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A EVOLUO DO DIAGNSTICO CITOGENTICO EM HUMANOS EVOLUTION OF THE CYTOGENETIC DIAGNOSTIC IN HUMAN

GRAZIELA SPONCHIADO1, JAMYLLE P.C. ALCOBAS1, LUCIANA REQUIO1, SNIA M. MORALES1, ZAOR C. JUNIOR1, MNICA LUCIA ADAM2
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RESUMO Desde a descoberta dos cromossomos e sua associao a diversos quadros clnicos, metodologias tm sido desenvolvidas em busca da acurcia diagnstica. Entre estas, a Citogentica Molecular tem se destacado pela sua versatilidade na identificao de diversas cromossomopatias e anormalidades cromossmicas em cncer. Tcnicas, como a FISH, CGH, SKY e M-FISH, combinam os conhecimentos da Biologia Celular, da Citogentica e da Gentica Molecular, levando a diagnsticos seguros na maioria dos casos. E, quando necessrio, a combinao de vrias metodologias atingem o mesmo objetivo. Porm, a utilizao destas metodologias rotineiramente em laboratrios de anlises clnicas esbarra no alto custo das mesmas, sendo, portanto, utilizadas em casos especficos ou, ainda, em pesquisas cientficas. Palavras-chave: Citogentica Molecular; FISH; CGH; SKY; M-FISH.

1 INTRODUO Pesquisas relacionadas a cromossomos tm progredido por mais de um sculo.(1) No decorrer de quatro dcadas, o papel que os cromossomos representam em doenas humanas passou a ser o interesse principal dos bilogos e dos clnicos. A Citogentica e a Biologia Molecular tm dado uma profunda contribuio, mostrando o reconhecimento e o entendimento de muitos aspectos das doenas humanas.(2) Segundo Painter(3), a primeira pessoa a estudar cromossomos humanos acreditase ter sido Arnold em 1879; j outros propem o nome Hansemann em 1891. Primeiramente, acreditava-se que o nmero de cromossomos humanos fosse 48. Porm, o exato
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nmero de cromossomos nas clulas somticas foi determinado por Tjio e Levan(4), em 1956, utilizando cultura de clulas provenientes de tecido de pulmo fetal. Em 1960, a adio de fitoemaglutinina s culturas de linfcitos do sangue demonstrou que a mesma estimulava a diviso celular (isto mitoses), aumentando assim significantemente o nmero de metfases.(5,6) Estes estudos melhoraram a anlise dos cromossomos humanos e levou concluso de que a anlise destes era indispensvel no estudo de doenas humanas, aps a visualizao de uma cpia extra do cromossomo 21 (isto , trissomia) nos pacientes portadores da Sndrome de Down. Outras trissomias foram encontradas e ligadas a determinados fentipos como Sndrome de Patau (cromossomo 13) e

e-mail: grazi_s@uol.com.br e-mail: mladam@yahoo.com

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Ps-graduados em Biologia Molecular no Centro Universitrio Positivo UnicenP. Curitiba PR. 2 Professora de ensino superior e Mestre em Cincias Biolgicas A/C: Gentica Humana pela UNESP-Botucatu. Professora titular da disciplina de Citogentica Molecular Ps-graduao em Biologia Molecular no Centro Universitrio Positivo UnicenP. Curitiba PR.

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Sndrome de Edwards (cromossomo 18).(7) Um outro marco foi a descoberta do cromossomo Filadlfia e sua associao com a Leucemia Mielide Crnica(8), que impulsionou o campo da Citogentica do cncer. Em 1970, a introduo e o sucesso da aplicao de vrias tcnicas de colorao levaram ao conhecimento dos diversos padres de bandamento dos cromossomos, tais como o GTG, CBC entre outros. O bandamento melhorou com preciso a anlise cromossmica(9,10), permitindo a anlise de muitos tecidos e doenas diferentes. A metodologia de alta resoluo das bandas GTG tornou possvel a deteco de delees e translocaes pequenas nos cromossomos.(11) At a chegada das tcnicas de Citogentica Molecular, no ano de 1980, a anlise cromossmica era baseada no estudo das bandas cromossmicas produzidas pelos mtodos de colorao at ento conhecidos. Porm, estas metodologias no eram precisas nos discernimentos da origem dos cromossomos envolvidos em rearranjos complexos, como translocaes envolvendo vrios cromossomos, comumente encontrados em tumores slidos e leucemias. A evoluo das tcnicas de Citogentica Moderna, incluindo a Molecular, vieram ao encontro do melhoramento do diagnstico das aberraes cromossmicas.(7,12) Em funo dos recentes avanos nas metodologias citogenticas, objetivou-se descrever de maneira sucinta a evoluo de tais metodologias, bem como seus princpios e aplicaes, visando introduzir os conhecimentos bsicos utilizao das mesmas.

