Los productos RBR estn elaborados bajo un sistema de Gestin de Calidad ISO 9001:2000

AFLAPREP
INSTRUCCIONES DE USO

APLICACIN DE COLUMNAS DE INMUNOAFINIDAD PARA LA PREPARACION DE MUESTRAS PREVIO AL ANLISIS DE AFLATOXINAS POR HPLC
CODIGO DE PRODUCTO: P07
Versin P07/V15/26.01.05
Material de vidrio de laboratorio Embudos de filtracin Cilindros adaptadores, 100 ml y 500 ml Pipetas de 1ml, 5ml y 10ml Vaso de precipitado * disponible en R-Biopharm Rhne Ltd.
POR FAVOR LEER CUIDADOSAMENTE ANTES DE USAR

CONTENIDO
COMPONENTES DEL KIT AFLAPREP ............................................. MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS....................... NOTAS IMPORTANTES....................................................................... Peligro................................................................................................... Decontaminacin.................................................................................. Almacenamiento............................................................................... Vida de anaquel.................................................................................... Sensibilidad...................................................................................... Recuperacin................................................................................... Muestreo.......................................................................................... INTENCIN DE USO............................................................................ PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIN................................................. Ejemplos de Procedimientos para la extraccin de muestra................ Preparacin de la columna................................................................... Captura de las Aflatoxinas.................................................................... Lavado.................................................................................................. Elusin.................................................................................................. CUANTIFICACIN DE AFLATOXINAS POR HPLC............................ CONDICIONES DEL HPLC RECOMENDADAS.................................. Uso del Kobra Cell................................................................................ Uso de derivatizacin Post columnas con Iodo.................................... PREPARACIN DE ESTNDARES DE AFLATOXINA PARA EL ANLISIS POR HPLC........................................................................... CALIDAD............................................................................................... SOPORTE TCNICO........................................................................... LINEA DE PRODUCTOS PARA MICOTOXINAS................................. REFERENCIAS..................................................................................... GARANTA............................................................................................ PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO CON AFLAPREP .......................

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NOTAS IMPORTANTES Peligro

Las aflatoxinas son sustancias peligrosas. Solamente los laboratorios equipados para el manejo de materiales txicos y solventes pueden realizar anlisis de aflatoxinas. Debe utilizarse vestimenta protectora, incluyendo guantes de goma y anteojos de seguridad durante todo el ensayo. Las columnas contienen 0.01% p/v de timerosal. Si se salpican ojos piel, debe lavarse inmediatamente con abundante cantidad de agua.

Decontaminacin
Es importante que el vaso de la licuadora, las jeringas, los adaptadores y los embudos de filtracin se laven exhaustivamente luego de cada ensayo dado que los residuos de ensayos previos pueden producir resultados inadecuados. Todo el material y los reactivos deben decontaminarse sumergindolos por lo menos durante 30 min en una solucin de hipoclorito de sodio (aprox. 5% (p/p)) seguido de la adicin de acetona (5% en v) por 30 minutos. Luego de un enjuague exhaustivo con agua destilada, se realiza el lavado normal. Se recomienda que las jeringas utilizadas durante el ensayo se enjuaguen con metanol y luego con agua destilada al final de cada ensayo. Nota: Las aflatoxinas se absorben fcilmente en la superficie del material de vidrio, reduciendo la recuperacin de las aflatoxinas de cada muestra. Para solucionar este problema se recomienda que el material que entra en contacto con las soluciones de aflatoxinas (ej. estndares eluidos de las muestras) deben sumergirse en cido diluido (ej. cido sulfrico 2 mol/l) por varias horas, y luego enjuagado exhaustivamente con agua destilada para remover trazas de cido previo a su uso.

