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La microscopie est divise en deux grands groupes I-La microscopie optique ou photonique: La microscopie en lumire directe La microscopie en contraste de phase La microscopie fluorescence II-La microscopie lectronique: La microscopie transmission La microscopie balayage
Soit en absorbant certaines longueurs dondes de la lumire. Cest la microscopie en lumire directe.
Soit en provoquant un dphasage des diffrents rayons lumineux. Cest la microscopie en contraste de phase.
Soit en mettant de la lumire une autre longueur donde que celle dorigine. Cest la microscopie fluorescence.
Introduction la Fluorescence
La premire observation de la fluorescence: John Frederick William Herschel En 1845 Solution de quinine
Introduction la Fluorescence
LUMINESCENCE
PHOTOLUMINESCENCE
FLUORESCENCE
PHOSPHORESCENCE
La photoluminescence est un phnomne radiatif conscutif une excitation lumineuse (photons de lumire visible ou ultraviolette). La chimiluminescence est un phnomne radiatif conscutif une raction chimique (chimiluminescence vraie) ou enzymatique (bioluminescence).
Introduction la Fluorescence
La Fluorescence Molculaire
Phosphorescence Croisement intersystme Emission de fluorescence Fluorescence retarde Conversion interne Transfert de charge intramolculaire
hv
Changement conformationnel
MOLECULE EXCITEE
Transfert de proton transformation photochimique Formation dexciplexe Formation dexcimre Transfert dnergie Transfert dlectron
E0
Absorption UV
E= hc/
Remarque: du fait de la dissipation dnergie, lnergie mise est plus faible que lnergie excitatrice et donc la longueur donde est plus leve. hvex > hvem
ex < em
Principe de la fluorescence
S2 S1
CI
10-10-10-8S CIS Relaxation non radiative Fluorescence Absorption Transfert dnergie Non radiatif
10-15S
hvex
10-6-1S
Etat fondamental S0
Transitions radiatives: Fluorescence et phosphorescence. Transitions non radiatives: conversion interne (CI), croisement intersystme (CIS).
Principe de la fluorescence
Phosphorescence
Absorption
Dsexcitation
Absorption
Dsexcitation
10-15S
10-10-10-7S
10-6-1S
Etat fondamental S0 Lmission de lumire se produit entre deux tats de mme multiplicit (singulet excitsingulet fondamental).
Etat fondamental S0 Lmission de lumire se produit entre deux tats de multiplicit diffrentes (Triplet T1singulet fondamental S0). Processus plus long que la fluorescence.
Introduction la Fluorescence
Un spectre dmission de fluorescence est un histogramme des nergies libres par la population de fluorophores lors de la transition radiative vers les diffrents niveaux de rsonances de ltat fondamental S0.
S1
Etat excit
S0
Etat fondamental
intensit
Introduction la Fluorescence
ABS.
EM.
La dtection dune espce fluorescente est dautant plus facile que le dplacement de stokes est grand Exemple: pour la fluorescine, respectivement 495 nm et 521 nm, dplacement de Stokes = 26 nm.
