Ctedra Alicia Goyena Junio 2010

Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)

Una vieja tcnica rescatada por la tecnologa

CROMATOGRAFA

En 1906 Tswett la defini como: Mtodo en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente.

CROMATOGRAFA
I.U.P.A.C define la cromatografa de forma ms amplia como: Mtodo usado principalmente para la separacin de los componentes de una mezcla, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es mvil.

CROMATOGRAFA
La fase estacionaria puede ser un slido lquido soportado en un slido o en un gel La fase estacionaria puede encontrarse empaquetada en una columna, extendida en una capa, distribuida como una pelcula u otras

Fase
estacionaria

Fase mvil Tcnica

Proceso Adsorcin
Interc. inico Excl. molecular

Lquido Slido Gas Gas Lquido Lquido

TLC Columna Columna Columna Papel TLC Columna

Adsorcin Particin Particin (Absorcin)

Las retenciones tienen su origen en fenmenos de interaccin que se dan entre los componentes y las dos fases:

ADSORCIN Es un proceso fsico o qumico por el cual una especie qumica (tomos, iones o molculas) es retenida en puntos activos de la superficie de un material. El fenmeno queda limitado a la superficie que separa las fases (superficie interfacial)

ABSORCIN Es un proceso fsico (absorcin pura) o qumico (absorcin con reaccin qumica) en el cual una especie qumica se traslada de una primera fase a otra, incorporndose a la masa de la segunda fase. Ambos son fenmenos superficiales) msicos (no

INTERCAMBIO INICO

EXCLUSIN MOLECULAR
La separacin se basa en el tamao molecular. Se aplica especies de elevado peso molecular. Empaquetamiento
TIPO Hidroflico FASE MVIL Acuosa DENOMINACIN Filtracin en gel USADO Especies polares Especies no polares

Hidrofbico

Solventes orgnicos no polares

Permeacin en gel

Fase
estacionaria

Fase mvil Tcnica

Proceso Adsorcin
Interc. inico Excl. molecular

Lquido Slido Gas Gas Lquido Lquido

TLC Columna Columna Columna Papel TLC Columna

Adsorcin Particin Particin (Absorcin)

CROMATOGRAFA en columna

Separacin de clorofilas y xantofilas, MikhailTswett, 1913

http://www.uni-regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-CC-e.htm

PROCESO CROMATOGRFICO
MUESTRA A B

La muestra se pone en contacto con la F.E. que se va agregando Los solutos avanzan arrastrados por la F.M. con velocidad.
B A

Tiempo de Retencin = Tiempo transcurrido para la separacin de cada componente.

CROMATOGRAFA en capa fina

http://www.uni-regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC-e.htm

CROMATOGRAFA GASEOSA

CROMATOGRAFA GASEOSA

CROMATOGRAFA GASEOSA - Columnas

CROMATOGRAMA

CROMATOGRAMAS
Separacin deficiente Separacin ptima

Picos anchos (dilucin) No simtricos Separacin incompleta

Picos finos Simtricos Separacin completa

CROMATOGRAMAS
Influencia de la temperatura
Elucin isotrmica

Programa de temperaturas

CRONOLOGA
1850 - Separacin de anilinas El qumico F.F.Runge descubri que los cationes orgnicos se separaban por migracin cuando se depositaba una disolucin que los contena sobre un material poroso, como papel. 1906 - Extractos vegetales coloreados. El botnico ruso Tswett utiliz la cromatografa en columna para separar.

CRONOLOGA
El mayor desarrollo se produce a partir de 1930 - Lederer. Posteriormente los qumicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografa en el campo de la qumica orgnica e inorgnica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

CRONOLOGA
Durante la II Guerra Mundial apareci la cromatografa de intercambio inico. Finalidad: separar las tierras raras y los elementos de transicin.

Extensin mundial de los mtodos cromatogrficos a partir de 1940.

CRONOLOGA
1941 - Martin y Synge enuncian el concepto de cromatografa gas lquido. Fueron tambin los responsables del desarrollo de la cromatografa de distribucin lquido lquido y la teora de platos tericos en cromatografa (Premio Nobel) 1955 - apareci en el mercado el primer aparato comercial para cromatografa gaslquido.

CRONOLOGA
Uno de los primeros cromatogramas, Tiempo total de corrida 7 horas!

CRONOLOGA
1963-JC Giddins sienta bases tericas del desarrollo del HPLC. 1970-Introduccin de la fases silanizadas 1974-Finnigan realiza el primer sistema LC-MS 1985-Fenn introduce el electrospray

CRONOLOGA
1994- GC-MS es la tcnica predominante en MS por volumen de aplicaciones, Warner 2004- Waters saca al mercado el UPLC

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Evolucin de la cromatografa preparativa en columna

Mejoras
(selectividad y resolucin) Miniaturizacin y utilizacin de fases estacionarias muy elaboradas.