COMPONENTES DEL KIT AFLAPREP

50 Columnas de Inmunoafinidad AFLAPREP

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROVISTOS

Balanza de laboratorio Licuadora rotatoria con jarra de 1 l de capacidad (para usar con solventes) Agua destilada /deionizada * Tabletas de Buffer fosfato salino (PBS) (Prod: RP202) * papel de filtro Whatman N113 N4 (Prod: P66 y P67) * Paquete de accesorios para columnas de inmunoafinidad conteniendo 10 jeringas, adaptadores y conectores (Prod: AP01) * Rack para las columnas de inmunoafinidad (Prod: CR1) grampas Los solventes requeridos para realizar la extraccin de aflatoxinas se describen en el procedimiento del ensayo apropiado. * Estndar de Aflatoxina B1, B2, G1, G2 (Prod: P22) Sistema de HPLC

Almacenamiento
El kit debe almacenarse a 2-8C No congelar. Las columnas tambin son estables a temperatura ambiente (ver RBR para ms detalles). Asegrese que las columnas no se hayan secado y que contengan buffer por encima del gel. Es importante notar que el anticuerpo incluido en la columna de inmunoafinidad se puede desnaturalizar por temperaturas extremas cambios de pH.

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West of Scotland Science Park, Unit 3.06 Kelvin Campus, Maryhill Road, Glasgow Scotland G20 0SP Tel: +44 (0)141 945 2924 Fax: +44 (0)141 945 2925 e-mail : info@r-biopharmrhone.com

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extraccin con acetonitrilo se recomienda para uso con frutas secas y especias. La extraccin con cloroformo, aunque consume mucho tiempo y es peligrosa, sigue siendo el solvente de preferencia para varios laboratorios, por lo que hemos incluido aqu el mtodo. Adems de los mtodos descriptos en las instrucciones de uso, RBR ha desarrollado muchas Notas de Aplicacin para matrices difciles, que estn a disposicin de los usuarios por pedido.

Vida de anaquel
El kit AFLAPREP es estable por 18 meses desde la fecha de elaboracin si se almacena a 2-8C. Las columnas tambin son estables a temperatura ambiente (ver RBR para ms detalles)

Sensibilidad
La sensibilidad depende del sistema de deteccin empleado por el analista. Sin embargo, la sensibilidad del sistema se puede mejorar si se requiere, simplemente aumentando el volumen de muestra que se pasa a travs de la columna de inmunoafinidad.

Ejemplos de Procedimientos de Extraccin de muestras a) Metanol

Pesar 50g de muestra bien molida y 4g de cloruro de sodio en un recipiente para licuar de 1 litro de capacidad, resistente a solventes. Agregar 250ml de metanol:agua (60:40v/v) calidad HPLC en el recipiente, tapar y licuar por 1 min a alta velocidad. Diluir el extracto con 250ml de agua destilada. Mezclar bien por agitacin (no elctricamente). Inmediatamente luego de agitar, filtrar aproximadamente 2550ml de extracto de muestra por papel de filtro Whatman No.4 No. 113. Transferir 10ml del filtrado (equivalente a 1g de muestra) a un cuerpo de jeringa de vidrio para pasar por la columna de inmunoafinidad (ver Preparacin de Columnas). Nota: Para varios tipos de nueces se ha encontrado que se pueden obtener mejores recuperaciones filtrando el extracto de muestra previo a la dilucin. Utilizando este procedimiento, se licuan 50g de nueces y 4 g de sal con 250 ml de metanol:agua destilada (60:40 v/v) calidad HPLC. Se filtra la muestra a travs de papel de filtro Whatman No. 14 No. 113 y se colecta un volumen apropiado. Se diluye el filtrado con igual volumen de agua destilada. Se transfieren 10ml del filtrado diluido (equivalente a 1g de muestra) a un cuerpo de jeringa de vidrio para pasar por la columna de inmunoafinidad (ver Preparacin de Columnas).

Recuperacin
Si el analista quiere considerar las prdidas que ocurren durante la extraccin, se recomienda que una muestra fortificada de la misma matrz del material a analizar, se analice siguiendo el procedimiento completo de extraccin de la AFLAPREP como estndar de referencia. Las recuperaciones obtenidas con la muestra fortificada deben luego ser utilizadas para corregir los resultados obtenidos para las muestras.

