Laboratorio de Biotecnologa de Cultivos Celulares

Prctica No. 3. Produccin de tetraciclina en cultivo lquido por Streptomyces aureofaciens en medio sinttico.
Elabor: IBT. Karen Gisela Moreno Guerrero

1. Introduccin Desde tiempos remotos el hombre ha sacado provecho de los microorganismos, utilizndolos en su beneficio para producir alimentos y bebidas principalmente. Sin embargo, desde el descubrimiento de la penicilina en 1929, tambin se han utilizado y cada vez en mayor medida para producir antibiticos. Los antibiticos son sustancias producidas naturalmente por los microorganismos pero que no son esenciales para su crecimiento. Su funcin en la naturaleza es la de brindar al microorganismo productor una ventaja competitiva sobre otra u otras poblaciones microbianas al contar con un arma que las elimine del medio por el que compiten. Su uso teraputico y medicinal en seres humanos, plantas y animales es destruir o detener el crecimiento de microorganismos infecciosos que afecten al organismo vivo. Fue la imperiosa necesidad de antibiticos durante la Primera Guerra Mundial lo que llev primero a la bsqueda de mtodos ms eficaces para la produccin de penicilina, el primer antibitico usado masivamente y descubierto por Alexander Flemming en 1929. Posteriormente, la investigacin se encamin tambin a la bsqueda de nuevos antibiticos, siendo la mayora obtenidos de bacterias aisladas del suelo, principalmente de las pertenecientes al gnero streptomyces. As por ejemplo, tenemos a la actinomicina, descubierta por Waksman en 1940, la estreptomicina, estreptotricina, tetraciclina y clortetraciclina, por mencionar solo algunos de los ms conocidos. Las tetraciclinas son un grupo de antibiticos de amplio espectro que se pueden obtener por sntesis qumica o bien por sntesis microbiana a partir de cultivos de Streptomyces aureofaciens, aunque se prefiere sta ltima sobre la sntesis qumica por su bajo costo. Bsicamente, la estructura qumica de los tres derivados de tetraciclina es un sistema de anillos de naftaceno al que se aaden diferentes tomos constituyentes. As, la clortetraciclina tiene un tomo de cloro mientras que la oxitetraciclina un grupo oxhidrilo. Evaluacin de la actividad de un antibitico. El mtodo ms utilizado para evaluar la actividad de un antibitico o bien la sensibilidad de uno o ms microorganismos a ste es el antibiograma. Existen dos mtodos comunes para realizar un antibiograma: por difusin en placa y por dilucin en caldo. El primer mtodo, tambin conocido como mtodo Kirby-Bauer, consiste en sembrar sobre una placa de agar al microorganismo de prueba y exponerlo a la accin del o los antibiticos a probar, que se colocan sobre el medio slido en discos de papel filtro o cilindros metlicos para localizar su difusin. Al cabo de cierto periodo de incubacin (comnmente 24 horas) aparecer un halo de inhibicin alrededor del disco del o los antibiticos que indica la resistencia del microorganismo. En el segundo, en tubos con caldo de cultivo se colocan distintas diluciones del antibitico de concentracin conocida. Los tubos se inoculan con el microorganismo de prueba y al trmino del periodo de incubacin se descartaran aquellos tubos en los que haya turbiedad en el medio debida al crecimiento microbiano. El tubo que contenga ausencia de microorganismos contendr la concentracin adecuada del antibitico.

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2. Objetivos General Utilizar un cultivo del actinomiceto Streptomyces aureofaciens para producir el antibitico tetraciclina por fermentacin lquida en un medio sinttico. Particulares Evaluar la diferencia en la produccin de la tetraciclina al utilizar dos medios de cultivo sintticos de diferente composicin. Evaluar la actividad antimicrobiana y el rendimiento en la produccin del antibitico en el medio de cultivo contra un estndar comercial de tetraciclina realizando un antibiograma.

3. Desarrollo experimental

1.1.