Principe de la fluorescence
Caractristiques de la fluorescence
Longueur donde dmission (maximum du spectre): em Rendement quantique de fluorescence: Coefficient dextinction ou absorbance spcifique: Lintensit de fluorescence ou brillance: If Temps de vie de fluorescence:
Caractristiques de la fluorescence
1) Excitation et Emission
Lexcitation dun fluorophore 3 longueurs dondes ne change pas le profil dmission correspondant Par contre, lintensit dmission est proportionnelle lintensit de lexcitation
Caractristiques de la fluorescence
2) Rendement quantique
Lefficacit de fluorescence pour une molcule donne est dtermine par le rendement quantique . Dfini par le rapport entre le nombre de photons mis et le nombre de photons absorbs par la molcule. = If / Ia
Le rendement quantique peut varier en fonction de lenvironnement des fluorochromes: concentration, polarit, PH
Caractristiques de la fluorescence
Reflte la probabilit dabsorption dune molcule. Sa valeur peut constituer un critre pour le choix des colorants Plus est grand, Plus intense sera la fluorescence intensit lumineuse incidente gale
Caractristiques de la fluorescence
Ia = Io - It = Io ( 1 - 10-.C.l )
qui se simplifie :
If 2,3 f . Io . . C. l
Soit une relation linaire entre C, la concentration du fluorophore, et If, lintensit dmission Io : intensit lumineuse incidente It : intensit lumineuse transmise C : concentration de la molcule absorbante, en mol.l-1 (M) l : trajet optique, en cm If : intensit dmission
Caractristiques de la fluorescence
Fluorescine Cyanine5 EYFP B-phycorythrine Tryptophan Quantum Dot 605 Quantum Dot 655
80 000 200 000 84 000 2 410 000 6 000 1 000 000 3 000 000
Caractristiques de la fluorescence
f = f . N
N , constante de temps intrinsque de ltat excit
Quelques exemples
Caractristiques de la fluorescence
0 ns
Impulsion laser (picoseconde)
5 ns
On utilise une lumire pulse pour mesurer le temps de vie de fluorescence (la dtection doit tre rapide). Les molcule sont excites t=0, puis on enregistre lintensit de fluorescence en fonction du temps (Rsolue en temps)
10 ns
32 ns
Daprs Y Usson
Caractristiques de la fluorescence
Daprs Y Usson
Les molcules organiques: colorants, les sondes fluorescentes Les protines auto-fluorescentes: GFP et ses drivs Les nano-cristaux semi-conducteurs: quantum dots
Fluorescine
Texas Red
DAPI
Phosphore Oxygne
Introduction la Fluorescence
Spectres dabsorption et dmission de liso-thiocyanate de fluorescine et de liodure de propidium
Les fluorochromes en biologie Quelques exemples des produits drivs de la fluorescine (1)
Les fluorochromes en biologie Quelques exemples des produits drivs de la fluorescine (2)
Une famille de fluorophores pour marquer des protines, des anticorps secondaires, etc
Caractristiques de la fluorescence
FLUORESCENCE MOLECULAIRE
Inhibiteurs
PH
Reprsentation schmatique des diffrents facteurs environnementaux susceptibles dinfluencer la fluorescence (tir du livre de Bernard Valeur)
Quenching de la fluorescence
Diminution du rendement quantique dun fluorochrome par les conditions environnementales comme la force ionique, le pH, leffet des solvants ou la prsence dautres fluorochromes qui rduisent lefficacit dmission. Le quenching correspond une relaxation non-radiative des lectrons excites vers ltat fondamental.
Exemple de quenching de fluorescence de la 5-tetramethylrhodamine couple des primers M13 par des sondes non fluorescentes attaches en 3.
Fluorescence emission
polarit
Ex= 488 nm
Ex= 514 nm
Ex= 534 nm
Le photobleaching (photoblanchiment) correspond la destruction irrversible dun fluorochrome excit par la lumire en prsence doxygne. Le fading correspond la diminution de fluorescence sur une longue priode sans ncessairement dexcitation lumineuse (simple oxydation)
Fluorescein
Les chantillons ont t illumins continuellement et une image a t enregistre toutes les 5 secondes avec une camra CCD.
(Daprs C. Poujol)
Profil de photoblanchiment de la fluorescine et du Texas-Red. Les mmes chantillons sont placs dans un milieu de montage ProLong (antifading reagent), dans un produit X ou dans un milieu sans anti-fading . La prsence danti-fading prserve lintensit de fluorescence en inhibant la formation de radicaux libres.
(Daprs C. Poujol)
Attnuer lintensit lumineuse excitatrice Augmenter la vitesse de balayage en microscopie confocale ou diminuer le temps dillumination en microscopie plein champ (obturateur rapide, temps dexposition diminu, rapidit de lacquisition en Z
Coefficient dextinction important Fort rendement quantique (0,8-0,9) Faible rendement triplet Dure de vie de ltat excit courte (3ns) Grand dcalage de Stokes Faible photoblanchiment
Lauto-fluorescence
La magie des QDs est de pouvoir modifier leurs proprits optiques loisir simplement en changeant leur taille, leur forme ou leur composition.
(daprs C.Poujol)