Muestreo
Se debe obtener una muestra representativa siguiendo alguno de los procedimientos de muestreo oficiales reconocidos. Se recomienda moler finamente como mnimo 1 kg de muestra representativa y tomar de all una muestra de 50 g para el ensayo.

INTENCION DE USO
Las Aflatoxinas son sustancias carcingenas producidas por los hongos Aspergillus flavus y Aspergills parasiticus. Dado que estos hongos crecen en una amplia gama de materias prima como nueces, cereales, higos y especias, es necesario hacer anlisis de dichos productos para controlar presencia de aflatoxinas antes de su incorporacin a otros alimentos y piensos. Se necesita un ensayo rpido y simple que pueda ser utilizado para controlor un rango diverso de alimentos. Las columnas de inmunoafinidad AFLAPREP cumplen con

b) Acetonitrilo
Este mtodo es similar al protocolo de metanol, pero provee mejores recuperaciones para aflatoxina B1 para aquellos usuarios que estn preocupados con esta toxina. Colocar 50g de muestra molida y 4g de cloruro de sodio en un recipiente para licuar de 1 litro de capacidad, resistente a solventes. Agregar 250ml de acetonitrilo 60% calidad HPLC, tapar y licuar a alta velocidad por 1 min. Filtrar el extracto de muestra por papel de filtro Whatman No.4 No. 113 y colectar 20 ml del filtrado. Diluir 5 ml del filtrado con 120ml de buffer fosfato salino (PBS 0.01M). Asegurarse que los 125ml de la muestra diluida (equivalente a 1g de muestra) se transfieran a un cuerpo de jeringa de vidrio para pasar por la columna de inmunoafinidad (ver Preparacin de Columnas). Debe notarse que la concentracin final de acetonitrilo que se pasa por la columna no debe ser mayor al 2.5% para evitar la desnaturalizacin del anticuerpo en la columna.

dichos requerimientos.
El procedimiento de las columnas AFLAPREP se basa en la tecnologa de anticuerpos monoclonales, que hacen que el ensayo sea altamente especfico, sensible, rpido y simple de realizar. Las columnas AFLAPREP contienen una suspensin en gel de anticuerpo monoclonal unido covalentemente a un soporte slido. El anticuerpo es especfico para las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2. Luego de la extraccin de las toxinas, el extracto de muestra se pasa a travs de una columna de inmunoafinidad. Cualquier aflatoxina que est presente en la muestra es retenida por el anticuerpo dentro de la suspensin de gel. La columna se lava con PBS para remover el material no unido. La toxina unida es liberada por el anticuerpo luego de la elusin de la columna con metanol acetonitrilo. El eluido se colecta en un vial para anlisis por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC).

c) Cloroformo
Colocar 50g de muestra molida y 25g de celita, tambin llamada tierra de diatomeas (Sigma), en un recipiente cnico de 500ml. Agregar 250ml de cloroformo y 25ml de agua destilada deionizada, tapar y agitar por 30 minutos. Filtrar a travs de papel de filtro Whatman No. 4 No. 113 y colectar 20ml del filtrado. Tomar 10ml del filtrado y evaporarlos a sequedad, utilizando un evaporador rotatorio a 60C. Reconstituir el residuo con 50ml de agua destilada. Transferir toda la solucin (equivalente a 2.0g de muestra) a cuerpo de jeringa de vidrio para pasar por la columna de inmunoafinidad.

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Es posible utilizar diferentes solventes de extraccin para el anlisis de aflatoxina en alimentos y matrices agrcolas, dependiendo del requerimiento del analista. La extraccin tpica con metanol se recomienda para la extraccin de aflatoxinas de nueces, cereales y maz, mientras que la

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Reversin del flujo Revertir el flujo subiendo y bajando lentamente el mbolo de la jeringa durante el pasaje del eluyente a travs de la columna de inmunoafinidad. Este proceso va a revertir la direccin del flujo del eluyente asegurando una completa desnaturalizacin del anticuerpo. Debe repetirse tres veces durante el pasaje del eluyente a travs de la columna.

