UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Trabalho acadmico apresentado disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paran.

CURITIBA 2008

SUMRIO

1- INTRODUO................................................................................................ 1.1- MEIOS DE CULTURA..............................................................................

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2- DIVERSIDADE MICROBIANA........................................................................ 7 3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SLIDO........................................................... 13 3.1- TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS........................................... 13

3.2- TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO............................. 14 3.3- TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO........................... 16

3.4- TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE................................ 17 4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LQUIDO......................................................... 5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO..................................................... 6- CULTURAS PURAS DE BACTRIAS........................................................... 7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS.................................................. 17 18 21 21

8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS................................................................. 23 9- CULTURAS PURAS DE ALGAS.................................................................... 23 10- OUTRAS TCNICAS.................................................................................... 23

11- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................. 25 12- ANEXOS....................................................................................................... 27

1- INTRODUO

Isolamento consiste na obteno de culturas puras que envolvem somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de uma colnia atravs da observao da produo de determinado produto ou da morfologia da colnia (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Apesar de existir a possibilidade de utilizar microrganismos geneticamente modificados, ainda possvel encontrar uma grande variedade de novos microrganismos no meio ambiente, sendo que muitos podem ser at comercialmente interessantes. A primeira etapa para a utilizao de um microrganismo de interesse industrial muitas vezes a etapa de isolamento de uma colnia. Normalmente, as colnias de microrganismos se originam somente de uma clula ou esporo de microrganismo. Essas colnias apresentam caractersticas morfolgicas diferentes, as quais permitem a distino entre os microrganismos, como mostra a Figura 1. No entanto, para conseguir uma visualizao das colnias independentes no meio slido, necessrio a distribuio uniforme das bactrias sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2006)

Figura 1- Morfologia de colnias bacterianas

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o microrganismo de interesse est presente de forma homognea denominada cultura axnica. Um cultivo desse tipo d oportunidade de investigao de

caractersticas fisiolgicas e genticas sem a interferncia de outros microrganismos e em uma densidade populacional muito maior do que a encontrada em amostras de meio ambiente. No entanto alguns fatores podem ser alterados justamente por esse motivo, pois no meio ambiente ocorre uma interao entre diversas espcies e nutrientes, podendo, por exemplo, modificar o formato, a textura e a colorao de colnias (OGUNSEITAN, 2005). O isolamento, assim como todo o processo que ir se desenvolver futuramente, deve ser o mais econmico possvel, levando-se em considerao a produtividade que ser obtida pelo microrganismo e os gastos necessrios para isolamento de tal microrganismo. Fatores importantes na escolha de um microrganismo so as suas caractersticas nutricionais, pois se almeja obter microrganismos que utilizem substratos baratos, que podem ser obtidos atravs da formulao adequada do meio de isolamento; a temperatura tima, pois organismos com temperatura tima de 40C para cima facilitam o isolamento e reduz os custos de resfriamento do fermentador; ser compatvel com o fermentador utilizado e com o processo de cultivo desejado; e deve ser geneticamente estvel, ou quando se deseja a manipulao gentica devem ser conhecidos os melhores mecanismos (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Os microrganismos isolados podem ser obtidos a partir de ambientes naturais ou a partir de bancos de cepas. Esses centros de cepas, como os mostrados na Tabela 1, podem fornecer microrganismos de caractersticas j conhecidas, mas nem sempre esto presentes os melhores caracteres desejados, enquanto o ambiente possui uma infinidade de variaes. Os bancos de culturas tm como funo o armazenamento, a preveno de eventuais mudanas nas suas caractersticas, o ensino e a pesquisa sobre manuteno e caracterizao de cepas (ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988). Pode ser mais barato comprar uma cultura do que isol-la da natureza, mas tambm pode ser que se encontre um organismo muito melhor depois de uma procura extensa no meio ambiente. Mas geralmente necessrio utilizar uma cepa dos bancos como uma referncia para comparao com novos microrganismos descobertos atravs do isolamento da natureza (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

Tabela 1 Principais centros de coleo de culturas

Fonte: ROITMAM, TRAVASSOS e AZEVEDO, 1988.

