varan
segn las regiones geogrficas. En Colombia algunos estudios demuestran que
sustancias tales como: candidina, antgeno respiratorio mixto, lisado estafilococico,
son muy tiles para dichos estudios.

La segunda gran aplicacin de estas pruebas es en el estudio de algunas infecciones
en que pueden utilizarse bien como herramientas epidemiolgicas o bien como
recurso diagnstico; una prueba positiva a un determinado antgeno indica que el
paciente ha estado en contacto previo con dicho antgeno.

Las ms utilizadas en clnica son:

- Entidades micticas:
Histoplasmosis Histoplasmina
Coccidioidomicosis Esferulina
Paracoccidioidomicosis Paracoccidioidina

- Entidades parasitarias:
Leishmaniasis tegumentaria americana Reaccin de Montenegro

- Entidades Bacterianas:
Tuberculosis Tuberculina
Lepra Reaccin de Mitsuda

En la tuberculosis la reaccin de tuberculina o reaccin de Mantoux se hace positiva
luego de la infeccin o la vacunacin con BCG. La reaccin de Mitsuda tiene una
interpretacin diferente en el sentido que define un estado de no respuesta o anergia,
indicando una Lepra Lepromatosa o de hipersensibilidad indicando una Lepra
Tuberculoide.

El informe del laboratorio es:
- Reaccin positiva: formacin de una ppula indurada mayor a 0.5 mm de dimetro
- Reaccin Negativa: ninguna manifestacin hasta las 48 horas

TECNICAS INMUNOENZIMATICAS


Los ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas se basan en la habilidad de los
materiales biolgicos de adsorberse a superficies plsticas tales como poliestireno
(fase slida).

Existen diferentes maneras de configurar ELISAs, las cuales dependen de la
naturaleza de la muestra, la viabilidad de los reactivos y la precisin y sensibilidad
requeridas. En muchas situaciones, no es necesario tener una medida precisa de la
concentracin de una muestra dada, por ejemplo en el tamizaje de hibridomas o en las
pruebas de rutina para medir la presencia de aditivos en alimentos. Bajo tales
circunstancias es slo suficiente dar el resultado con un si o un no, o baja, media o alta
concentracin. Estos mtodos semi-cuantitativos requieren ser desarrollados
cuidadosamente.

El uso de la ELISA se ha incrementado por la gran disponibilidad de anticuerpos
monoclonales y de antgenos recombinantes especficos para un nmero de
enfermedades autoinmunes e infecciosas. Por medio de esta tcnica tambin se
pueden determinar niveles sanguneos de hormonas, drogas, marcadores
tumorales etc.

La prueba de ELISA est basada en la habilidad del antgeno o anticuerpo de: 1)
Adsorberse a un soporte - fase slida, manteniendo su actividad inmunolgica; 2)
Unirse a una enzima y que el complejo antgeno o anticuerpo- enzima conserven tanto
su actividad inmunolgica como su actividad enzimtica. Este mtodo es empleado
para la determinacin de antgenos o anticuerpos a partir de diferentes muestras.

Para realizar el ensayo es preciso disponer de una preparacin pura de un antgeno
(Ag) o un anticuerpo (Ac) o de ambos. El componente (Ag o Ac) se acopla a un
soporte slido como por ejemplo a placas de poliestireno, papel, perlas, etc., que
absorber una cierta cantidad de la protena; a uno de los componentes de la
reaccin, sea Ag o Ac, se le marca o conjuga con una enzima y luego se escoge el
substrato adecuado para la enzima utilizada.

Componentes de la ELISA
- Fase slida: Se puede utilizar para la fase slida: plstico, nitrocelulosa, vidrio,
celulosa, poliacrilamida, papel o dextrn.
- Conjugado: Enzima + Ag o Ac : Se conjuga o marca el Ag o Ac con una enzima.
La enzima utilizada debe ser estable, fcil de conjugar, fcil de detectar y de bajo
costo. Las enzimas ms utilizadas para las pruebas de ELISA son la fosfatasa
alcalina, la peroxidasa y la -D-galactosidasa.
- Substrato: El substrato utilizado debe producir una reaccin con un producto
coloreado fcilmente medible, tambin debe ser estable y de bajo costo. Para la
enzima peroxidasa se utiliza el substrato o-fenilendiamina (OPD) y para la enzima
fosfatasa alcalina, el substrato ms utilizado es el p-nitrofenilfosfato (pNPP).
- Solucin frenadora: Se utiliza para detener la reaccin, los ms utilizados son HCl,
H
2
SO
4
, NaOH, H
2
O, dependiendo del tipo de enzima utilizada en el conjugado.


