Transfer en CIA de ADN en Plantas

EDICIN N 28
Elaboracin de una planta transgnica: Tcnica de Biobalstica

Como se explic en el Cuaderno N 18 las tcnicas de ingeniera gentica y el uso de nuevos conocimientos cientficos permiten modificar los organismos mediante intervenciones precisas, rpidas y controladas. Incluso, es posible transferir a las plantas informacin gentica de organismos no emparentados. En la actualidad esta metodologa es aplicada rutinariamente y son muchos los esfuerzos y los recursos que se invierten con el objetivo de optimizar las tcnicas para trasladarlas a diferentes especies vegetales. La transformacin gentica ha sido adoptada como un mtodo para mejorar o introducir nuevas caractersticas, y para entender el funcionamiento de las plantas. Mtodos de transformacin gentica La transformacin de plantas depende de la introduccin estable de los transgenes dentro del genoma vegetal. Con el objeto de hacer ms fcil y eficiente la transferencia de ADN hacia clulas o tejidos vegetales, se han desarrollado diferentes mtodos de transformacin gentica, que se pueden dividir en dos clases de acuerdo con el mecanismo utilizado para la transferencia: 1. mtodos basados en la utilizacin de vectores biolgicos, como Agrobacterium tumefaciens o virus vegetales; 2. mtodos que consisten en la transferencia directa de ADN, como el de biobalstica. Si bien en la actualidad es posible obtener plantas transgnicas de diferentes especies con Agrobacterium, el rango natural de hospedantes de la bacteria se constituy en un importante factor limitante en los primeros intentos por transformar monocotiledneas y algunas dicotiledneas que no eran susceptibles a la misma. En consecuencia, se desarrollaron mtodos alternativos de transferencia directa de ADN basados en procedimientos de naturaleza qumica, fisicoqumica, o mecnica. Estos nuevos mtodos, permiten transferir ADN desnudo (sin mediacin de vectores biolgicos), y el ms ampliamente utilizado en la transformacin gentica de plantas es el bombardeo con micropartculas tambin conocido como biobalstica. El desarrollo de este mtodo tuvo grandes implicancias en lo que se refiere al mejoramiento gentico de plantas de inters agronmico como arroz, maz o soja, que hasta entonces no se haban podido transformar con Agrobacterium. Qu es la Biobalstica? El trmino biobalstica deriva de la conjuncin de biologa y balstica o balstica biolgica. Este es un mtodo muy original ideado y refinado en la dcada de 1980
"El Cuaderno de PorquBiotecnologa" es una herramienta didctica creada y desarrollada por el equipo pedaggico del Programa Educativo PorquBiotecnologa. Su reproduccin est autorizada bajo la condicin de que se aclare la autora y propiedad de este recurso pedaggico por parte del Programa Educativo PorquBiotecnologa.
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por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de clula. En este procedimiento el ADN es introducido en las clulas por medio de partculas microscpicas (micropartculas) aceleradas a velocidades supersnicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. Las partculas son aproximadamente esfricas (de 0.4 a 2.0 micrmetros de dimetro), estn hechas de materiales densos como oro o tungsteno (ver microfotografa 1 y 2 , respectivamente), y se recubren con el ADN que se desea transferir a las plantas. Para que las micropartculas puedan atravesar las membranas celulares y llegar al ncleo de las clulas blanco, son impulsadas a gran velocidad por explosin de plvora seca, liberacin de gas comprimido a alta presin (aire, helio, CO2 1 2 o N2 ), o por una descarga elctrica de una Micropartculas de oro (1) y tungsteno (2) gota de agua. Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de las micropartculas debido a las modificaciones del entorno inico.
Microcan con partculas metlicas rodeadas de ADN.

