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II. Mikrobiologische Prfungen B a sisp rfungen II. B asic Microbiological Tests Microbiological Testing

Mit K ra nkheitserregern konta m inierte Med iz inp rod ukte k nnen d ie Q uelle v on Infektionen beim Menschen sein. Med iz inp rod ukte und ihre H erstellungsv erfa hren m ssen d a her gem Med iz inp rod ukted irektiv e so a usgelegt sein, d a ss d a s Infektionsrisiko fr Pa tienten, A nw end er und D ritte a usgeschlossen od er sow eit w ie m glich v erringert w ird . F r Med iz inp rod uktehersteller bed eutet d ies, d a ss insbesond ere Prod ukte, d ie sterilisiert w erd en sollen, unter a ngem essenen und m ikrobiologisch berw a chten U m gebungsbed ingungen ( z . B . Z onenkonz ep t) hergestellt w erd en m ssen. D a rber hina us m ssen d ie Prod ukte und ggf. d ie R ohstoffe sow ie d ie V erp a ckungsm a teria lien regelm ig a uf m ikrobiologische B ela stungen berp rft w erd en, d enn nur so ka nn d er sp tere S terilisa tionserfolg gew hrleistet w erd en. D ie m ikrobiologischen B a sisp rfungen d er m d t geben d em H ersteller A ufschluss ber d ie K eim bela stung ihrer Prod ukte im V erla uf d es H erstellungsp roz esses, helfen d en S terilisa tionserfolg und D esinfektionsleistungen z u bew erten und untersttz en H ersteller bei d er berw a chung d er Prod uktionsbed ingungen.

Med ical d ev ices contam inated w ith p ath ogens m ay be a sou rce of infection for h u m ans. Th erefore, accord ing to th e Med ical D ev ice D irectiv e, d ev ices m u st be d esigned and m anu factu red in su ch a w ay as to elim inate or red u ce th e risk of infection to th e p atient, u ser or th ird p arties as far as p ossible. C onseq u ently , m ed ical d ev ice m anu factu rers, in p articu lar if th ey m anu factu re sterile d ev ices, m u st p rod u ce th eir p rod u cts u nd er ad eq u ate and m icrobiologically m onitored cond itions inv olv ing a clear z one concep t. F u rth erm ore, th e final p rod u cts, and if necessary th e starting and p ack aging m aterials, m u st be su bjected to biobu rd en d eterm inations in ord er to su p p ort th e later steriliz ation su ccess. Th e m icrobiological basic tests of m d t inform th e m anu factu rer abou t th e m icrobiological statu s of th eir p rod u cts, d eterm ine antiinfectiv e p rop erties of m aterials and d isinfectants and h elp to control m anu factu ring p rocesses and steriliz ation p roced u res.

II. Mikrobiologische B a sisp rfungen II. B asic Microbiological Tests

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1 . K E IM Z A H L B E S T IM M U N G

1. BIOBURDEN DETERMINATIONS

Keimzahlbestimmungen (Bioburden) werden durchgefhrt, um Kenntnis ber die mikrobielle Belastung einzelner Medizinprodukte nach oder whrend der Produktion zu erlangen. Da die Wiederfindungsraten von Bakterien und Pilzsporen auf einem Medizinprodukt oder dessen Packmittel stark materialabhngig sind, muss vor der eigentlichen Keimzahlbestimmung eine Methodenvalidierung gem EN ISO 11737-1 durchgefhrt werden. Die materialabhngige Wiederfindungsrate wird dann zur Korrektur der gefundenen Keimbelastungswerte herangezogen und fhrt zu einer realittsnahen Ermittlung der zu erwartenden Keimbelastung. Bei der Validierung der Bioburdenbestimmung knnen zwei unterschiedliche Richtlinien herangezogen werden. Einerseits kann die EN ISO 11737-1 herangezogen werden. Die Norm schreibt den Einsatz von den folgenden drei Prfkeimen vor: Staphylococcus aureus, Fusarium solani und Bacillus subtilis. Als Alternative kann auch die Validierung nach den harmonisierten Pharmakopen (Ph.Eur., USP und JP) durchgefhrt werden. Laut diesen harmonisierten Pharmakopen sind 5 Prfkeime einzusetzen: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans und Aspergillus brasiliensis.
1 .1 . V a lid ie ru n g d e r K e im z a h lb e s tim m u n g

The bioburden of a product is determined in order to assess the number of viable microorganisms present on a medical device or its packaging material during or at the end of the manufacturing process. As the recovery rates of bacteria and molds, which adhere to a medical device or its package, strongly depend on the respective material properties, any bioburden determination procedure needs to be validated according to EN ISO 11737-1. The determined recovery rate is then applied to the measured bioburden value in order to evaluate the real microbiological status of a product. For the validation of the bioburden determination two different guidelines can be used: First, EN ISO 11737-1 can be used. This standard specifies the use of the following three microorganisms: Staphylococcus aureus, Fusarium solani and Bacillus subtilis. Alternatively, the validation can also be performed using the harmonized Pharmacopeia (Ph. Eur., USP, and JP). According to these three harmonized Pharmacopeia a total of five microorganisms must be used: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans and Aspergillus brasiliensis.