Tipos de ELISA

Mtodos no competitivos

1- Placa cubierta con antgeno

Se conoce tambin como ELISA Indirecta para determinacin de anticuerpos. Esta
tcnica mide los niveles de Acs del paciente contra un Ag especifico. El Ag especifico
de la prueba es fijado en el soporte-fase slida. Se agrega la muestra del paciente, si
el paciente tiene Acs especficos para el Ag se forma un complejo Ag-Ac que es
detectado por un segundo anticuerpo que es una anti-gammaglobulina marcada con
una enzima. Luego es adicionado el substrato especfico para la enzima,
observndose el desarrollo del color el cual puede ser medido en un espectofotmetro.
La intensidad del color es proporcional a la concentracin de Acs en la muestra del
paciente.
Ejemplo: ELISA para VIH, Hepatitis A,B,C, Rubola, Toxoplasma, anti DNA,
Antifosfolpidos, etc.














2- Placa cubierta con anticuerpo

Se conoce tambin como ELISA Directa en la deteccin de antgeno. Esta tcnica
determina los niveles de antgeno en la muestra del paciente. Se utiliza un Ac unido a
la fase slida, estos ensayos son tambin llamados ELISA de captura o ELISA
sndwich, donde el Ag en la muestra es capturado por el anticuerpo unido a la fase
slida, luego es aadido un segundo anticuerpo especifico contra un eptope
antignico diferente marcado con una enzima. Ejemplo: ELISA para hormona
estimulante de la tiroides (TSH), gonadotropina corinica subunidad Beta (HCG),
antgeno prosttico (PSA), Inmunoglobulina E (IgE) etc.


















Mtodos competitivos
Reaccin de
color
Antgeno
Especfico
Suero con
Anticuerpos
Anticuerpos
marcados
con enzima
Adicin del
substrato
Reaccin de
color
Anticuerpo
Especfico
Suero con
Antgeno
Anticuerpos
marcados
con enzima
Adicin del
substrato
Estos mtodos hacen posible obtener una cantidad estimada de un particular
anticuerpo y antgeno, an cuando stos no pueden aislarse del medio en donde ellos
se encuentran. Ellos pueden dar una informacin til acerca de la presencia de
determinantes antignicos comunes y diferentes.

1- ELISA competitivo para detectar Antgeno

En esta prueba se aaden simultneamente la muestra del paciente con el Ag o Ac
marcado con la enzima. Luego se adiciona el substrato. Los niveles de Ag o Ac
presentes en la muestra del paciente son inversamente proporcionales a la intensidad
del color desarrollado en la reaccin.
Ejemplos: ELISA para anticuerpos anti-core VHB, niveles de Tiroxina (T4).











2- ELISA competitivo para detectar Anticuerpos










Tcnicas in situ
Tcnicas inmunohistoqumicas
Dotblot
Inmunoblot
Ensayo de ELISA en placa


WESTERN BLOT

El fundamento es la separacin por la tcnica de electroforesis en geles de
poliacrilamida (PAGE SDS) de una mezcla de protenas cargadas negativamente
gracias al uso de un detergente aninico (Dodesil sulfato de sodio SDS), donde la
posicin de cada una de ellas depende de su peso molecular. El grupo de protenas
separadas se transfiere desde el gel separador de poliacrilamida hasta una membrana
de soporte (membrana de nitrocelulosa) por capilaridad (blotting) o por corriente
elctrica, de forma que la membrana adquiere una rplica del grupo de protenas
separadas en el gel. Se puede detectar la posicin del antgeno proteico en la
membrana colocando un anticuerpo especfico y realizando tcnicas como ELISA para
detectarlo. Habitualmente se utiliza una variacin de la tcnica para detectar la
presencia de anticuerpos anti VIH en el suero de los pacientes. En este caso, se
separa una mezcla definida de protenas del VIH y se transfiere a la membrana; la
Anticuerpo
Especfico
Adicin del
substrato

