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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS

BIOMETRIA, TAXA DE ECLOSO E MICROBIOTA BACTERIANA E FNGICA DE OVOS DE JACAR-DOPANTANAL - Caiman yacare DAUDIN, 1802

Rachel de Sousa Lima Pulcherio

CUIAB - MT 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS

BIOMETRIA, TAXA DE ECLOSO E MICROBIOTA BACTERIANA E FNGICA DE OVOS DE JACAR-DOPANTANAL - Caiman yacare DAUDIN, 1802

Autora: Rachel de Sousa Lima Pulcherio

Orientadora: Prof. Dr. Rosa Helena dos Santos Ferraz Co-Orientadora: Prof. Dr. Valria Dutra
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias, rea de concentrao: Medicina Veterinria, da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para obteno do ttulo de Mestre em Cincias Veterinrias.

CUIAB MT 2012

FICHA CATALOGRFICA

Dados Internacionais para Catalogao na Publicao (CIP) Bibliotecria: Patrcia Jaeger / CRB1-1736.

P981b

Pulcherio, Rachel de Sousa Lima.

Biometria, taxa de ecloso e microbiota bacteriana e fngica de ovos de Jacar-do-Pantanal Caiman yacare DAUDIN, 1802 / Rachel de Sousa Lima Pulcherio - Cuiab: Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT, 2012. 91f.:il. Dissertao apresentada ao Programa de Ps Graduao em Cincias Veterinrias, rea de concentrao: Medicina Veterinria, da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para obteno do ttulo de Mestre em Cincias Veterinrias. Orientadora: Prof. Dr. Rosa Helena dos Santos Ferraz. Co Orientadora: Prof. Dr Valria Dutra. 1 Caiman yacar Jacar-do-Pantanal 2. Microbiota bacteriana e fngica. 3. Biometria. 4. Ninho. 5. Enterobactria 6. Espcie Crocodiliano 7. Criao Comercial Jacar 8. Incubao Artificial 9. Taxas de Ecloso 10. Ovos de Jacar. I. Ttulo. II. Pulcherio, Rachel de Sousa Lima. III. UFMT. CDU: 598.14:636:591.613 (817.2)

MINISTRIO DA EDUCAO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO PR-REITORIA DE ENSINO DE PS-GRADUAO PROGRAMA DE ENSINO DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS
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FOLHA DE APROVAO
TTULO : "Biometria, taxa de ecloso e microbiota bacteriana e fngica de ovos de jacar-do-pantanal - Caiman yacare Daudin, 1802."

AUTOR : Mestranda Rachel de Sousa Lima Pulcherio

Dissertao defendida e aprovada em 29/02/2012.

Composio da Banca Examinadora:

Presidente Banca / Orientador Instituio : Examinador Interno Instituio :

Ps-Doutor(a) Rosa Helena dos Santos Ferraz

Doutor(a)

SANDRA HELENA RAMIRO CORRA Zilca Maria da Silva Campos

Doutor(a) Examinador Externo Instituio : Embrapa Pantanal

Doutor(a) Examinador Suplente Valria Dutra Instituio : UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CUIAB, 29/02/2012.

PARECER DA COMISSO DE BIOTICA

DEDICATRIA

Dedico este trabalho ao meu filho Davi, que enche meus dias de luz; e minha famlia, que, com seu imenso amor e pacincia, me deram o apoio necessrio para que eu chegasse at aqui.

Dedico-o, igualmente, in memoriam, minha av, Heber de Mattos Pulcherio, que, se tivesse tido oportunidade, teria sido mdica veterinria e que me legou exemplos inesquecveis de amor aos animais e de terna compaixo pelas suas dores.

AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente a Deus, por ter estado sempre ao meu lado e me dado a oportunidade de realizar o mestrado e ingressar no setor acadmico e da pesquisa. Sou grata, em especial, ao meu namorado Thiago Jos Campos de Souza pelo esforo em me incentivar na realizao da pesquisa e pelo carinho e pacincia em me tranquilizar nas horas de angstia. Ele faz parte desta conquista. Muito obrigada minha orientadora, Professora Doutora Rosa Helena dos Santos Ferraz e minha co-orientadora, Professora Dr. Valria Dutra, pelo auxlio, pacincia e sabedoria em me orientar durante a execuo deste trabalho. Agradeo ao Sr. Acssio da Silva Prado pela boa vontade e disposio em nos guiar e localizar os ninhos no Pantanal, Fazenda Ypiranga e Pousada Piuval, na pessoa dos senhores Joo Losano Eubank de Campos e Eduardo Matos Eubank de Campos e ao mdico veterinrio Lauzimar Fernando Morandi, por viabilizarem a realizao desse experimento. Agradeo de corao minha amiga e biloga Tain Figueras Dorado Rodrigues por estar ao meu lado durante as coletas e permitindo, generosamente, que a minha inexperincia diminusse em contato com o muito que sabe. Agradeo, ainda, aos discentes de graduao da Faculdade de Medicina Veterinria, Fernanda Harumi Maruyama e Luiz Felipe Souza de Lima; discente do Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias, Thas Ruiz, e ao aluno Marcos Antnio Gonalves Ardevino Filho, do Programa de Ps-Graduao em Ecologia e Conservao da Biodiversidade da Universidade Federal de Mato Grosso/UFMT, pela disposio de todos em me ajudarem nas idas ao Pantanal e no andamento da pesquisa. Agradeo, tambm, a todos os colegas de trabalho no Laboratrio de Microbiologia do Hospital Veterinrio da UFMT pelos ensinamentos e ajuda, oferecidos durante o trabalho de isolamento das bactrias no laboratrio e que foram de grande valia na realizao deste trabalho. Por fim, mas no por ltimo, agradeo a meu pai, Ayrton Pulcherio Filho, por ter sido e ser sempre para mim, uma referncia em termos de tica e responsabilidade profissional; minha me, Maria Cristina de Carvalho Sousa Lima

Piloni e ao meu padrasto, Pedro Roberto Piloni, pelo cuidado e ateno ao meu filho para que eu pudesse realizar este trabalho.

EPGRAFE

Se as coisas continuarem do jeito que vo, um dia o mundo no ter mais rpteis. Certas pessoas aceitaro tranqilamente essa

situao, mas eu me inquieto diante de tal perspectiva. Os rpteis constituem uma parte velha da natureza silvestre, o meio em que o homem obteve os nervos e os hormnios e estamos dispostos a deixar que toda natureza silvestre desaparea. Quando tal acontecer, j no seremos rigorosamente humanos. (Archie Carr e redatores da Life, 1971)

RESUMO

BIOMETRIA, TAXA DE ECLOSO E MICROBIOTA BACTERIANA E FNGICA DE OVOS DE JACAR-DO-PANTANAL - Caiman yacare DAUDIN, 1802

A criao comercial do jacar-do-Pantanal tem-se consolidado no Estado de Mato Grosso atravs do sistema de criao denominado ranching em que os ovos so coletados na natureza, incubados artificialmente e recriados em instalaes apropriadas. Dessa forma, verifica-se que esta atividade econmica est em ntima dependncia da eficincia reprodutiva da espcie na natureza e das condies de incubao artificial. As taxas de ecloso na crocodilicultura refletem o sucesso da incubao artificial, estando diretamente relacionadas, tanto s condies de transporte do ovo, quanto s condies fsicas e sanitrias da incubadora. Considerando a escassez de informaes sobre os ninhos, a biometria dos ovos, dos filhotes e a composio da microbiota bacteriana e fngica de ovos de C. yacare destinados criao comercial, o presente trabalho teve como objetivo dimensionar os ninhos de C. yacare, quantificar o nmero de ovos por ninho, realizar a biometria dos ovos e dos filhotes recm-eclodidos, verificar as taxas de ecloso e caracterizar a microbiota bacteriana e fngica de ovos no momento da coleta para a incubao artificial. Foram avaliados 20 ninhos provenientes de quatro diferentes reas denominadas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro em uma fazenda no Pantanal Norte, municpio de Pocon. A mdia da altura, largura da base e do pice dos ninhos foram, respectivamente, de 36,3 cm, 126,8 cm e 46,5 cm. Desses 20 ninhos obteve-se um total de 464 ovos, com uma mdia de 23,2 ovos por ninho e taxa de ecloso de 72,41% (336 ovos). Dos 128 ovos que no eclodiram, 124 (96,9%) se apresentaram com odor ftido e contedo caseoso/ptrido e 4 (3,1%) continham filhotes que possuam o vitelo exteriorizado. Os valores mdios obtidos para o comprimento, a largura e a massa dos ovos foram, respectivamente, de 6,6 cm, 3,9 cm e 67,5 g. Os valores mdios para o comprimento rostro-cloacal e massa corprea dos filhotes recm-eclodidos foram respectivamente, de 12,2 cm e 45,1 g. A anlise estatstica no mostrou significncia estatstica (p>0,05) entre as quatro regies, para os parmetros: dimenses dos ninhos, taxa de ecloso, nmero de ovos infrteis, ovos que no eclodiram (odor ftido ou retardo no desenvolvimento), nmero de ovos por ninho, tamanho dos ovos e dos filhotes. Nos 20 ninhos estudados, foram identificadas 22 bactrias diferentes, sendo as mais frequentes Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes e Flavobacterium multivorum e as menos freqentes foram Escherichia hermanni, Hafnia alvei, Morganella morganni, Salmonella sp., Shigella sonnei e Serratia marcescens. Sete fungos diferentes foram encontrados, sendo o Fusarium sp. o mais comum e Geotrichum sp., Mycelia sterilia e Trichoderma sp. os de menor ocorrncia. Todas as bactrias e fungos isolados j haviam sido relatados por outros autores como integrante da microbiota oral e/ou cloacal de crocodilianos e/ou como agentes etiolgicos de processos patolgicos.

Palavras-chave: Caiman yacare. Criao comercial. Enterobactria. Incubao artificial. Ninho.

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ABSTRACT

BIOMETRY, HATCH RATES AND BACTERIAL AND FUNGAL MICROBIOTA OF PANTANAL CAIMAN EGGS Caiman yacare DAUDIN, 1802

The commercial breeding of the Pantanal Caiman has been growing in the State of Mato Grosso through the breeding system named ranching, which means that the eggs are collected in the wild, they are artificially incubated and the hatchlings are reared in adequate rearing pens. Thus, one can observe that this economic activity is intimately dependent on the species reproductive efficiency in the wild and on the conditions the artificial incubation occurs. The hatch rates at crocodilian farming reflect the success of the artificial incubation, being directly related both to the conditions of the egg transportation and to the sanitary conditions of the incubator room. Taking into consideration the lack of information about the nests, about the eggs biometry, about the hatchlings, and about the composition of the bacterial and fungal microbiota of C. yacare meant to commercial breeding, this paper aimed at measuring the C. yacare nests, at counting the number of eggs per nest, at taking the biometry of eggs and of new born hatchlings, at checking the hatch rates, and at characterizing the bacterial and fungal microbiota of eggs at the moment of collection for artificial incubation. Twenty nests from four different areas Piuval, Estrada Parque, Vazante and Lixeiro - of a farm in North Pantanal, in the town of Pocon were evaluated. The average height, width of the bottom and of the top of the nests were, respectively, 36.3 cm, 126.8 cm and 46.5 cm. From these 20 nests, there was a total of 464 eggs, with an average of 23.2 eggs per nest and hatch rate of 72.41% (336 eggs). Among the 128 eggs that did not hatch, 124 (96.9%) presented a fetid smell and a caseous/putrid content, and 4 (3.1%) had hatchlings with the yolk-sac unresorbed. The average values observed as for the length, the width and the mass of the eggs were, respectively, 6.6 cm, 3.9 cm and 67.5 g. The average values as for the snout-vent length and for the body mass of the new born hatchlings were, respectively, 12.2 cm and 45.1 g. The statistical analysis did not reveal relevant statistical differences (p>0.05) among the four regions, as for the parameters: sizes of the nests, hatch rates, number of infertile eggs, eggs that did not hatch (fetid smell or late development), number of eggs per nest, size of the eggs and of the hatchlings. In the 20 nests that were studied, 22 different bacteria were identified, and the most frequent were Bacillus cereus, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes e Flavobacterium multivorum while the less frequent were Escherichia hermanni, Hafnia alvei, Morganella morganni, Salmonella sp., Shigella sonnei e Serratia marcescens. Seven different fungi were found, the Fusarium sp. being the most frequent and the Geotrichum sp., Mycelia sterilia and Trichoderma sp. the less frequent. All bacteria and fungi that were isolated at this study have already been related by other authors as part of the crocodilians oral and/or cloacal microbioat or as ethiological agents of infectious processes.

Key words: Caiman yacare. Commercial breeding. Enterobacteria. Artificial incubation. Nest.

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LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1: Mapa mostrando a localizao geogrfica dos 20 ninhos nas quatro reas do Pantanal Norte, municpio de Pocon/MT ................................. 29 Figura 2: Mensurao da largura do pice do ninho de Caiman yacare ................... 29 Figura 3: Coleta de amostra microbiolgica da superfcie dos ovos em ninho de Caiman yacare ......................................................................................... 30 Figura 4: Ovos coletados e acondicionados para o transporte, no material vegetal do respectivo ninho ...................................................................... 31 Figura 5: Mensurao do comprimento do ovo de C. yacare com paqumetro analgico .................................................................................................. 31 Figura 6: Exame ovoscpico em ovo de C. yacare mostrando-se translcido e, portanto, classificado como grau zero e caracterizado como infrtil. ....... 32 Figura 7: Sistema de incubao artificial de ovos de C. yacare adotado na propriedade rural no Pantanal Norte, municpio de Pocon/MT. ............ 33 Figuras 8a-d: Ninho de C. yacare da rea Piuval localizado em um capo de gravats (a), na rea Estrada Parque (b) e Lixeiro (c) em campos de murundus e na Vazante em cambarazais (d). ................. 38 Figuras 9a-b: Ninhos de C. yacare contendo invertebrados como cupins (a) e diplpodas (b) .................................................................................... 38 Figuras 10a-b: Ovo de C. yacare aps abertura, evidenciando o contedo caseoso (a) e ptrido (b), ambos com odor ftido ............................ 41 Figuras 11a-b: Filhote de C. yacare sem odor ftido e com retardo no desenvolvimento, evidenciado pelo vitelo fora da cavidade abdominal e feto em autlise caracterizando a morte fetal ............ 42

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, respectivas reas de ocorrncia, coordenadas geogrficas e ocorrncia de invertebrados, no municpio de Pocon, MT abr 2011 ....................................................................................................... 37 Tabela 2 - Mdias da altura (cm), largura da base (cm) e do pice (cm) dos ninhos de Caiman yacare em diferentes reas, municpio de Pocon, MT abr 2011 .......................................................................... 39 Tabela 3 - Mdias do comprimento (cm), largura (cm) e da massa (g) de ovos de Caiman yacare nas respectivas reas, no municpio de Pocon, MT abr 2011 .......................................................................................... 39 Tabela 4 - Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, rea de ocorrncia dos ninhos, nmero de ovos por ninho, nmero de ovos no eclodidos e taxa de ecloso, no municpio de Pocon, MT abr 2011 ................................................................................................ 41 Tabelas 5 - Mdias do nmero de ovos de Caiman yacare, da taxa de ecloso, do nmero de ovos no eclodidos (infrteis ou com odor ftido), nas respectivas reas de coleta, no municpio de Pocon, MT abr 2011 ....................................................................................................... 42 Tabela 6 - Mdias do comprimento rostro-cloacal - CRC (cm) e da massa (g) de filhotes recm-eclodidos de Caiman yacare, e coeficiente de variao, nas respectivas reas de coleta, no municpio de Pocon, MT abr 2011 ........................................................................................ 43 Tabela 7 - Ocorrncia das bactrias nas respectivas reas e ninhos coletados, no municpio de Pocon, MT abr 2011 ................................................ 44 Tabela 8 - Ocorrncia dos fungos nas respectivas reas e ninhos coletados, no municpio de Pocon, MT abr 2011..................................................... 45

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SUMRIO

1 INTRODUO ....................................................................................................... 15 1.1 Taxonomia ......................................................................................................... 15 1.2 Distribuio geogrfica..................................................................................... 16 1.3 Importncia ecolgica e econmica ................................................................ 16 1.4 Justificativa e objetivos .................................................................................... 17 2 REVISO DE LITERATURA ................................................................................. 19 2.1 Maturidade sexual e perodo reprodutivo ....................................................... 19 2.2 Nidificao e postura ........................................................................................ 19 2.3 Incubao natural .............................................................................................. 21 2.4 Biometria de ninhos .......................................................................................... 22 2.5 Biometria de ovos e filhotes ............................................................................. 23 2.6 Sistema de criao comercial e incubao artificial ...................................... 24 2.7 Microbiota bacteriana ....................................................................................... 26 2.8 Microbiota fngica ............................................................................................ 27 3 MATERIAL E MTODOS ...................................................................................... 28 3.1 rea de estudo .................................................................................................. 28 3.2 Georreferenciamento e biometria do ninho .................................................... 28 3.3 Coleta das amostras, transporte e biometria dos ovos ................................. 30 3.4 Ovoscopia e incubao artificial ...................................................................... 31 3.5 Processamento microbiolgico ....................................................................... 33 3.6 Biometria dos filhotes ....................................................................................... 34 3.7 Delineamento experimental e anlise estatstica ........................................... 34 4 RESULTADOS ....................................................................................................... 36 4.1 Georreferenciamento, caracterizao e biometria dos ninhos ..................... 36 4.2 Ovoscopia e biometria dos ovos ..................................................................... 37 4.3 Incubao artificial e taxa de ecloso ............................................................. 39 4.4 Biometria dos filhotes ....................................................................................... 42 4.5 Microbiota bacteriana e fngica ....................................................................... 43 5 DISCUSSO .......................................................................................................... 46 5.1 Caracterizao e biometria dos ninhos ........................................................... 46 5.2 Ovoscopia e biometria dos ovos ..................................................................... 47

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5.3 Incubao artificial e taxa de ecloso ............................................................. 48 5.4 Biometria dos filhotes ....................................................................................... 51 5.5 Microbiota bacteriana ....................................................................................... 51 5.6 Microbiota fngica ............................................................................................ 55 6 CONCLUSES ...................................................................................................... 59 7 CONSIDERAES FINAIS ................................................................................... 60 REFERNCIAS ......................................................................................................... 61 APNDICE A ARTIGO CIENTFICO ..................................................................... 74

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1 INTRODUO

O Caiman yacare, conhecido como jacar-do-Pantanal, uma das espcies de crocodilianos de ocorrncia em territrio brasileiro (UETZ, GOLL e HALLERMANN, 2011). Ele considerado um crocodiliano de porte mdio, atingindo de dois metros e meio a trs metros de comprimento na vida adulta (MIRANDA et al., 2002). Os indivduos dessa espcie, assim como os outros crocodilianos passam boa parte de sua vida na gua, utilizando as margens dos rios e/ou lagoas para termorregulao, alimentao e reproduo (ZUG, VITT e CALDWELL, 2001). Durante o incio da dcada de 90, as populaes de jacar-do-Pantanal foram consideradas reduzidas de alguma forma, principalmente devido ao aumento da caa ilegal durante os anos 70 e 80, porm, os maiores problemas que o C. yacare enfrenta atualmente so a destruio de seu habitat, a construo de hidreltricas e o assoreamento de rios que continuam a afetar as populaes de jacars, principalmente no Brasil (CAMPOS et al., 2010). E, embora em alguns locais se apresente reduzido, est classificado como espcie de baixo risco de extino, pois possui ampla distribuio e populaes numerosas (IUCN, 1996), provavelmente devido ao seu pequeno tamanho na maturidade, associado habilidade de se adaptar a uma ampla variedade de ambientes e ao fato ter aprendido a viver com cautela (CAMPOS et al., 2010).