O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o microrganismo desejado, podendo variar desde solo at guas, ar, lodo, alimentos ou rgos. Caractersticas que um determinado organismo possui para se

desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no processo de isolamento. Presso seletiva muitas vezes utilizada no isolamento de microrganismos que se desenvolvem preferencialmente em determinado substrato, na presena de certos compostos ou no cultivo sob condies que so adversas a outros microrganismos que no so de interesse. Quando no possvel fazer uso da presso seletiva, utilizam-se caractersticas detectveis como morfologia (tipo e forma da colnia) ou produo de compostos caractersticos de determinada espcie (como, por exemplo, a produo de antibiticos por estreptomicetos) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

1.1- MEIOS DE CULTURA

Para fazer o isolamento de um microrganismo, deve-se empregar o meio de cultivo mais adequado para o seu desenvolvimento. O meio de cultura um material nutriente preparado em laboratrio cuja utilizao importante para o crescimento, transporte e estocagem de microrganismos. No preparo do meio muitas vezes emprega-se o ambiente natural como modelo de composio, pois os requerimentos nutricionais dos microrganismos refletem o tipo de ambiente onde ele encontrado (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Os meios de cultivo podem ser classificados em: meios sintticos (quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintticos so aqueles em que a composio qumica exata conhecida. Alguns microrganismos necessitam de um meio definido com muitos fatores necessrio para o crescimento e so denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios quimicamente definidos so utilizados normalmente em trabalhos experimentais em laboratrios ou para o crescimento de seres autotrficos (TORTORA et al., 2006). J os meios complexos so aqueles que apresentam algum componente que tem uma composio varivel. Nesse caso esto includos extratos de leveduras, de carne, de plantas ou produtos da digesto protica como peptonas. Quando o meio complexo est na forma lquida chamado de caldo nutriente e quando est na forma solidificada chamado de gar nutriente. Esses meios so utilizados normalmente para bactrias heterotrficas e fungos (TORTORA et al., 2006). Meios complexos tambm so usados quando no as necessidades nutricionais de um

microrganismo em particular no so conhecidas e, portanto, um meio definido no pode ser construdo (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). No caso de microrganismos anaerbios deve-se utilizar um meio especial denominado meio redutor. Eles contm reagentes como o tioglicolato de sdio que capaz de se combinar com o oxignio dissolvido, eliminando-o da cultura (TORTORA et al., 2006). Meios de cultivo que propiciam o desenvolvimento de vrios tipos de microrganismos so chamados de meios de uso geral, como o tryptic soy broth. Quando esses meios so complementados com algumas substncias de forma a fortific-lo, temos ento um meio enriquecido. Quando h substncias que favorecem o crescimento de determinado organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a serem chamados de meios seletivos. Nesses meios h componentes como sais de bile e cristal violeta (inibem o desenvolvimento de bactrias gram-positivas), substratos degradados somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibiticos (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Os meios de cultivo tambm podem ser diferenciais quando possvel distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. Por exemplo, no gar sangue possvel separar bactrias hemolticas (que formam um halo ao seu redor) de no-hemolticas (que no formam halo), ou no gar MRS com corante azul de anilina, onde as bactrias lcteas iro ficar azuladas e outros microrganismos no. Tambm existem os meios de enriquecimento, que so utilizados no isolamento de bactrias presentes em pequeno nmero junto com outras que esto em grande quantidade. Ele semelhante ao meio seletivo, sendo que a diferena que o microrganismo a ser cultivado est em pequena quantidade e seu crescimento deve ser estimulado (TORTORA et al., 2006). A tabela 2 resume todos esses meio e em que ocasies eles devem ser utilizados.

Tabela 2- Meios de Cultura Tipo Quimicamente definido Complexo Redutor Seletivo Finalidade Crescimento de quimioautotrficos e autotrficos e anlises microbiolgicas. Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotrficos. Crescimento de anaerbios obrigatrios. Impedir o crescimento de microrganismos no desejados; favorecer o crescimento do organismo de interesse. Diferencial Diferenciar colnias do organismo de interesse dos outros microrganismos. Enriquecimento Semelhante ao seletivo, mas com a caracterstica importante de aumentar o nmero de bactrias de interesse tornando-a detectvel. Fonte: TORTORA et al., 2006.