1.1. V a lid a t io n o f t h e Bio b u r d e n De t e r m in a t io n

A. Durchfhrung gem DIN EN ISO 11737-1 und EN ISO 11137-2 Oberflchliche Beimpfung steriler Prfgegenstnde mit folgenden drei Keimen: Staphylococcus aureus, Fusarium solani und Bacillus subtilis Ablsen der beimpften Keime in Waschlsung Membranfiltration, Verdnnungsreihen oder Ausspatelmethode Bestimmung der Wiederfindungsrate Bebrtungszeit 1 5 Tage

A. Procedure according to EN ISO 11737-1 and EN ISO 11137-2 Inoculation of sterile test items with the following microorganisms: Staphylococcus aureus, Fusarium solani and Bacillus subtilis D etachment of inoculated microorganisms using a rinsing solution M embrane filtration, dilution series or spread plates D etermination of recovery rates Incubation time up 1 5 days

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II. Mikrobiologische B a sisp rfungen II. B asic Microbiological Tests

B. Durchfhrung in Anlehnung an harmonisierte Pharmakopen (Ph.Eur., USP und JP) Oberflchliche Beimpfung steriler Prfgegenstnde mit folgenden fnf Keimen: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans und Aspergillus brasiliensis Ablsen der beimpften Keime in Waschlsung Membranfiltration, Verdnnungsreihen oder Ausspatelmethode Bestimmung der Wiederfindungsrate Bebrtungszeit 1 5 Tage

B. Procedure in analogy to harmonized Pharmacopeia (Ph. Eur., USP and JP) Inoculation of sterile test items with the following microorganisms: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Candida albicans and Aspergillus brasiliensis D etachment of inoculated microorganisms using a rinsing solution M embrane filtration, dilution series or spread plates D etermination of recovery rates Incubation time 1 5 days
1.2 . Bio b u r d e n De t e r m in a t io n

1 .2 . K e im z a h lb e s tim m u n g

Durchfhrung gem Ph.Eur., USP oder EN ISO 11737-1 Membranfiltration, Verdnnungsreihen oder Ausspatelmethode Verwendung von 12 Kulturmedien Bebrtungszeit 7 Tage ggf. Untersuchung von Produkten und Verpackungen
2 . P R F U N G E N A U F S T E R IL IT T

Procedure according to Ph.Eur., USP, or EN ISO 11737-1 M embrane filtration, dilution series or spread plates Application of 1 2 media Incubation time 7 days Applicable for products and packaging materials
2 . STERIL ITY TESTING

Die Prfung auf Sterilitt weist nach, ob sich auf einem geprften Produkt vermehrungsfhige Organismen befinden. Sie dient jedoch nicht zum Nachweis eines Sterilittserfolges nach Sterilisation. Dazu ist eine Validierung des jeweiligen Sterilisationsverfahrens erforderlich. K A P IT E L III
2 .1 . V a lid ie ru n g d e r P r fu n g e n a u f S te rilit t

Sterility tests confirm that a product does not contain any viable microorganisms. Sterility tests, however, can not be applied to prove the success of a sterilization procedure. These procedures have to be validated separately. C H AP TER III

2 .1. V a lid a t io n o f t h e St e r ilit y Te s t

Durchfhrung gem Ph.Eur., USP (Nachweis der Abwesenheit von antimikrobiellen Eigenschaften des Produktes) Verwendung von 12 Kulturmedien Vergleich des Wachstums von wenig Keimen (< 10 0 Keime) in Anwesenheit und Abwesenheit des Produktes Prfung von bis zu 6 verschiedenen Keimen (Ph.Eur, USP) Bebrtungszeit 14 Tage anwendbar auf Produkte und Primrpackmittel

Procedure according to Ph.Eur.and USP (confirmation of the absence of antimicrobial activity of product) Application of 1 2 media Comparison of growth of microorganisms (< 10 0 CFU) in the absence and presence of product Test of up to 6 different microorganisms Incubation time 14 days Applicable for products and packaging materials

II. Mikrobiologische B a sisp rfungen II. B asic Microbiological Tests

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2 .2 . D ire k tb e s c h ic k u n g

2 .2 . Dir e c t Tr a n s f e r t o C u lt u r e Me d iu m

Durchfhrung gem EN ISO 11737-2 oder in Anlehnung an Ph.Eur. und USP Verwendung von 12 Kulturmedien Positiv-Kontrollen Bebrtungszeit 14 Tage anwendbar auf Produkte und Primrpackmittel
2 .3. M e m b ra n filte rm e th o d e