Fuente:
http://www.xtec.es/~jcarrasc/transgenicas.htm
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Si las partculas atraviesan las membranas y son atrapadas en el ncleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinacin al azar, lo que se considera como transformacin estable. La transformacin estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de seleccin in vitro (ver cuadernos N 5, 18 y 67) que permita distinguir clulas transformadas y no transformadas.
En este mtodo de transformacin las construcciones genticas son ms simples e incluyen los genes de inters y de seleccin con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plsmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las clulas, o bien de forma de molcula lineal (el plsmido cortado en un punto), a diferencia de los plsmidos utilizados con Agrobacterium (plsmido ti desarmado). Tambin es muy comn que una vez obtenida la construccin gentica dentro de un plsmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para slo tener la secuencia con los genes de inters y de seleccin (incluidas las secuencias regulatorias) y as reducir el fragmento de ADN a transferir. Un poco de historia El primer can gnico desarrollado operaba de forma similar a una pistola, en la que una bala de plstico acelerada por explosin de plvora liberaba una salva de micropartculas metlicas revestidas de ADN. Como se muestra en el esquema, luego del impacto, la bala quedaba retenida en el extremo del tubo de aceleracin y las micropartculas eran impulsadas hacia el tejido blanco a travs de un orificio existente en la placa.
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La primera demostracin de que el sistema funcionaba se realiz en 1987 al introducir ADN en clulas epidrmicas de cebolla. Poco despus, el mtodo fue probado en diferentes organismos con xito. As el mtodo de bombardeo de
micropartculas se constituy en el segundo mtodo de transformacin gentica de plantas ms empleado, luego del de Agrobacterium. Posteriormente este can gnico fue modificado y se reemplaz la carga de plvora por presin de gas para generar el impulso de las micropartculas. El modelo ms utilizado en la actualidad es el can de alta presin de helio PDS-1000/He, registrado como sistema biobalstico por Dupont. Este can consta de una cmara principal en donde se bombardea el tejido blanco en condiciones de vaco parcial. El helio comprimido es liberado a gran velocidad hacia la cmara, e impulsa una membrana de plstico que lleva las micropartculas recubiertas de ADN, las cuales son as aceleradas hacia el tejido blanco.
Fuente : www.biorad.com
En 1996 se empez a utilizar una pistola gnica de mano como alternativa al can PDS 1000/He. Este dispositivo permite trabajar sin vaco con virtualmente cualquier
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tipo de clulas o tejido blanco. Adems puede utilizarse para realizar estudios en organismos vivos.
Fuente: http://science.marshall.edu/harrison/research.html
Cules son las aplicaciones de la Biobalstica? El bombardeo de micropartculas es considerado un mecanismo universal, ya que, por su naturaleza fsica, permite introducir ADN (sin necesidad de vectores) en cualquier tipo de tejido o clula. Ha sido utilizado para introducir y expresar material gentico no slo en plantas sino tambin en bacterias, protozoarios, algas, hongos, clulas y tejidos animales (insectos, peces, aves y mamferos) y an animales y plantas in vivo. Al elegir un tejido blanco para la transformacin por biobalstica debe tenerse en cuenta la capacidad de la especie de inters para regenerar in vitro. Entre los explantos vegetales utilizados con mayor xito, se encuentran las hojas, suspensiones celulares, meristemas, embriones, primordios foliares, cotiledones y callos (ver cuaderno N35 y 56). Adems en la actualidad,
constituye el nico medio que permite transformar organelas celulares, como mitocondrias y cloroplastos de modo reproducible. Este mtodo a su vez es sumamente til para analizar la funcin y regulacin gnica, transferir ARN viral y estudiar vas metablicas. Los logros ms destacados en la generacin de plantas transgnicas por medio de este mtodo, incluyen especies de gran importancia econmica como son la soja, el maz, el arroz, el sorgo, la papaya, la caa de azcar, el trigo y el esprrago.
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CONSIDERACIONES METODOLGICAS Como ya se expresara en el Cuaderno N 18, al trabajar el tema de mejoramiento vegetal mediante transformacin gentica es importante tener siempre presente la diferenciacin entre mejoramiento convencional (cruzamiento y mutagnesis) y mejoramiento mediante ingeniera gentica. A su vez, es importante enfatizar que en ambos casos se trata de modificacin gentica, aunque mediante diferentes tcnicas y con diferentes resultados (en cuanto a direccionalidad y previsibilidad de los cambios), y que la biotecnologa moderna viene a complementar prcticas convencionales. La comprensin del tema de biobalstica requiere de ciertos conocimientos de fsica, por lo que se adapta preferentemente para el trabajo con alumnos de polimodal (secundario). Con alumnos ms pequeos es posible abordarlo, pero a modo de relato simple, sin entrar en detalles de la tcnica. Se sugiere, al abordar el tema de biobalstica con alumnos de secundario, coordinar el trabajo con el profesor de fsico-qumica para aplicar los siguientes conceptos que se utilizan en el texto: velocidad, aceleracin de partculas, tamao de partcula, los elementos qumicos y sus propiedades (oro, tungsteno), descarga elctrica, presin de gas, gas comprimido, alta presin de helio, vaco, etc. Si es posible, se recomienda ver la animacin de la tcnica de biobalstica que se encuentra en el sitio http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/images/Genegun1.html. Aunque las explicaciones que acompaan la animacin son en ingls, esto no impide comprender la secuencia y su significado. Incluir la animacin como parte de la explicacin resulta de utilidad para que los alumnos, incluso los de primaria, puedan interpretar la tcnica. En el mismo sitio http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/genetransfer.html se incluye tambin una animacin de la tcnica de modificacin mediada por la bacteria Agrobacterium si se quisiera trabajar ambos temas. Se sugiere trabajar la tcnica de transferencia de genes mediante Agrobacterium ya que introduce el tema y se menciona en este Cuaderno, antes de trabajar la tcnica de biobalstica. Al trabajar estas tcnicas se puede repasar las caractersticas de la clula vegetal y, particularmente, la presencia de la pared celular (que est ausente en la clula animal) y que es ms rgida y de composicin diferente a la membrana celular (presente en todas las clulas). Las representaciones grficas (esquema, grficos, etc.) y tambin las animaciones audiovisuales, pueden resultar una herramienta til para la comprensin de ideas y conceptos ya que permiten comprimir informacin, localizar ideas claves y establecer relaciones entre ellas. Pero, en algunos casos, las representaciones grficas resultan difciles de interpretar por los alumnos y pueden obstaculizar la comprensin. Es recomendable dedicarle un tiempo al anlisis para favorecer su
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interpretacin y, en consecuencia, la comprensin de los conceptos que se pretende transmitir. Se sugiere explicitar los cdigos y simbolismos que se emplean, y favorecer la explicitacin por parte de los alumnos mediante la construccin de equivalencias con otros lenguajes: traducir los textos en esquemas y los esquemas en textos. Las actividades que se presentan a continuacin ofrecen situaciones para aplicar la interpretacin de esquemas y fotografas. Cuando se realiza un trabajo de traducir una imagen visual a un lenguaje escrito es til y un ejercicio interesante, limitar la cantidad de lneas que debe ocupar el texto (por ejemplo, entre 5 y 8 lneas). De esta forma se exige a los alumnos la organizacin, y expresin clara y concisa de los conceptos, un ejercicio que requiere de prctica. CONCEPTOS RELACIONADOS ADN; genes; ingeniera gentica; conceptos de fsico-qumica: aceleracin de partculas, tamao de partcula, los elementos qumicos y sus propiedades (oro, tungsteno), descarga elctrica, presin de gas, gas comprimido, alta presin de helio, vaco; clula vegetal y clula animal; clasificacin de las plantas.
ACTIVIDADES
Objetivos: - Repasar los conceptos trabajados en el texto - Aplicar los conocimientos adquiridos a la interpretacin de esquemas o representaciones grficas. - Analizar casos reales del empleo de tcnicas de transformacin gentica. Actividad 1. Repaso de conceptos a partir de una representacin grfica
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a.
Redactar un texto que explique qu representa el siguiente esquema. La explicacin debe incluir los conceptos y estructuras que aparecen en la ilustracin. Rta. El esquema representa las dos tcnicas (Agrobacterium y biobalstica)
por medio de las cuales se puede transformar una planta. En este caso, se transfiere a la clula de la planta una caracterstica de resistencia viral. El gen transferido se incorpora a un cromosoma del genoma de la planta de manera estable.
b. c.
Indicar cules son los mtodos representados. Rta. Mtodo de Agrobacterium