2- DIVERSIDADE MICROBIANA

O termo diversidade, no contexto biolgico, define a multiplicidade de formas presente em um sistema, sendo que muitas vezes essas diferentes formas s ficam aparentes atravs da utilizao de ferramentas especializadas de observao. Essas ferramentas podem ir desde a visualizao atravs de microscpio ou at uma anlise em nvel molecular. No entanto, mesmo com toda a tecnologia disponvel, no possvel obter uma informao completa sobre todos os microrganismos presentes em uma amostra de ambiente, devido inadequao de certos microrganismos s tcnicas de recuperao, isolamento e cultivo utilizadas atualmente. Esses microrganismos no cultivveis ainda so metabolicamente ativos e so chamados de viveis, mas no cultivveis (VBNC viable but non-culturable) ou de somniclulas ou dormentes no-esporuladas. Portanto, muitos microrganismos presentes na natureza ainda no formaram colnias viveis sob condies laboratoriais e somente 10% (ou menos) passvel de ser cultivado em laboratrio. A figura 2 esquematiza os microrganismos possveis de serem cultivados (ativos, danificados e dormentes) e aqueles no-cultivveis (VBNC, inativas, e mortas) (OGUNSEITAN, 2005).

Figura 2- Estados fisiolgicos dos microrganismos e possibilidade de cultivo

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Para os organismos cultivveis, ainda pode haver uma diferena na sua atividade na natureza e sob condies laboratoriais. Por exemplo, as cianobactrias Trichodesminium so capazes de formar colnias em laboratrio, mas na natureza so encontradas somente na forma individualizada. A maioria das tentativas de isolamento tenta proporcionar uma condio balanceada de nutrientes como fonte de carbono, condies timas de temperatura, pH, presso de oxignio e umidade. Algumas espcies requerem tambm fatores de crescimento, sendo que alguns deles podem estar sendo produzidos por outras espcies que convivem junto no meio ambiente. A simulao de um ambiente natural um bom comeo para o isolamento e cultivo desses microrganismos. (OGUNSEITAN, 2005) Devido grande diversidade de microrganismos presentes no meio ambiente, possvel encontrar numa amostra ambiental caractersticas nutricionais variadas, as quais definem o tipo de meio de isolamento a ser utilizado. Pode-se fazer uma distino com relao s fontes de energia, fontes de carbono e os oligoelementos.

A figura 3 mostra as diferentes combinaes dessas caractersticas e a classificao dos microrganismos com relao a elas.

Figura 3- Classificao de microrganismos de acordo com as fontes utilizadas

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Meios de cultivo seletivo ou condies seletivas de incubao podem ser usados para estreitar a variedade de espcies em uma comunidade microbiana. O uso de meios enriquecidos com determinado substrato limitante possibilita um maior crescimento de determinadas espcies em detrimento de outras. Por exemplo, Beijerinck isolou espcies de Rhizobium de ndulos de razes atravs do enriquecimento por substratos nitrogenados limitantes; estudos recentes usando enriquecimento tambm conseguiram descobrir espcies capazes de metabolizar molculas xenobiticas e antropognicas de poluentes. A tcnica de enriquecimento tambm pode ser chamada na literatura de bioaugmentation ou molecular breeding (OGUNSEITAN, 2005). As interaes entre microrganismos no ambiente podem ser muito importantes, e, quando no se deseja utilizar somente um microrganismo isolado, pode-se fazer uso de dois tipos de culturas: culturas de populaes mistas ou culturas de comunidades microbianas. A primeira consiste na combinao de duas

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ou mais culturas puras enquanto exclui outros microrganismos, pois feito em condies asspticas. Culturas de comunidades microbianas j incluem interaes entre fatores biticos e abiticos, podem ocorrer variaes da composio das espcies microbianas devido a essas condies. Elas so mantidas em microcosmos que so estruturados para incubar amostras naturais em laboratrio, sendo importantes na investigao de como mudanas ambientais tem reflexo na diversidade microbiana. (OGUNSEITAN, 2005) H uma grande diversidade de populaes microbianas, sendo que em cada ambiente ser encontrado um nicho diferente. Pequenas distncias como milmetros no solo podem ter uma condio de oxignio, luz e nutrientes diferente que propicia o desenvolvimento de variados microrganismos. A tabela 3 mostra a quantidade de microrganismos estimada no solo dependendo da profundidade estudada. Esse nmero no certo, pois no possvel isolar em uma placa para contagem todos os tipos de microrganismos presentes na natureza (TORTORA et al., 2006).