Suero con antgeno +
Antgeno marcado con
enzima
Reaccin de
color
Reaccin de
color
Suero con anticuerpos
+
Anticuerpo marcado con
enzima
Antgeno
Especfico
Adicin del
substrato

membrana se incuba con el suero problema y se contina con una prueba de ELISA
para detectar dichos anticuerpos anti-VIH. La tcnica de transferir protenas de un gel
a una membrana se llama "Western blotting"

Las bandas proteicas transferidas son teidas evidenciando as su presencia y peso
molecular ya que se utilizan patrones de peso molecular. En el caso de la bsqueda
de anticuerpos contra el antgeno (Western blot para VIH) si las bandas proteicas se
tien luego de aplicada la tcnica de ELISA, significa que la muestra analizada tiene
anticuerpos contra esos antgenos protecos especficos del virus.

Se utiliza para determinar la presencia y tamao de una protena en una muestra
biolgica. En el caso del la prueba de Western blot para VIH se detectan los
anticuerpos presentes en los pacientes contra algunas de las protenas del virus. Su
aplicacin es muy amplia tanto en clnica como en investigacin.




BIBLIOGRAFIA

- Alfonso-Valds Y, Bermudez-Domnguez MI, Surez-Rodrguez O, et al.
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Colombia. 1999. 47:3
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- Guzmn MA, Iriondo M. Las pruebas cutneas en la evaluacin inmunolgica.
Serie de Notas e Informes Tcnicos. No. 15. INS 1991
WESTERN BLOT PARA VIH
SUEROS
- 21 Control positivo fuerte
- 22 Control positivo dbil
- 23 Control negativo
- 24 Suero Pte. 1 positivo
- 25 Suero Pte. 2 positivo
gp160
gp120
p66
p55
gp41
p31
p24
p17
VIH2
WESTERN BLOT PARA VIH
SUEROS
- 21 Control positivo fuerte
- 22 Control positivo dbil
- 23 Control negativo
- 24 Suero Pte. 1 positivo
- 25 Suero Pte. 2 positivo
gp160
gp120
p66
p55
gp41
p31
p24
p17
VIH2
WESTERN BLOT PARA VIH
SUEROS
- 21 Control positivo fuerte
- 22 Control positivo dbil
- 23 Control negativo
- 24 Suero Pte. 1 positivo
- 25 Suero Pte. 2 positivo
gp160
gp120
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Rostaing L, Modesto A, Cisterne JM, et al. Serologic markers of autoimmunity in renal
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Ruddy S, Moxley G: Clinical utility of assays for immune complexes and complement.
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- Mary Louise Turgeon. Immunology and Serology in Laboratory Medicine. 2d
edition. Mosby Year Book, Inc. 1996. USA.
- Wistreich, George A. Microbiology Laboratory. Prentice-Hall, Inc. 1997. USA.

UNHEATED SERUM REAGIN (USR)

