Universidad de Chile Facultad de Ciencias Departamento de Qumica Licenciatura Ciencias mencin Qumica

Informe de Laboratorio N2 Determinacin de c. oxolnico y flumequina por HPLC con detector de fluorescencia y UV-Vis

Autores:

lvaro Etcheverry Mariana Montanares Daniela Bobadilla Nicols Faras aetcheverry@ug.uchile.cl mariana.montanares@gmail.com danii.bobadilla@gmail.com nicolasfariasr@gmail.com

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Fecha de entrega: 04/05/2012 RESUMEN Este prctico consisti en comparar las sensibilidades de dos tipos de detectores comnmente utilizados en HPLC. Detector de UV-Vis (del tipo de arreglo de diodos) y un detector de fluorescencia. Aunque ambos detectores funcionan bajo los principios de la espectroscopa electrnica, cada uno posee sensibilidades distintas. Para llevar a cabo esto, se utilizaron dos compuestos antimicrobianos utilizados en la industria pesquera, el cido oxolnico y la flumequina, ambos con propiedades fluorescentes. Los lmites de deteccin para el UV-Vis fueron de 110,7ppb y 60,8ppb para el cido oxolnico y la flumequina, mientras que los lmites de cuantificacin fueron de 145ppb y 356ppb para el cido oxolnico y la flumequina. Por otro lado, los lmites de deteccin para la fluorescencia fueron de 73,3ppb y 147ppb para el cido oxolnico y la flumequina, mientras que los lmites de cuantificacin fueron de 403ppb y 36ppb para el cido oxolnico y la flumequina, respectivamente. INTRODUCCIN En el presente laboratorio se realizaron curvas de calibracin para acido oxolnico y flumequina, los cuales son compuestos que se utilizan en la industria pesquera. Las curvas de calibracin se realizaron por separado en dos detectores diferentes del HPLC, detector UVvisible la que implica la espectroscopia de fotones en la regin de radiacin ultravioleta-visible en esta regin del espectro electromagntico, las molculas se someten a transiciones electrnicas y un detector de fluorescencia que realiza una espectrometra de fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometra de absorcin mide transiciones desde el estado basal al estado excitado. El detector de fluorescencia es ente 10 y 1000 veces ms sensible que el detector UVvisible, para determinar esta diferencia calcularemos el lmite de deteccin de ambos detectores con la ecuacin: LD = (Ybl + 3Sbl)/b Y el lmite de cuantificacin mediante la ecuacin: LC= (Ybl + 10Sbl)/b (2) (1)

Donde en ambas ecuacin: Ybl corresponde al intercepto de la curva de calibracin en la zona baja. Sbl es el intercepto de la curva de desviacin estndar versus concentracin. B es la pendiente de la curva de calibracin. El limite de deteccin es la concentracin mnima de analito que puede ser detectada por el equipo corresponde a una seal significativamente diferente a una seal marcada por el blanco o el ruido del equipo y el limite de cuantificacin es la concentracin mas baja para mediciones cuantitativamente precisas. 2

Las estructuras de los compuestos fluorescentes e muestran en las figuras siguientes. Cabe notar que es comn que aquellos compuestos con dobles enlaces conjugados a grupos carbonilos presenten fluorescencia.

Figura N1: Estructura Flumequina.

Figura N2: Estructura cido oxolnico.

PARTE EXPERIMENTAL 1. Datos brutos obtenidos: Los datos obtenidos a partir de las muestra se adjuntan a continuacin; se agruparon de acuerdo al compuesto a utilizar para comparar la sensibilidad de los detectores. A. cido oxolnico Concentracin (ppb) 200 300 400 500 1000 2000 4000 Tabla N1: Datos obtenidos para el cido oxolnico c. Oxolnico UV-visible Fluorescencia 1 2 3 1 2 89070 94640 2612 2889 2902 166930 165980 2065 2996 5847 261120 280200 6687 6664 5865 313380 323360 17058 17282 16115 682050 943685 45357 44687 42859 1954330 2087600 87831 89155 89155 3509620 3453695

3 78130 185190 269615 380250 1028140 1853330 3395880

B. Flumequina Concentracin (ppb) 200 300 400 500 1000 2000 4000 Tabla N2: Datos obtenidos para la flumequina Flumequina UV-visible Fluorescencia 1 2 3 1 2 2601 2091 1801 121145 121760 2164 2574 2291 209060 238885 3794 3606 4117 339335 333310 5472 5972 4514 395530 405070 8484 12240 13480 900170 913995 19104 19685 18799 2456900 3005650 48253 44140 44481 5441340 5595265

3 146650 210630 336760 407420 840010 2416295 5455330

2. Tratamiento de datos: Para realizar la curva de calibracin, se realiz un promedio de las tres mediciones para cada concentracin junto a su desviacin estndar a partir de los datos de la Tabla N 1. Tabla N3: rea promedio y desviacin estndar para las mediciones de c. Oxolnico. c. Oxolnico Concentracin (ppb) UV-visible Fluorescencia rea promedio Desviacin rea promedio Desviacin 200 87280,0 8399,3 300 2801,0 163,8 172700,0 10827,1 400 3636,0 1970,6 270311,7 9559,1 500 6405,3 468,1 338996,7 36073,2 1000 16818,3 619,3 884625,0 180445,7 2000 44301,0 1293,0 1965086,7 117504,8 4000 88713,7 764,4 3453065,0 56872,6 Usando los datos de la Tabla N 3 se realiz un grfico utilizando el software OriginPro 8.5, con un arreglo lineal para extraer las ecuaciones para cada recta, para los datos de cada detector. Las ecuaciones de las rectas de rea y la desviacin estndar para cada tipo de detector se presentan a continuacin.