Materiales

Cepas microbiolgicas Streptomyces aureofaciens Escherichia coli Staphylococcus aureus Para la preparacin de la cepa de Streptomyces Reactivos Glucosa Peptona KH2PO4 MgSO4*7H2O Agar-agar Agua destilada Materiales 1 caja Petri de 100x15 mm 1 matraz Erlenmeyer 250 mL 1 esptula de acero inoxidable 1 probeta graduada de 100 mL 1 vaso de precipitados de 100 mL Charolas de polipropileno o aluminio para pesar Encendedor Equipo Autoclave Balanza analtica Campana de flujo laminar Incubadora a T=30C Lmparas de alcohol

Para la preparacin del inculo Reactivos NaCl Sucrosa Harina de soya Citrato de sodio cido actico (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O KH2PO4 K2HPO4 CaCO3 MnSO4*4H2O ZnSO4*7H2O K2Cr2O7

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Agua destilada Materiales 3 tubos de ensaye roscados de 16x150 mm 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL 3 Pipetas graduadas de 10 mL 1 probeta graduada de 100 mL 1 vaso de precipitados de 100 mL 1 esptula de acero inoxidable Algodn

Charolas de polipropileno o aluminio para pesar Encendedor 1 clip Propipeta Equipo Autoclave Balanza analtica Campana de flujo laminar Incubadora con agitacin reciprocante o rotatoria a T=30C Lmparas de alcohol

Para la fermentacin lquida Reactivos Sucrosa cido actico cido ctrico Citrato de sodio*5H2O (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O KH2PO4 K2HPO4 CaCO3 MnSO4*4H2O ZnSO4*7H2O K2Cr2O7 Agua destilada Materiales 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL 1 probeta graduada de 50 mL 1 pipeta de 5 mL 1 propipeta 1 esptula de acero inoxidable Algodn Charolas de polipropileno o aluminio para pesar Encendedor 1 clip Equipo Autoclave Balanza analtica Campana de flujo laminar Incubadora con agitacin T=30C y 200 rpm Lmparas de alcohol

rotatoria

Para el antibiograma Reactivos Medio para antibiticos No.1 y 2 o Agar Mueller-Hinton Caldo Luria o Caldo nutritivo Estndar de tetraciclina comercial Agua destilada Materiales Embudo Buchner de 4.5 cm Matraz Kitazato de 125 mL Desecador Papel filtro Whatman No. 4 de 4.5 cm 5 tubos Eppendorf Puntas azules estriles 1 hisopo 6 crculos de papel filtro de 4.5 cm o 6 penicilindros 1 tapa de caja Petri Pinzas de diseccin Encendedor Plumn indeleble Vernier o regla milimtrica Equipo Balanza analtica Bomba de vaco

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Campana de flujo laminar Estufa de secado Micropipeta de volumen variable de 1001000 L

Incubadora Lmparas de alcohol

1.2.

Mtodos 1.1.1. Preparacin de la cepa para iniciar el cultivo

Preparar las cajas Petri de 15 x 100 mm conteniendo cada una por lo menos 30 mL de Agar Waksman, de acuerdo con la siguiente formulacin: Componente Glucosa Peptona KH2PO4 MgSO4*7H2O Agar agar g/L 10.0 5.0 1.0 0.5 20

Inocular las cajas Petri con suspensin de esporas o micelio de Streptomyces aureofaciens. Incubar a 30C por un periodo de 10 das para favorecer la esporulacin. 1.1.2. Preparacin del inculo para la fermentacin

Preparar el medio para el inculo de acuerdo con la siguiente formulacin: Componente Sucrosa Harina de soya Citrato de sodio (Na3C6H5O7*5H2O) (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O KH2PO4 K2HPO4 CaCO3 MnSO4*4H2O ZnSO4*7H2O K2Cr2O7 cido actico (CH3COOH) Cantidad/L 30.0 g 5.0 g 1.0 g 3.3 g 0.25 g 0.10 g 0.10 g 1.00 g 0.01 g 0.04 g 0.016 mg 0.40 mL

Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121C por 15 minutos. Inocular con suspensin de esporas o suspensin miceliar (hechas con solucin salina) de Streptomyces aureofaciens obtenidos de la cepa inoculada en el agar Waksman. Incubar a 30C de 48 a 72 hr con agitacin reciprocante con 3 in a 97 ciclos/min o agitacin rotatoria a 200 rpm. 1.1.3. Fermentacin lquida

Preparar el medio A o B, segn la siguiente formulacin:

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Componente Sucrosa cido ctrico (H3C6H5O7*H2O Citrato de sodio (Na3C6H5O7*5H2O) (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O KH2PO4 K2HPO4 CaCO3 cido actico (CH3COOH) MnSO4*4H2O ZnSO4*7H2O K2Cr2O7

Medio A Cantidad/L 30 g -------2.5 g 3.3 g 0.25 g 0.10 g 0.10 g 1.0 g 0.40 g 0.01g 0.04 g 0.016 mg

Medio B Cantidad/L 40 g 12.8 g -------6.0 g 0.25 g 0.15 g -------11.0 g -------0.01 g 0.04 g 0.016 mg

Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121C por 15 minutos. Inocular el medio para fermentacin con 2.5 mL del inculo. Incubar a 30C durante 4 a 6 das con agitacin rotatoria a 200 rpm. 1.1.4. Antibiograma para la evaluacin de la actividad antimicrobiana y concentracin de la tetraciclina en los medios de cultivo A y B.

a) Preparacin de las placas para el antibiograma. Preparar 1 caja Petri con 20 mL de medio para antibiticos 1 y 2 o agar Mueller-Hinton. Paralelamente, preparar un cultivo de 24 horas de Escherichia coli en caldo Luria o Staphylococcus aureus en caldo nutritivo. Empapar un hisopo estril en la suspensin del cultivo cuidando de retirar el exceso presionando y rodando el hisopo sobre las paredes del tubo antes de retirarlo. Extender de forma homognea (ver el esquema) en tres direcciones sobre toda la superficie de la placa de agar, cuidando de no dejar sitios sin cubrir. Incubar en posicin invertida a 37C durante 24 horas una vez que han sido colocados los discos con el antibitico. 1 2 3

Figura 1. Esquema para la siembra del inculo en las placas para antibiograma.

b) Determinacin de la biomasa (en peso seco) y clarificacin del medio de cultivo Retirar el matraz de fermentacin de la incubadora y filtrar el medio al vaco a travs de un disco de papel filtro Whatman No. 4 (previamente tarado a peso constante) para retener la

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biomasa. NO DESECHAR EL MEDIO FILTRADO. Posteriormente, colocar el papel filtro en un horno de secado a 60C durante 1 hora. Dejar enfriar en un desecador y determinar la biomasa producida en peso seco. c) Antibiograma para determinar la actividad y concentracin de la tetraciclina Preparar una solucin madre de 1000 g/mL a partir de un estndar comercial de tetraciclina. De la solucin madre preparar las siguientes diluciones: 125 g/mL, 250 g/mL, 500 g/mL y 750 g/mL. Colocar sobre las placas de agar Mueller-Hinton o medio para antibiticos 1 y 2 previamente inoculadas con el microorganismo de prueba cinco crculos de papel filtro como lo muestra el esquema, previamente embebidos en 200 L de cada una de las diluciones del estndar de tetraciclina, incluida la dilucin madre. En el centro de la caja Petri colocar un sexto crculo de papel filtro embebido en 200 L del medio de cultivo filtrado. Marcar sobre la tapa de la caja las concentraciones correspondientes de tetraciclina. Incubar las cajas en posicin invertida a 37C durante 24 horas.