1.1 Taxonomia

Todos os crocodilianos vivos pertencem classe Reptilia, subclasse Archosauria, ordem Crocodylia, subordem Eusuchia e famlia Crocodylidae. Atualmente, encontram-se divididos em 25 espcies das quais seis podem ser encontradas no Brasil: Melanosuchus niger, Paleosuchus palpebrosus, Paleosuchus trigonatus, Caiman crocodilus, Caiman yacare e Caiman latirostris (UETZ, GOLL e HALLERMANN, 2011).

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1.2 Distribuio geogrfica

Os crocodilianos so, hoje, os maiores rpteis vivos no planeta (LANE, 2006) e esto distribudos na maior parte dos esturios doces e salobros, rios e zonas pantanosas de todas as regies tropicais e semitropicais do mundo (RUEDAALMONACID et al., 2007). Especificamente, o C. yacare pode ser encontrado nas plancies do Norte e Leste da Bolvia e no Oeste do Brasil, desde o Sul da Amaznia at os rios Guapor/Madeira e Paraguai/Paran e no Norte da Argentina (CAMPOS et al., 2010).

1.3 Importncia ecolgica e econmica

Os crocodilianos so predadores que esto no topo da cadeia alimentar no ambiente em que vivem. Esta posio lhes confere um papel importante como consumidores de peixes, moluscos, insetos e outros, a partir do momento em que favorecem a seleo natural de suas presas habituais e eliminam indivduos mais velhos ou fracos das populaes, mantendo o equilbrio natural. Tambm so importantes espcies sentinelas da degradao dos ecossistemas por

contaminantes ambientais e o monitoramento do nvel de contaminantes em crocodilianos pode fornecer uma boa indicao do nvel de contaminantes no ecossistema aqutico (MILNES e GIULLETTE, 2008). Alm disso, suas fezes enriquecem as guas onde vivem e aumentam a produtividade biolgica das mesmas, promovendo o crescimento de algas e de todo tipo de organismos plantcnicos (RUEDA-ALMONACID et al., 2007). Um nmero de doenas que se desenvolvem na gua so vetoriadas por populaes de moluscos, mosquitos e peixes saudveis e, ao consumirem grandes quantidades dessas espcies, os crocodilianos podem exercer um controle biolgico indireto de muitos parasitos que esto presentes nesses animais como os moluscos (Ipomoea) que atuam como hospedeiros da Fasciola hepatica e Schiistosoma

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mansoni, que atacam as populaes humanas e seus animais (RUEDAALMONACID et al., 2007; MAZZOTTI et al., 2009). A partir dessas informaes, percebe-se que as atividades dos crocodilianos mantm o equilbrio, a funo e a estrutura do ecossistema (CRAIGHEAD, 1968), gerando a necessidade da implementao de programas de manejo que aliem o aproveitamento econmico conservao de suas populaes selvagens

remanescentes (KING, 1989), evitando-se, assim, o comrcio ilegal da espcie e otimizando a sustentabilidade da atividade econmica. Desse modo, com a regulamentao do sistema de criao denominado ranching, pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis - Ibama (BRASIL, 1990; BRASIL, 2009), a explorao comercial da espcie em suas reas de ocorrncia passou a ser uma alternativa ecolgica e economicamente vivel, pois visa a preservar a espcie e a permitir o manejo sustentado do jacar-do-Pantanal (CAMPOS, MOURO e COUTINHO, 2005).

1.4 Justificativa e objetivos

Alm de promover a conservao dos ambientes naturais e da biodiversidade, reduzindo a presso exercida pela caa nessas populaes (BULTE e DAMANIA, 2005), a crocodilicultura aumenta a produtividade da terra, atravs da diversificao dos meios de produo (COUTINHO e CAMPOS, 2002) e incrementa os rendimentos das mesmas pela comercializao do couro e da carne no mercado nacional e internacional (RODRIGUES et al., 2007). Dessa forma, a criao comercial do C. yacare tem alcanado grande destaque econmico no Estado de Mato Grosso, pois, alm de o jacar-do-Pantanal ser uma espcie nativa e abundante na regio, houve, em 1990, a regulamentao do sistema de criao pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (Ibama) denominado ranching (BRASIL, 1990; BRASIL, 2009). O ranching fundamenta-se na coleta de filhotes ou de ovos na natureza, mediante prvio levantamento populacional da espcie na rea pretendida e, aps a autorizao e o controle do rgo ambiental federal, os ovos so incubados artificialmente e recriados em instalaes apropriadas (CAMPOS, MOURO e

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COUTINHO, 2005). Verifica-se, por conseguinte, que esta atividade econmica est

em ntima dependncia da eficincia reprodutiva da espcie na natureza. O conhecimento da biologia reprodutiva e de tcnicas para a incubao artificial so por isso fatores decisivos para o sucesso em longo prazo da criao comercial. Alguns dados sobre a biologia reprodutiva de espcies de crocodilianos, incluindo o C. yacare, podem ser obtidos de Verdade (1995); Platt e Thorbjarnarson (2000); Campos (2003); Coutinho et al.(2005); Bassetti (2006); Zhang et al. (2008); Velasco e Ayarzagena (2010), porm eles no se referem biometria dos ovos destinados a esse sistema de criao e s tcnicas de incubao artificial, embora Huchzermeyer (2003) tenha afirmado que as taxas de ecloso na crocodilicultura so baixas devido utilizao de tcnicas inadequadas na incubao artificial, bem como em razo das condies fsicas e sanitrias da incubadora. As condies sanitrias do processo de incubao (assepsia durante a coleta e incubao artificial dos ovos) so pouco exploradas, embora fatores como exposio a alta temperatura e umidade (FERGUSON, 1981a) e manuseio no momento da coleta (BASSETTI, 2006) j tenham sido relatados como condies que favorecem o processo de contaminao de ovos por fungos e bactrias. Considerando a escassez de informaes sobre os ninhos, sobre a biometria de ovos e sobre a composio da microbiota bacteriana e fngica de ovos de C. yacare incubados naturalmente e que so coletados e destinados s criaes comerciais, o presente trabalho teve como objetivo dimensionar os ninhos de C. yacare, descrever a fitofisionomia da rea onde o ninho foi construdo, o nmero de ovos por ninho, as biometrias dos ovos e dos filhotes recm-eclodidos, verificar as taxas de ecloso dessa espcie e caracterizar a microbiota bacteriana e fngica de ovos no momento da coleta para a incubao artificial.

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2 REVISO DE LITERATURA

Neste captulo, sero abordados alguns tpicos referentes ao processo reprodutivo de Caiman yacare relacionados oviposio, incubao, biometria e microbioba bacteriana e fngica.

2.1 Maturidade sexual e perodo reprodutivo

Na natureza, as fmeas de C. yacare podem tornar-se vitelognicas com cerca de cinco anos de idade e comprimento rostro-cloacal (CRC) maior que 55 cm, mas ovrios maduros, com folculos vitelognicos avanados, somente foram observados em fmeas com sete anos de idade e CRC maior que 70 cm (COUTINHO et al., 2001). Entretanto, o tamanho mnimo de reproduo efetiva ainda maior em vida livre e, embora fmeas jovens (CRC<75 cm) sejam eventualmente capazes de realizar postura, a maioria das fmeas na populao comea a nidificar com cerca de nove a dez anos de idade, quando atingem CRC equivalente a 80 cm e massa corporal acima de 12 kg (CAMPOS, 1993; CAMPOS e MAGNUSSON, 1995; COUTINHO, 2000), na mesma idade em que os machos tambm atingem maturao completa das gnadas (COUTINHO et al., 2005). Em ambiente natural, o perodo reprodutivo do C. yacare est associado ao incio da estao chuvosa, ocorrendo a postura dos ovos de dezembro a fevereiro no Brasil (CAMPOS et al., 2010).

2.2 Nidificao e postura

A escolha do local para nidificao varia de espcie para espcie entre os crocodilianos. As espcies que vivem em florestas constroem ninhos em montes de folhas colhidas do cho da floresta e dependem do calor produzido pela compostagem ao invs do sol para incubar os ovos. As espcies de pntanos fazem

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ninhos em montes a partir da vegetao existente nestes ambientes e dependem tanto do calor da compostagem como do sol para a incubao dos ovos, enquanto que os animais que vivem em rios constroem seus ninhos nos bancos de areia acima do nvel de inundao e dependem do sol para obter o calor necessrio incubao (HUCHZERMEYER, 2003). As espcies de jacars da famlia Alligatoridae constroem seus ninhos em montes com restos de folhagens e gravetos dentro da mata, prximos de corpos dgua e nos tapetes de vegetao flutuante. No Pantanal Sul, Campos e Magnusson (1995) descrevem ninhos de C. yacare em florestas perto de rios intermitentes, em trechos de florestas em campos inundados e em campos rodeados por gua. Os fatores que levam as fmeas a selecionarem o habitat de nidificao so desconhecidos (COUTINHO e CAMPOS, 2005), porm, o tamanho e a composio dos ninhos dependem mais do habitat e da disponibilidade de material do que das espcies envolvidas (MAGNUSSON, 1979). Verdade (1995) concluiu tambm para o C. latirostris que a presena da terra pode ser justificada pela necessidade de complementao do tamanho "normal" do ninho, onde, aparentemente, no h folhas em quantidade suficiente para sua construo. No Pantanal, provvel que os ciclos anuais de cheia e seca alterem a disponibilidade dos locais de nidificao e tambm a oferta do material para construo dos ninhos do C. yacare (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995). Todos os ovos de uma ninhada so depositados ao mesmo tempo no ninho e cobertos com o material do mesmo (HUCHZERMEYER, 2003). O nmero e o tamanho dos ovos esto relacionados com a espcie e o tamanho dos indivduos (RUEDA-ALMONACID et al., 2007), de modo que fmeas menores e mais jovens realizam a postura de ovos em nmero e tamanho menores em relao a fmeas mais velhas, que do origem a filhotes mais fortes e viveis (HUCHZERMEYER, 2003). Vrios autores correlacionaram o nmero de ovos de cada ninho com a massa corporal das fmeas, como ocorre no C. yacare (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995), no C. crocodilus crocodilus (CAMPOS, 2003) e no C. latirostris (LARRIERA et al., 2004; MONTINI et al., 2006). Segundo Campos (2003), outros fatores como a idade, o estado nutricional e a gentica dos pais tambm podem influenciar a produo de ovos em Caiman crocodilus crocodilus, Paleosuchus palpebrosus e Melanosuchus niger. Quanto ao nmero de ovos por ninho, diversos valores so apresentados nas diferentes espcies. Webb e Cooper-Preston (1989) relatam para o Crocodilus

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porosus ninhos contendo de 2 a 78 ovos e Sobern, Tabet e Alvarez (2002) relatam valores mdios para o Crocodilus acutus de 24,77 ovos por ninho. Em Caiman crocodilus crocodilus o nmero mdio de ovos por ninho encontrados por Prez (2001) e Campos (2003) foram, respectivamente, de 29,6 e de 25, variando este ltimo de 14 a 38 ovos. Para o C. yacare, Campos et al. (2010) descrevem valores entre 22 a 35 ovos, com no mximo 42 ovos por ninho.

2.3 Incubao natural

O perodo de incubao varia, aproximadamente, de 60 a 90 dias, mas depende da espcie, assim como da temperatura, sendo menor com o aumento da temperatura (HUCHZERMEYER, 2003). No jacar-do-Pantanal, da postura dos ovos at a ecloso dos filhotes, podem decorrer at 70 dias, dependendo das condies de incubao dos ovos e dos cuidados da fmea (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995). A temperatura e umidade ideais para o desenvolvimento dos embries de crocodilianos durante esse perodo, respectivamente, de 97-99% e de 28C a 34C (BASSETTI, 2006). Em ambiente natural, Campos et al. (2008) revelaram que os ovos de ninhos de C. crocodilus crocodilus estudados perderam peso durante a incubao e atriburam esse fato perda de gua, pois os jacars nessa populao nidificaram no fim da estao de seca, quando o nvel das guas do rio est baixo. As fmeas investem tempo na construo e nos cuidados contra predadores no ninho, permanecendo ao lado dos filhotes recm-eclodidos at um ano de vida (CINTRA, 1989). As principais causas de mortalidade de ovos de jacars no Pantanal so as inundaes e a predao dos ninhos (COUTINHO e CAMPOS, 2005). Alm de causar as inundaes, as chuvas tm efeito direto na sobrevivncia dos ovos, pois interferem na temperatura dos ninhos de floresta e de vegetao flutuante (CAMPOS, 1993). As inundaes foram relatadas como a principal causa de mortalidade de ovos, atingindo 29% para o Melanosuchus niger (VILLAMARN-JURADO e SUREZ, 2007) e 12,8% para M. niger e Caiman crocodilus (VILLAMARN et al., 2011), tendo sido a mdia de sucesso de ecloso para o Melanosuchus niger de 42,4% (VILLAMARN-JURADO e SUREZ, 2007).

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Quanto predao, Campos e Magnusson (1995) relatam que os lobinhos (Cerdocyon thous), quatis (Nasua nasua) e porcos-monteiros (Sus scrofa) so espcies capazes de destruir parcial ou totalmente os ninhos. J no Equador, Villamarn-Jurado et al. (2011) afirmam que 69,7% dos ninhos foram predados, principalmente por humanos, lagartos e jaguars. A viabilidade dos ovos tambm depende do tipo de habitat de nidificao. Montini et al. (2006) relataram um sucesso maior de ecloso em ninhos de C. latirostris construdos em vegetao flutuante do que naqueles feitos em floresta. Nos ninhos de crocodilianos tambm pode haver uma interao com invertebrados como cupins em ninhos de Paleosuchus trigonatus (MAGNUSSON,
LIMA e SAMPAIO, 1985) e formigas em ninhos de Alligator mississipiensis (ALLEN et

al., 1997). Neste ltimo trabalho, os autores investigaram os efeitos da formiga de fogo (Solenopsis invicta) sobre filhotes de aligtores. Esta espcie frequentemente se instala nos ninhos desses crocodilianos e, medida que se inicia o processo de ecloso, elas podem penetrar nos ovos e consumir o contedo do mesmo, picando os filhotes at que a me os leve para a gua, o que, se ocorrer de forma rpida, no trar maiores consequncias para os filhotes, mas, se houver demora, podero aparecer edemas, principalmente ao redor dos olhos e extremidades dos membros.

2.4 Biometria de ninhos

Verdade (1995) mensurou ninhos de C. latirostris e obteve valores mdios para a altura, comprimento e largura de, respectivamente, 49,2 cm, 134,2 cm e 103,4 cm. Platt e Thorbjarnarson (2000) obtiveram para os mesmos parmetros, no Crocodylus acutus, as seguintes dimenses: 30 cm, 200 cm e 160 cm, em ninhos feitos em montes de areia e folhas. Villamarn-Jurado e Surez (2007) obtiveram valores mdios, para o Melanosuchus niger, de 0,54 m de altura e 1,65 m de dimetro e no C. yacare foram relatadas dimenses mdias de 44 cm de altura, 132 cm de comprimento e 121 cm de largura (FAUNAGUA-MAPZA-SERNAP-SITIPNIS, 2004).