HPLC

High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography

Fases estacionarias: micropartculas esfricas 2-5 m de dimetro PRDIDA DE PRESIN IMPORTANTE EN LA COLUMNA Utilizacin de BOMBA para una fuerte presin a la fase mvil para caudal conveniente

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Hace intervenir mecanismos de intercambio solucin/fase mvil/fase estacionaria basados en los correspondientes coeficientes de reparto
El desarrollo instrumental es posterior al de la CG debido a dificultades para lograr un flujo estable en el eluyente.

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Es actualmente la herramienta ms poderosa en qumica analtica. Permite separar, identificar y cuantificar los compuestos presentes en cualquier muestra que pueda disolverse en un lquido.

Hoy pueden identificarse fcilmente componentes trazas en concentraciones menores a las ppt.

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

Las razones de la popularidad de esta tcnica son:

Sensibilidad. Determinaciones cuantitativas exactas Separacin de especies no voltiles y termolbiles. Gran aplicabilidad: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, plaguicidas, antibiticos, esteroides, gran variedad de sustancias inorgnicas

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE

HPLC puede y ha sido aplicado en todo tipo de muestra: medicamentos, alimentos, cosmticos, matrices ambientales, forenses, productos industriales, etc.

INSTRUMENTACIN

Recipiente con Fase mvil

Filtro Inyector Computadora

Bomba

Pre-columna

Control de la bomba

Columna cromatogrfica

Detector

INSTRUMENTACIN

Sistema de bombeo
Constituye el sistema de suministro de fase mvil al sistema.

Debe cumplir con los siguientes requisitos:

Generacin de presiones por encima de 6000 psi (~410 atmsferas) Proveer un flujo constante, libre de pulsos Constancia en la velocidad de flujo ( 0.1 - 10 mL/min ) Componentes resistentes a la corrosin por diversos disolventes (acero inoxidable o PEEK -PolyEtherEtherKetone)

INSTRUMENTACIN

Tratamiento de la fase mvil

Desgasificador sparging.

Filtracin

INSTRUMENTACIN

Filtros
Es imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan obstruir los canos y la formacin de burbujas que puedan deteriorar el relleno de las columnas y que produzcan inestabilidad en la seal del detector. Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran con membranas de 0,45 a 0,22 m.

INSTRUMENTACIN

Sistema de inyeccin de muestras

INSTRUMENTACIN

Sistema de inyeccin de muestras

Aguja: Aguja -largo y dimetro externos adecuados para el inyector -Dimetro interno pequeo -Punta roma Jeringa: Jeringa -Volumen : > 2 veces el Loop(

INSTRUMENTACIN

Columnas para HPLC

Tubos de acero inoxidable Longitud: 10-30cm Dimetro interno: 2-5 mm Partculas para empaquetamiento de la columna: 3 a 10 m Microcolumnas Longitud: 3-7.5cm Dimetro interno: 1-4.6 mm Partculas para empaquetamiento de la columna: 3 a 5 m Ventaja: Velocidad y mnimo consumo de fase mvil.

INSTRUMENTACIN

Columnas para HPLC

INSTRUMENTACIN

Pre-columna o guarda columna

Son usadas para aumentar la vida til de la columna analtica. Eliminan materias en suspensin, contaminantes y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Su composicin de relleno deber ser semejante al de la columna analtica. Se reemplaza cuando se contamina

Cromatografa de adsorcin
La fase estacionaria es la superficie de un slido polar finamente dividido. El analito compite con la fase mvil por los sitios sobre la superficie del empaquetamiento y la retencin se debe a las fuerzas de adsorcin. Fase estacionaria: Slice o almina Fase mvil: Solvente orgnico o mezcla.

Fase estacionaria - SLICAGEL

Polmero tridimensional de xido de silicio parcialmente hidratado SiO2nH2O

Amorfo Poroso (40-300) Gran rea superficial (100-800m2/g)

Fase estacionaria - SLICAGEL

Partculas de slice (tamao de poro, 10 nm) a)Agregado de partculas esfricas, rea superficial 150 m2/g b)Estructura esponjada, rea superficial 300m2/g.

Fase estacionaria - SLICAGEL

Partculas irregulares o esfricas Tamao : -LC 40-200 -HPLC 3 -10 -(UPLC 1.7)

Columnas monolticas de slice

Columnas monolticas de slice

Slido de gran porosidad (80%) en forma de red tridimensional, no hay partculas. Pueden ser de slicagel (Merck) o de polmeros de estireno y divinilbenceno (Dionex). Se hacen crecer en el interior de una columna.
www.chromatography.merck.de

Columnas monolticas de slice

Columna Monoltica de fase reversa, C18 de 100x 4.6 mm, 8 veces menos presin que columnas de 3y 100.000 platos/m Tiempos de anlisis menores al minuto Flujos altos, incompatibles con LCMS