250 g/mL

125 g/mL Medio de cultivo

500 g/mL

1000 g/mL

750 g/mL

Figura 2. Esquema para la colocacin de los crculos de papel filtro en la caja Petri. Al trmino de la incubacin, medir el dimetro de los halos de inhibicin en los estndares de tetraciclina y el medio de cultivo. Para calcular la concentracin del antibitico en el medio de cultivo, graficar el logaritmo de la concentracin de las diluciones de tetraciclina contra el dimetro del halo de inhibicin. Interpolar en el grfico el dimetro del halo en el papel embebido con el medio de cultivo para conocer la concentracin de antibitico en el mismo. La ausencia de halo de inhibicin en el sexto crculo indicar que no hubo produccin de antibitico. 4. Resultados Reportar los periodos reales y temperaturas de incubacin durante la fermentacin y en el ensayo del antibiograma. Reportar la biomasa producida en el medio de cultivo de fermentacin en peso seco. Esquematizar o fotografiar los resultados de los antibiogramas para cada antibitico obtenido con los medios A y B.

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Trazar la grfica de del halo de inhibicin vs. Log [antibitico] y reportar la concentracin para el antibitico en los medios A y B. Reportar el dimetro del halo de inhibicin para los antibiticos obtenidos en los medios A y B. 5. Anlisis de resultados Hacer un comparativo de las diferencias obtenidas en cantidad de biomasa, actividad y produccin de antibitico entre los medios A y B, sustentando de manera concisa y comprobable las respuestas con la bibliografa consultada. Explicar si las diferencias obtenidas se deben a solo unos constituyentes del medio de cultivo en particular o toda la formulacin en conjunto. Explicar tambin el efecto de los componentes del medio de cultivo sobre la produccin del antibitico. Explicar tambin si el antibitico obtenido es tetraciclina, oxitetraciclina o clortetraciclina y por qu. 6. Conclusiones Concluya de manera clara y concisa sobre el cumplimiento de los objetivos. Incluya tambin perspectivas o puntos de vista. 7. Cuestionario 1. Describe las caractersticas del genero streptomyces. 2. Qu otro microorganismo es utilizado para producir tetraciclina adems del Streptomyces aureofaciens? 3. Esquematiza la molcula base de la tetraciclina con los diferentes tomos constituyentes para obtener los derivados oxitetraciclina y clortetraciclina. 4. Cul es el mecanismo de accin de la tetraciclina? 5. A que se refiere el trmino espectro de un antibitico? 6. Qu otros gneros microbianos son productores de sustancias antibiticas? 7. Cul es la diferencia entre un agente bacteriosttico, bacterioltico y bactericida? 8. Cules son los metabolitos primarios y secundarios? A cul de ellos pertenece la tetraciclina? 9. Qu son un medio sinttico y uno no sinttico? 10. Describe al menos un mtodo empleado para la purificacin de antibiticos. 11. Por qu otro mtodo, aparte de la fermentacin lquida, es posible producir antibiticos? Descrbelo.

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12. Explica al menos un mtodo para la obtencin y seleccin de cepas mutantes sobreproductoras de antibiticos. 13. Menciona al menos tres microorganismos comnmente empleados en los antibiogramas. Menciona tambin las caractersticas del Agar Mueller-Hinton, que lo hacen un medio ideal para las pruebas de sensibilidad a antibiticos. 14. Cules son las otras aplicaciones de los antibiogramas, adems de utilizarse para cuantificar un antibitico? 15. Describe el procedimiento que comnmente se utiliza para aislar nuevas cepas productoras de antibiticos.

8. Referencias bibliogrficas Brock D.T., Madigan T.M. Microbiologa. 6a ed. Prentice Hall. Mxico 1993 Darken, Berenson, Shirk, Sjolander. Production of tetracycline by Streptomyces aureofaciens in synthetic media. Applied Microbiology. 1960 January; 8(1): 4651 Scragg, A. Biotecnologa para Ingenieros. Sistemas Biolgicos en Procesos Tecnolgicos. Ed. Limusa. Mxico 1992 ENCB-IPN. Microbiologa Prctica. 2 ed. Mxico 1998 ENCB-IPN. Manual de Prcticas de Bacteriologa Mdica. Mxico 2003