Tabela 3- Microrganismos por grama de um solo tpico de jardim em vrias profundidades. Profundidade (cm) Bactrias Actinomicetos* Fungos Algas** 3-8 20-25 35-40 65-75 135-145
* Bactrias filamentosas ** Algas encontradas em grandes profundidades no so ativas metabolicamente, mas foram introduzidas por drenagem ou movimentos mecnicos.

9.750.000 2.080.000 2.179.000 245.000 570.000 11.000 1.400 49.000 5.000 -

119.000 25.000 50.000 14.000 6.000 3.000 5.000 500 100 -

Fonte: TORTORA et al., 2006.

Alm dos solos, tambm podem ser isolados microrganismos do ambiente areo, aqutico. No ambiente aqutico, as populaes microbianas so afetadas principalmente pela disponibilidade de oxignio, nutrientes e luminosidade. Para algas fotossintticas a luz a fonte de energia principal e, portanto, elas se localizam prximas superfcie. Esses organismos so importantes para o ambiente porque tambm so fontes de alimento para bactrias, protozorios, peixes e outras

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formas de vida aqutica. Como o oxignio no se difunde bem na gua, perto do fundo de um lago estaro microrganismos anaerbicos. A Figura 4 mostra um lago em trs zonas de caractersticas diferentes e os microrganismos mais provveis de serem encontrados em cada uma (TORTORA et al., 2006).

Figura 4- As zonas de um lago e os microrganismos tpicos de cada zona

Fonte: TORTORA et al., 2006.

Podemos ver tambm a variao dos tipos de microrganismos encontrados de acordo com cada poro de um ambiente atravs da coluna de Winogradsky (Figura 5). Ela consiste de uma coluna de 30 cm de altura por 5 cm de dimetro onde h a deposio de um tero do volume com sedimento de rio ou lago e a complementao com gua do mesmo ambiente. ento feito o cultivo por dois a trs meses e, aps esse perodo possvel isolar microrganismos devido ao gradiente qumico. Ser possvel encontrar microrganismos representantes de cada uma das categorias apresentadas anteriormente na Figura 3. (OGUNSEITAN, 2005)

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Figura 5- Separao de microrganismo de acordo com o gradiente qumico

Fonte: OGUNSEITAN, 2005.

Devido grande quantidade de microrganismos presentes em um meio natural altamente competitivo, eles tentam explorar todas as vantagens fisiolgicas e metablicas possveis para ter um desenvolvimento melhor em relao aos outros microrganismos competidores. Eles devem utilizar os nutrientes comuns mais rapidamente, utilizar nutrientes que outros no consigam metabolizar e ainda se possvel produzir metablitos que inibem o crescimento de concorrentes. Por exemplo, bactrias lcticas so capazes de tornar um nicho inspito para organismos competidores atravs da produo de cido ltico que ir acidificar o meio e inibir alguns outros organismos (TORTORA et al., 2006). Microrganismos que se desenvolvem em ambientes que apresentam condies extremas de temperatura, salinidade, acidez ou alcalinidade so chamados de extremfilos. Seu isolamento tem sido muito importante atualmente devido possibilidade de cultiv-los sem que haja contaminaes ou o uso de suas

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enzimas em condies que desativam outras que no so de interesse, como no caso da Taq polimerase utilizada no processo de PCR. (OGUNSEITAN, 2005) 3- ISOLAMENTO EM CULTIVO SLIDO

