UNIVERSIDAD DE SANTANDER Facultad de Ciencias Exactas Fsicas y Naturales

GUIA DE LABORATORIO

PROGRAMA DE BACTERIOLOGA Y MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PREPARACIN DE DNA PLASMDICO POR LISIS ALCALINA CON SDS Nombre del Profesor : Nombre del Curso Cdigo del curso: Horas de trabajo con el docente Horas de trabajo independiente Horas totales (desarrollo de la prctica) 1. Introduccin Los plasmidos son molculas de DNA extracromosomal los cuales estn presentes en algunas clulas bacterianas, levaduras y hongos. Los mismos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero tambin se han encontrado plsmidos lineales. La replicacin de los plasmidos es independiente de la replicacin del cromosoma del husped ya que los plasmidos poseen su propio origen de replicacin. El nmero de copias de un plasmido en la clula es variable, todo depende del origen de replicacin del que posea el mismo y su regulacin. Los plsmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la clula pero le proveen una ventaja competitiva a las clulas que los poseen, dado a que los plasmidos poseen genes que le confieren caractersticas selectivas a su husped tales como resistencia a antibiticos, nuevas habilidades metablicas como degradacin de carbohidratos, factores de virulencia y produccin de toxinas entre otros. Los plsmidos poseen un inters singular en Ingeniera Gentica por ser uno de los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molcula que resulta de la unin de un DNA vector con el DNA de inters (denominado entonces "inserto") se denomina molcula de vector recombinante. Existen unos requerimientos bsicos que un plsmido debe poseer para que sea un buen vector al aplicar su uso en la biologa molecular. Debe poseer un origen de replicacin, un gen para un marcador de seleccin (ya sea resistencia a algn antibitico) y un lugar de clonaje mltiple (MCS). El MCS es una regin donde pueden digerir varias enzimas de restriccin pero solamente una vez. Existen diversos mtodos para el aislamiento de plasmidos. Las tcnicas de Minipreps o mini preparaciones de plasmidos, permiten la recuperacin de plasmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las clulas con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe. Por el contrario la configuracin superenrrollada del plasmido se mantiene estable. La lisis alcalina es el mtodo mayormente utilizado para el aislamiento de plasmidos circulares proveniente de clulas bacterianas. Existen diversos protocolos para realizar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos bsicos. a. Remover las clulas del medio de cultivo en caldo mediante centrifugacin. b. Descartar el sobrenadante para reducir contaminacin mediante fragmentos de la pared celular del husped. c. Resuspender las clulas en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa. d. Lisar las clulas con NaOH y SDS. e. Unin de las hebras de DNA y remocin de contaminacin mediante el acetato de potasio. f. Precipitacin del DNA de plasmido mediante alcohol (etanol o isopropanol) y una sal (Acetato de amonio, Cloruro de litio, Cloruro de sodio o Acetato de sodio). g. Enjuague del material gentico con EtOH al 70%. h. Resuspender el material gentico. ALCANCE Con este protocolo se obtiene DNA plasmdico a partir de cultivos bacterianos a pequea escala (1.4 ml), mediante tratamiento con lisis alcalina y SDS. La obtencin de DNA plasmdico a pequea escala es esencial para el anlisis de colonias recombinantes. YADIRA YLEANA PINTO Laboratorio de Biologa Molecular 1horas 2 horas 3 horas