Preparacin de la columna
Las columnas de inmunoafinidad deben estar a temperatura ambiente antes de su uso. Remover la tapa de la parte superior de la columna, cortar el fondo sellado y volver a colocar. Ajustar firmemente la columna al cuerpo de vidrio de 10 ml de la jeringa y colocar en un soporte apropiado para columnas de inmunoafinidad (rack clampstand). Asegrese que el tapn inferior de la columna de inmunoafinidad est an en su lugar.

Captura de las Aflatoxinas

Luego de la aplicacin de un procedimiento de extraccin apropiado, remover el tapn inferior de la columna y pasar el volumen sugerido de muestra a travs de la columna de inmunoafinidad a un flujo de 2-3ml/min. Es esencial una pequea presin continua para la captura de las aflatoxinas por el anticuerpo. El volumen de muestra debe ser de 10ml si se utiliza la extraccin con metanol (equivalente a 1g de material original de la muestra), 125ml si se utiliza la extraccin con acetonitrilo (equivalente a 1g de muestra y 50 ml (equivalente a 2g de muestra) para aquellos analistas que deseen utilizar el mtodo de extraccin con cloroformo. Este procedimiento debe realizarse manualmente utilizando una bomba y un cuerpo de jeringa de vidrio, aunque es mas apropiado utilizar un sistema Vac-Elut (Jones Chromatography), una bomba peristltica multicabezal un sistema ASPEC (Gilson) para el anlisis de un gran nmero de muestras. Con el objeto de mejorar el lmite de deteccin, se pueden pasar volmenes mayores de muestra a travs de la columna de inmunoafinidad; para mayor informacin, por favor contacte a R-Biopharm Rhne Ltd.

CUANTIFICACIN DE AFLATOXINAS POR HPLC

Inyectar 100ul de la muestra en un HPLC. Cuantificar la concentracin de las aflatoxinas comparando las alturas reas de los picos de la muestra con la curva de calibracin de estndares.

CONDICIONES RECOMENDADAS DEL HPLC Usando un Kobra Cell

Kobra Cell Pre Columna seteo a 100A Inertsil ODS-3 5m, 4mm x 10mn (Hichrom) equivalente Inerstil ODS-3V 5m, 4,6mm x 150mn (Hichrom) equivalente 60:40 v/v agua:metanol A 1 litro de fase mvil adicionar 119mg de bromuro de potasio y 350l de cido ntrico 4M para dispensar la fase mvil 1.0 ml/minuto Excitacin: 362nm Emisin: 425nm (B1 y B2) 455nm (G1 y G2) Mantiene la Precolumna y Columna analtica a 40C Del proveedor preferido Vlvula Reodyne sampleador 100l

Columna analtica: Fase mvil:

Lavado
Agregar 10ml de buffer fosfato salino (PBS) al cuerpo de vidrio de la jeringa y pasar a travs de la columna de inmunoafinidad a 5 ml por minuto. Repetir el procedimiento de lavado, asegurndose que todo el PBS residual ha sido expelido de la columna antes del prximo paso.

Bomba HPLC Veloc. de flujo: Detector de Fluorescencia: Horno: Integrador: Inyector: Volumen de Inyeccin:

Elusin
Colocar un vial color mbar directamente debajo de la columna. Pipetear 1 ml de metanol grado HPLC (eluyente) en el cuerpo de vidrio. Eluir las aflatoxinas de la columna a un vial de vidrio por pasaje lento del metanol a travs de la columna a un flujo de 1 gota por segundo. Se recomienda la reversin de la direccin del flujo (back flushing) con el eluyente por 3 veces para asegurarse una completa desnaturalizacin del anticuerpo monoclonal y la subsiguiente liberacin de las aflatoxinas a la solucin. Luego de la elusin, pipetear 1 ml de agua destilada en el cuerpo de vidrio de la jeringa, pasar por la columna y colectar en el vial mbar, dando un volumen total de 2ml.

Nota: El uso de Kobra Cell (K01) requiere solamente una bomba en el HPLC y evita la necesidad de una cnula de reaccin y de un bao de agua. Ms informacin sobre el Kobra Cell (K01) se puede obtener de R-Biopharm Rhne Ltd.