Esse mtodo usado para o isolamento de certos produtores de enzimas, usando meios seletivos contendo o substrato que podem ser degradados pelas enzimas produzidas pelos microrganismos desejados. Os estudos iniciais feitos pelo bacteriologista alemo Robert Koch foram muito importantes para a obteno de culturas puras. Antigamente, as tentativas de isolamento eram feitas somente atravs de meios lquidos, sendo assim muito difcil isolar microrganismos como bactrias. Em 1881, Koch fez uma tentativa de cultivo slido em superfcie de batata. Por volta do mesmo tempo, um associado de Koch, Frederick Loeffler, desenvolveu o extrato de carne peptonado para o cultivo de bactrias patognicas, e Koch tentou solidificar esse meio (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Ele conseguiu atravs da mistura do meio com gelatina em um suporte slido que permitia a sua solidificao, mas tinha a desvantagem de se liquefazer temperatura superiores a 28C e ser degradada por vrias espcies microbianas que possuem gelatinase (LECLERC et al., 1983). Por volta do ano de 1882, passou-se a se utilizar gar como agente solidificante, que foi descoberto por Minora Tarazaemon, um japons dono de uma hospedaria, ao perceber que uma sopa de algas tinha gelificado aps uma noite fria (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Outro agente solidificante o cido silcico, o qual quimicamente definido. Ele importante na preparao de meios que devem ser rigorosamente definidos (LECLERC et al., 1983).

3.1- TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS

Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de uma ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se uma pequena parcela do meio de inculo e o espalha sobre uma placa de Petri com gar fazendo movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem vrias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontnua ou contnua (DROVAL, LIMA e HABU, 2001). A forma descontnua seria feita como mostrado na

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figura 6, onde so feitas estrias na poro 1 da placa e em seguida flamba-se a ala; aps, faz-se uma retirada de bactrias da regio 1 e espalha-se sobre a regio 2; flamba-se mais uma vez e espalha-se bactrias da regio 2 na 3. As colnias presentes na regio 3 estaro mais isoladas (TORTORA et al., 2006). Fazendo de forma contnua, haveria primeiramente a coleta de uma pequena quantidade do meio de semeadura e iniciar-se-ia as estrias em uma das bordas da placa e percorreria o fio de platina continuamente na forma de estrias at a outra borda da placa (DROVAL, LIMA, HABU, 2001). LECLERC e colaboradores (1983) descrevem a semeadura por estrias feita em duplicata em uma mesma placa, percorrendo a ala ou fio de platina somente at o centro da placa, e do lado oposto fazendo o mesmo procedimento. As colnias isoladas estaro mais ao centro e, atravs da repetio, poder-se-ia obter microrganismos que estavam presentes na segunda amostra do inculo, porm no presente na primeira.

Figura 6- Semeadura por estrias com ala de platina

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002; TORTORA et al., 2006.

3.2- TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO

Nessa tcnica, que mostrada na figura 7, um pequeno volume da soluo de microrganismos contendo de 30-300 clulas transferido para o cento de uma

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placa de gar j solidificado com o auxlio de uma pipeta estril. Em seguida, mergulha-se uma ala de Drigalski em lcool e a flamba de modo a manter todo o material estril. Com o auxlio dessa ala, espalha-se aquele volume depositado por toda a superfcie do gar. As colnias cresceram espalhadas por toda a superfcie do gar. (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002)

Figura 7- Semeadura por espalhamento

Fonte: PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002. O espalhamento pode ser feito tambm empregando outros materiais. GREENE e colaboradores testaram a utilizao do aparato mostrado na figura 8, que consiste de um anel cilndrico metlico com uma tira de material fibroso. Ao botar em contato o material fibroso e a amostra de inculo lquida, por exemplo, os microrganismos iro se fixar na fibra e esto carimba-se meios de cultivo estreis sucessivamente, de modo a obter colnias cada vez mais isoladas e definidas. Figura 8- Aparato para semeadura do meio

Fonte: GREENE, VERSLEY e KEENAN, 1962.

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3.3- TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO

O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm denominado de pour plate muito utilizado para bactrias e fungos. A amostra original diluda de forma que quando feita a placa consegue-se colnias bem separadas. Um pequeno volume da melhor diluio ento derramado em uma placa de Petri sem gar. Em seguida, derrama-se gar fundido na temperatura de 45C e mistura-se os dois com uma agitao leve da placa e deixa-se o meio solidificar. Figura 9- Comparao entre o mtodo de pour plate e de espalhamento

Fonte: TORTORA et al., 2006.