tumefaciens y de Biobalstica.
Indicar en cada mtodo cmo es trasladado el ADN forneo hacia las clulas vegetales. Rta. En el Mtodo de Agrobacterium el ADN forneo es transferido en la
secuencia de ADN-T del plsmido de Agrobacterium y en la Biobalstica el ADN es transferido desnudo (sin vector) pegado a micropartculas de metal (oro o tungsteno) que son impulsadas a gran velocidad hacia las clulas vegetales.
d.
Indicar en qu consiste el proceso de seleccin in vitro. Rta. Una vez que las
clulas blanco son bombardeadas o puestas en contacto con Agrobacterium tumefaciens se las debe cultivar en un medio de cultivo con un agente de seleccin para rescatar las clulas que hayan sido transformadas. Para que se pueda realizar este proceso, junto con el gen de inters las clulas deben recibir un gen de seleccin que al expresarse les confiera a las clulas algn tipo de resistencia por ejemplo a un antibitico o herbicida.
e.
Cul fue el motivo que impulso a los investigadores a desarrollar un mtodo de transformacin alternativo al de Agrobacterium? Rta. El rango de hospedantes de
Agrobacterium limitado a unas pocas dicotiledneas, la falta de susceptibilidad a la infeccin de ciertas especies vegetales especialmente de inters agronmico.
Actividad 2. Repaso de conceptos. Verdadero o Falso Indicar cul de las siguiente afirmaciones es verdadera o falsa. En caso de ser falsa justificar. a. La transformacin gentica de plantas consiste en la transferencia de material gentico proveniente del mismo u otro organismo. VERDADERO b. El cultivo de tejidos es utilizado para regenerar plantas a partir de clulas vegetales que han sido transformadas. VERDADERO c. La biobalstica es un mtodo de transformacin gentica que utiliza un vector biolgico para transferir ADN hacia clulas blanco. FALSO. La biobalstica
transfiere ADN directamente sin utilizar un vector biolgico.
d. Si el ADN transferido por algn mtodo de transformacin atraviesa la membrana plasmtica de una clula vegetal y se aloja en su citoplasma, la planta regenerada a partir de esa clula ser transgnica. FALSO: la planta ser
transgnica slo si el ADN transferido se integra a un cromosoma de la planta y si luego permanece estable en el genoma de la planta de modo de ser transferido (heredado) a la descendencia.
e. En las tcnicas de transformacin gentica es necesario disponer del gen de