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La concentracin real de aflatoxina se determina utilizando la siguiente ecuacin: [Aflatoxina], ng/ml = ABSORBANCIA 362 x 1000 x coeficiente En la cual el coeficiente para la toxina respectiva es: B1 14.31 B2 13.08 G1 18.53 G2 17.10
B B

Derivatizacin Post columna utilizando Iodo

Pre Columna: Columna Analtica: Fase mvil: Reactivo HPLC Post columna Inertsil ODS-3 5m, 4mm x10mm (Hichrom) equivalente Inertsil ODS-3V 5m, 4.6mm x150mm (Hichrom) equivalente 60:40 v/v agua:metanol Disolver 40g de cristales de iodo en 1 litro de agua, agitar al menos 1 hora y almacenar en recipiente caramelo. Antes de usar, filtrar 500ml de la solucin stock a travs de papel de filtro Whatman No. 4 y colectar en botella caramelo. Preparar solucin fresca diariamente Nota: Para rellenar la solucin stock saturada, llevar a 1 litro con agua destilada deionizada y agitar por 1 hora. 2 Bombas del HPLC Detector de Fluorescencia: Horno: Integrador: Inyector: Volumen de Inyeccin: Para dispensar la fase mvil a un flujo de 0.8ml/minuto y (b) solucin saturada de iodo a un flujo de 0.4ml/minuto Excitacin: 362nm Emisin: 425nm (B1 y B2) 455nm (G1 y G2) Mantiene la Precolumna y la columna analtica a 40C Del proveedor preferido Vlvula Reodyne sampleador 100l

Diluir cada toxina con metanol para dar 1000ng/ml. Mezclar alcuotas de 1ml de las soluciones de toxina para dar una mezcla de 1000ng de aflatoxinas totales por 1ml de metanol. Para preparar una curva de calibracin de estndares de 4 puntos, basado en la presuncin que el equivalente a 1g se pasa por la columna de inmunoafinidad: Tomar 80l de solucin 1000ng de aflatoxinas totales (a b) y llevar a 2ml con metanol:agua 1:1 v/v (=40ng/ml 80ppb) Tomar 1ml de 40ng/ml y llevar a 2 ml con metanol:agua 1:1 v/v (20ng/ml 40ppb) Tomar 1ml de 20ng/ml y llevar a 2 ml con metanol:agua 1:1 v/v (10ng/ml 20ppb) Tomar 400l de 10ng/ml y llevar a 2 ml con metanol:agua 1:1 v/v (2ng/ml 4ppb) Inyecta 100l de cada solucin en el HPLC. El orden de elusin es G2, G1, B2 y B1.

CALIDAD
Los productos RBR estn desarrollados, elaborados y distribuidos bajo un sistema de manejo de la calidad ISO 9001, garantizando productos de calidad consistente que siempre cumplen nuestras especificaciones de rendimiento. Nuestros productos han sido utilizados en varios estudios colaborativos para el desarrollo de mtodos estndar europeos e internacionales y son ampliamente utilizados por importantes instituciones, compaas alimenticias y laboratorios oficiales. Estn disponibles referencias de los usuarios de los productos de RBR por pedido.

PREPARACIN DE ESTNDARES DE AFLATOXINA PARA EL ANLISIS POR HPLC Preparacin de 1000ng/ml de Solucin stock de Aflatoxina
a) Solucin de Estndar de Aflatoxina lista para usar (P22, 1000ng/ml) est disponible en R-Biopharm Rhne Ltd. b) Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, polvo cristalino, se pueden conseguir en Sigma. Cada polvo de aflatoxina se resuspende en benceno:acetonitrilo (98:2 v/v) y se deja toda la noche a temperatura ambiente para dar una solucin stock concentrada conteniendo 1mg/ml. Estas soluciones se pueden almacenar a -20C hasta por 2 aos sin prdida de actividad.
B