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Esse mtodo permite o crescimento de colnias na superfcie e dentro do gar, pois algumas clulas foram misturadas no gar durante a sua solidificao, como pode ser verificado na Figura 9, onde h a comparao do crescimento aps a semeadura por pour plate e por espalhamento (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). A maioria dos fungos e bactrias no morta pela breve exposio ao gar quente, mas microrganismos sensveis ao calor certamente podem ser danificados pelo gar fundido e ficarem impossibilitados de formarem colnias. Alm disso, quando se deseja identificar microrganismos atravs da morfologia da colnia, esse mtodo no muito indicado, pois as colnias presentes dentro do gar no fornecero dados corretos. (TORTORA et al., 2006)

3.4- TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE

Faz-se a utilizao da agulha de platina e semea-se o material contido nela picando um gar slido contido num tubo (Figura 10). Com isso haver o crescimento de microrganismos em anaerbio-se no fundo e aerobiose perto da superfcie do gar.

Figura 10- Semeadura em profundidade

Fonte: Adaptado de DROVAL, LIMA e HABU, 2001.

4- ISOLAMENTO EM CULTIVO LQUIDO

Os meios de enriquecimento que propiciam um grande aumento de determinada populao microbiana so geralmente lquidos. Aps o crescimento avantajado ento ocorre o isolamento de determinadas clulas. Isso pode ser feito

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como mostrado nas tcnicas em estado slido ou atravs de uma srie de diluies em meio lquido. Fazendo uma diluio em novo meio estril, como na figura 11, espera-se que em certo momento se obter culturas provenientes de somente uma nica clula. dessa forma que feita o isolamento e a contagem de clulas de Escherichia coli em guas ou alimentos, por exemplo (LECLERC et al., 1983).

Figura 11- Srie de diluio para isolamento de um microrganismo

Fonte: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002. 5- ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO

Mtodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento de um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele dever produzir um nmero muito maior de clulas do que em relao aos outros. Cultivo em meio de enriquecimento geralmente feito em Erlenmeyers. No entanto, o crescimento de um determinado organismos oriundo de uma amostra variada na forma de batelada pode resultar numa mudana das condies do meio, e, portanto, ocorre uma variao nas presses seletivas. Isso pode ser reajustado inoculando uma parcela desse meio de enriquecimento em um novo meio idntico ao inicial. Aps um bom desenvolvimento do microrganismo desejado, semea -se uma alquota em meio slido (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). A prevalncia do microrganismo desejado com relao aos outros depender da taxa mxima de crescimento dele com relao aos outros organismos capazes de tambm crescer no meio. Portanto, aquele capaz de crescer mais rapidamente com os substratos disponveis poder ter um nmero maior de clulas.

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No entanto, nem sempre o organismo com maior taxa de crescimento o desejvel, mas sim aquele que apresenta uma maior afinidade pelo substrato limitante. Para isso, faz-se uso de um cultivo contnuo, onde novo meio de cultivo adicionado de tempos em tempos e as presses seletivas so restauradas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Em um cultivo contnuo, a taxa de crescimento depende da taxa de diluio e da concentrao do substrato limitante. Para definir isso, deve-se partir da equao de Monod, mostrada na frmula 1: (1) onde a taxa de crescimento , s a concentrao do substrato residual, K s a constante de utilizao do substrato (que expressa a afinidade do microrganismo para o consumo do substrato). No estado estacionrio, temos que igual a taxa de diluio (D), transformando a frmula em: (2) onde a concentrao do substrato no reator, que ser constante no estado

estacionrio. Como mostrado pela frmula 2, se o substrato estiver abaixo do nvel da taxa de crescimento predita pela taxa de diluio, pode ocorrer que a taxa de crescimento ser menor que a taxa de diluio e as clulas sero eludas do reator (wash out) numa taxa maior do que a taxa de sua produo, resultando na diminuio na concentrao de biomassa desse microrganismo (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Como exemplo genrico de um processo de isolamento usando cultivo contnuo temos a Figura 12, em que temos dois microrganismos em cultivo contnuo, onde, se a taxa de diluio for menor do que a do ponto Y, o organismo B se desenvolver mais, mas quando a taxa de diluio maior, temos o organismo A se desenvolvendo preferencialmente. Portanto, o cultivo ser limitado pelo substrato, podendo ser obtidos microrganismos que no seriam detectados durante o cultivo em batelada. Os organismos obtidos atravs do cultivo em batelada ou em placas de Petri podem muitas vezes no se adaptar ao cultivo contnuo, sendo mais vantajoso fazer

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o isolamento diretamente atravs do cultivo contnuo para selecionar aqueles j adaptados para essa condio quando deseja-se desenvolver um processo em sistema contnuo.