Procedure according to EN ISO 11737-2 or in analogy to Ph.Eur and USP Application of 1 2 media Positive controls Incubation time 14 days Applicable for products and packaging materials
2 .3 . Me m b r a n e F ilt r a t io n Me t h o d

Durchfhrung gem EN ISO 11737-2 oder in Anlehnung an Ph.Eur. und USP Verwendung von 12 Kulturmedien Positiv-Kontrollen Bebrtungszeit 14 Tage ggf. Untersuchung von Produkten und Verpackungen
3. K E IM D IF F E R E N Z IE R U N G U N D N A C H W E IS P A T H O G E N E R L E IT K E IM E

Procedure according to EN ISO 11737-2 or in analogy to Ph.Eur and USP R insing of samples in saline solution Application of 1 2 media Positive controls Incubation time 14 days Applicable for products and packaging materials
3 . DIF F ERENTIATION AND DETEC TION OF P ATH OG ENIC MIC ROORG ANISMS

Durchfhrung nach Ph.Eur. oder USP Bestimmung von Bakterien und Pilzen mikroskopische Differenzierung, G ram-Frbung kulturelle G robdifferenzierung Feindifferenzierung mittels biochemischer Tests Nachweis / Ausschluss von pathogenen Keimen durch Anreicherung auf selektiven Nhrbden, z. B. Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella spec.
4 . P R F U N G A U F A U S R E IC H E N D E A N T IM IK R O B IE L L E W IR K S A M K E IT

Procedure according to Ph.Eur. or USP D etermination of bacteria, molds and yeasts M icroscopic differentiation, gram-staining D ifferentiation using culture techniq ues D ifferentiation using biochemical tests D etection / ex clusion of pathogenic microorganisms by amplification in selective nutrient media, e. g. Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella spec.
4 . ANTIMIC ROBIAL AC TIV ITY TESTING

Einige Produkte werden vom Patienten mehrfach verwendet oder ber einen lngeren Z eitraum aufgebraucht. In diesen Fllen sind zuverlssige Desinfektion oder Konservierung des Produktes erforderlich. Nachfolgend sind beispielhaft Prfungen auf ausreichende antimikrobielle Wirkung dargestellt.

Some medical devices can be applied repeatedly or can be used up by patients over a longer period of time. For such products effective disinfectants, respectively effective preservative agents, are req uired. In the following, some tests are presented which are applied to investigate such antimicrobial properties.

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II. Mikrobiologische B a sisp rfungen II. B asic Microbiological Tests

4 .1 . S u s p e n s io n s te s t z u r B e s tim m u n g d e r B a k te riz id ie v o n D e s in fe k tio n s m itte ln

4 .1. Su s p e n s io n Te s t t o De t e r m in e Ba c t e r ic id a l Ef f e c t s o f Dis in f e c t a n t s

Durchfhrung nach EN 10 40 ; weitere Verfahren nach EN 1276 , EN 136 9 7 oder EN 13727 Prfung von fertigen Desinfektionsmitteln oder einzelnen Wirkkomponenten Validierung der Inaktivierung des Konservierungsmittels Beimpfung z.B. mit Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus Bestimmung der zeitabhngigen Abttungsraten Kriterium: Reduktion der lebensfhigen Keime um 10 5 nach 6 0 min bei 20 C
4 .2 . S u s p e n s io n s te s t z u r B e s tim m u n g d e r F u n g iz id ie v o n D e s in fe k tio n s m itte ln

Procedure according to EN 10 40 ; further procedures according to EN 12 76 , EN 136 9 7 or EN 1372 7 Test of final disinfectants or active ingredients V alidation of inactivation of the disinfecting agent Inoculation for ex ample with Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus D etermination of time-dependent killing rates Evaluation of success: reduction by 10 5 after 6 0 min at 2 0 C

4 .2 . Su s p e n s io n Te s t t o De t e r m in e F u n g ic id a l Ef f e c t s o f Dis in f e c t a n t s

Durchfhrung nach EN 1275; weitere Verfahren nach EN 16 50 , EN 136 9 7 oder EN 136 24 Prfung von fertigen Desinfektionsmitteln oder einzelnen Wirkkomponenten Validierung der Inaktivierung des Konservierungsmittels Beimpfung mit Candida albicans und Aspergillus brasiliensis Bestimmung der zeitabhngigen Abttungsraten Kriterium: Reduktion der lebensfhigen Keime um 10 4 nach 6 0 min bei 20 C
4 .3. K o n s e rv ie ru n g s m itte lb e la s tu n g s te s t (P E T )