SOPORTE TECNICO
RBR ofrece a los usuarios de nuestros productos asistencia o asesoramiento cuando estos lo requieran. Por tal motivo nos complace en ofrecer los siguientes servicios a los usuarios de nuestros productos: Anlisis de muestras problemas Notas de aplicacin para muestras dificultosas Referencias bibliogrficas de la Biblioteca RBR Instalacin y asesoramiento del Kobra cell Asesoramiento de condiciones para HPLC Asesoramiento en preparacin y tratamiento de estndares. Actualizacin en legislacin, muestreo y otras novedades por e-mail

Para preparar la solucin de trabajo de los estndares de aflatoxina, primero diluir 50l de la solucin stock concentrada de cada toxina con 5 ml de metanol. Medir la absorbancia de cada una de las soluciones de toxina utilizando un espectrofotmetro UV, seteado a 362nm, haciendo un blanco con metanol. Las lecturas se hacen por triplicado y se calcula el promedio en cada caso.

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LINEA DE PRODUCTOS PARA MICOTOXINAS
A) Columnas de inmunoafinidad para anlisis cuantitativo de micotoxinas por HPLC:DONPREP (P50B) EASI-EXTRACT Zearalenone (RP90) FUMONIPREP (P31) AFLAPREP (P07) EASI-EXTRACT Aflatoxin (RP70N) AFRAPREP M (P04) OCHRAPREP (P14B) B) Estndares y materiales de referencia RBR elabora una gama de estndares de micotoxinas para uso en HPLC y un gran nmero de materiales de referencia. Para mas detalles, por favor contctese con RBR. C) Kobra Cell para derivatizacin de aflatoxinas B1 y G1 Es la nica celda electroqumica recomendada en mtodos estndar de la EC. El equipo es utilizado por institutos de referencia, empresas alimentarias y laboratorios gubernamentales en todo el mundo. D) Productos adicionales para el anlisis de micotoxinas:RBR tambin provee un nmero de columnas de inmunoafinidad para tests de screening adems de Aflacards y sistemas de ELISA para la deteccin de una gama de micotoxinas.

Referencias
1. Commission Directive 98/53/EC, Laying down the sampling methods and the methods of anlisis for the oficial control of the levels for certain contaminants in foodstuffs, Oficial Journal of the European Communities L201/93 2. Determination of the levels of aflatoxin in peanut butter using Aflaprep Immunoaffinity column clean up procedure: Collaborative trial, J. Assoc. Public Analysts. 1992, 28, 1-10. 3. Determination of the levels of aflatoxin in medicinal herbs and plant extracts, Reif and Metzger, J. Chromatography A. 692, 1995, 131-136. 4. Candlish, A.A.G., Haynes, C.A., & Stimson, W.H. Detection and determination of aflatoxins using affinity chromatography. Internacional Journal of Food Science and Technology (1998) 23. 479-485. 5. Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography using post column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste and pprika powder: Collaborative Study. J.AOAC Internacional Vol 83. No 2, 2000. 6. Commission Regulation (EC) No 2174/2003. establixhing maximum limits for aflatoxins in a variety of food products

Garanta
R-Biopharm Rhne Ltd. no garantiza ni expresa ni explcitamente, excepto que todos los productos elaborados por R-Biopharm Rhne Ltd. estn hechos con materiales de calidad apropiada. Si algn material est defectuoso, RBiopharm Rhne Ltd. le va a proveer un producto de reemplazo. El usuario asume todos los riesgos y responsabilidades que resulten del uso de los productos y procedimientos de R-Biopharm Rhne Ltd. R-Biopharm Rhne Ltd. no ser responsable de cualquier dao, prdida gasto originado directa indirectamente del uso de los productos procedimientos de R-Biopharm Rhne Ltd.

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Los productos RBR estn elaborados bajo un sistema de Gestin de Calidad ISO 9001:2000 AFLAPREP PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO Solvente de Extraccin: Metanol Analistas que deseen utilizar procedimientos alternativos de extraccin (acetonitrilo o cloroformo) debern consultar la seccin Procedimientos de Extraccin de Muestras (solventes a, b c) en Aflaprep Instrucciones de Uso.

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