REPARTO

Empaquetamientos en fase normal y en fase reversa

Cromatografa En Fase Normal En fase Reversa Fase mvil No polar Polar Fase estacionaria Polar No polar

Cromatografa de adsorcin
MODO NORMAL FASE MVIL: Hexano

MONOCAPA

Cromatografa de adsorcin

Cromatografa de reparto
La fase estacionaria es un lquido inmiscible con la fase mvil lquida Lquido-lquido: absorcin fsica Lquido-fase enlazada: enlace qumico

REPARTO

Empaquetamiento de fase enlazada

Los soportes se preparan con slice. La superficie de la slice totalmente hidrolizada est constituida por grupos silanol qumicamente reactivos. Reaccin con organoclorisilano, forman SILOXANOS

REPARTO

Empaquetamiento de fase enlazada

Estructura superficial de la slicagel

Reaccin los grupos silanol de la silicagel con un reactivo organoclorosilano

REPARTO

Empaquetamiento de fase enlazada

La retencin de los analitos es por lipofilia, es un reparto y el tiempo de retencin depende de la K de reparto

REPARTO

Aplicaciones tpicas
de cromatografa de fase enlazada. a.Aditivos de refrescos b.Insecticidas organofosforados

REPARTO

Seleccin de las fases mvil y estacionaria

Equilibrio apropiado entre las fueras intermoleculares de los tres participantes (analito, fase mvil y fase estacionaria)
Hidrocarburos teres steres Cetonas Aldehdos Amidas Aminas Alcoholes Agua

Se elige la polaridad de la fase estacionaria bastante similar a la de los analitos y para la elucin se utiliza una fase mvil de polaridad considerablemente distinta.

Aumento polaridad

REPARTO

Seleccin de las fases mvil y estacionaria

Los disolventes ms usados son: Para Fase Normal: hexano, tolueno,tetraclorurode carbono y cloroformo. Para Fase Reversa: metanol, acetonitrilo, THF, isopropanol y agua.

REPARTO

Seleccin de las fases mvil y estacionaria

Puede justificarse el hecho de que se empleen tan pocos disolventes entre los muchos orgnicos disponibles por varias razones : El precio de un gran stock para un laboratorio es costoso. La alta calidad HPLC se deteriora con el almacenamiento prolongado. Se pueden conseguir polaridades muy diversas en la optimizacin de metdicas variando convenientemente la proporcin y no la naturaleza qumica de los disolventes.

En resumen
Hay 4 modos principales de cromatografa, dependiendo de la fase estacionaria. Normal, de Adsorcin Reversa o ligada, de Absorcin o Particin Intercambio inico Exclusin de tamao Principal parmetro operativo de la separacin en cromatografa en modo normal y reverso, es el control de la fuerzade la FM

Tipos de elucin
Isocrtica: La composicin permanece constante tica Con gradiente: La composicin cambia de manera gradiente continua o escalonada.

Aplicaciones

Cromatografa de adsorcin:

especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos.
Cromatografa de reparto:

especies poco polares no inicas.

Cromatografa de exclusin por tamao:

solutos con masas moleculares superiores a 10000 u.

Cromatografa de intercambio inico:

especies inicas de masa molecular ms pequea.

Detectores

INSTRUMENTACIN

Su eleccin depende de la naturaleza del analito. Se clasifican segn la propiedad que midan, ya sea de la solucin o del soluto. Detectores universales no son indispensables Ms usados se basan en la absorcin de UV y visible. Detectores de diodos integrados.

Detectores

INSTRUMENTACIN

Detectores

INSTRUMENTACIN

HPLC/MS

HPLC/MS

Pginas web
http://www.forumsci.co.il/HPLC/topics.html#Intro http://pubs.acs.org/journals/chromatography/ www.waters.com/WatersDivision/pdfs/success.pdf http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/detc_to t.html

CROMATOGRAFA GASEOSA - Columnas

Soportes slidos Tierras de diatomeas

Soportes no diatomceos
Microbolas de vidrio (poca fase estacionaria) Tefln (poca retencin superficial de lquidos) Microbolas de polmeros orgnicos

CROMATOGRAFA GASEOSA

Unidades de presin
1 atm = 760 mmHg = 760 Torr 1 atm = 101325 Pa 1 atm = 1,01325 bar 1 atm = 10,332274527999 m c.a. (metros de columna de agua) 1 atm = 14,69594877551 PSI 1 psi = 0.06895 bar 1 bar = 14.50326 psi 1 psi = 6.8948 KPa

Unidades de presin
1 bar = 100 000 Pa = 1000 hPa = 100 kPa = 100 kN/m2 = 1,02 kg/cm2 1 atm = 1,01325 bares 1 bar 1 bar = 14,5037738 PSI 1 bar = 750,06 mm Hg 1 bar = 14,50 libras/pulgada2 (lb/in2) 1 atm = 760 mm Hg