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usada para detectar regies especficas do DNA, e elucidar, assim, anormalidades at mesmo em nvel de gene.(7) Em contraste, a tcnica de Hibridizao Genmica Comparativa (CGH) separa os desequilbrios do genoma inteiro, principalmente em tumores slidos, identificando ganhos e perdas cromossmicas, usando diferencialmente o DNA do tumor marcado e o DNA normal.(14) O Caritipo Espectral (SKY) a tcnica que combina a anlise convencional dos cromossomos com a especificidade do FISH. Pode ser usado para identificar cromossomos marcadores e detectar translocaes telomricas, e rearranjos complexos observados tambm em cncer.(15) A FISH-multicolor (M-FISH) a tcnica de SKY, mas com a utilizao de clones de cromossomos artificiais de leveduras.(13) Ambas as tcnicas possibilitam a colorao diferencial de cada par cromossmico. 2.1 Hibridizao in situ A hibridizao in situ proporciona a interao dos conhecimentos da Biologia Celular, da Citogentica e da Gentica Molecular.(16) A Hibridizao in situ refere-se a procedimentos que demonstram as seqncias especficas de DNA e RNA diretamente em preparaes cromossmicas (in situ). Este mtodo foi descrito por Gall e Pardue (1969).(17) Uma vez que a resoluo relativamente boa (aproximadamente 12x107 pares de bases), pode ser determinada a localizao regional exata de uma seqncia em seu cromossomo correspondente.(18,19) Originalmente, utilizavam sondas (segmentos de DNA conhecidos) marcadas radioativamente. Atualmente, os protocolos utilizam sondas no radioativas que apresentam vantagens, como a alta resoluo, menor tempo de processamento, estabilidade e riscos menores na manipulao.(20) 2.1.1 Princpio da Hibridizao in situ As clulas em metfase ou intrfase so fixadas em uma lmina e desnaturadas para converter o filamento duplo de DNA em filamento simples. A preparao metafsica ou

2 TCNICAS DE CITOGENTICA MOLECULAR Os avanos recentes em procedimentos de Citogentica Molecular permitiram a deteco dos rearranjos cromossmicos sutis, que eram indetectveis pela anlise convencional do bandamento GTG.(13) A tcnica de Hibridizao Fluorescente in situ (FISH)

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2.2 FISH A tcnica de FISH (Fluorescent in situ Hybridization) tornou-se o mtodo mais promissor dentro da Citogentica nos ltimos anos. Os segmentos de DNA ou RNA, quimicamente modificados, so utilizados como sondas e reconhecem especificamente um nico par cromossmico (Chromosome Especifc Probe ou CSP), regies especficas, tais como: centrmeros (alfa satlites especficos) e telmeros ou at mesmo um loco stio especfico.(21) O comprimento individual das sondas pode variar de poucos pares de base (oligonucleotdeos sintticos) at acima de 1 Mpb (YACs). Sondas contendo elementos repetitivos, usadas para detectar regies heterocromticas e centromricas de cromossomos individuais, so particularmente teis na investigao de aberraes cromossmicas numricas. O grande tamanho do alvo proporciona a deteco eficiente e permite a anlise rapidamente. J as sondas de cpia nica podem ser clonadas em diferentes sistemas vetores (plasmdios, fagos, cosmdios, P1, BACS e YACs) que permitem variaes no tamanho do inserto de 100pb at 1 Mpb.(22)