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2.5 Biometria de ovos e filhotes

Huchzermeyer (2003) afirma que o fator mais importante relacionado ninhada o tamanho do ovo que consequentemente ter influncia no tamanho do filhote. Webb e Cooper-Preston (1989) relatam dimenses mdias de ovos de Crocodilus porosus de 7,84 cm de comprimento (variando de 6,57 a 8,95 cm), 4,90 cm de largura e 109,19 g. de massa. Em Crocodylus acutus, Platt e Thorbjarnarson (2000) descrevem valores mdios para o comprimento, largura e massa, respectivamente e 70,5 mm, 44,1 mm e 85,6 g. Cardeilhac et al. (1999) mensuraram ovos de Alligator mississippiensis provenientes de trs regies diferentes: a regio Sul dos Everglades, o Sudoeste de Louisiana e o Lago Griffin, cujos valores mdios obtidos, respectivamente, para cada uma das trs regies foram: comprimento de 7,25 cm, 7,26 cm e 7,57 cm, largura de 4,079 cm, 4,20 cm e 4,47 cm e a massa de 68,85 g, 72,4 g e 86 g. Estes autores observaram diferena estatstica na regio do Lago Griffin, que foi atribuda s graves mudanas ambientais. Em ovos de C. latirostris, Verdade (1995) descreve uma mdia de 6,728 cm para o comprimento, 4,28 cm para a largura e 70,888 g para a massa e Pia, Simoncini e Larriera (2005), para a mesma espcie, apresentam o comprimento, a largura e a massa, variando respectivamente, de 3,03 a 5,05 cm, de 4,25 a 8,27 cm e de 30,75 a 88,56 g. Em C. crocodilus crocodilus, Prez (2001) descreve largura de 49,1 mm e massa de 61,1 g e Campos (2003) obteve para esta mesma espcie valores mdios de comprimento de 5,78 cm e largura de 3,59 cm. Miranda et al. (2002) relatam que a mdia da massa dos ovos foi de 61,28 g para o C. yacare. Campos et al. (2008), em C. crocodilus crocodilus e C. crocodilus yacare, encontraram uma relao positiva entre o nmero de ovos, a mdia do volume do ovo (mdia estimada entre o comprimento e a largura do ovo) e o tamanho do embrio no Amazonas. Porm, na regio do Pantanal Central, essa relao ocorreu apenas entre o nmero de ovos e a mdia do volume dos ovos. Neste mesmo estudo, tambm houve uma relao positiva entre o nmero de ovos e a mdia do volume dos ovos com as fmeas, j que fmeas maiores usam um espao maior na cavidade abdominal para produzir ovos maiores e em maior quantidade. Temsiripong (1999) realizou a biometria de filhotes de Alligator

mississippiensis, cujo CRC foi de 13,9 cm, variando de 10,5-16,6 cm e a massa

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mdia foi de 62,22 g, variando de 30-90 g. Segundo Verdade (1995), a biometria de filhotes de C. latirostris apresentou a mdia de comprimento total (CT) de 24,654 cm e massa de 47,61 g. Prez (2001) tambm realizou a biometria de recm-nascidos de C. crocodilus crocodilus em que a mdia do CT foi de 22,4 cm, variando de 19,6 a 25,5 cm, enquanto a mdia de massa corprea encontrada foi de 39,1 g, variando de 26,1 a 57,5 g. Miranda et al. (1999) mensuraram o comprimento rostro-cloacal e a massa corprea de filhotes recm-eclodidos de C. yacare que foram submetidos a diferentes temperaturas de incubao e obtiveram as seguintes mdias,

respectivamente, 13,23 cm e 52,78 g a 28 C e 13,58 cm e 53,09 g a 32C. Estes autores concluram que as temperaturas testadas no influenciaram o ganho de massa, mas, no geral, o melhor CRC foi obtido em temperatura de 32C. Alm da temperatura, Campos e Magnusson (1995) afirmam que os ovos maiores deram origem a maiores filhotes de C. yacare coletados no Pantanal Sul.

2.6 Sistema de criao comercial e incubao artificial

Alm da produo de carne e couro (SARKIS-GONALVES et al., 2001), outra vantagem da criao comercial de crocodilianos a preveno da alta mortalidade dos ovos causada pela predao e inundao e a reduo da mortalidade dos filhotes recm-eclodidos, diminuindo o impacto sobre a espcie na natureza (CASTRO e SILVA, 2005). No Brasil, o modelo legal vigente para a explorao de populaes naturais de jacar (COUTINHO e CAMPOS, 2006) o ranching, regulamentado a partir da Portaria 126 de 1990 do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis - Ibama (BRASIL, 1990; BRASIL, 2009). Este sistema de criao s pode ser aplicado em locais com grandes remanescentes populacionais (SARKIS-GONALVES et al., 2001), j que a coleta dos ovos/filhotes s deve ser realizada mediante prvio levantamento populacional da espcie na rea pretendida e autorizao do rgo competente (CAMPOS, MOURO e COUTINHO, 2005). A incubao artificial utilizada nas criaes comerciais aps a coleta autorizada de ovos na natureza. A incubao um processo relativamente simples, em que devem ser consideradas a temperatura e a umidade das incubadoras. Os

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ovos podem ser incubados em bandejas plsticas contendo vermiculita umedecida, o que proporciona conservao da umidade e manuteno do calor necessrio durante a incubao (GRIGG,1987). Huchzermeyer (2003) sugere a incubao dos ovos em prateleiras, pois afirma que facilita o acesso e a remoo aos ovos infrteis, reduzindo o risco de contaminao e tambm previne o superaquecimento causado pelo calor metablico produzido pelo embrio. O ambiente de incubao extremamente importante, pois influencia a taxa de desenvolvimento embrionrio, crescimento aps a ecloso, o perodo de incubao, a mortalidade embrionria e o sexo (LUXMOORE, 1992). O sucesso dessa modalidade de incubao est diretamente relacionado s condies de transporte dos ovos do ninho incubadora e das condies fsicas e sanitrias da incubadora durante esse processo (GRIGG, 1987). Segundo Huchzermeyer (2003), a taxa de ecloso em relao ao nmero de ovos por ninho na incubao artificial baixa, o que pode ser atribudo utilizao de tcnicas inadequadas. Em cativeiro, Verdade (2001) relatou uma taxa de ecloso de 79,83% de ovos de C. latirostris no sistema de ciclo fechado, caracterizado pela reproduo, oviposio e incubao em cativeiro. Nesta mesma espcie, no sistema ranching, Pia et al. (2007a) descrevem taxas de ecloso de 73,4% e tambm, taxas de ecloso que variaram de acordo com a temperatura de incubao, em que 79,3% foi obtido a 29C, 77,9% a 31C e 50,6% a 33C (PIA et al., 2007a). Em ovos de Caiman crocodilus crocodilus incubados artificialmente, Prez (2001) encontrou 84,1% de sucesso de ecloso em que 1,71% dos ovos no eclodidos apresentaram morte embrionria, 9,84% eram infrteis e 4,22% possuam malformaes que foram atribudas a fatores hereditrios. Miranda et al. (2002) relataram taxas de ecloso relacionadas temperatura de incubao em C. yacare de 66,63% a 28C e de 83,3% a 30C. Martinz et al. (2002) encontraram, em ovos de C. latirostris e C. yacare, 77% de sucesso de ecloso em que 9% dos ovos eram infrteis e 14% sofreram morte embrionria. Joanen e McNease (1981) revelaram que, alm de fatores ambientais, o estado da incubao dos mesmos no momento da coleta tambm influencia a ecloso.

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2.7 Microbiota bacteriana

As condies sanitrias do processo de incubao (assepsia durante a coleta e incubao artificial dos ovos) so pouco exploradas, embora fatores como exposio a alta temperatura e umidade (FERGUSON, 1981a) e manuseio no momento da coleta (BASSETTI, 2006) j tenham sido relatados como condies que favorecem o processo de contaminao de ovos por fungos e bactrias. Por outro lado, Ferguson (1981a) relatou que a presena de bactrias no ninho durante a incubao natural facilita a ecloso do filhote pela ao dos cidos oriundos do metabolismo bacteriano sobre a camada externa do ovo. Existem poucas informaes referentes constituio dessa microbiota, mas Schumacher e Cardeilhac (1990) encontraram, na membrana de ovos de Alligator mississipiensis com leses caractersticas de contaminao, os seguintes microorganismos: Enterobacter cloacae, Citrobacter sp., Proteus sp. e Pseudomonas aeruginosa. Todas essas espcies fazem parte da microbiota intestinal de crocodilianos, indicando uma contaminao fecal como fonte do problema. Salmonella arizona, Pseudomonas aeruginosa e Aeromonas hydrophila foram isoladas de membranas da casca de ovos de crocodilos do Nilo que no eclodiram no Zimbabwe (FOGGIN, 1992). Gattamorta et al. (2002) investigaram a presena de Salmonella sp. no contedo de ovos recm-eclodidos de C. latirostris. Em contrapartida aos escassos relatos da microbiota de ovos de crocodilianos, a microbiota oral e cloacal de crocodilianos tem sido descrita sem, no entanto, ser correlacionada microbiota dos ovos (RAMOS et al., 1993; HUCHZERMEYER, 2000; GERMINO et al., 2008; SILVA et al., 2009). Teoricamente, a bactria pode infectar o ovo, tanto via transovariana, atravs de uma infeco do vitelo, quanto durante a postura, atravs da casca. A casca e as membranas apresentam uma certa barreira para a penetrao da bactria, porm, pequenas rachaduras na casca permitem facilmente o acesso da bactria (HUCHZERMEYER, 2003). Em mdia, 3 a 15% dos ovos tm a casca rachada durante o processo de postura (JOANEN, 1969; POOLEY, 1969; WEBB, MESSEL e MAGNUSSON, 1977; GOODWIN e MARION 1978) e, se um ovo sofre uma contaminao, ele pode representar um perigo para os ovos adjacentes no ninho. Alm disso, a terra onde os ninhos so construdos tambm se torna contaminada

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com o tempo, principalmente se algum ovo quebrado antes da ecloso (HUCHZERMEYER, 2003).

2.8 Microbiota fngica

Os fungos esto normalmente presentes no solo (GAIRHE, 2007) e, sob certas condies, como alta umidade, tambm podem infectar os ovos de crocodilianos no ninho (HUCHZERMEYER, 2003), j que os ninhos deste grupo de animais so construdos a partir de materiais do ambiente como terra, galhos e folhas (VERDADE, 2001). Huchzermeyer (2003) ainda afirma que o risco de uma infeco fngica maior em ninhos feitos em formato de monte, devido ao tipo de material utilizado para a construo dos mesmos. Os fungos presentes no material do ninho so capazes de penetrar a casca do ovo, Hibberd (1994) descobriu que o tamanho dos poros da casca de ovos de Crocodylus porosus era suficiente para permitir que hifas e esporos entrassem. Ela tambm relatou o crescimento de hifas ao longo de pequenas rachaduras na casca, isolando as espcies Fusarium solani, Paecilomyces lilacinus e Aspergillus sp.. Schumacher e Cardeilhac (1990) tambm isolaram os fungos Fusarium oxysporum, Paeciliomyces aviotti, Penicillium fellucanum e Aspergillus niger em ovos de Alligator mississippiensis. O fungo pode no matar todos os embries afetados durante a incubao, porm, alguns filhotes infectados podem morrer tardiamente (HIBBERD e HARROWER, 1993). Gairhe (2007) avaliou as causas de mortalidade de filhotes de gavial e mostrou que apenas 38% dos filhotes sobreviveram nos primeiros dez meses de vida e, desses 38%, 18,98% tinham leses fngicas na pele, cujos isolados revelaram a presena dos fungos Curvularia spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Pseudallescheria boydii, Rhizopus spp. e Trichoderma spp..

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3 MATERIAL E MTODOS

3.1 rea de estudo

A coleta dos ovos e do material para a caracterizao da microbiota bacteriana e fngica de ovos de C. yacare foi realizada em uma fazenda localizada no municpio de Pocon, durante o ms de abril de 2011, conforme aprovao pelo Comit de tica em Pesquisa Animal - Cepa/UFMT (protocolo n. 23108.044293/108). Esta propriedade realiza a coleta e a incubao artificial de ovos destinados criao comercial. Para tanto, durante o ms de maro foram realizados nesta propriedade o censo de ninhos e a respectiva identificao. De um total de 103 ninhos encontrados, 20 foram coletados para a incubao artificial sendo definidos por sorteio levando-se em conta as quatro regies da fazenda que apresentaram maior ocorrncia: a rea designada de Piuval (ninhos n. 1-6), a rea Estrada Parque (ninhos n. 7-11), Vazante (ninhos n. 12-16) e a rea denominada Lixeiro (ninhos n. 17-20).

3.2 Georreferenciamento e biometria do ninho

No local de cada ninho trabalhado foi realizado o georreferenciamento (Figura 1) e parmetros biomtricos como altura, largura da base e do pice (Figura 2) dos 20 ninhos foram mensurados com auxlio de fita mtrica flexvel. Dados referentes fitofisionomia da rea escolhida pela fmea para a construo do ninho tambm foram coletados de acordo com o preconizado por Cunha, Junke e Leito-Filho (2007).

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Figura 1: Mapa mostrando a localizao geogrfica dos 20 ninhos nas quatro reas do Pantanal Norte, municpio de Pocon/MT.

Figura 2: Mensurao da largura do pice do ninho de Caiman yacare.

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3.3 Coleta das amostras, transporte e biometria dos ovos

Os ninhos foram abertos com cuidado, sem que os ovos fossem tocados e, aps a abertura, procedeu-se coleta das amostras microbiolgicas da superfcie dos ovos por swabs (Figura 3), sendo ento acondicionadas em meio de transporte (meio de Stuart), resfriadas a aproximadamente 4C em recipiente isotrmico e transportadas para o processamento, no excedendo o perodo de 24 horas at a semeadura.

Figura 3: Coleta de amostra microbiolgica da superfcie dos ovos em ninho de Caiman yacare.

Aps a coleta, os ovos de cada ninhada foram identificados, indicando a sua posio original no ninho, acondicionados em caixas forradas com o material vegetal do respectivo ninho (Figura 4) e transportados at a incubadora. Aps a chegada dos ovos na propriedade, foi realizada a contagem e a biometria (Figura 5) dos mesmos. Os parmetros analisados foram a mensurao do eixo maior (comprimento), do menor (largura) e da massa, respectivamente aferidos por paqumetro analgico e dinammetro de mo (Pesola de 100g e preciso de 0,3g).

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Figura 4: Ovos coletados e acondicionados para o transporte, no material vegetal do respectivo ninho.

Figura 5: Mensurao do comprimento do ovo de C. yacare com paqumetro analgico.

3.4 Ovoscopia e incubao artificial

Todos os ovos passaram pelo exame de ovoscopia e foram classificados de acordo com o grau de desenvolvimento embrionrio adaptado de Ferguson (1981b), sendo considerados de grau zero (Figura 6) aqueles que se apresentaram inteiramente translcidos (infrteis) e de graus um a quatro aqueles que

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apresentaram graus crescentes de opacidade, sendo o grau quatro totalmente opaco. Desde o ingresso dos ninhos ao incubatrio at a ecloso do ltimo ninho transcorreram 39 dias de incubao artificial, perodo em que temperatura (em C) e umidade relativa do ar (em %) foram verificadas a cada seis horas, respectivamente, por um termmetro de mnima e mxima e um higrmetro.

Figura 6: Exame ovoscpico em ovo de C. yacare mostrando-se translcido e, portanto, classificado como grau zero e caracterizado como infrtil.

Aps o trmino do perodo de incubao de cada ninho, os ovos que no eclodiram foram abertos por inciso longitudinal com lmina de bisturi e o contedo foi inspecionado quanto presena ou no de embrio/feto. Amostras

microbiolgicas foram colhidas do contedo de cinco ovos, sendo dois deles com odor ftido e outros trs sem aparente decomposio e com filhotes no eclodidos que apresentavam o vitelo exteriorizado. Os ovos com odor ftido foram caracterizados no s pela presena dessa caracterstica, mas tambm pela observao de uma colorao escurecida e manchas circulares na casca. No local destinado incubao, cada ninho foi mantido separadamente em pequenos recintos delimitados por tijolos de oito furos, forrados e cobertos pelo material oriundo do ninho, conforme procedimento adotado na propriedade em coletas anteriores (Figura 7). Os ovos foram depositados nesses compartimentos

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(incubadora), onde permaneceram at o momento da ecloso. Antes da colocao dos ovos na incubadora, foi coletada uma amostra microbiolgica dos tijolos, que foi conservada e processada nas mesmas condies descritas anteriormente.

Figura 7: Sistema de incubao artificial de ovos de C. yacare adotado na propriedade rural no Pantanal Norte, municpio de Pocon/MT.

3.5 Processamento microbiolgico

Para a identificao de bactrias, as amostras coletadas foram semeadas em gar sangue e gar Mac Conckey para a identificao de bactrias, sendo incubadas em ambiente aerbico e anaerbico a 37C e observadas a cada 24 horas por at 72 horas. Aps a observao do crescimento bacteriano, as colnias foram identificadas de acordo com suas caractersticas morfotintoriais e provas bioqumicas. As anlises foram realizadas segundo a metodologia descrita por Quinn et al. (1994) e Koneman et al. (2001). A colnia condizente com Salmonella sp. foi confirmada atravs da tcnica de reao em cadeia de polimerase (PCR) em que a extrao foi realizada segundo a metodologia de fervura-centrifugao descrita por Soumet et al. (1994) e o PCR segundo Suh & Song (2005), utilizando um par de primers que originam produtos de amplificao de 298 pares de base correspondente ao gene invA.

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Para a pesquisa de fungos e leveduras, as amostras coletadas foram semeadas em gar Sabouraud-dextrose (4%) e gar Sabouraud-dextrose com cloranfenicol (100 mg/L), incubadas em ambiente aerbico de 28C a 30C e observadas a cada 24 horas por at sete dias. Aps a observao do crescimento fngico, procedeu-se ao microcultivo nos meios gar batata-dextrose (BDA) e gar fub acrescido de Tween-80 a 1%. Os dois ltimos meios foram empregados visando a estimular a esporulao dos fungos, s vezes insuficiente ou ausente em gar-Sabouraud. A incubao foi realizada de forma similar descrita anteriormente para o cultivo inicial. Lminas originadas no microcultivo foram coradas com lactofenol e azul de tripano (0,05%) para determinar a diferenciao de estruturas reprodutivas sexuais e ou assexuadas. Para a classificao dos fungos, foram utilizadas as chaves de identificao segundo Domsch, Gams e Anderson (1993), Alexpoulos, Mims e Blackwell (1996), Watanabe (2002) e Harman et al. (2004).

3.6 Biometria dos filhotes

Aps a ecloso, a biometria dos filhotes tambm foi realizada com a mensurao do comprimento rostro-cloacal (CRC), a qual foi obtida com auxlio de fita mtrica flexvel e com a aferio da massa por meio de dinammetro de mo (Pesola de 100g e preciso de 0,3g). Aps a biometria, os filhotes foram transferidos para as instalaes da criao comercial e os ovos remanescentes foram contados para a verificao da taxa de ecloso e, na sequncia, abertos para a verificao da presena de embrio/feto conforme descrito anteriormente.

3.7 Delineamento experimental e anlise estatstica

O delineamento estatstico utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos (reas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro). Todos os ovos de um determinado ninho foram considerados uma parcela. O nmero de repeties de

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cada tratamento foi diferente em funo da proporo de ninhos encontrados em cada rea. As correlaes entre a quantidade de ovos por ninho, a biometria dos ninhos, dos ovos e dos filhotes, a taxa de ecloso, a quantidade de ovos infrteis e os ovos que no eclodiram (por odor ftido ou retardo no desenvolvimento em relao aos outros filhotes eclodidos no mesmo ninho) e as reas estudadas foram submetidas anlise de varincia (ANOVA) e teste de mdias Tukey conforme Banzato e Kronka (1992), utilizando-se o software SAEG.