Procedure according to EN 12 75; further procedures according to EN 16 50 , EN 136 9 7 or EN 136 2 4 Test of final disinfectants or active ingredients V alidation of inactivation of the disinfecting agent Inoculation with Candida albicans and Aspergillus niger D etermination of time-dependent killing rates Evaluation of success: reduction by 10 4 after 6 0 min at 2 0 C

4 .3 . P r e s e r v a t iv e Ef f ic a c y Te s t (P ET)

Durchfhrung nach Ph.Eur. oder USP frisch hergestellte Proben oder Proben nach Anwendungssimulation Validierung der Inaktivierung des Konservierungsmittels Beimpfung mit Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans und Aspergillus brasiliensis (USP: auerdem Escherichia coli) Prfung der Keimzahl zu verschiedenen Z ielzeitpunkten Beurteilung der Ergebnisse (Erfllung der Kriterien A und B)

Procedure according to Ph.Eur. or USP Freshly prepared samples or samples after simulated use V alidation of inactivation of the preservative agent Inoculation of test solution with Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans and Aspergillus brasiliensis (USP: Escherichia coli in addition) D etermination of bioburden at various times intervals Evaluation of results (fulfillment of criteria A and B)

II. Mikrobiologische B a sisp rfungen II. B asic Microbiological Tests

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4 .4 . P r fu n g v o n M e ta lle n u n d K u n s ts to ffe n a u f o lig o d y n a m is c h e A k tiv it t

4 .4 . Olig o d y n a m ic Ac t iv it y o f Me t a ls a n d P la s t ic Ma t e r ia ls

Durchfhrung als modifizierter Konservierungsmittelbelastungstest (Ph.Eur.) Voreq uilibrierung der Prfgegenstnde in physiologischer Kochsalzlsung bei stark wirksamen Materialien: Parallelanstze in CASO Bouillon Validierung der Inaktivierung der antimikrobiellen Wirkung Beimpfung mit geeigneten Mikroorganismen Inokulationsdosis: 10 0 bis 10 0 0 KBE pro ml Keimzahlbestimmungen zu relevanten Z eitintervallen parallel gefhrte Wachstumskontrollen Beurteilung der Keimreduktion im Vergleich zu den Kontrollen
5 . M IK R O B IO L O G IS C H E B E R W A C H U N G V O N P R O D U K T IO N S B E D IN G U N G E N

M odified Preservative Efficacy Test according to Ph.Eur. Eq uilibration of test items in physiological saline solution In case of strong antimicrobial materials: parallel testing in CASO Bouillon V alidation of inactivation of the preservative materials effect Inoculation with suitable microorganisms Inoculation with 10 0 to 10 0 0 cfu per ml Bioburden determination at relevant time intervals G rowth controls in a parallel time schedule D etermination of reduction rates in comparison to controls
5 . MIC ROBIOL OG IC AL MONITORING OF P RODUC TION

Produkte, die sterilisiert werden sollen, mssen gem MDD unter angemessenen und berwachten Bedingungen hergestellt sein. Die Europische G MP-Richtlinie gibt hierzu hilfreiche Anregungen, wie die berwachung des Produktionsbereiches und der darin arbeitenden Mitarbeiter realisiert werden kann. In Z usammenarbeit mit dem Auftraggeber erarbeitet die mdt ein angemessenes Monitoringprotokoll, welches Z eitpunkte und Positionen der Probennahme festlegt und G renz- und Alarmwerte definiert. Auf diese Weise wird der mikrobiologische Status der Produktionsumgebung anhand der folgenden Testsysteme festgehalten und bewertet: Oberflchenkeime: Abklatschtests (z. B. CASO-Agar Platten mit Enthemmern) Luftkeime: Sedimentationstests (z. B. CASO-, SAB-Agar Platten) Wasserkeime: (z. B. CASO-, SAB-Agar Platten) Darber hinaus bietet mdt Trainingskurse zur Produktions-, Betriebs- und Personalhygiene an.

According to the M D D devices which are supposed to be sterilized must be manufactured under appropriate and controlled conditions. In this regard the European G M P G uideline offers helpful suggestions as how the practical performance concerning the production area, and the personnel working in this area, can be realized. In cooperation with the manufacturer, mdt develops a suitable sampling plan which specifies the time regimen and sampling positions in the production area and which determines action and alert limits for each sampling position. Thereby the microbiological status of the controlled environment can be documented and evaluated for the following test systems: M icroorganisms on surfaces: Total colony count (e. g., Tryptic Soy Agar with Neutralizer) Airborne microorganisms: Sedimentation test (e. g., CASO-, SAB-Agar Plates) M icroorganisms in water supplies: Plating of samples (e. g., CASO-, SAB-Agar Plates) Furthermore, mdt offers hygiene training courses for employees working in a cleanroom environment.