2.2.1 Princpios da FISH Esta tcnica baseada na descoberta de Gall e Pardue(17), e John, Brirnstiel e Jones(24), que marcaram o RNA ribossomal hibridizado aos cromossomos acrocntricos. A FISH envolve uma marcao fluorescente de sonda de DNA que hibridiza com a seqncia do DNA genmico. Inicialmente, os istopos radioativos foram usados para a tcnica, entretanto, o uso dos fluorocromos mais seguro, requer uma reao mais curta e pode proporcionar cores diferentes.(7) 2.3 Hibridizao Genmica Comparativa (CGH) A tcnica de Hibridizao Genmica Comparativa (CGH) proporciona uma alternativa para os estudos de Citogentica Molecular, por no depender do conhecimento prvio de regies genmicas freqentemente afetadas e de clulas em metfase do tecido em estudo. Dentro do seu limite de resoluo, ela permite a deteco de perdas e ganhos de DNA, considerando-se o genoma como um todo. Esta tcnica requer apenas a obteno de DNA das clulas a serem investigadas e, desta forma, uma abordagem que apresenta vantagens nas investigaes de desequilbrios genmicos, especialmente em tumores slidos.(25) A metodologia original de CGH foi descrita por Kallioniemi et al. (14) e, a partir de ento, vrios autores a modificaram, com o objetivo de otimizar as aplicaes referentes ao isolamento e amplificao in vitro do DNA genmico, marcao diferencial do DNA, preparao de metfases de referncia e anlise de imagens.(26,27,28,29,30,31)

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interfsica , ento, hibridizada com seqncias de DNA que so complementares ao segmento de interesse e que tenham sido marcadas com biotina (Ib), um hapteno enzimtico que possibilita a deteco por anticorpos especficos dos segmentos marcados.(2) O stio de hibridizao torna-se visvel por meio deste anticorpo primrio contra a biotina, o qual est ligado a um fluorocromo, por exemplo, isotiocianato de fluorescena (FITC-fluorescein isoticyamate). Se o sinal primrio for muito fraco, um anticorpo secundrio (p. ex. avidina) fixado biotina. Um anticorpo primrio adicional pode ser fixado ao anticorpo secundrio, amplificando o sinal, que pode, ento, ser visualizado pelo brilho fluorescente ao microscpio ptico de fluorescncia.(18,19) Sondas de todos os 24 cromossomos humanos podem ser hibridizadas na metfase para cada seqncia de DNA de cada cromossomo, induzindo imagens coloridas diferentes.(18)

A FISH permite a identificao de anormalidades cromossmicas, diretamente em clulas interfsicas, obtidas a partir de suspenses, de tecido congelado ou fixado e emblocado em parafina, alm da anlise em preparaes cromossmicas. Desta forma, so inmeras as aplicaes da tcnica de FISH nos estudos citogenticos para identificao de cromossomopatias (principalmente de microdelees e marcadores).(23)

2.3.1 Princpios da CGH CGH um procedimento baseado em duas cores, ou seja, uma hibridizao in situ por fluorescncia competitiva entre amostras de DNA tumoral (por exemplo, marcado com biotina, fluorescncia verde) e normal (por exemplo, marcado com digoxigenina, fluorescncia vermelha) marcadas diferencialmente, em metfases normais de linfcitos de sangue perifrico, estimulados por fitoemaglutinina. As amostras do tumor e do DNA normal so combinadas, em adio ao DNA Cot-1 (frao de seqncias genmicas altamente repetitivas do DNA) no marcado na mistura de hibridizao, o qual suprime as seqncias repetitivas que esto presentes em ambos os genomas, pois a hibridizao das seqncias repetitivas pode prejudicar a avaliao das seqncias nicas que esto excessivamente ou pouco representadas.(13) Utiliza-se, ento, um contracorante como DAPI, que tem fluorescncia azul. Se ocorrerem ganhos ou perdas de seqncias de DNA tumoral, notase uma variao na razo de fluorescncia verde : vermelho com a utilizao de um Software apropriado para anlise.(22) 2.4 FISH Multicolor (M-FISH) e Caritipo Espectral (SKY) Novos avanos foram dificultados pelas barreiras tcnicas, na aquisio e registro das imagens nos experimentos de FISH multicoloridos, pois o nmero de fluorocromos, apresentando espectros de emisso distintamente separados, era limitado, o que impedia o registro inequvoco das imagens.(22) Em 1996, duas tcnicas novas relataram a identificao dos cromossomos humanos com 24 cores diferentes. A primeira foi denominada de M-FISH (Multitarget, Multifluor, Multicolor ou Muitiplex-FISH).(32) e a segunda de SKY (Spectral Kariotyping).(13) Apesar de as duas tcnicas identificarem, em um nico experimento de FISH, todos os cromossomos humanos em diferentes cores, elas so fundamentalmente diferentes.(22)