Profesora Maye Bernal
Rivera

INTRODUCCIN

En la confirmacin diagnstica de las Enfermedades Infecciosas, no siempre es
posible la identificacin directa del agente etiolgico; en muchas ocasiones ser
posible llegar a la precisin diagnstica mediante la investigacin de anticuerpos
especficos en el suero de pacientes, contra componentes antignicos del agente
etiolgico , es decir, establecer un Diagnstico Indirecto. La Sfilis, una de las
Infecciones de Tansmisin Sexual (ITS) ms importante, cuyo agente etiolgico
(treponema pallidum) slo se puede observar en las fases iniciales de la enfermedad
(Sfilis primaria y Sfilis secundaria) ; para poder establecer el diagnstico en las otras
fases (latente y Sfilis terciaria) , se requiere la invesigacin de anticuerpos dirigidos
contra componentes de treponema pallidum. Aunque estos anticuerpos no son
altamente especficos , su hallazgo junto con la historia clnica bien hecha, constituye
una base importante, tanto para el diagnstico de la enfermedad, como para su
seguimiento.
La prueba de oro para el diagnstico serolgico de la Sfilis, es el VDRL; el antgeno
utilizado para la bsqueda de los anticuerpos es una preparacin artificial de;
colesterol-cardiolipina lecitina, preparada en alcohol absoluto y desarrollada por los
laboatorios de Enfermedades de transmisin sexual de los Estados Unidos (Venreal
Diseases Research Latoratories), de donde la prueba toma la sigla VDRL. La prueba
se realiza en suero calentado a 56C, para destruir factores que puedan interferir con
la reaccin. Derivadas de esta prueba, est la Rapid Protein Reagine (RPR) en la cual
el antgeno viene listo para usarse, no requiere el calentamiento del suero ni el uso del
microscopio para la visualizacin de la reaccin ya que el antgeno incorpora particulas
de carbn, que facilitan la observacin del fenmeno cuando la prueba es reactiva.
Otra prueba derivada del VDRL es la Uniheated Serum Reagin (USR) que utiliza el
mismo antgeno que el VDRL, pero suspendido en Clorhidrato de colina, que hace
innecesario el calentamiento del suerop y, viene listo para usarse . Todas la pruebas:
VDRL, RPR y USR, tienen la misma especificidad, sensibilidad e interpretacin.

OBJETIVO
Conocer y utilizar un recurso de diagnstico indirecto en el manejo clnico de una
entidad especfica : Sfilis.

MATERIALES
Antgeno USR
Suero a procesar
Suero Control Positivo
Suero Control Negativo
Solucin salina 0.9%
Lminas planas con anillo de cermica de 14 mm de dimetro
Pipetas de 0.1 ml
Agitador de Manzzinni a 180 rpm (hoja de papl con un crculo de 16 cm)
Microscopio (objetivo de 10X)

METODOS

1. Colocar 50 microlitos del suero control positivo en el primer crculo de la lmina, 50
microlitros del suero control negativo en el segundo crculo y 50 microlitos del suero
del paciente en el tercer crculo.
2. Mezclar fuertemente el antgeno de USR durante 10 segundos, con movimientos de
rotacin e inversin.
3. Adicionar 16 microlitos del antgeno mezclado a cada uno de los crculos.
4. Colocar las lminas en el agitador durante 4 minutos, a 180 rpm (manualmente
dibujar 4. un crculo de 18 centmetros de dimetro y sobre l, tomar
cuidadosamente la lmina, durante 4 minutos , con movimientos suaves y
constantes.
5. Colocar la lmina en el microscopio y leer en 10X.


LECTURA E INTERPRETACION

La ausencia de grumos se interpreta como una prueba NO REACTIVA (negativa), es
decir, ausencia de anticuerpos anti Treponema pallidum.
La presencia de grumos se lee como REACTIVA (positiva). Si los grumos son muy
tenues, la reaccin se interpreta como RECTIVA DEBIL.
Cuando la reaccin es REACTIVA O REACTIVA DEBIL, debe hacerse una prueba
cuantitativa. Para ello se hace diluciones dobles del suero (1:2,1:4,1:8, ....) hasta la
dilucin en que la reaccin se haga dbil. : Esta ltima dilucin, indica el ttulo de
reactividad y si por ejemplo corresponde a la dilucin 1:32, entonces se informa como
REACTIVA 32 DILS . Si el suero sin diluir es dbil reactivo y en la dilucin siguiente es
NO REACTIVO, la prueba se informa como REACTIVA O DILS.
Una prueba REACTIVAindica que hay anticuerpos anti pallidum es decir, que el
paciente ha estado infectado. Estos anticuerpos se negativizan con el tratamiento y
por lo tanto para el mdico constituyen un gran indicador de la efectividad o no del
tratamiento. La prueba aunque altamente sensible, no lo es tanto en especificidad y
bien puede ocurrir que en ciertas circunstancias la prueba sea REACTIVA en ausencia
de infeccin sifiltica ; esas pruebas se denominan Falsas Reactivas y debern
aclararse con pruebas confirmatorias especficas.


BIBLIOGRAFA

Guzmn MA, Sfilis Manual de Procedimientos Diagnsticos. Serie de
ublicaciones Cientficas No. 8 Insituto de Salud.