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inters dentro de un vector (vehculo) apropiado para ser transferido al tejido que se quiere transformar, como por ejemplo un plsmido. VERDADERO f. Los mtodos directos de transferencia de ADN como la Biobalstica, permiten transferir ADN desnudo sin mediacin de vectores biolgicos. VERDADERO g. En la transformacin mediada por Agrobacterium tumefaciens los genes de inters son transferidos a las clulas vegetales incluidos en la secuencia de ADNT . VERDADERO h. Siempre que un ingeniero gentico usa Agrobacterium para transformar una planta, sta desarrolla los tumores tpicos de la agalla de la corona, adems de expresar el gen de inters agronmico que se le ha transferido. FALSO: la planta
i. El mtodo de transformacin mediada por Agrobacterium permite transferir ADN a cloroplastos. FALSO: El nico mtodo reportado hasta el momento que permite
transformar cloroplastos es la biobalstica.
desarrollar los tumores tpicos de la agalla de la corona slo si no se sacaron de la secuencia de ADN-T los genes que la bacteria posee (para inducir la formacin de tumores) y son transferidos a las plantas cuando las infecta. Cuando un investigador quiere transformar una planta para expresar una caracterstica beneficiosa saca los genes de la bacteria que provocan la enfermedad de la agalla y en su reemplazo coloca los genes de inters y de seleccin.
j. El primer can gnico usado en la transferencia directa de ADN fue un dispositivo similar a una pistola en la que un percutor generaba una explosin de plvora impulsando una bala de plstico con las partculas de metal y ADN hacia el tejido blanco. VERDADERO
Actividad 3. Transformacin gentica en fotos La siguiente figura muestra, a travs de fotografas, los pasos de transformacin gentica de una gramnea. Analizar la figura y responder a las preguntas que siguen.
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A- Can gnico PDS/1000-He usado para bombardeo de micropartculas. B- Clulas en suspensin de Festuca arundincea dispuestas sobre papel previo al bombardeo. C, D, EPlntulas transgnicas de los callos resistentes obtenidos en seleccin. F- Plantas transgnicas creciendo en invernadero. Fuente: http://science.marshall.edu/harrison/research.html
a. Qu tipo de mtodo de transformacin se utiliza? Rta. Biobalstica. b. Qu tcnica de propagacin se utiliza para regenerar plantas completas? Rta.
Cultivo in vitro.
c. La figura C muestra callos que proliferan a partir de las clulas cultivadas in vitro con agente de seleccin, luego del bombardeo. Indicar cul es la funcin del agente de seleccin. Rta El agente de seleccin es una sustancia que facilita la
identificacin temprana de las clulas transformadas (que regenerarn plantas completas) porque slo estas sobreviven a la presencia del agente de seleccin en el cultivo. Esto es posible gracias a la expresin del gen de seleccin que se transfiere junto al gen de inters.
d. Si se desea que la gramnea resista el cultivo en lugares donde escasea la lluvia qu debera incluir la construccin gentica que se elabore para transformar la planta? Rta. Debera tener el gen de inters que le otorgue resistencia a sequa, un gen
selector para identificar las clulas transformadas de las que regenerarn plantas transgnicas, y las secuencias regulatorias respectivas.
e. Si la planta a transformar fuera maz y dentro de la secuencia de ADN transferido se hubiese incluido un gen de resistencia BT: qu caracterstica nueva tendr la planta de maz? qu beneficios obtendra el productor? Rta. La
planta ser resistente a insectos ya que expresar una protena BT insecticida. El productor ahorra en insecticidas y previene el ataque de insectos, el cultivo es
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seguro en s mismo. Adems disminuye el uso de insecticidas sintticos txicos que de otra manera se seguiran usando.
MATERIAL DE CONSULTA 1. Documentos de la biblioteca del Consejo Argentino para la Informacin y el desarrollo de
la Biotecnologa (ArgenBio). Adopcin, beneficios e impacto. http://www.argenbio.org/h/biblioteca/index.php
2. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal. (2004). Ediciones Instituto Nacional de Tecnologa