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2.4.1 SKY- Cariotipagem espectral A tcnica de SKY utiliza um novo mtodo ptico, baseado em uma nica exposio atravs de um filtro triplo e anlise espectroscpica, permitindo a anlise de todo o genoma e a visualizao instantnea do espectro de emisso definido para cada cromossomo humano. A anlise espectral no dependente da intensidade do sinal, mas apenas da imagem espectral criada pela marcao combinatria da sonda.(13,33) A SKY, assim, combina a espectroscopia de Fourier, sistema de imagem Chargecoupled Devise (CCD) e o microscpio de epifluorescncia. A emisso espectral de todos os pontos na amostra medida simultaneamente na amplitude espectral visvel e prxima ao infravermelho. Vinte e quatro sondas marcadas com cores diferentes, de maneira combinatria e especfica para cada tipo cromossmico, so hibridizadas em uma metfase aps desnaturao do DNA. Os espectros de emisso das combinaes individuais dos fluorforos so convertidos em um espectro de cores diferentes mostradas pela marcao das cores azul, verde e vermelho para especificar a amplitude espectral dos comprimentos de onda fluorescente. O caritipo espectral, portanto, composto de uma falsa cor especfica para cada tipo de cromossomo. A cariotipagem espectral tem um amplo espectro de aplicao diagnstica na anlise das alteraes cromossmicas estruturais constitucionais e Citogentica do cncer.(18) 2.4.2 M-FISH Com esta tcnica, conjuntos de sondas de DNA especficas para os cromossomos, cada uma marcada com sua prpria combinao de corantes fluorescentes de ligao ao DNA, so hibridizados com os cromossomos metafsicos. Para cada tipo cromossmico construdo um cdigo de barra multicolorido especfico, usando-se dife-

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3 DISCUSSO Os avanos das tcnicas de Citogentica Molecular melhoraram as possibilidades diagnsticas. Porm, mesmo tcnicas mais refinadas nem sempre so resolutivas em todos os casos. Por exemplo, a tcnica de FISH tem como limitao a no identificao dos rearranjos cromossmicos pequenos, perdas e ganhos de DNA e tem a necessidade do conhecimento ou incio da origem do rearranjo para a seleo da sonda adequada. J na tcnica de CGH, os rearranjos cromossmicos como translocaes recprocas ou inverses no podem ser detectados e h dificuldade em detectar mosaicismos. A segurana e a sensibilidade desta metodologia estritamente dependente da homogenidade das amostras de DNA isoladas. Se a amostra de DNA contm mais de 50% de clulas no tumorais (estroma normal), as alteraes em clulas espordicas ou em baixas freqncias, incluindo monossomias e trissomias, escapam da deteco. Assim, as anlises de clulas tumorais obtidas de reas histopatologicamente definidas, atravs de mtodos de microdissecao, mais promissora. Contudo, esta tcnica permite a localizao de seqncias em excesso ou ausentes no genoma tumoral e tambm serve de triagem para aberraes no balanceadas. Uma outra vantagem desta tcnica que ela s depende do DNA da amostra tumoral e no de preparaes cromossmicas prvias e pode detectar delees de 10-20Mb.