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4 RESULTADOS

4.1 Georreferenciamento, caracterizao e biometria dos ninhos

As coordenadas geogrficas de cada ninho e as respectivas reas de ocorrncia esto descritas na tabela 1. Os ninhos dos quais o material biolgico foi coletado, localizados na rea Piuval, foram construdos pelas fmeas no interior de capes de gravats e prximos gua. Eles eram formados por razes, terra mida e uma pequena quantidade de material em decomposio no solo (serrapilheira). Os ninhos localizados na Estrada Parque eram construdos em campos de murundus e, em sua maior parte, eram constitudos de serrapilheira e, em menor proporo, de terra e razes. Na Vazante, os ninhos foram encontrados em cambarazais (ninhos 12 e 14) e campos de murundus (ninhos 13, 15 e 16) e eram formados por serrapilheira, gravetos e uma quantidade menor de terra. Os ninhos localizados na rea do Lixeiro foram construdos em campos de murundus e continham terra, gravetos e pouca serrapilheira (Figuras 8a-d). Todos os ninhos investigados neste trabalho possuam sombreamento parcial oferecido por rvores localizadas ao redor dos mesmos e foram construdos em camada nica. Alm disso, foi observada a presena de invertebrados (tabela 1), como cupins em 40% dos ninhos, formigas em 30%, diplpodas em 25% (Figuras 9a-b) e lacraias em 5% em todas as quatro reas. Dos 20 ninhos caracterizados, observou-se altura mdia de 36,3 cm, variando de 20 a 46 cm. A mdia da largura da base e do pice dos ninhos foi, respectivamente, de 126,8 cm (variando de 94 cm a 137 cm) e 46,5 cm (variando de 31 cm a 66 cm). Comparando as mdias das quatro reas estudadas, observou-se que no houve diferena estatstica para a altura, largura da base e do pice dos ninhos entre elas (P<0,05), como descrito na tabela 2.

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Tabela 1 Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, respectivas reas de ocorrncia, coordenadas geogrficas e ocorrncia de invertebrados, no municpio de Pocon, MT abr 2011 Ninho 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 rea Coordenadas geogrficas S 16 24'59''; WO 56 36'38.8'' S 16 25'05.5''; WO 56 36'33.2'' S 16 24'49.1''; WO 56 36'33.6'' S 16 24'59.8''; WO 56 36'33.6'' S 16 24'42.7''; WO 56 36'31.5'' S 16 25'03.3''; W 56 36'32.9'' S 16 23'07.8''; W 56 37' 40.2'' S 16 23'06.0''; W 56 37'42.2'' S 16 23'13.7''; W 56 37'40.4'' S 16 23'16.0''; W 56 37'42.7'' S 16 22'52.5''; W 56 37'47.2'' S 16 22'37.3''; W 56 36'45.3'' S 16 22'38''; W 56 36'44.1'' S 16 22'07.1''; W 56 36'45.8'' S 16 21'59.3''; W 56 36'54.5'' S 16 21'598.7''; W5636'57.1'' S 1622'10.3''; W 5637'58'' S 16 22'6.0''; W 53 38'5.3'' S 16 21'57.9''; W 56 38'05.5'' S 16 22'9.8''; W 56 37'34'' Invertebrados Cupins/formigas Cupins/formigas Cupins/diplpodas Cupins ---Diplpodas Formigas --Cupins Diplpodas/cupins --Diplpodas/formigas Cupins/formigas --Cupins --Formigas/lacraia ----Diplpodas

Piuval

Estrada Parque

Vazante

Lixeiro

4.2 Ovoscopia e biometria dos ovos

Nos 20 ninhos analisados, chegou-se a um total de 464 ovos que foram submetidos ao exame ovoscpico, obtendo-se para os graus 0 (totalmente translcido), 2, 3 e 4 (totalmente opaco), respectivamente, 19 (4,1%), 2 (0,4%), 26 (5,6%) e 417 (89,9%) ovos. Dentre os 417 ovos opacos, 66 deles apresentavam rachaduras e material viscoso emergindo por elas, evidenciando a ecloso dos animais no momento do exame; outros 38 ovos opacos no apresentavam rachaduras, mas possuam odor ftido e um ovo apresentou-se quebrado.

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Figuras 8a-d: Ninho de C. yacare na rea Piuval localizado em um capo de gravats (a), na rea Estrada Parque (b) e Lixeiro (c) em campos de murundus e na Vazante em cambarazais (d).

Figuras 9a-b: Ninhos de C. yacare contendo invertebrados como cupins (a) e diplpodas (b).

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Tabela 2 - Mdias da altura (cm), largura da base (cm) e do pice (cm) dos ninhos de Caiman yacare em diferentes reas, municpio de Pocon, MT abr 2011 Altura do ninho Base do ninho pice do ninho 46,83 a 50,00 a 47,60 a 40,50 a

Piuval 35,67 a 114,83 a Estrada Parque 34,70 a 113,40 a Vazante 39,60 a 177,80 a Lixeiro 36,25 a 101,25 a Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste Tukey (P<0,05).

Quanto biometria dos ovos provenientes dos 20 ninhos, as mdias do comprimento, da largura e da massa foram respectivamente, de 6,6 cm (variando de 5,2 cm a 7,8 cm), 3,9 cm (variando de 3,4 cm a 4,4 cm) e 67,5 g (variando de 30 g a 87 g.) Para os parmetros analisados, em termos de comprimento, largura e massa, no houve diferena estatstica (tabela 3) entre as quatro reas (p<0,05).

Tabela 3 - Mdias do comprimento (cm), largura (cm) e da massa (g) de ovos de Caiman yacare nas respectivas reas, no municpio de Pocon, MT abr 2011 Comprimento dos ovos Largura dos ovos Massa dos ovos 68,30 a 69,36 a 64,32 a 66,76 a

Piuval 6,66 a 4,00 a Estrada Parque 6,62 a 3,98 a Vazante 6,62 a 3,98 a Lixeiro 6,47 a 3,86 a Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste Tukey (P<0,05).

4.3 Incubao artificial e taxa de ecloso

Durante o perodo analisado, a temperatura mdia foi de 28,5C, tendo sido observada uma temperatura mnima de 23,6C e mxima de 33,7C. A umidade relativa do ar mdia foi de 81,3%, sendo o valor mnimo igual a 57,4% e o valor mximo igual a 95,8%. A variao da temperatura (em C) e da umidade relativa do ar (em %) durante o perodo de incubao est descrita no grfico 1.

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88,0 86,0 84,0

30,5 30,0 29,5 29,0 28,5 28,0 27,5 27,0 26,5 26,0 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

82,0 80,0 78,0 76,0 74,0 72,0 70,0

Dias de amostragem (abril/2010)

Mdia diria de Umidade (%) Mdia diria de Temperatura (C)

Grfico 1 - Variao mdia da temperatura (em C) e umidade relativa do ar (em %) no ambiente durante a incubao dos ovos.

O nmero de ovos por ninho variou de 5 a 33 ovos (Tabela 4), sendo a mdia de 23,2. Aps o trmino da incubao, 336 ovos (72,4%) eclodiram. Dos 128

(27,6%) que no eclodiram, 124 (96,9%) apresentaram odor ftido e, ao serem abertos, possuam contedo que variava de caseoso a ptrido (Figuras 10a-b) e 4 (3,1%) no possuam odor ftido e continham filhotes que, quando comparados com os filhotes do mesmo ninho j eclodidos, estavam atrasados quanto ao desenvolvimento (Figura 11a), o que foi evidenciado pela presena do vitelo ainda fora da cavidade abdominal. Dentre os 124 ovos, em 15 deles (12,1%) foi possvel observar a presena de feto e/ou embrio, caracterizando a morte embrionria/fetal (Figura 11b), no sendo possvel a identificao deles no restante (109; 87,9%) devido decomposio avanada.

Temperatura (C)

Umidade (%)

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Tabela 4 - Ninhos selecionados para a coleta de ovos de Caiman yacare, rea de ocorrncia dos ninhos, nmero de ovos por ninho, nmero de ovos no eclodidos e taxa de ecloso, no municpio de Pocon, MT abr 2011 Ninho 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TOTAL rea N de ovos por ninho 25 33 11 25 5 23 27 25 30 26 25 30 26 26 28 15 22 20 10 32 464 N. ovos no eclodidos 5 6 5 3 5 2 3 16 12 4 25 7 7 6 3 8 5 3 2 1 128 Taxa de ecloso (%) 80 81,81 45,45 88 0 91,3 88,88 64 60 84,61 0 76,66 73,07 76,92 10,71 53,33 77,27 85 80 96,87

Piuval

Estrada Parque

Vazante

Lixeiro

Figuras 10a-b: Ovo de C. yacare aps abertura, evidenciando o contedo caseoso (a) e ptrido (b), ambos com odor ftido.

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Figuras 11a-b: Filhote de C. yacare sem odor ftido e com retardo no desenvolvimento, evidenciado pelo vitelo fora da cavidade abdominal e feto em autlise caracterizando a morte fetal.

A comparao da taxa de ecloso, do nmero de ovos no eclodidos (infrteis ou com odor ftido ou com retardo no desenvolvimento fetal) e a comparao das mdias do nmero de ovos por ninho entre as quatro reas no mostraram significncia (p>0,05), indicando que esses parmetros no sofreram influncia do fator rea (Tabela 5).

Tabelas 5 - Mdias do nmero de ovos de Caiman yacare, da taxa de ecloso, do nmero de ovos no eclodidos (infrteis ou com odor ftido), nas respectivas reas de coleta, no municpio de Pocon, MT abr 2011 Nmero de ovos no eclodidos Ovos com odor Nmero de ovos Taxa de ecloso Ovos infrteis ftido Piuval 20,33 a 77,04 a 4,91 a 16,39 a Estrada Parque 26,60 a 57,91 a 6,76 a 35,33 a Vazante 25,20 a 73,60 a 0,80 a 25,6 a Lixeiro 21,00 a 86,90 a 3,57 a 9,57 a Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste Tukey (P<0,05).

4.4 Biometria dos filhotes

A biometria dos filhotes recm-eclodidos de jacar-do-Pantanal tambm foi aferida, sendo a mdia do comprimento rostro-cloacal (CRC) de 12,2 cm, possuindo, o menor filhote, comprimento igual a 10,7 cm e o maior 13,1 cm. A massa mdia dos

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filhotes foi de 45,1 g, variando de 31 a 58 g. A comparao das mdias do CRC e da massa dos filhotes entre as reas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro tambm no mostrou significncia e esto descritas na tabela 6.

Tabela 6 - Mdias do comprimento rostro-cloacal - CRC (cm) e da massa (g) de filhotes recmeclodidos de Caiman yacare, e coeficiente de variao, nas respectivas reas de coleta, no municpio de Pocon, MT abr 2011 Comprimento rostro-cloacal Piuval 12,125 a Estrada Parque 12,38 a Vazante 11,98 a Lixeira 12,225 a CV 3,478 Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste Tukey (p<0,05). Massa 41,959 a 47,564 a 46,44 a 43,67 a 11,919

4.5 Microbiota bacteriana e fngica

A amostra microbiolgica coletada na incubadora antes da chegada dos ovos resultou em sete bactrias diferentes: Alcaligenes sp., Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes, Flavobacterium multivorum, Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae, Shigella sp. e Streptococcus sp. Essa mesma amostra tambm resultou nos seguintes fungos: Aspergillus sp., Mycelia sterilia e Penicillium sp. Nas amostras de ovos de C. yacare oriundas de 20 ninhos coletados, foram identificadas 22 bactrias diferentes, sendo a mais frequente a espcie Bacillus cereus, isolada em 95% das amostras e as espcies Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Salmonella sp., Serratia marcescens e Shigella sonnei foram isoladas em 5% dos ninhos (Tabela 7). Essas mesmas amostras evidenciaram a presena de sete diferentes fungos, sendo seis gneros e uma espcie (Tabela 8). O Fusarium sp. foi o mais comum, presente em 40% das amostras e os gneros Geotrichum sp., Mycelia sterilia e Trichoderma sp. os menos comuns, com 10% de ocorrncia. As amostras oriundas do contedo dos ovos com odor ftido apresentaram os seguintes microorganismos: Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Flavobacterium multivorum, Pseudomonas stutzeri,

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Staphylococcus aureus e Streptococcus sp.. Aquelas provenientes dos filhotes no eclodidos apresentaram: Aeromonas hydrophila, Alcaligenes sp., Escherichia colli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas stutzeri, Staphylococcus sp. e Streptococcus sp.. O fungo encontrado na amostra do contedo do ovo com odor ftido resultou em Geotrichum sp. e no filhote no eclodido foi o Fusarium sp.
Tabela 7 - Ocorrncia das bactrias, em porcentagem, nas respectivas reas de coleta, no municpio de Pocon, MT abr 2011 Piuval (%) 16,66 16,66 100 66,66 66,66 50 16,66 66,66 33,33 33,33 33,33 16,66 33,33 66,66 Estrada Parque (%) 60 20 40 80 40 40 20 80 20 20 20 20 60 20 20 20 Vazante (%) 20 20 60 80 100 60 60 60 80 20 60 20 40 20 20 60 Lixeiro (%) 50 50 25 100 100 75 25 100% 25 25 TOTAL (%) 35 25 30 95 75 60 15 40 5 80 5 5 20 30 30 5 15 10 10 5 5 45

Bactrias Acinetobacter sp. Aeromonas hydrophila Alcaligenes sp. Bacillus cereus Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Enterobacter aglomerans Escherichia colli Escherichia hermanni Flavobacterium multivorum Hafnia alvei Morganella morganni Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas stutzeri. Salmonella sp. S. aureus S. intermedius Serratia liquefacians Serratia marcescens Shigella sonnei Streptococcus sp.

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Tabela 8 - Ocorrncia dos fungos, em porcentagem, nas respectivas reas de coleta, no municpio de Pocon, MT abr 2011 Piuval (%) Fungos Aspergillus sp. Cunninghamella echinulata Fusarium sp. Geotrichum sp. Mycelia sterilia Penicillium sp. Trichoderma sp. 16,6 33,3 66,6 -16,6 16,6 16,6 Estrada Parque (%) 20 40 20 20 20 40 Vazante (%) 20 40 20 40 Lixeiro (%) 50 25 25 50 25 Total (%) 25 25 40 10 10 35 10

46 5 DISCUSSO

5.1 Caracterizao e biometria dos ninhos

O local de nidificao caracterizado neste trabalho se assemelha s descries encontradas para outros crocodilianos (GREER, 1970; FERGUSON, 1985; PREZ, 2001; MIRANDA et al., 2002; HUCHZERMEYER, 2003; AVANZINE et al., 2007) incluindo o C. yacare (COUTINHO e CAMPOS, 2005). Na natureza, so encontrados ninhos com diferentes itens em sua constituio, de acordo com a espcie e os recursos disponveis no ambiente de nidificao. H ninhos, por exemplo, constitudos por material vegetal, como capim, gravetos e eventualmente misturados com terra (SARKIS-GONALVES et al., 2001), como descrito para os ninhos das regies Estrada Parque e Vazante. Segundo Huchzermeyer (2003), as espcies que vivem em florestas constroem ninhos a partir de montes de folhas encontradas no cho da floresta e dependem do calor produzido pela compostagem, e no do sol, para incubar os ovos. As espcies que vivem em pntanos fazem o ninho a partir da vegetao de mangue e tambm dependem do calor da compostagem, bem como do sol para a incubao dos ovos. Villamarn-Jurado e Surez (2007) descreveram ninhos de Melanosuchus niger como montes cnicos feitos de serrapilheira e razes e ainda afirmaram que todos os ninhos encontrados estavam prximos a uma lagoa, o que corrobora os dados obtidos nesta investigao pois, como descrito acima, os ninhos de C. yacare encontrados estavam sempre localizados prximo gua e eram formados por montes de serrapilheira, razes e terra. Com relao biometria dos ninhos de Caiman yacare, os valores obtidos neste experimento para a altura e a largura foram, respectivamente, menores e maiores do que aqueles apresentados por Faunagua-Mapza-Sernap-Sitipnis (2004). A altura tambm foi menor em relao aos valores obtidos para o C. latirostris (VERDADE, 1995) e M. niger (VILLAMARN-JURADO e SUREZ, 2007) e maior quando comparada ao C. acutus (PLATT e THORBJARNARSON, 2000). J a largura foi menor do que aquelas encontradas no C. acutus (PLATT e THORBJARNARSON, 2000) e M. niger (VILLAMARN-JURADO e SUREZ, 2007) e maior em relao quela obtida no C. latirostris (VERDADE, 1995). No possvel inferir que o tamanho da espcie influencie o tamanho do ninho, mas esta variedade de tamanhos entre diferentes espcies de crocodilianos possivelmente est relacionada disponibilidade de material para a

47 construo do mesmo conforme descrito por Magnusson (1979), assim como os ciclos anuais de cheia e seca no Pantanal, que alteram no s a oferta de material como tambm a disponibilidade dos locais de nidificao (CAMPOS e MAGNUSSON, 1995), ou seja, os ninhos tero variaes de tamanho e constituio de acordo com disponibilidade do material no ambiente. semelhana do observado nos ninhos de C. yacare, Magnusson, Lima e Sampaio (1985) e Allen et al. (1997) tambm relataram a presena de invertebrados como cupins e formigas, respectivamente para o Paleosuchus trigonatus e Alligator mississipiensis. No entanto, esses autores no relataram a presena de diplpodas como observado para o C. yacare. Embora no se tenha objetivado o estudo das interrelaes entre esses invertebrados e o jacar-do-Pantanal, Allen et al. (1997) investigaram os efeitos da formiga de fogo (Solenopsis invicta) sobre filhotes de aligatores. Esta espcie frequentemente se instala nos ninhos desses crocodilianos e, medida que se inicia o processo de ecloso, elas podem penetrar nos ovos e consumir o contedo do mesmo, picando os filhotes at que a me os leve para a gua, o que, se ocorrer de forma rpida, no trar maiores consequncias para os filhotes, mas, se houver demora, poder aparecer edema, principalmente ao redor dos olhos e extremidades dos membros.