100000

80000

60000

rea

rea promedio Desviacin estndar

40000

20000

0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Concentracin (ppb)

Grfico N 1: rea y desviacin estndar para el c. Oxolnico con el detector de UV-Vis.

UV-Vis

Yrea Ydesviacin

= 23,65X-5210 = 0,012X+864

3500000 3000000 2500000 2000000

rea

1500000 1000000 500000 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

rea promedio Desviacin estndar

3500

4000

4500

Concentracin (ppb)

Grfico N2: rea y desviacin estndar para el c. Oxolnico con el detector de fluorescencia. Fluorescencia Yrea Ydesviacin = 905X-61018 = 14,5X + 42560

Para cada grfico se obtuvieron las ecuaciones correspondientes. 5

Con los datos de las ecuaciones de cada una de las rectas se realiz el clculo de los lmites de deteccin (LD) y de cuantificacin (LC), que se resumen en la Tabla N4. Para el caso de valores negativos de LC o LD se inform el valor absoluto de stos. Tabla N 4: Lmites de cuantificacin y deteccin para el c. Oxolnico. Intercepto Intercepto Pendiente LD (ppb) LC (ppb) Ybl Sbl UV-Vis 23,65 -5210 864 110,7 145 Fluorescencia 905 -61018 42560 73,7 403 Para la flumequina se realiz el mismo procedimiento que para el cido oxolnico, obtenindose las tablas y grficos a continuacin. Tabla N5: rea promedio y desviacin estndar para las mediciones la flumequina. Flumequina Concentracin (ppb) UV-visible Fluorescencia rea promedio Desviacin rea promedio Desviacin 200 2164,3 405,0 129851,7 14551,0 300 2343,0 209,9 219525,0 16784,6 400 3839,0 258,5 336468,3 3023,1 500 5319,3 740,9 402673,3 6296,9 1000 11401,3 2601,4 884725,0 39336,4 2000 19196,0 450,1 2626281,7 329169,3 4000 45624,7 2282,6 5497311,7 85118,0 De los grficos realizados a partir de los datos de la Tabla N 5 se extraen las ecuaciones de la recta las cuales nos permitirn calcular los lmites de deteccin y cuantificacin.

100000

80000

60000

rea

rea promedio Desviacin estndar

40000

20000

0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Concentracin (ppb)

Grfico N 3: rea y desviacin estndar para la flumequina con el detector de UV-Vis. UV-Vis Yrea Ydesviacin
6000000

= 11,32X-746 = 0,429X+479

Flumequina en Fluorescencia

5000000

4000000

rea

3000000

2000000

rea promedio Desaviacin estandar

1000000

0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Concentracin (ppb)

Grfico N 4: rea y desviacin estndar para la flumequina con el detector de fluorescencia. Fluorescencia Yrea = 1434X-278860 Ydesviacin = 39,9X + 22725

Con los datos de las ecuaciones de cada una de las rectas se realiz el clculo de los lmites de deteccin (LD) y de cuantificacin (LC).

Tabla N 6: Lmites de cuantificacin y deteccin para la flumequina. Intercepto Intercepto Pendiente LD (ppb) LC (ppb) Ybl Sbl UV-Vis 11,32 -746 479 60,8 356 Fluorescencia 1434 -278.860 22725 147 36 DISCUSIN De los datos obtenidos es posible observar que la metodologa utilizada es la adecuada, debido a que al ir aumentando las concentraciones utilizadas, las reas halladas fueron aumentando de forma linear y constante de acuerdo a los incrementos en las concentraciones. A la hora de obtener curvas de calibracin es una buena opcin ir incrementando las concentraciones de tal forma que cada una sea el doble de la anterior, lo que nos permite observar si los datos obtenidos concuerdan. Como es de esperarse, los lmites de deteccin y cuantificacin son menores en la fluorescencia debido a que este detector es ms sensible y nos permite analizar concentraciones muy pequeas (del orden de los ppb). Sin embargo, existe el problema de que no todas las especies qumicas son fluorescentes, por lo que es necesario hacer reaccionar el compuesto en cuestin para obtener un derivado fluorforo. Por otro lado, el detector UV-Vis, posee una menor sensibilidad, pudiendo detectar compuestos que estn en el orden de los ppm. CONCLUSIONES A partir de lo realizado en el prctico se puede concluir que: Tanto como para el detector UV- visible como para el de fluorescencia tienen ciertas limitaciones. Para el detector UV- visible la cantidad de analito debe ser de un orden mayor en comparacin al del detector de Fluorescencia ya que sino el detector UVvisible no generara una seal apta, sino que se vera afectada por el ruido. Paralelamente, el detector de fluorescencia debe ser utilizado con cantidades pequeas del analito ya que, con cantidades muy grandes, el instrumento se satura y el anlisis del pico cromatogrfico no ser ptima ya que la banda que se obtendr ser muy ancha. El detector de fluorescencia es entre 200 a 600 veces ms potente que el detector UV. BIBLIOGRAFA SKOOG, Douglas A. y West, Donald M. Anlisis Instrumental, 2da Edicin. Mxico, McGraw-Hill, 1992.