Figura 1- Efeito da concentrao do substrato na taxa de crescimento de dois microrganismos.

Fonte: STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995.

Essa tcnica bastante utilizada na seleo de microrganismos para a produo de biomassa, mas tambm j foi usada para o isolamento de bactrias produtoras de enzimas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

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6- CULTURAS PURAS DE BACTRIAS

Ao fazer o isolamento das culturas, no s de bactrias, mas tambm de outros microrganismos, deve-se fazer uma coleta de material ambiental com instrumentos estreis. Bactrias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo necessita de um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam gar suplementado com extratos na concentrao de 10 a 50% do volume total, outras necessitam de infuses feitas do material da onde foram coletadas (solo, lama, folhas, pedras, troncos, detritos). Podem ser usados tambm alguns meios seletivos como gar sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey (DEMAIN and DAVIES, 1999). 7- CULTURAS PURAS DE ACTINOMICETOS

Actinomicetos so bactrias filamentosas que fazem parte da maioria dos substratos naturais. No difcil isolar actinomicetos de amostras que tambm contm fungos devido s suas propriedades fisiolgicas distintas. O uso de antibiticos e antifngicos tambm auxilia no isolamento, como mostra a tabela 4.

Tabela 4- Antibiticos usados e microrganismos alvo que so inibidos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995. Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20 dias para formarem colnias definidas quando incubadas temperatura de 65-80C (DEMAIN and DAVIES, 1999). O crescimento desses microrganismos tambm favorecido quando h no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 5:

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Tabela 5- Substncias que estimulam o desenvolvimento de actinomicetos em geral e actinomicetos produtores de antibiticos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995. El-Nakeeb e Lechevalier compararam meios de cultivo no isolamento de actinomicentos. Pela tabela 6 percebe-se que a quantidade de actinomicetos obtidos variando a fonte de carbono e nitrognio e o tipo de meio utilizado. Tabela 6- Comparao de meio AGS com meio de chitin e efeito das fontes de carbono e nitrognio no meio*

Fonte: EL-NAKEEB and LECHEVALIER, 1963.

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8- CULTURAS PURAS DE FUNGOS

Fungos podem ser isolados de diversos materiais. Devido sua preferncia por substratos que tambm forneam suporte para o seu crescimento, eles so freqentemente encontrados em matria em decomposio, plantas, rochas e solo. Em uma planta, por exemplo, dependendo do tecido que for coletado, pode-se encontrar diferentes tipos de fungos. Esses microrganismos tambm so bastante variados, e a mudana de somente um dos constituintes de um meio de cultivo pode resultar no isolamento de um fungo diferente. Para a seleo de um meio, deve-se considerar as condies fsicas do meio de origem e o tipo de fungo que se deseja. A luminosidade tambm um fator importante s vezes, pois alguns fungos necessitam de luz para frutificarem (DEMAIN and DAVIES, 1999). Macrofungos tem o isolamento facilitado, pois possvel isol-los do ambiente atravs da coleta de tecidos, esporos ou estruturas vegetativas.

9- CULTURAS PURAS DE ALGAS

Para isolar eficientemente algas, necessrio simular em parte o ambiente onde a amostra foi coletada, como pH, temperatura, salinidade, luminosidade. Mtodos de diluio so bastante indicados nesse caso, uma vez que algas e microalgas so normalmente encontradas em meio lquido. A filtragem de amostras e posterior inoculao do filtro em novo meio estril tambm um mtodo utilizado. 10- OUTRAS TCNICAS

O avano da biologia molecular, da gentica e da imunologia permitiu o desenvolvimento de novos mtodos de isolamento com o uso de detectores, enzimas e receptores de determinados microrganismos. Abaixo esto listados alguns exemplos: A utilizao de organismos testes com sensitividade elevada para determinado antibitico podem indicar onde esto os microrganismos produtores.