5.2 Ovoscopia e biometria dos ovos

Dos 464 ovos submetidos ao exame de ovoscopia, 19 mostraram-se translcidos, o que evidenciou a condio de infertilidade dos mesmos. Os 445 restantes apresentaram algum grau de opacidade, sugerindo, portanto, que estariam frteis e consequentemente viriam a eclodir. No entanto, a inspeo dos mesmos durante a biometria mostrou que um estava parcialmente quebrado e outros 38 apresentaram odor ftido e, embora os 39 ovos estivessem totalmente opacos, esses ovos provavelmente no iriam eclodir, o que foi verificado no exame fsico aps o perodo de incubao. Dessa forma, verificou-se que a expectativa de que o nmero de ovos restantes (406) eclodissem no se concretizou. O que se observa que, durante o exame ovoscpico, ovos com contedo ptrido ou caseoso, mas que no apresentam odor ftido e, portanto, no podem ser identificados ao exame fsico, podem ser confundidos com um ovo embrionado de grau quatro. Isso talvez justifique a diferena entre o nmero de ovos efetivamente eclodidos (336) e a expectativa de ecloso frente ao exame ovoscpico.

48 Webb e Cooper-Preston (1989) e Verdade (1995) relatam mdias das dimenses dos ovos, respectivamente, para o Crocodilus porosus e Caiman latirostris, maiores do que as relatadas neste experimento, embora os valores citados por Verdade (1995) sejam ligeiramente maiores. Diferentemente ocorreu em relao aos valores obtidos por Campos (2003) para o C. crocodilus crocodilus, sendo estes dados inferiores aos encontrados no C. yacare. Embora se trate da mesma espcie, Miranda et al. (2002) encontraram valores mdios de massa inferiores aos obtidos neste experimento. A diferena entre as dimenses dos ovos das espcies C. porosus e C. latirostris, que foram maiores que a do C. yacare, e do C. crocodilus crocodilus, que foram um pouco menores, pode ser justificada pelo fato de serem espcies distintas cujas dimenses corpreas tambm diferem entre elas, pois, o tamanho do ovo est positivamente correlacionado ao tamanho da fmea, em que fmeas maiores so capazes de produzir ovos maiores e em maior quantidade (FERGUNSON, 1985; PLATT e THORBJARNARSON, 2000;

HUCHZERMEYER, 2003; CAMPOS, 2003; LARRIERA et al., 2004; MONTINI et al., 2006; RUEDA-ALMONACID et al., 2007). Alm disto, Huchzermeyer (2003) afirmou que nos crocodilianos o tamanho dos ovos varia com a idade das fmeas, de modo que fmeas mais jovens apresentam ovos menores, o que pode justificar a diferena da massa encontrada por Miranda et al. (2002) que foi inferior relatada nesta investigao, ainda que se tratando da mesma espcie.

5.3 Incubao artificial e taxa de ecloso

Para a incubao artificial de ovos de crocodilianos no so recomendadas temperaturas abaixo de 27C ou acima de 34C, o que poderia comprometer a sobrevivncia dos embries (SARKIS-GONALVES et al., 2001). Neste experimento, embora tenha sido registrada uma temperatura de 23,6C, as mdias ficaram compreendidas dentro do intervalo citado como ideal para crocodilianos. A temperatura e umidade relativa do ar so capazes de interferir na incubao dos ovos e consequentemente modificar a taxa de ecloso (MIRANDA et al., 2002; PIA, LARRIERA e CABRERA, 2003; PIA, SIMONCINI E LARRIERA, 2005; PIA et al., 2007a). A taxa de ecloso obtida neste experimento (72,4%) provavelmente esteja associada ao nmero de ovos comprometidos (ftidos com contedo caseoso e/ou ptrido) e no s variaes da

49 temperatura durante o curto tempo de incubao artificial, pois os ovos foram coletados no tero final do perodo de incubao. Alguns estudos sugeriram que temperaturas muito altas ou baixas causam malformaes e comprometem a sobrevivncia dos filhotes (WEBB e COOPER-PRESTON, 1989). Por outro lado, Miranda et al. (2002) relataram que os ovos de Caiman crocodilus yacare que tiveram a temperatura reduzida de 30 C para 28 C sofreram danos severos. O nmero de ovos por ninho encontrado para o C. yacare corrobora os dados apresentados por Campos et al. (2010). Segundo Rueda-Almonacid et al. (2007), o nmero de ovos produzidos est relacionado com o tamanho dos indivduos e a espcie, embora Campos (2003), em estudo com Caiman crocodilus crocodilus, Paleosuchus palpebrosus e Melanosuchus Nger, concluiu que h outros fatores capazes de afetar a produo de ovos, alm do tamanho da fmea como a idade, o estado nutricional e a gentica dos pais. Embora neste experimento no se tenha objetivado a captura e biometria das fmeas, vrios autores correlacionaram o nmero de ovos de cada ninho com a massa corporal de fmeas de vrias espcies de crocodilianos como o C. crocodilus crocodilus (CAMPOS, 2003) e o C. latirostris (LARRIERA et al., 2004; MONTINI et al., 2006). Todos eles afirmaram que existe uma correlao positiva entre o nmero e o tamanho dos ovos e o tamanho das fmeas, sendo que as fmeas maiores realizam a postura de mais e maiores ovos que as fmeas menores. Alm disso, Basseti (2006) afirma que, o estresse no perodo pr-reprodutivo tambm pode afetar o desenvolvimento gonadal de fmeas de crocodilianos com baixa posio hierrquica, impedindo que entrem no estro ou diminuindo o desenvolvimento folicular e, consequentemente, o nmero de ovos. Esses fatores (tamanho, idade, gentica e estado nutricional dos pais), como explicado anteriormente, so capazes de interferir tanto na biometria como no nmero de ovos por ninho, dessa forma, assim como tambm no houve diferena estatstica entre as quatro reas no parmetro biometria dos ovos, compreende-se essa igualdade de resultados quando analisado o nmero de ovos por ninho, j que esses parmetros esto correlacionados por possurem as mesmas causas. Na tabela 4 apresentada nos resultados, observou-se que os ninhos 3, 5, 16 e 19 continham um nmero de ovos por ninho abaixo do que est descrito por Campos et al. (2010) para o C. yacare que descrevem valores entre 22 a 35 ovos, com no mximo 42 ovos por ninho. Essa diferena pode ser justificada pelas descries no pargrafo acima, porm, Hunt (1989) descreve em seu trabalho, com ninhos de aligtores, que quando ocorre a predao dos ninhos, as fmeas os cobrem novamente, deixando-os aparentemente intactos e com uma quantidade menor de ovos. O que tambm corrobora

50 essa hiptese a taxa de ecloso desses ninhos que, com excesso do ninho 19 estavam abaixo ou em torno de 50%, pois os ovos de crocodilianos so altamente sensveis ao calor excessivo causado pela incidncia solar direta (SARKIS-GONALVES et al., 2001). A taxa de ecloso verificada neste experimento (72,41%) apresenta valor prximo quele (79,83%) descrito por Verdade (2001) para o C. latirostris criado no sistema de ciclo fechado (farming), assim como, nesta mesma espcie, Pia et al. (2007a) relataram taxas de ecloso que variaram de acordo com a temperatura de incubao (79,3% a 29C; 77,9% a 31C e 50,6% a 33C), obtendo, em outro experimento, mdia de sucesso de ecloso de 73,4% (PIA et al., 2007b). Miranda et al. (2002) tambm revelaram taxas de ecloso relacionadas temperatura de incubao em C. yacare (66,63% a 28C e de 83,3% a 30 C). O valor obtido neste experimento est compreendido entre os valores mnimo e mximo obtidos por Miranda, mas, considerando-se que a temperatura mdia de incubao neste experimento foi de 28,5C, pode-se dizer que se obteve uma taxa de ecloso superior a relatada por esses autores. Na Argentina, Martinz et al. (2002) revelaram taxas de ecloso de 77% em C. latirostris e C. yacare. Quanto taxa de ovos infrteis, Prez (2001) relata taxas de 9,84% para o Caiman crocodilus crocodilus e Martinz et al. (2002) encontraram 9% em ovos de C. latirostris e C. yacare. Neste experimento (C. yacare), os ovos infrteis, corresponderam a 4,1%, sendo essa taxa inferior s citadas anteriormente. Com relao aos ovos que no eclodiram (128) e foram abertos, em 15 deles (12,1%) observou-se morte fetal, no sendo possvel identificar morte embrionria, devido ao grau de autlise dos tecidos, restando apenas contedo putrido no interior do ovo. Conforme citao de Huchzermeyer (2003), difcil a diferenciao entre um ovo infrtil e um com morte embrioria precoce. Martinz et al. (2002) tambm obtiveram taxa de mortalidade embrionria (14%) acima das obtidas neste experimento. Segundo Huchzermeyer (2003), a infertilidade do ovo pode ser explicada por fatores genticos, doenas ou a condio nutricional da fmea, o que poderia justificar a taxa de 4,09% encontrada neste trabalho e a diferena com os dados de Prez (2001), sendo que, em nenhum dos trabalhos foi verificada a condio nutricional e sanitria das fmeas. No caso dos ovos que aparentemente no possuiam odor ftido (4; 3,1%), mas que tambm no eclodiram, ao serem abertos, observou-se a presena de feto vivo, porm, ainda com o vitelo exteriorizado, mostrando um retardo no desenvolvimento em relao aos demais animais da ninhada. Sabe-se que alguns fatores, como a temperatura e umidade, podem ser responsveis pelo retardo no desenvolvimento embrionrio de

51 crocodilianos (FERGUSON 1985, MIRANDA et al. 2002, HUCHZERMEYER, 2003). Isso tambm pode ser justificado pela variao individual, em que os ovos em um mesmo ninho so afetados de forma diferente pelo tratamento trmico, dependendo do potencial de desenvolvimento de cada indivduo, conforme relatado por Miranda et al. (2002).

5.4 Biometria dos filhotes

O comprimento rostro-cloacal de filhotes recm-eclodidos de C. yacare mostrou-se inferior aos valores apresentados para o Alligator mississippiensis (TEMSIRIPONG, 1999) e C. yacare (MIRANDA et al., 1999), assim como, para o C. latirostris (VERDADE, 1995) C. crocodilus crocodilus (PREZ, 2001), embora estes dois ltimos autores tenham realizado a mensurao do comprimento total. Quanto massa corprea, verificaram-se neste experimento valores menores do que os citados, tambm para o C. yacare, por Miranda et al. (1999). possvel que tal diferena esteja relacionada temperatura de incubao, pois, segundo Miranda et al. (1999), a temperatura de incubao capaz de afetar o desenvolvimento dos animais. A massa corprea do C. yacare tambm foi menor do que as citadas para o Alligator mississippiensis e C. latirostris, mas foi maior (45,1 g) quando comparada do C. crocodilus crocodilus (39,1 g). Huchzermeyer (2003) afirma que o fator mais importante relacionado ninhada o tamanho do ovo e, consequentemente, o tamanho do filhote, j que filhotes pequenos possuem, via de regra, menor capacidade de desenvolvimento. Alm disso, a massa dos filhotes est relacionada com a espcie e o tamanho das fmeas, assim como o tamanho dos ovos, como descrito anteriormente (PLATT e THORBJARNARSON, 2000; HUCHZERMEYER, 2003).

5.5 Microbiota bacteriana

A amostra microbiolgica que foi coletada na incubadora antes da chegada dos ovos resultou em bactrias que esto naturalmente presentes no ambiente como Alcaligenes sp., Bacillus cereus, Flavobacterium multivorum e Hafnia alvei (QUINN et al., 1994; KONEMAN et al., 2001). Tambm houve a ocorrncia de enterobactrias como o Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Shigella sp. que, alm de possurem

52 potencial patognico, so bactrias comuns microbiota dos crocodilianos, de outros rpteis e tambm dos humanos (NOVAK e SEIGEL, 1986; FLANDRY et al., 1989; MISRA, et al. 1993; HUCHZERMEYER, et al., 2000, KONEMAN et al., 2001; CUPULMAGAA, RUBIO-DELGADO e REYES-JUREZ, 2005; JOHNSTON et al., 2010; UHART et al., 2011). A presena dessas espcies pode ser atribuda ao fato de que as instalaes destinadas incubao artificial j haviam sido utilizadas para a incubao de ovos de jacars-do-Pantanal em anos anteriores. Mesmo tendo sido realizada uma prvia higienizao do local, esse agentes podem ter permanecido pela caracterstica quente e mida desse local, propcio para o seu desenvolvimento. Alm disso, o manuseio dos tijolos (com os quais foram montadas as incubadoras) pelo ser humano tambm pode ser considerado como possvel fonte de contaminao, j que essas espcies tambm lhe so comuns (KONEMAN et al., 2001). De forma semelhante, justifica-se a presena do Streptococcus sp., pois tambm possui potencial patognico (BARNETT e CARDEILHAC, 1995; BISHOP et al., 2007) e est presente em animais e seres humanos sadios (MATUSHIMA e RAMOS, 1993; QUINN et al. 1994; HUCHZERMEYER et al. 2000). Em relao microbiota bacteriana de ovos de jacar-do-Pantanal em ambiente natural, das 22 espcies encontradas, 13 pertencem famlia Enterobacteriacea (Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter aglomerans, Escherichia colli, Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Proteus vulgaris, P. mirabilis, Salmonella sp., Serratia liquefacians, Serratia marcescens e Shigella sonnei), quatro se classificam como bactrias gram negativas no fermentadoras da glicose (Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Flavobacterium multivorum e Pseudomonas stutzeri), trs so cocos gram positivos (Streptococcus sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus intermedius), e duas so, respectivamente, um bacilo gram positivo (Bacillus cereus,) e um bacilo gram negativo (Aeromonas hydrophila). A presena da espcie Bacillus cereus em 95% das amostras evidenciou a caracterstica do gnero, uma vez que as espcies pertencentes a este gnero so amplamente encontradas no ar, solo e gua (QUINN, et al. 1994) e podem estar presentes em amostras de animais conforme relatado por outros autores que identificaram a presena deste gnero no aparelho digestrio de crocodilianos aparentemente sadios (WILLIAMS et al., 1990; HUCHZERMEYER et al., 2000; SILVA et al., 2009). A espcie Flavobacterium multivorum tambm faz parte do grupo de bactrias que esto naturalmente presentes no ambiente, estando amplamente distribuda no solo e na gua. Ela apresenta certo potencial patognico em animais imunodeprimidos (QUINN et

53 al., 1994) e j foi relatada em rpteis (CUBAS e BAPTISTOTTE, 2007) como cascavis (FERREIRA JNIOR et al., 2009); tracaj (GATTAMORTA, CARVALHO e CATO-DIAS, 2000); jararaca (BASTOS et al., 2008) e Alligator mississipiensis (WILLIAMS et al., 1990). As espcies Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter

aglomerans, Escherichia colli, Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Proteus vulgaris, P. mirabilis, Salmonella sp., Serratia liquefacians, Serratia marcescens e Shigella sonnei so enterobactrias e tm sido identificadas em outros estudos como integrantes comuns da microbiota do trato digestrio de rpteis, incluindo crocodilianos e podem constituir-se agentes oportunistas de infeces (ROGGENDORF e MLLER, 1976; NOVAK e SEIGEL, 1986; FLANDRY et al., 1989; MISRA et al., 1993; HUCHZERMEYER et al., 2000; CUPUL-MAGAA, RUBIO-DELGADO e REYESJUREZ, 2005; PESSOA et al., 2008; FERREIRA JUNIOR et al., 2009; JOHNSTON et al., 2010; UHART et al., 2011). Espcies da famlia Enterobacteriacea, assim como espcies j descritas na microbiota cloacal de crocodilianos eram esperadas, pois o ovo, durante o processo de postura, passa pela cloaca da me no momento em que est sendo posto no ninho e, consequentemente, entra em contato com os microorganismos presentes nesta regio. Alm disso, a fmea, durante a postura, defeca no ninho, contaminando o ambiente com bactrias residentes do intestino (HUCHZERMEYER, 2003). O estreptococo pode ser encontrado naturalmente em mucosas e no aparelho respiratrio e digestrio de animais e seres humanos (QUINN et al., 1994). Este gnero apresentou uma ocorrncia de 45,45% dos isolamentos. Essa bactria, alm de ser bastante comum em relatos de animais sadios (MATUSHIMA e RAMOS, 1993; HUCHZERMEYER et al.; 2000), possui grande potencial patognico. Bishop et al. (2007) relataram casos de fascite necrosante em Crocodylus porosus causadas por Streptococcus agalactiae. Madsen (1993) isolou Streptococcus sp. em carne congelada de cauda de crocodilos no Zimbabwe. Barnett e Cardeilhac (1995) atriburam a septicemia ocorrida em filhotes de aligatores americanos como sendo causada por essa bactria. As bactrias gram negativas no fermentadoras da glicose encontradas foram: Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp. e Alcaligenes sp. A espcie Pseudomonas stutzeri amplamente distribuda em solos e guas e raramente associada a infeces (KONEMAN et al., 2001). No entanto, o gnero Pseudomonas considerado como uma das principais causas de septicemia provocada por bactrias gram negativas em rpteis (MITCHELL, 2006). Ferreira Jnior et al. (2009) relataram a presena da espcie Pseudomonas aeruginosa como sendo uma das de maior ocorrncia na microbiota de