4 CONCLUSO A tcnica de FISH, mesmo com um custo mais elevado que as tcnicas de Citogentica Convencional, atualmente tem sido utilizada em laboratrios com fins diagnsticos. Em contrapartida, as tcnicas de SKY e M-FISH tm um alto custo para serem utilizadas em diagnstico e so utilizadas apenas em pesquisas cientficas. Junto com outros mtodos como bandamento GTG e anlises moleculares tradicionais, a Citogentica Molecular vem ao encontro do aumento significativo da quantidade de informao que pode ser gerada de um espcime. Portanto, estes processos so complementares e, quando utilizados em combinaes adequadas aos intuitos diagnsticos, podem identificar anormalidades no detectadas pela anlise Citogentica Convencional sozinha.

REFERNCIA 1 Waldeyer W. Karyokinesis and its relation to the process of fertilization. Q J Micro Sci. 1890; 30:159-281. 2 Verma RS, Babu A. Human Chromosomes: Principles and Techniques. 2nd ed. McGrawHill, 1995. 3 Painter TS. Studies in mammalian sperma togenesis II. The spermatogenesis of man. J Exp Zool.1923; 37:291-336.

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rentes clones de YAC (cromossomos artificiais de levedura) contendo sondas de DNA a serem aplicadas. Somente cinco diferentes fluorforos so necessrios para a anlise da imagem pelo microscpio de epifluorescncia, usando-se uma cmera (CCD-charge-coupled device), com dispositivo de carga acoplada para gerar uma imagem composta de cada cromossomo em uma visualizao pseudocolorida por Software apropriado. O caritipo formado dessa maneira composto de 22 pares de autossomos e o X e o Y em cores diferentes.(18)

As limitaes encontradas na tcnica de SKY so que, alm de necessitar de preparaes cromossmicas, ou seja, um cultivo celular prvio, esta metodologia tambm no identifica com segurana rearranjos como microdelees ou rearranjos muito pequenos, inverses, duplicaes e delees, sendo necessria a confirmao por FISH. Porm, esta tcnica possui uma vantagem de se obter os resultados em um nico experimento, usando sondas para cada cromossomo individual e tambm permite a identificao da origem de marcadores cromossmicos.

4 Tjio JH, Levan A. The Chromosome Number in Man. Hereditas. 1956; 42: 1-6. 5 Moorehead PS, Nowell PC, Mellman WJ, Battips DM, Hungerford DA Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res. 1960 Sep;20:613-6. 6 Nowell PC. Phytohemagglutinin: an initiator of mitosis in cultures of normal human leukocytes. Cancer Res. 1960 May; 20:462-6. 7 Mcneil N, Ried T. Novel molecular cytogenetic techniques for identifying complex chromosomal rearrangements: technology and applications in molecular medicine. Exp Rev Mol Med. [peridico on line} 2000 Set [capturado 2004 Out 06]:[14telas} Disponvel em: http:// www.ermm,cbcu.cam.ac.uk/00001940h.htm. 8 Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 1973 Jun1; 243(5405):290-3. 9 Seabright M. Human chromosome banding. Lancet. 1972 Apr 29; 1(7757):967. 10 Caspersson T, Zech L, Johansson C. Diffe rential binding of alkylating fluorochromes in human chromosomes. Exp Cell Res. 1970 Jun; 60(3):315-9. 11 Yunis JJ. High resolution of human chromosomes. Science. 1976 Mar 26;191(4233): 1268-70. 12 Bernard OA, Berger R. Location and Function of Critical Genes in Leukemogenesis Inferred From Cytogenetic Abnormalities in Hematologic Malignancies. Sem Hema. 2000 Oct.; 37(4):412-19. 13 Schrck E, du Manoir S, Veldman T, Achoell B, Wienberg J, Ferguson-Smith MA et al. Multicolor spectral karyotyping of human

chromosomes. Science. 26;273(5274): 4947.