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A clonagem de genes codificantes para enzimas ou receptores usados na deteco de microrganismos pode fazer com que eles estejam mais acessveis em grande escala para a realizao dos testes.

O uso de genes reprteres, que codificam substncias facilmente detectveis e que so fusionados com uma seqncia que produz a substncia de interesse.

Sondas moleculares para seqncias de genes particulares podem detectar microrganismos capazes de produzir certos produtos. O desenvolvimento de testes imunolgicos como a captura por ELISA. (STANBURY, WHITAKER e HALL, 1995)

Com relao a esse ltimo, a tcnica de imunocaptura pode ser utilizada no isolamento de bactrias. SANTOS e REIS (artigo em anexo 1) utilizaram essa metodologia para isolar Gluconacetobacter diazotropicus e de bactrias fixadoras de nitrognio proveniente do solo. Para o isolamento de G. diazotropicus fez-se uso de anticorpos anti-Gluconacetobacter diazotropicus fixados em uma microplaca de poliestireno de 96 poos, onde colocada a amostra de solo. Aps as etapas de incubao e lavagem, a ligao da bactria com o anticorpo foi quebrada com a adio de KCl 0,1M. A desvantagem dessa tcnica que necessrio o conhecimento prvio do microrganismo que se deseja isolar e deve-se fazer o inculo de suas clulas mortas em cobaias como coelhos para a produo de anticorpos. As tcnicas de micromanipulao tambm podem ser utilizadas para o isolamento, apesar de serem mais caras devido aos equipamentos. Com o uso de objetivas de longa distncia com uma grande magnificao, possvel coletar uma nica clula microbiana atravs de tubos microcapilares, que iro aspirar a bactria e depois deposit-la em uma outra superfcie de gar ou em um meio lquido (para mais, ver artigo em anexo 2). Existe tambm a possibilidade de utilizar a citometria de fluxo para separar clulas de microrganismos. Essa tcnica utiliza anticorpos marcados, sondas de nucleotdeos marcadas fluorescentemente ou constituentes celulares que

naturalmente refratam a luz ou emitem fluorescncia. A Tabela 1 presente no anexo 3, mostra propriedades de certos microrganismos que podem ser diferenciadas atravs da citometria de fluxo, podendo-se ento isolar essas clulas.

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11- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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DAVIES,

J.

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Industrial

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EL-NAKEEB, M. A.; LECHEVALIER, H. A. Selective isolation of aerobic actinomycetes. Appl. Microbiol., Vol. 11, p. 75-77, 1963.

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LECLERC, H.; IZARD, D.; HUSSON, M.-O.; WATTRE, P.; JAKUBCZAK, E. Microbiologie Gnrale. Doin diteurs, Paris, 1983. 369 p. OGUNSEITAN, O. Microbial Diversity Form and Function in Prokaryotes. Blackwell Publishing, Oxford, 2005, 292 p. PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A. Microbiology. 5th edition. The McGraw-Hill Companies, 2002, 1139 p. ROITMAM, I.; TRAVASSOS, L. R.; AZEVEDO, J. L. Tratado de Microbiologia Volume 1. Editora Manole Ltda., So Paulo, 1988, 186p.

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SANTOS, C. C. R.; REIS, V. M. Desenvolvimento do Mtodo de Imunocaptura de Bactrias para Aplicao em Solo Argiloso. EMBRAPA, Comunicado Tcnico 64, ISSN 1517-8862, Maro 2004, Seropdica, RJ.

STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357 p.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8 edio, 1 reimpresso, Artmed, Porto Alegre, 2006, 894 p.

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12- ANEXOS

ANEXO 1

DESENVOLVIMENTO DO MTODO DE IMUNOCAPTURA DE BACTRIAS PARA APLICAO EM SOLO ARGILOSO

CARLA CRISTIANE ROCHA DOS SANTOS e VERNICA MASSENA REIS

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ANEXO 2

NEW TECHNIQUES FOR ISOLATION OF SINGLE PROKARYOTIC CELLS

JRGEN FRHLICH and HELMUT KNIG

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ANEXO 3

SCREENING FOR MICRORGANISMS WITH SPECIFIC CHARACTERISTICS BY FLOW CYTOMETRY AND SINGLE-CELL SORTING

TOHORU KATSURAGI and YOSHIKI TANI