Agropecuaria. Editores: Dra. Viviana Echenique, Dra. Clara Rubinstein, Ing. Agr. Luis Mroginski. http://www.argenbio.org/h/biblioteca/libro.php
3. Animacin simple acerca del proceso de transformacin mediante Agrobacterium.

http://www.agriculture.purdue.edu/agbiotech/images/leafdisk1.html
4. Cultivos transgnicos. Texto, esquemas, fotos y animaciones.
5. http://www.colostate.edu/programs/lifesciences/CultivosTransgenicos/sp_how.html#tra
nsformation
6. Las plantas transgnicas (en espaol). EIBE (Iniciativa Europea para la Educacin en Biotecnologa). Texto e ilustraciones.
7. http://www.ipn.uni-kiel.de/eibe/UNIT09ES.PDF 8. Fuente muy completa con links que permiten navegar y entrar en diferentes temas de
biologa. En espaol http://fai.unne.edu.ar/biologia
9. Aplicaciones de la biotecnologa en el sector agropecuario y agroalimentario. Mtodos de
Obtencin de Plantas genticamente modificadas. Presentacin Power Point. Silvana Petruccelli. Centro de Investigacin y desarrollo en criotecnologa de Alimentos. Facultad de Ciencias Exactas UNLP. http://www.inta.gov.ar/pergamino/info/prensa/biotec/Dra_S_Petrucelli.pdf

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Microcan con partculas metlicas rodeadas de ADN.

Indicar cules son los mtodos representados. Rta. Mtodo de Agrobacterium

e. En las tcnicas de transformacin gentica es necesario disponer del gen de

2. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal. (2004). Ediciones Instituto Nacional de Tecnologa

3. Animacin simple acerca del proceso de transformacin mediante Agrobacterium.

4. Cultivos transgnicos. Texto, esquemas, fotos y animaciones.

9. Aplicaciones de la biotecnologa en el sector agropecuario y agroalimentario. Mtodos de

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