54 cascavis, assim como Pessoa et al. (2008) relataram a presena dessa espcie em 16% na microbiota de jabutis domiciliados no Estado de So Paulo. Por outro lado, a Pseudomonas putida foi relatada por Gattamorta, Carvalho e Cato-Dias (2000), em tracaj, como espcie de baixa ocorrncia. O gnero Acinetobacter tambm est presente no solo, na gua (QUINN et al., 1994) e j foi relatado em tracajs (Podocnemis unifilis), em baixos nveis, por Gattamorta Carvalho e Cato-Dias, (2000) e por Pessoa et al. (2008) que relataram a espcie Acinetobacter iwoffii em 6% dos casos estudados de jabutis (Geochelone carbonaria) domiciliados no Estado de So Paulo. Esta mesma espcie foi descrita por Ferronato et al. (2009) em 40% dos casos da microbiota oral de Phrynops geoffranus. As bactrias pertencentes ao gnero Alcaligenes so saprfitas e frequentemente so isoladas dos intestinos dos vertebrados (QUINN et al., 1994), podendo-se tornar um patgeno oportunista e causar infeces nosocomiais (KONEMAN et al., 2001). Huchzermeyer et al. (2000) isolaram Alcaligenes faecalis em 6,89% dos isolados de microbiota cloacal de crocodilos anes (Osteolaemus tetraspis). A espcie Aeromonas hydrophila foi isolada em 25% dos ninhos estudados e outros trabalhos relataram a sua presena em porcentagens variadas, como Gorden et al. (1979) que isolaram esta mesma espcie em 85% de amostras da cavidade oral e em 70% de amostras obtidas a partir de tecido interno de aligatores americanos que vieram a bito sem causa aparente, sugerindo que esta espcie poderia estar envolvida na causa da morte. A Aeromonas hydrophila j foi isolada em filhotes de aligatores americanos (BARNETT e CARDEILHAC, 1995). Gattamorta, Carvalho e Cato-Dias (2000) encontraram uma prevalncia de 58,62% desta espcie em swabs cloacais de Podocnemis unifilis. Pessoa (2008) relatou apenas 4% de isolados de Aeromonas em Geochelone carbonaria. Johnston et al. (2010) estudaram a microbiota presente nas fezes de aligatores americanos e a Aeromonas hydrophila estava presente em 59 dos 70 isolados. Ferronato et al. (2009) relataram a presena de 25% desta espcie em Phrynops geoffranus. A diferena de resultados obtidos nesta investigao com os trabalhos supracitados pode ser explicada pelo uso de mtodos diferentes de isolamento bacteriano (SANTOS et al., 2010). Alm disso, Michael (2006) afirma que a presena do gnero Aeromonas sp. relatada como um dos principais agentes envolvidos em casos patolgicos em rpteis, o que pode justificar a alta ocorrncia desta bactria em relatos de animais j doentes. O gnero Staphylococcus sp. um grupo de bactrias patognicas que colonizam, alm de outras estruturas, as membranas mucosas do intestino (QUINN et al., 1994). Este gnero j foi relatado por estar presente na microbiota oral e intestinal de variadas

55 espcies de crocodilianos como aligatores americanos (MAINSTER et al., 1972; BARNETT e CARDEILHAC, 1995), em um crocodilo ano cativo com artrite sptica (HEARD et al., 1988), em gaviais (MISRA et al., 1993), em jacars-do-papo-amarelo (MATUSHIMA e RAMOS, 1993) e em crocodilos anes (HUCHZERMEYER et al., 2000). Silva et al. (2009) relataram que o gnero Staphylococcus sp. foi o de maior ocorrncia com 14,74% na microbiota oral e cloacal de C. latirostris. As amostras do contedo dos ovos com odor ftido e dos filhotes sem aparente decomposio e com retardo no desenvolvimento resultaram em bactrias que tambm foram isoladas da casca dos ovos em ambiente natural, indicando que, mesmo que essas bactrias sejam necessrias para colonizao da microbiota dos recm-nascidos, elas tambm oferecem risco de contaminao, pois a bactria pode infectar o ovo tanto transovarialmente, atravs de uma infeco do vitelo, ou aps a postura, atravs da casca. A casca e as membranas apresentam uma certa barreira para a penetrao da bactria, porm, pequenas rachaduras na casca permitem facilmente o acesso bactria (HUCHZERMEYER, 2003). Em mdia, 3 a 15% dos ovos tm a casca rachada durante o processo de postura (JOANEN, 1969; POOLEY, 1969; WEBB, MESSEL e MAGNUSSON, 1977; GOODWIN e MARION, 1978) e, se um ovo sofre uma contaminao, ele pode representar um perigo para os ovos adjacentes no ninho, o que pode explicar a taxa de 27,6% de ovos no eclodidos. Alm disso, a terra onde os ninhos so construdos tambm se torna contaminada com o tempo, principalmente se algum ovo quebrado antes da ecloso (HUCHZERMEYER, 2003).

5.6 Microbiota fngica

Os fungos isolados neste experimento so fungos saprfitas, ou seja, amplamente encontrados no solo e meio ambiente e alguns deles, j foram descritos como componentes da microbiota oral e cloacal de crocodilianos ou mesmo como causadores de algum tipo de transtorno patolgico (QUINN et al., 1994; HUCHZERMEYER, 2000; HUCHZERMEYER, 2003; SUMMERBELL, 2003). Huchzermeyer (2003) afirma que a maioria das infeces por fungos so oportunistas e que aqueles que fazem parte da microbiota intestinal so excretados diariamente com as fezes e, sob condies favorveis como o calor e umidade, podem-se multiplicar, o que justifica a presena dos fungos em ovos de C. yacare, pois, alm de o ninho ser um ambiente mido e quente, as

56 fmeas de crocodilianos a defecam no momento da postura, contaminando o ambiente com os microorganismos presentes na microbiota intestinal. Este mesmo autor ainda afirma que o risco de uma infeco fngica maior em ninhos feitos em formato de monte, devido ao tipo de material utilizado para a construo dos mesmos, como o caso do C. yacare. Alm disso, a incubao artificial com o material proveniente do ninho pode oferecer um risco de contaminao dos ovos, principalmente contaminaes fngicas (HUCHZERMETER, 2003). Os fungos presentes no material do ninho so capazes de penetrar a casca do ovo, conforme descrito por Hibberd (1994), que descobriu que o tamanho dos poros da casca de ovos de Crocodylus porosus era suficiente para permitir que hifas e esporos penetrassem. Relatou, tambm, que houve o crescimento de hifas ao longo de pequenas rachaduras presentes na casca. A maioria dos fungos encontrados neste trabalho pertence ao Filo Ascomycota (Aspergillus sp.; Fusarium sp.; Geotrichum sp.; Mycelia sterilia, Penicillium sp. e Trichoderma sp.), sendo apenas a espcie Cunninghamella echinulata pertencente ao Filo Zygomicota (SUMMERBELL, 2003). A amostra microbiolgica que foi coletada na incubadora antes da chegada dos ovos resultou em fungos que esto naturalmente presentes no ambiente como Aspergillus sp., Mycelia sterilia e Penicillium sp. (QUINN et al., 1994; KONEMAN et al., 2001). O Fusarium sp. foi isolado em 40% das amostras. Esse gnero principalmente encontrado em estudos agrcolas, ecolgicos ou de biodiversidade (SUMMERBELL, 2003), estando amplamente distribudo no ambiente e, consequentemente, est presente no ambiente de nidificao. Algumas espcies como o Fusarium nygamai esto associadas com razes de plantas e gros (BURGESS e TRIMBOLI, 1986) e, como foi descrito neste trabalho, as razes esto presentes na constituio do ninho de jacars-doPantanal. J o F. proliferatum tem sido frequentemente isolado no substrato de plantas, em insetos e no solo (ODONEL et al., 1998). O F. sacchari na natureza comumente isolado de uma variedade de plantas tropicais (ODONEL et al., 1998). O F. solani uma espcie bem conhecida pela associao com vrios tipos de solo e plantas, assim como o F. oxysporum, que tambm relatado em lagos, rios e esgotos (DOMSCH, GAMS e ANDERSON, 1993). O gnero Fusarium, alm de estar normalmente presente no ambiente, tambm capaz de causar doena tanto em crocodilianos, como em outros rpteis e mamferos. O Fusarium moniliforme j foi isolado dos pulmes de um Alligator mississippiensis que apresentou pneumonia (FRELIER, SIGLER e NELSON, 1985). O Fusarium solani foi isolado de rgos internos de Crocodilus porosus de cativeiro que tambm estavam doentes (HIBBERD e HARROWER, 1993; BUENVIAJE et al., 1994).

57 Fusarium sp. foi isolado de C. porosus cativos (HIBBERD et al., 1996), da gengiva de um C. crocodilus fuscus de cativeiro (KUTTIN et al., 1978) e da pele de um C. porosus cativo (BUENVIAJE, LADDS e MARTIN, 1998). Hibberd e Harrower (1993) descreveram uma alta mortalidade em filhotes de Crocodylus porosus que foi atribuda ao Fusarium solani, que estava presente em amostras do fgado, dos pulmes e do intestino delgado. Nestes mesmos animais tambm foram isolados Paecilomyces lilacinus, Cladosporium spp. e Aspergillus spp., mas em uma frequncia mais baixa. Amostras ambientais mostraram que este patgeno estava amplamente distribudo no ambiente da fazenda. Uma contaminao dos ovos pelo fungo foi determinada como a causa primria provvel da infeco juntamente com subsequente trauma fsico nos filhotes. O material do ninho foi implicado como a maior fonte de contaminao do ovo (HIBBERD et al., 1994; 1996). O Penicillium sp. foi isolado em 35% dos ninhos e este gnero est entre os fungos mais comuns de decomposio da natureza, sendo comumente encontrado no solo e tambm em serrapilheiras (SUMMERBELL, 2003). Este fungo tambm possui potencial patognico. Em crocodilianos, ele j foi isolado dos pulmes de crocodilos e aligatores (KEYMER, 1974), da pele de C. porosus (BUENVIAJE et al., 1994; HIBBERD et al., 1996) e Huchzermeyer et al. (2000) relatam a presena deste fungo na microbiota intestinal de Osteolaemus tetraspis. O gnero Aspergillus sp. ocorreu em 25% dos casos. Este tambm classificado como um fungo saprfita, chamado comumente de fungo do solo e um agente oportunista de infeces em animais e humanos (SUMMERBELL, 2003). Em crocodilianos, j foi relatado em C. porosus doentes (BUENVIAJE et al., 1994; HIBBERD et al., 1996; BUENVIAJE, LADDS e MARTIN, 1998) e de leses da pele de jacars (gnero Caiman) de cativeiro (TROIANO e ROMN, 1996). Alm de tambm j ter sido isolado a partir da microbiota intestinal de Osteolaemus tetraspis (HUCHZERMEYER et al., 2000). A espcie Cunninghamella echinulata tambm foi isolada em 25% das amostras. Os membros deste gnero so saprfitas que vivem normalmente no solo, na vegetao em decomposio e podem ser parasitas facultativos de plantas. A patogenicidade da Cunninghamella echinulata essencialmente determinada pelas condies do hospedeiro ou do ambiente, capazes de favorecer sua multiplicao e instalao (SCHIPPER e STALPERS, 2002). O gnero Geotrichum sp. foi isolado em 10% dos ninhos e este tambm um fungo do solo, gua, ar e plantas, ele tambm comumente encontrado na microbiota de seres humanos (SUMMERBELL, 2003) e tambm em crocodilianos (HUCHZERMEYER et

58 al., 2000) e, assim como os anteriormente descritos, tambm capaz de causar infeces em crocodilianos como em C. porosus (HIBBERD et al., 1996). A Micelia sterilia um grupo de fungos no qual no h produo de condios, apenas de hifas (HOWARD, 2002). Este grupo de fungos comumente isolado a partir de substrato de plantas (LACAP, HYDE e LIEW, 2003). O fungo Trichoderma sp. foi isolado em 10% das amostras e, assim como os outros, este tambm est presente no solo e plantas (HARMAN et al., 2004) e tambm existe relato deste gnero causando doena na pele de aligatores americanos selvagens (FOREYT, LEATHERS e SMITH, 1985) e como componente da microbiota de Osteolaemus tetraspis sadios (HUCHZERMEYER et al., 2000).

59 6 CONCLUSES

Diante dos resultados apresentados, julgamos poder concluir que: A constituio dos ninhos est relacionada disponibilidade de material no ambiente. frequente a presena de invertebrados nos ninhos sem que, contudo, fosse possvel relacionar tal fato a quaisquer danos ou benefcios aos animais. A fitofisionomia das reas selecionadas pelas fmeas para a construo dos ninhos era diversificada, mas estava sempre associada a curso dgua. No houve diferena estatisticamente significativa entre as quatro regies estudadas para o parmetro tamanho do ninho. O nmero de ovos por ninho tambm no variou estatisticamente de acordo com a regio analisada. No houve diferena estatisticamente significativa entre as quatro regies estudadas para o parmetro tamanho dos ovos e dos filhotes. A taxa de ecloso foi de 72,4% e os ovos que no eclodiram (128; 27,6%) apresentaram morte fetal, contedo caseoso ou ptrido ou retardo no desenvolvimento fetal. A microbiota bacteriana encontrada na superfcie dos ovos apresentou-se ampla e reflete a origem a partir do solo, da gua e do organismo da me. A microbiota fngica saprfita e tambm reflete sua origem.

60 7 CONSIDERAES FINAIS

Tanto na microbiota bacteriana quanto na fngica existem espcies com potencial patognico para o Caiman yacare, seja durante a vida embrionria/fetal ou ps-ecloso. Todavia, os fatores predisponentes que viabilizam a instalao do processo patolgico, ainda precisam ser explorados do ponto de vista cientfico, para que se estabelea o limite entre as perdas por processo seletivo daquelas efetivamente oriundas do desequilbrio entre agente etiolgico e hospedeiro. Dessa forma, talvez seja possvel compreender os fatores que culminam com a perda da viabilidade dos ovos, sejam eles genticos, ambientais ou patolgicos.

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74 APNDICE A - ARTIGO CIENTFICO

Trabalho 2616 WM (Adapt.p.PVB, 14.12.11)

Taxa de ecloso e microbiota bacteriana de ovos de jacar-doPantanal (Caiman yacare Daudin, 1802)1

ABSTRACT.- 2012. [Hatch rate and bacterial microbiota of the Pantanal caiman (Caiman yacare Daudin, 1802) eggs.] Taxa de ecloso e microbiota bacteriana de ovos de jacar-do-Pantanal (Caiman yacare Daudin, 1802). The commercial breeding of the Pantanal Caiman has been growing in the State of Mato Grosso and the success of this activity is strongly related to the species reproductive efficiency in the wild, particularly with the conditions of the artificial incubation which interfere directly in the hatch rates. The sanitary conditions of the incubation process (asepsis during the collection and artificial incubation of the eggs) are barely explored. Thus, this paper aims at characterizing both the hatch rates and the bacterial microbiota of the C. yacare eggs at the moment of collection for artificial incubation, as well as at correlating the microbiota and the hatch rates with the environment (phytophysiognomy) in which the nests were collected. Microbiological samples were collected from the surface of eggs in twenty nests, located at a farm in North Pantanal, in the city of Pocon. After being collected, the eggs were counted and prepared to be taken to the incubator. Among these twenty nests, there was a total of 464 eggs in which 336 animals hatched (72.41%). The remaining eggs where opened and 124 (26.72%) of them were fetid and had putrid contents and 4 (0.86%) didn`t have fetid smell but had hatchlings with the yolk-sac still outside the abdominal cavity. Among the 124 eggs, in 15 of them (12.1%) it was possible to see a hacthling and/or embryo, not being possible to see them in the rest (109; 87.9%), due to advanced decomposition. The comparison from the hatch rate with the four areas didnt show significance (p>0.05), indicating that these parameters were not influenced by the factor area. In the samples from 20 nests, 22 different bacteria were identified: Bacillus cereus (95%), Flavobacterium multivorum (80%), Citrobacter freundii (75%), Enterobacter aerogenes (75%), Streptococcus sp. (45%), Escherichia colli (40%), Acinetobacter sp. (35%), Alcaligenes sp. (30%), Proteus vulgaris (30%), Pseudomonas stutzeri (30%), Aeromonas hydrophila (25%), Proteus mirabilis (20%), Enterobacter agglomerans (15%), Staphylococcus aureus (15%), Serratia liquefacians (10%), Staphylococcus intermedius (10%), Escherichia hermanini (5%), Hafnia alvei (5%), Morganella morganni (5%), Salmonella sp. (5%), Serratia marcescens (5%) and Shigella sonnei (5%). When the areas were compared in terms of microbiota, statistical difference was observed for two species (p<0.05) Citrobacter freundii and Enterobacter agglomerans. However, for the other species, the area effect was not significant (p>0.05). The hatch rates in this paper were 72.41% , and aspects which determine them, whether in natural or artificial environments, still need to be more explored from the scientific point of view. Regarding the microbiota, all the bacteria isolated at this study had already been related by other authors as part of the crocodilians oral and/or cloacal microbiota or as ethiological agents of infectious processes. INDEX TERMS: nest, commercial breeding, ranching, enterobacteria. RESUMO.- A criao comercial do jacar-do-Pantanal tem alcanado grande destaque econmico no Estado de Mato Grosso e o sucesso dessa atividade est diretamente relacionado eficincia reprodutiva da espcie
1

Recebido em 14 de dezembro de 2011. Aceito pra publicao em ......................................

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na natureza, em especial, s condies de incubao que interferem diretamente nas taxas de ecloso. As condies

sanitrias do processo de incubao (assepsia durante a coleta e incubao artificial dos ovos) so pouco exploradas. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo verificar as taxas de ecloso dessa espcie e caracterizar a microbiota bacteriana de ovos de C. yacare no momento da coleta para a incubao artificial, assim como correlacionar tanto a microbiota como as taxas de ecloso com o ambiente (fitofisionomia) em que os ninhos foram coletados. Foram coletadas amostras microbiolgicas da superfcie dos ovos em 20 ninhos, localizados em uma fazenda no Pantanal Norte, municpio de Pocon. Aps a coleta, os ovos foram contados e preparados para o transporte at a incubadora. Desses 20 ninhos, obteve-se um total de 464 ovos dos quais eclodiram 336 animais (72,41%). Os ovos remanescentes foram abertos e 124 (26,72%) deles apresentaram odor ftido e contedo ptrido e 4 (0,86%) no possuam odor ftido mas continham filhotes com vitelo ainda fora da cavidade abdominal. Dentre os 124 ovos, em 15 deles (12,1%) foi possvel observar a presena de feto e/ou embrio, no sendo possvel a identificao deles no restante (109; 87,9%), devido decomposio avanada. A comparao da taxa de ecloso com as quatro reas no mostrou significncia (p>0,05), indicando que esses parmetros no sofreram influncia do fator rea. Nas amostras dos 20 ninhos, foram identificadas 22 bactrias diferentes: Bacillus cereus (95%), Flavobacterium multivorum (80%), Citrobacter freundii (75%), Enterobacter aerogenes (75%), Streptococcus sp. (45%), Escherichia colli (40%), Acinetobacter sp. (35%), Alcaligenes sp. (30%), Proteus vulgaris (30%), Pseudomonas stutzeri (30%), Aeromonas hydrophila (25%), Proteus mirabilis (20%), Enterobacter agglomerans (15%), Staphylococcus aureus (15%), Serratia liquefacians (10%), Staphylococcus intermedius (10%), Escherichia hermanini (5%), Hafnia alvei (5%), Morganella morganni (5%), Salmonella sp. (5%), Serratia marcescens (5%) e Shigella sonnei (5%). Quando as reas foram comparadas em termos de microbiota, observou-se diferena estatstica para duas espcies (p<0,05) Citrobacter freundii e Enterobacter agglomerans, porm, para as demais espcies, o efeito de rea no foi significativo (p>0,05). A taxa de ecloso neste trabalho foi de 72,41% e aspectos que as determinam, sejam em ambientes natural ou artificial, ainda precisam ser melhor explorados do ponto de vista cientfico. Em relao microbiota, todas as bactrias isoladas j haviam sido relatadas por outros autores como fazendo parte da microbiota oral e/ou cloacal de crocodilianos ou como agentes etiolgicos de processos infecciosos. TERMOS DE INDEXAO: ninho, criao comercial, ranching, enterobactria.