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14 Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science. 1992 Oct 30;258(5083):818-21. 15 Veldman T, Vignon C, Schrock E, Rowley JD, Ried T. Hidden chromosome abnormalities in hematological malignancies detected by multicolor spectral karyotyping. Nat Genet. 1997 Apr;15(4):406-10 16 Spectror DL, Goldman RD, Leinwand LA. Fluorescence in situ hybridization to DNA. In: Sub cellular localization of genes and their products. Cells. Cold Spring Harbor Laboratory Press -N.Y. 1998a; 3:111.11-111.45. 17 Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 Jun;63(2):378-83. 18 Passarge E. Cromossomos. In: Passarge E.Gentica Texto e Atlas. 2nd ed. Porto Alegre- RG :Artmed, 2004:192. 19 Pasternak JJ. Tecnologia do DNA recombinante. In: Pasternak JJ. Gentica Molecular Humana: Mecanismos das doenas hereditrias. Barueri-SP: Manole, 2002:130-31. 20 Nederlof PM, Robinson D, Abuknesha R, Wiegant J, Hopman AH, Tanke HJ et al. Three color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequence. Cytometry. 1989 Jan;10(1):20-7. 21 Bhler EM. Molecular approaches to cytogenetics. In Molecular Aspects of Human Genetic, England. 1989; 1:135-46. 22 Rogatto SR., Rainho CA. Citogentica Molecular. In: Rogatto SR. Citogentica sem

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Risco: Biossegurana e Garantia de Qualidade. Departamento de Gentica, Instituto de Biocincias. Universidade Estadual Paulista: Botucatu-SP, 2000: 133-49 23 Hopman AHN, Rumaekers FCS, Vooijs GP. lnterphase cytogenetics of solid tumors. In: In Situ Hybridization. Oxford Science Press. NY. 1992; 8:165-86. 24 John HA, Birnstiel ML, Jones KW. RNADNA hybrids at the cytological level. Nature. 1969 Aug 9;223(206):582-7. 25 Spectror DL, Goldman RD, Leinwand LA. Comparative genomic hybridization. In: Subcellular localization of genes and their products. Cells. Cold Spring Harbor Laboratory Press -N.Y. 1998b; 3:112.1-112.11. 26 Speicher MR, du Manoir S, Schrock E, Hol tgreve-Grez H, Schoell B, Lengauer C et al. Molecular cytogenetic analysis of formal infixed, paraffin-embedded solid tumors by comparative genomic hybridization offer universal DNA-amplification. Hum. Mol Genet. 1993; 2:11907-14. 27 Isola J, De Vries S, Chu L, Ghazvini S, Waldman F. Analysis of changes in DNA sequence copy number by comparative genomic hybridization in archival paraffin-embedded tumor samples. Am J Pathol. 1994 Dec;145(6):1301-8. 28 Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Piper J, Isola J, Waldman FM, Gray JW et al. Optimizing comparative genomic hybrization for analysis of DNA sequence copy number changes in solid tumors. Genes Chromosomes Cancer. 1994 Aug;10(4):231-43. 29 Lundsteen C, Maahr J, Christensen B, Bryndorf T, M, Lichter P et al. Image analysis in comparative genomic hybridization. Cytometry. 1995 Jan 1;19(1):42-50.

30 Piper J, Rutovitz D, Sudar D, Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Waldman FM et al. Computerimage analysis of comparative genomic hybridization. Cytometry. 1995 Jan 1; 19(1):10-26. 31 James L, Varley J. Preparation, labeling and detection of DNA from archival tiddue sections suitable from comparative genomic hybridization. Chromosom Res. 1996; 4:1634. 32 Speicher MR, Ballard SG, Ward DC. Ka ryotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nat Genet. 1996 Apr;12(4):368-75. 33 Macville M, Veldman T, Padilla-Nash H, Wangsa D, Obrien P, Schrock E et al. Spectral Karyotyping, a 24-colours FISH technique for the identification of chromosomal rearrangements. Histochem Cell Biol. 1997 Oct-Nov;108(4-5):299-305.

ABSTRACT Since the discovery of the chromosomes and its association with diverse clinical features, methodologies have been developed in search of diagnostic accuracy. Among these, the Molecular Cytogenetic has detected versatility in the identification of diverse chromosompathis and chromosomal abnormalities in cancer. Techniques as the FISH, CGH, SKY and M-FISH combine the knowledge of Cellular Biology, Cytogenetic and the Molecular Genetics, taking to safe diagnostics in the majority of the cases. And, whenever necessary, the combination of some methodologies reaches the same objective. However, these methodologies routinely can not be used in laboratories of clinical analyses, because of their high cost. These methodologies have been used in specific cases or scientific research. Key words: Molecular Cytogenetic; FISH; CGH; SKY; M-FISH.

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