INTRODUO O jacar-do-Pantanal (Caiman yacare Daudin, 1802) uma das seis espcies de crocodilianos de ocorrncia no Brasil (Brnils 2010), cuja criao comercial tem alcanado grande destaque econmico no Estado de Mato Grosso a partir da regulamentao do sistema de criao pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (Ibama) denominado ranching (Brasil 1990, 2009). Este sistema fundamenta-se na coleta de filhotes ou de ovos na natureza, mediante prvio levantamento populacional da espcie na rea pretendida, na incubao artificial desses ovos e na recria dos jovens em instalaes apropriadas (Campos et al. 2005). Dessa forma, verifica-se que o sucesso dessa atividade est diretamente
relacionado eficincia reprodutiva da espcie na natureza, em especial, s condies de incubao. Em ambiente natural, o perodo reprodutivo de C. yacare se estende de janeiro a maro (Coutinho & Campos 2006), poca em que as fmeas realizam a postura de 22 a 35 ovos, sendo no mximo 42 ovos por ninho (Campos et al. 2010). O perodo de incubao de C. yacare varia com a temperatura e umidade durante a

incubao, podendo ir de 70 a 90 dias (Miranda et al. 1999). Joanen & McNease (1981) revelaram que, alm de fatores ambientais, o estado da incubao dos mesmos no momento da coleta tambm influencia a ecloso. Em cativeiro, Verdade (2001) relatou uma taxa de ecloso de 79,83% de ovos de jacar-de-papoamarelo (Caiman latirostris) no sistema de ciclo fechado (farming), caracterizado pela reproduo, oviposio e incubao em cativeiro. Em ovos de Caiman crocodilus crocodilus incubados artificialmente, Prez (2001) encontrou 84,1% de sucesso de ecloso em que 1,71% dos ovos no eclodidos apresentaram morte embrionria, 9,84% eram infrteis e 4,22% possuam malformaes que foram atribudas a fatores hereditrios. Miranda et al. (2002) relataram taxas de ecloso relacionadas temperatura de incubao em C. yacare de 66,63% a 28C e de 83,3% a 30C. Montini et al. (2006) relataram, em C. latirostris, baixa taxa de ecloso (62%) na incubao natural em virtude do local de nidificao, em que o sucesso dessa taxa foi maior em ninhos de vegetao flutuante do que naqueles construdos em matas. Para esta mesma espcie,

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Pia et al. (2007b) relataram uma taxa de ecloso de 73,4% no sistema ranching. Huchzermeyer (2003) afirmou que as taxas de ecloso na crocodilicultura so baixas e as atribuiu utilizao de tcnicas inadequadas na incubao artificial. Alm dos fatores j citados por Joanen e McNease (1981), Grigg (1987) relatou que o sucesso da taxa de ecloso est diretamente relacionado s condies de transporte do ovo do ninho ao setor de incubao e s condies fsicas e sanitrias da incubadora. As condies sanitrias do processo de incubao (assepsia durante a coleta e incubao artificial dos ovos) so pouco exploradas, embora fatores como exposio a alta temperatura e umidade (Ferguson 1981a) e manuseio no momento da coleta (Bassetti 2006) j tenham sido relatados como condies que favorecem o processo de contaminao de ovos por fungos e bactrias. Por outro lado, Ferguson (1981a) relatou que a presena de bactrias no ninho durante a incubao natural facilita a ecloso do filhote pela ao dos cidos oriundos do metabolismo bacteriano sobre a camada externa do ovo, mas no especificou quais espcies bacterianas poderiam estar envolvidas nesse processo. Existem poucas informaes referentes constituio dessa microbiota, mas Schumacher Cardeilhac (1990) encontraram Enterobacter cloacae, Citrobacter sp., Proteus sp. e Pseudomonas aeruginosa da membrana de ovos de Alligator mississipiensis com leses caractersticas de contaminao. Todas essas espcies fazem parte da microbiota intestinal de crocodilianos, indicando uma contaminao fecal como fonte do problema. Salmonella arizona, Pseudomonas aeruginosa e Aeromonas hydrophila foram isoladas de membranas da casca de ovos de crocodilos do Nilo que no eclodiram no Zimbbue (Foggin 1992). Gattamorta et al. (2002) investigaram a presena de Salmonella sp. no contedo de ovos recm-eclodidos de C. latirostris, porm, no isolaram nenhuma espcie. Em contrapartida, a microbiota oral e cloacal de crocodilianos tem sido descrita sem, no entanto, ser correlacionada microbiota dos ovos (Ramos et al. 1992, Huchzermeyer et al. 2000, Germino et al. 2008, Silva et al. 2009). Considerando a escassez de informaes sobre a composio da microbiota bacteriana de ovos de C. yacare incubados naturalmente, o presente trabalho teve como objetivo verificar as taxas de ecloso dessa espcie e caracterizar a microbiota de ovos no momento da coleta para a incubao artificial, assim como correlacionar tanto a microbiota como as taxas de ecloso com o ambiente (fitofisionomia) em que os ninhos foram coletados. MATERIAL E MTODOS O experimento foi realizado em uma fazenda localizada no municpio de Pocon, durante os meses de maro e abril de 2011, conforme aprovao pelo Comit de tica em Pesquisa Animal (Cepa/UFMT, protocolo 23108.044293/10-8). Esta propriedade realiza a coleta e a incubao artificial de ovos destinados criao comercial. Para tanto, durante o ms de maro foram realizados nesta propriedade o censo de ninhos e a respectiva identificao. De um total de 103 ninhos encontrados, 20 foram coletados para a incubao artificial, sendo definidos por sorteio, levando-se em conta quatro reas da fazenda que apresentaram maior ocorrncia: a rea designada de Piuval (Ninhos 1-6), a Estrada Parque (Ninhos 7-11), a Vazante (Ninhos 12-16) e a Lixeiro (Ninhos 17-20). No local de cada ninho trabalhado, foram coletados dados referentes fitofisionomia da rea escolhida pela fmea para a construo do ninho, que foi descrita segundo Cunha, Junke & Leito-Filho (2007), e realizado o georreferenciamento. Aps a abertura do ninho, procedeu-se coleta das amostras microbiolgicas da superfcie dos ovos por swabs, sendo ento acondicionados em meio de transporte (meio de Stuart), resfriados a aproximadamente 4C em recipiente isotrmico e transportados para o processamento, no excedendo o perodo de 24 horas at a semeadura. Aps a coleta, os ovos de cada ninhada foram identificados na parte superior, indicando a sua posio original no ninho e transportados at a incubadora, sendo acondicionados em caixas forradas com o material vegetal do ninho. No local destinado incubao, cada ninho foi mantido separadamente em pequenos recintos delimitados por tijolos de oito furos (Figura 1), forrados pelo material oriundo do ninho, conforme procedimento adotado na propriedade em coletas anteriores. Os ovos foram depositados nesses compartimentos forrados e cobertos com o mesmo material vegetal onde permaneceram, por no mximo 39 dias, at o momento da ecloso. Neste mesmo recinto, foi instalado um termmetro de mnima e mxima e higrmetro, para o acompanhamento, respectivamente, da temperatura (em C) e umidade relativa do ar (em %) que foram mensuradas a cada seis horas durante todo o perodo da incubao. Aps a ecloso, os filhotes foram transferidos para as instalaes da criao comercial e os ovos remanescentes foram contados para a verificao da taxa de ecloso. Todos os ovos passaram pelo exame de ovoscopia e foram classificados de acordo com o grau de desenvolvimento embrionrio segundo Ferguson (1981b), sendo considerados infrteis, de grau 0, aqueles que se apresentaram

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totalmente translcidos e de grau 4 aqueles que no apresentaram nenhuma translucidez ao referido exame. Nos ovos em que no ocorreu a ecloso foram abertos atravs de um corte longitudinal com lmina de bisturi e o contedo foi inspecionado quanto presena ou no de embrio/feto. Os ovos com odor ftido foram caracterizados no s pela presena dessa caracterstica, mas tambm pela observao de uma colorao escurecida, manchas circulares na casca e/ou tamanho diminudo. As amostras coletadas foram semeadas em gar sangue e gar Mac Conckey para a identificao de bactrias, sendo incubadas em ambiente aerbico e anaerbico a 37C e observadas a cada 24 horas por at 72 horas. Aps a observao do crescimento bacteriano, as colnias foram identificadas de acordo com suas caractersticas morfotintoriais e provas bioqumicas. As anlises foram realizadas segundo a metodologia descrita por Quinn et al. (1994) e Koneman et al. (2001). A colnia condizente com Salmonella sp. foi confirmada atravs da tcnica de reao em cadeia de polimerase (PCR) em que foram realizadas a extrao segundo a metodologia de fervura-centrifugao descrita por Soumet et al. (1994) e o PCR segundo Suh & Song (2005), utilizando um par de primers que originam produtos de amplificao de 298 pares de base correspondente ao gene invA. O delineamento estatstico utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos (reas Piuval, Estrada Parque, Vazante e Lixeiro). Todos os ovos de um determinado ninho foram considerados uma parcela. O nmero de repeties de cada tratamento foi diferente em funo da proporo de ninhos encontrados em cada rea. A correlao da taxa de ecloso, da quantidade de ovos infrteis e dos ovos em que no houve ecloso por odor ftido ou retardo no desenvolvimento em relao aos outros filhotes eclodidos no mesmo ninho com as regies estudadas foi submetida anlise de varincia (Anova) e teste de mdias Tukey conforme Banzato e Kronka (1992), utilizando o software Saeg. A correlao da microbiota bacteriana encontrada em cada ninho com as quatro reas foi realizada segundo um modelo linear generalizado com funo de ligao logstica, por meio do pacote estatstico R (2010), em que, para cada bactria encontrada, foi feita uma anlise de deviance. O modelo estatstico que descreve as observaes dado por: yij i ij (Cordeiro & Demtrio 2007). RESULTADOS Os ninhos de Caiman yacare dos quais o material biolgico foi coletado, localizados na rea Piuval, foram construdos pelas fmeas no interior de capes de gravats e prximos gua. Eles eram formados por razes, terra mida e uma pequena quantidade de material em decomposio no solo (serrapilheira). Os ninhos localizados na Estrada Parque eram construdos em campos de murundus e, em sua maior parte, eram constitudos de serrapilheira e, em menor proporo, de terra e razes. Na Vazante, os ninhos foram encontrados em cambarazais (ninhos 12 e 14) e campos de murundus (ninhos 13, 15 e 16) e eram formados por serrapilheira, gravetos e uma quantidade menor de terra. Os ninhos localizados na rea do Lixeiro foram construdos em campos de murundus e continham terra, gravetos e pouca serrapilheira. Todos os ninhos investigados neste trabalho possuam sombreamento parcial oferecido por rvores localizadas ao redor dos ninhos e foram construdos em camada nica. Nos ninhos das quatro reas foi observada a presena de invertebrados como cupins em 40% dos ninhos, formigas em 30%, diplpodas em 25% e lacraias em 5% conforme mostrado no quadro 1, assim como as coordenadas geogrficas de cada ninho. Com relao temperatura e umidade no ambiente durante a incubao dos ovos, a temperatura mdia foi de 28,5C, tendo sido observada uma temperatura mnima de 23,6C e mxima de 33,7C. A umidade relativa do ar mdia foi de 81,3%, sendo o valor mnimo igual a 57,4% e o valor mximo igual a 95,8%. A variao da temperatura (em C) e da umidade relativa do ar (em %) durante o perodo de incubao est descrita na figura 2. Desses 20 ninhos obteve-se um total de 464 ovos (sendo 407 frteis; 38 ftidos e 19 se apresentaram translcidos ao exame de ovoscopia). Aps o termino da incubao, 336 filhotes (72,41%) eclodiram, dos 128 (27,58%) que no eclodiram, 124 (26,72%), ao serem abertos, se apresentaram com odor ftido e contedo ptrido e 4 (0,86%) no possuam odor ftido e continham filhotes que, quando comparados com os filhotes do mesmo ninho j eclodidos, estavam atrasados quanto ao desenvolvimento, o que foi evidenciado pela presena do vitelo ainda fora da cavidade abdominal. Dentre os 124 ovos, em 15 deles (12,1%) foi possvel observar a presena de feto e/ou embrio (Figura 3), no sendo possvel a identificao deles no restante (109; 87,9%), devido decomposio avanada (Quadro 1). A comparao da taxa de ecloso, do nmero de ovos infrteis e dos outros ovos em que no ocorreu a ecloso (odor ftido ou retardo

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no desenvolvimento) entre as quatro regies no mostrou significncia (p>0,05), indicando que esses parmetros no sofreram influncia do fator rea (Quadro 2). Nas amostras de ovos de C. yacare oriundas de 20 ninhos coletados, foram identificadas 22 bactrias diferentes que esto relacionadas no quadro 3. Quando a microbiota foi comparada entre as reas, a anlise estatstica mostrou que, para a maioria das espcies, o efeito de rea no foi significativo (p>0,05), indicando que no existe diferena entre as mesmas (Quadro 4). No entanto, para as espcies Citrobacter freundii e Enterobacter agglomerans observou-se diferena estatstica (p<0,05). DISCUSSO O local de nidificao de Caiman yacare caracterizado neste trabalho se assemelha s descries encontradas para outros crocodilianos (Greer 1970, Ferguson 1985, Prez 2001, Miranda et al. 2002, Huchzermeyr 2003, Avanzine et al. 2007). Na natureza, so encontrados ninhos com diferentes itens em sua constituio, de acordo com a espcie e os recursos disponveis no ambiente de nidificao. H ninhos, por exemplo, constitudos por material vegetal como capim e gravetos,eventualmente misturados com terra (SarkisGonalves et al. 2001), como descrito para os ninhos das regies Estrada Parque e Vazante. As espcies que vivem em florestas constroem ninhos a partir de montes de folhas encontradas no cho da floresta e dependem do calor produzido pela compostagem, e no do sol, para incubar os ovos. As espcies que vivem em pntanos fazem o ninho a partir da vegetao de mangue e tambm dependem do calor da compostagem, bem como do sol para a incubao dos ovos (Huchzermeyer 2003). Villamarn-Jurado e Surez (2007) descreveram ninhos de Melanosuchus niger como montes cnicos feitos de serrapilheira e razes e ainda afirmaram que todos os ninhos encontrados estavam prximos a uma lagoa, o que corrobora os dados obtidos nesta investigao pois, como descrito acima, os ninhos de C. yacare encontrados estavam sempre localizados prximo gua e eram formados por montes de serrapilheira, razes e terra. Segundo Verdade (1995), em C. Latirostris, a presena da terra pode ser justificada pela necessidade de complementao do tamanho "normal" do ninho onde, aparentemente, no h folhas em quantidade suficiente para sua construo. A semelhana do observado nos ninhos de C. yacare, Magnusson et al. (1985) e Allen et al. (1997) tambm relataram a presena de invertebrados como cupins e formigas, respectivamente para Paleosuchus trigonatus e Alligator mississipiensis. No entanto, esses autores no relataram a presena de diplpodas como observado para C. yacare. Embora no se tenha objetivado a identificao desses invertebrados nem as interrelaes entre eles e o jacar-do-Pantanal, Allen et al. (1997) investigaram os efeitos da formiga de fogo (Solenopsis invicta) sobre filhotes de aligtores. Esta espcie frequentemente se instala nos ninhos desses crocodilianos, e, medida que se inicia o processo de ecloso, elas podem penetrar nos ovos e consumir o contedo do mesmo, picando os filhotes at que a me os leve para a gua, o que, se ocorrer de forma rpida, no trar maiores consequncias para os filhotes, mas, se houver demora, podero aparecer edemas, principalmente ao redor dos olhos e extremidades dos membros. As lacraias so invertebrados que pertencem classe quilpoda que tem como caracterstica o hbito de viver escondida nos habitats escuros e midos, entre as folhas e galerias no solo (Couto 2008), de forma que se verifica que os ninhos de crocodilianos, que so montes de folhas midas e escuras, so um ambiente adequado para a instalao dessas espcies. Com relao temperatura e umidade relativa do ar na incubadora, sabe-se que, para a incubao de ovos de crocodilianos, no so recomendadas temperaturas abaixo de 27C ou acima de 34C, o que poderia comprometer a sobrevivncia dos embries (Sarkis-Gonalves et al. 2001). Embora se saiba que a temperatura e umidade relativa do ar sejam capazes de interferir na incubao dos ovos (Miranda et al. 2002, Pia et al. 2003, 2005, 2007a.), no se acredita que essa seja a causa da taxa de ecloso obtida neste experimento, pois os ovos foram coletados no ltimo tero do perodo de incubao e a taxa de ovos ftidos foi alta com 26,72% de todos os ovos acometidos. Alguns estudos sugeriram que temperaturas muito altas ou baixas causam malformaes e comprometem a sobrevivncia dos filhotes (Webb & Cooper-Preston 1989, He et al. 2002, Zhu et al. 2006). Miranda et al. (2002) relataram os efeitos da temperatura de incubao em ovos de Caiman crocodilus yacare e os ovos que tiveram a temperatura reduzida de 30C para 28C sofreram danos severos e afirmam ainda que esses danos foram causados no pela temperatura de 28 C, e sim pela mudana, o que tambm ocorreu neste trabalho. A taxa de ecloso verificada neste experimento (72,41%) assemelha-se s taxas descritas por Verdade (2001), que relatou uma taxa de ecloso de 79,83% de ovos de C. latirostris em cativeiro no sistema de ciclo fechado (farming). Miranda et al. (2002) tambm revelaram taxas de ecloso relacionadas

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temperatura de incubao em C. yacare de 66,63% a 28C e de 83,3% a 30C. Pia et al. (2007a) relataram taxas de ecloso de 79,3% a 29C, 77,9% a 31C e 50,6% a 33C para C. latirostris e, em ovos armazenados em caixas para o transporte de ovos de jacar (harvest containers), Pia et al. (2007b) verificaram mdia de sucesso de ecloso de 73,4%. Em C. latirostris e C. yacare na Argentina, Martinez et al. (2002) revelaram taxas de ecloso de 77%. Quanto taxa de ovos infrteis, Prez (2001) relata taxas de 9,84% para Caiman crocodilus crocodilus e Martinz et al. (2002) encontraram 9% de infertilidade em ovos de C. latirostris e C. yacare, sendo essas taxas neste trabalho para C. yacare inferiores (4,09%). Segundo Huchzermeyer (2003), a infertilidade do ovo pode ser explicada por fatores genticos, doenas ou a condio nutricional da fmea, o que poderia justificar a taxa de 4,09% encontrada neste trabalho e a diferena com os dados de Prez (2001), sendo que, em nenhum dos trabalhos foi verificada a condio sanitria das fmeas. A taxa de ecloso deste experimento est entre os valores citados para outros crocodilianos, embora nem todos os autores refiram-se a esse ndice como sendo baixo. Para que a criao comercial dessa espcie seja economicamente vivel, h a necessidade da otimizao dos esforos logstico e financeiro em todas as etapas do processo produtivo, inclusive na coleta e incubao dos ovos. Dessa forma, o ndice de 27,6% de ovos que no eclodiram resultam no final do processo, custos de obteno de matria prima (ovos) que no geram um produto (carne e couro) a ser comercializado, sendo assim, a melhoria na taxa de ecloso resultaria em melhor aproveitamento do recurso natural. Com relao aos ovos que no eclodiram (128) e foram abertos, s foi possvel observar a fertilidade de 15 deles (12,1%), que apresentavam feto em avanado estgio de desenvolvimento, pois, no incio do desenvolvimento, uma vez contaminado, o contedo do ovo se torna ptrido e o embrio acaba se dissolvendo. Dessa forma, torna-se difcil diferenciar um ovo infrtil de um com morte embrionria precoce (Huchzermeyer 2003). No caso dos ovos que aparentemente no possuiam odor ftido (4; 0,86%), mas que tambm no eclodiram, ao serem abertos, observou-se a presena de feto vivo, porm, ainda com o vitelo para fora, mostrando um retardo no desenvolvimento em relao aos outros. Sabe-se que alguns fatores, como a temperatura e umidade, podem ser responsveis pelo retardo no desenvolvimento embrionrio de crocodilianos (Ferguson 1985, Miranda et al. 2002, Huchzermeyer 2003), no entanto, outro fator mais provvel para esse achado a variao individual, em que os ovos em um mesmo ninho so afetados de forma diferente pelo tratamento trmico, dependendo do potencial de desenvolvimento de cada indivduo, conforme relatado por Miranda et al. (2002). Teoricamente, a bactria pode infectar o ovo tanto transovarialmente, atravs de uma infeco do vitelo, ou aps a postura, atravs da casca. A casca e as membranas apresentam uma certa barreira para a penetrao da bactria, porm, pequenas rachaduras na casca, permitem facilmente o acesso bactria (Huchzermeyer 2003). Em mdia, 3 a 15% dos ovos tm a casca rachada durante o processo de postura (Joanen 1969, Pooley 1969, Webb et al. 1977, Goodwin Marion 1978) e, se um ovo sofre uma contaminao, ele pode representar um perigo para os ovos adjacentes no ninho, o que pode explicar a taxa de 26,72% de ovos com odor ftido. Alm disso, a terra onde os ninhos so construdos tambm se torna contaminada com o tempo, principalmente se algum ovo quebrado antes da ecloso. Em relao microbiota bacteriana de ovos de jacar-do-Pantanal em ambiente natural, das 22 espcies encontradas, 13 pertencem famlia Enterobacteriaceea (Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter aglomerans, Escherichia coli, Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Proteus vulgaris, P. mirabilis, Salmonella sp., Serratia liquefacians, Serratia marcescens e Shigella sonnei), quatro se classificam como bactrias gram negativas no fermentadoras da glicose (Acinetobacter sp., Alcaligenes sp., Flavobacterium multivorum e Pseudomonas stutzeri), trs so cocos gram positivos (Streptococcus sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus intermedius), e duas so, respectivamente, um bacilo gram positivo (Bacillus cereus,) e um bacilo gram negativo (Aeromonas hydrophila). A diferena estatstica entre as espcies Citrobacter freundii e Enterobcter aglomerans nas quatro reas avaliadas aconteceram, pois a primeira ocorreu em 100% dos ninhos das regies Vazante e Lixeiro e a segunda foi isolada apenas na Vazante, em 60% dos ninhos. Alm do efeito rea sobre essas duas espcies, alguns autores inferem ainda que diferenas podem ocorrer devido reduo da populao bacteriana durante o transporte/estocagem das amostras, mesmo em meio e em temperatura adequadas (Santos et al. 2010), assim como o antagonismo bacteriano, em que certas bactrias acabam por inibir o desenvolvimento de outras, podendo estas estarem presentes no ambiente, mas no prevalecerem durante a semeadura e incubao (Quinn et al. 1994). A presena da espcie Bacillus cereus em 95% das amostras evidenciou a caracterstica do gnero, uma vez que as espcies pertencentes a este gnero so amplamente encontradas no ar, solo e gua (Quinn et

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al. 1994), e podem estar presentes em amostras de animais conforme relatado por outros autores que identificaram a presena deste gnero no aparelho digestrio de crocodilianos aparentemente sadios (Williams et al. 1990, Huchzermeyer et al. 2000, Silva et al. 2009). A espcie Flavobacterium multivorum tambm faz parte do grupo de bactrias que esto naturalmente presentes no ambiente, estando amplamente distribuda no solo e na gua. Ela apresenta certo potencial patognico em animais imunodeprimidos (Quinn et al. 1994) e j foi relatada em rpteis (Cubas & Baptistotte 2007) como em cascavis (Ferreira Jnior et al. 2009), tracaj (Gattamorta et.al. 2000), jararaca (Bastos et al. 2008) e em Alligator mississipiensis (Williams et al. 1990). As espcies Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter aglomerans, Escherichia coli, Escherichia hermanini, Hafnia alvei, Morganella morganni, Proteus vulgaris, P. mirabilis, Salmonella sp., Serratia liquefacians, Serratia marcescens e Shigella sonnei so enterobactrias e tm sido identificadas em outros estudos como integrantes comuns da microbiota do trato digestrio de rpteis, incluindo crocodilianos e podem-se constituir agentes oportunistas de infeces (Roggendorf & Mller 1976, Novak & Seigel 1986, Flandry et al. 1989, Misra et al. 1993, Huchzermeyer et al. 2000, Cupul-Magaa et al. 2005, Pessoa et al. 2008, Ferreira Junior et al. 2009, Johnston et al. 2010, Uhart et al. 2011). Espcies da famlia Enterobacteriaceae, assim como espcies j descritas na microbiota cloacal de crocodilianos eram esperadas, pois o ovo, durante o processo de postura, passa pela cloaca da me no momento em que est sendo posto no ninho e consequentemente entra em contato com os microorganismos presentes nesta regio. Alm disso, a fmea, durante a postura, defeca no ninho, contaminando o ambiente com bactrias residentes do intestino (Huchzermeyer 2003). O Estreptococos pode ser encontrado naturalmente em mucosas e no aparelho respiratrio e digestrio de seres humanos e animais. Este gnero apresentou uma ocorrncia de 45,45% dos isolamentos. Essa bactria, alm de ser bastante comum em relatos de animais sadios (Matushima & Ramos 1993, Huchzermeyer et al. 2000), possui grande potencial patognico. Bishop et al. (2007) relataram casos de fasciite necrosante em Crocodylus porosus causadas por Streptococcus agalactiae. Madsen (1993) isolou Streptococcus sp. em carne congelada de cauda de crocodilos no Zimbbue. Barnett e Cardeilhac (1995) atriburam a septicemia ocorrida em filhotes de aligtores americanos como sendo causada por essa bactria. As bactrias gram negativas no fermentadoras da glicose encontradas foram: Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp. e Alcaligenes sp. A espcie Pseudomonas stutzeri amplamente distribuda em solos e guas e raramente associada a infeces (Koneman et al. 2001), no entanto, o gnero Pseudomonas considerado como uma das principais causas de septicemia causada por bactrias gram negativas em rpteis (Mitchell 2006). Ferreira Jnior et al. (2009) relataram a presena da espcie Pseudomonas aeruginosa como sendo uma das de maior ocorrncia na microbiota de cascavis, assim como Pessoa et al. (2008) relataram a presena dessa espcie em 16% na microbiota de jabutis domiciliados no Estado de So Paulo. Por outro lado, Pseudomonas putida foi relatada por Gattamorta, Carvalho e Cato-Dias (2000), em tracaj, como espcie de baixa ocorrncia. O gnero Acinetobacter tambm est presente no solo, na gua (Quinn et al. 1994) e j foi relatado em tracajs (Podocnemis unifilis), em baixos nveis, por Gattamorta et al. (2000) e por Pessoa et al. (2008) que relataram a espcie Acinetobacter iwoffii em 6% dos casos estudados de jabutis (Geochelone carbonaria) domiciliados no Estado de So Paulo. Esta mesma espcie foi descrita por Ferronato et al. (2009) em 40% dos casos da microbiota oral de Phrynops geoffroanus. As bactrias pertencentes ao gnero Alcaligenes so saprfitas e frequentemente so isoladas dos intestinos dos vertebrados (Quinn et al. 1994), podendo-se tornar um patgeno oportunista e causar infeces nosocomiais (Koneman et al. 2001). Huchzermeyer et al. (2000) isolaram Alcaligenes faecalis em 6,89% dos isolados de microbiota cloacal de crocodilos anes (Osteolaemus tetraspis). A espcie Aeromonas hydrophila foi isolada em 25% dos ninhos estudados e outros trabalhos relataram a sua presena em porcentagens variadas, como Gorden et al. (1979) que isolaram esta mesma espcie em 85% de amostras da cavidade oral e em 70% de amostras obtidas a partir de tecido interno de aligtores americanos que vieram a bito sem causa aparente, sugerindo que esta espcie poderia estar envolvida na causa da morte. Aeromonas hydrophila j foi isolada em filhotes de aligtores americanos (Barnett & Cardeilhac 1995). Gattamorta et al. (2000) encontraram uma prevalncia de 58,62% desta espcie em swabs cloacais de Podocnemis unifilis. Pessoa (2008) relatou apenas 4% de isolados de Aeromonas em Geochelone carbonaria. Johnston et al. (2010) estudaram a microbiota presente nas fezes de aligtores americanos e a Aeromonas hydrophila estava presente em 59 dos 70 isolados. Ferronato et al. (2009) relataram a presena de 25% desta espcie em Phrynops geoffroanus. A diferena de resultados obtidos nesta investigao com os trabalhos supracitados pode ser explicada pelo uso de mtodos diferentes de isolamento bacteriano (Santos et al. 2010). Alm disso Michael (2006) afirma que a presena do gnero Aeromonas sp.

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relatada como um dos principais agentes envolvidos em casos patolgicos em rpteis, o que pode justificar a alta ocorrncia desta bactria em relatos de animais j doentes. O gnero Staphylococcus sp. um grupo de bactrias patognicas que colonizam, alm de outras estruturas, as membranas mucosas como o aparelho intestinal (Quinn et al. 1994). Este gnero j foi relatado por estar presente na microbiota oral e intestinal de variadas espcies de crocodilianos como aligtores americanos (Mainster et al. 1972, Barnett & Cardeilhac 1995), em um crocodilo ano cativo com artrite sptica (Heard et al. 1988), em garials (Misra et al. 1993), em jacars-do-papo-amarelo (Matushima & Ramos 1993) e em crocodilos anes (Huchzermeyer et al. 2000). Silva et al. (2009) relataram que o gnero Staphylococcus sp. foi o de maior ocorrncia com 14,74%. CONCLUSES A taxa de ecloso verificada neste experimento foi de 72,41%, e os aspectos que a determinam, sejam em ambiente natural ou artificial, ainda precisam ser melhor explorados do ponto de vista cientfico. Quanto constituio da microbiota, verificou-se diversidade de espcies bacterianas, sendo estas j relatadas na microbiota de crocodilianos e outros rpteis, em especial na microbiota da cloaca, possuindo, tambm, potencial patognico e, sob certas condies, como rachaduras na casca ou a presena de ovos quebrados no ninho, podem contaminar o ovo e afetar a taxa de ecloso. Agradecimentos.- Fazenda Ypiranga e Pousada Piuval, na pessoa dos senhores Joo Losano Eubank de Campos e Eduardo Matos Eubank de Campos, por viabilizarem a realizao desse experimento. Quadro 1. Coordenadas geogrficas, taxas de ecloso, nmero mdio de ovos infrteis, nmero mdio de ovos com odor ftido e a ocorrncia de invertebrados por ninho coletado de Caiman yacare em uma fazenda no municpio de Pocon, durante os meses de maro/abril de 2011 Coordenadas geogrficas S 16 24'59'' WO 56 36'38.8'' S 16 25'05.5'' WO 56 36'33.2'' S 16 24'49.1'' WO 56 36'33.6'' S 16 24'59.8'' WO 56 36'33.6'' S 16 24'42.7'' WO 56 36'31.5'' S 16 25'03.3'' W 56 36'32.9'' S 16 23'07.8'' W 56 37' 40.2'' S 16 23'06.0'' W 56 37'42.2'' S 16 23'13.7'' W 56 37'40.4'' S 16 23'16.0'' W 56 37'42.7'' S 16 22'52.5'' W 56 37'47.2'' S 16 22'37.3'' W 56 36'45.3'' S 16 22'38'' W 56 36'44.1'' S 16 22'07.1'' Taxa de N ovos N ovos ecloso com odor Invertebrados infrteis (%) ftido 80 81,81 36,36 88 0 91,3 88,88 52 60 84,61 0 76,66 73,07 76,92 5 0 1 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 6 4 3 5 2 3 12 12 4 16 7 7 6 Cupins/formigas Cupins/formigas Cupins/diplpodas Cupins ---Diplpodas Formigas --Cupins Diplpodas/cupins --Diplpodas/formigas Cupins/formigas ---

rea

Ninho 1 2 3

Piuval 4 5 6 7 8 Estrada Parque 9 10 11 12 Vazante 13 14

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W 56 36'45.8'' S 16 21'59.3'' W 56 36'54.5'' S 16 21'598.7'' W5636'57.1'' S 1622'10.3'' W 5637'58'' S 16 22'6.0'' W 53 38'5.3'' S 16 21'57.9'' W 56 38'05.5'' S 16 22'9.8'' W 56 37'34''

15 16 17 18 Lixeiro 19 20 Total 20

92,85 26,66 77,27 85 80 96,87 72,41

0 1 1 1 0 1 19

3 7 4 2 2 0 105

Cupins --Formigas/lacraia ----Diplpodas

Quadro 2. Mdias da taxa de ecloso, do nmero mdio de ovos infrteis e com odor ftido em diferentes reas do Pantanal de Pocon, MT

Taxa de ecloso (%) Piuval Estrada Parque Vazante Lixeiro 77,04 a 57,91 a 73,60 a 86,90 a

N de ovos infrteis 4,91 a 6,76 a 0,80 a 3,57 a

N de ovos com odor ftido 16,39 a 35,33 a 25,6 a 9,57 a

Mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste Tukey (P<0,05).

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Quadro 3. Ocorrncia das bactrias encontradas nas diferentes reas do Pantanal de Pocon, MT
reas Piuval Ninhos Bactrias Acinetobacter sp. Aeromonas hydrophila Alcaligenes sp. Bacillus cereus Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Enterobacter aglomerans Escherichia colli; Escherichia hermanni Flavobacterium multivorum Hafnia alvei Morganella morganni Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas stutzeri. Salmonella sp. Staphylococcus aureus Staphylococcus intermedius Serratia liquefacians Serratia marcescens Shigella sonnei Streptococcus sp. X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 16,66 16,66 0 100 66,66 66,66 0 50 16,66 66,66 0 0 33,33 33,33 33,33 16,66 0 0 33,33 0 0 66,66 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 60% 20% 40% 80% 40% 40% 0% 20% 0% 80% 20% 20% 20% 20% 60% 0% 20% 20% 0% 0% 0% 20% X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 20% 20% 60% 80% 100% 60% 60% 60% 0% 80% 0% 0% 20% 60% 20% 0% 40% 20% 0% 20% 0% 60% X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 50% 50% 25% 100% 100% 75% 0% 25% 0% 100% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 25% 25% 35 25 30 95 75 60 15 40 5 80 5 5 20 30 30 5 15 10 10 5 5 45 1 2 3 4 5 6 Total (%) Estrada Parque 7 8 9 10 11 Total (%) Vazante 12 13 14 15 16 Total (%) Lixeiro 17 18 19 20 Total (%) Total (%)

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Quadro 4. Resumo da anlise de deviance para as diferenas encontradas, entre as regies, quanto presena de diferentes espcies de bactrias Bactria Acinetobacter sp. Aeromonas hydrophila Alcaligenes sp. Bacillus cereus Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes Enterobacter agglomerans Escherichia colli Escherichia hermanini Flavobacterium multivorum Hafnia alvei Morganella morganni Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas stutzeri Salmonella sp. Staphylococcus aureus Staphylococcus intermedius Serratia liquefacians Serratia marcescens Shigella sonnei Streptococcus sp Valor-p 0,3601 0,6746 0,0906 0,4015 0,0435 0,7236 0,0171 0,4993 0,4692 0,2341 0,4015 0,4015 0,4993 0,1673 0,1673 0,4692 0,1595 0,3924 0,1469 0,4015 0,3284 0,3013

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Pulcherio, 2011

Fig.2. Variao da temperatura mdia (em C) e umidade relativa do ar (em %) no ambiente durante a incubao dos ovos.
90,0 Umidade (%) 85,0 80,0 28,0 75,0 70,0 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Dias de amostragem (abril/2010) Mdia diria de Umidade (%) 27,0 26,0 31,0 Temperatura (C) 30,0 29,0

Fig.3. Fotografia digital de um feto em autlise encontrado dentro de um ovo com odor ftido.

Pulcherio, 2011