GENERALIDADES Para obtener DNA plasmdico este debe ser replicado en una clula anfitriona. Con frecuencia se utilizan cepas de E. coli por las facilidades que ofrecen para su manipulacin y por ser un organismo muy estudiado. El cultivo bacteriano debe provenir de una sola colonia, la cual debe ser cultivada en 5 ml de medio lquido. Utilizando el agente selectivo adecuado (antibitico). Los cultivos deben ser incubados toda la noche a 37C con agitacin a 150 rpm. Principio del mtodo Este mtodo explota las diferencias en las propiedades de desnaturalizacin y renaturalizacin entre el DNA plasmdico (pequeos crculos de DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosmico (fragmentado). La alcalinizacin con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aninico (SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas, y la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven menos afectados por su pequeo tamao y estructura superenrollada. La neutralizacin del medio en presencia de una concentracin alta de sal (acetato potsico), provoca que se cierre covalentemente el DNA plasmdico y la precipitacin de las protenas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potsica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosmico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de protenas y DNA cromosmico se separan por centrifugacin del DNA plasmdico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa 2. Competencias 2.1 Competencia general Obtener DNA plasmdico de clulas bacterianas mediante el mtodo de lisis celular por lisis alcalina 2.2 Competencias especficas Describir los tipos de plasmidos su importancia, funcin y usos en la ingeniera gentica. Identificar las acciones de los componentes del protocolo de extraccin 3. Lista de Equipos Balanza Cmara de extraccin Cmara de flujo laminar para la inoculacin de bacterias Centrifuga refrigerada para tubos eppendorf pH-metro Shaker Vortex 3.1. Lista de materiales y reactivos - Cultivo bacteriano que contenga el plasmido Reactivos Solucin I: Glucosa/Tris/EDTA (GTE) 50mM glucosa 25mM TrisHCl pH 8.0 10mM EDTA Aada 4mg/ml lisozima antes de utilizar si ES una bacteria gram positiva. Solucin II: NaOH/SDS 0.2N NaOH 1% (w/v) SDS Prepare esta solucin antes de ser utilizada Solucin III: Acetato de Potasio 5M 29.5 ml acido actico glacial KOH en grano hasta pH de 4.8 H2O hasta 100ml Guardar a temperatura ambiente, no esterilizar. RNasa 10mM TrisCL pH 7.5 15 mM NaCL Caliente a 80C por 10 min. Permita que la solucin se enfrie a temperatura ambiente y guarde en alcuotas a -20C. Diluya a 10g/ml. Materiales Falcon 15 ml, Gradillas, Hielo, Micropipetas de 1000 ul, 200 ul y 10ul, Nevera de icopor, Puntas para micropipetas blancas (10ul), amarillas (200 ul) y azules (1000 ul), Tubos eppendord de 1.5 ul Elementos de proteccin

Bata de laboratorio Guantes de ltex Cmara de extraccin El estudiante debe traer al laboratorio: Guantes, bata, 4. Contexto TEORICO Contestar las siguientes preguntas antes de entrar a la prctica. 1. Que es un plsmido y que funciones cumplen en Biologa Molecular 2. Se puede decir que un DNA plasmdico es igual a un DNA genmico bacteriano? Explique 3. Cuales son las 3 diferentes conformaciones que pueden adquirir los plsmidos 4. En que consiste la Denaturacin alcalina para la extraccin de DNA plasmdico? 5. Cual es la funcin en un protocolo de extraccin de ADN plasmdico de : a. Buffer de lisis que con tiene un detergente b. Buffer de Neutralizacin que contiene un componente acido c. Buffer de Resuspensin d. Identifique cada uno de los anteriores Buffer en nuestro protocolo 6. Que funcin cumple la RNAsa A en el protocolo? 7. Para que se adiciona ampicilina en el medio de cultivo de las Bacterias? 8. Fuera del mtodo de extraccin por Denaturacin alcalina que otros mtodos existen para extraccin de ADN plasmdico?

4. Procedimiento Puntos de control Antes de comenzar el procedimiento se debe verificar el crecimiento bacterial para lo cual debe observarse el medio turbio. Al adicionar la solucin de lisis 2 debe observarse una nata blanca lo cual indica el rompimiento celular y despus de centrifugar se debe obtener un sobrenadante transparente. Luego de realizar la precipitacin se debe observar la presencia de un pellet despus de la centrifugacin. Al secar el pellet ste debe tornarse transparente. Desarrollo del mtodo Da N1: Inocular la bacteria deseada (contiene plasmido) en caldo (LB, YT o Terrific Broth) por 24 horas a 37C en agitacin. Recordar que si el plasmido tiene algn gen de seleccin, como por ejemplo resistencia a algn antibitico, se debe adicionar en el medio que va a ser inoculada la bacteria. Da N2: Transferir 1,5 ml de la bacteria en un eppendorf de 1,5 estril y centrifugar a 13,000 rpm (revoluciones por min) durante 2 minutos para formar un pellet de bacterias. Descartar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 100l de la solucin I(fra), darle vortex e incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Recordar que la solucin I debe estar en hielo. Aadir 200 l de la solucin II a cada tubo , tapar y mezclar bien por inversin. Incubar en hielo por 5 minutos. Aadir 150l de la solucin III(fra), tapar el tubo, mezclar por inversin (puede darle vortex) . Incubar en hielo por 5 minutos. Nuevamente vortex varios segundos y centrifugar por 5 minutos a 13,000 rpm. Transferir el sobrenadante a un eppendorf estril. Aadir dos volmenes de alcohol absoluto (etanol 100%). Mezclar invirtiendo el eppendorf y dejar incubando por 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar por 5 minutos a 13,000 rpm y descartar el sobrenadante cuidadosamente. Lavar el sedimento aadiendo 1 ml de alcohol al 70% (etanol) y mezclar invirtiendo varias veces Centrifugar por 3 minutos a 13,000 rpm y descartar el sobrenadante cuidadosamente. Dejar secar el etanol que no vayan a quedar restos en las paredes del tubo (5-10) min. Resuspender el sedimento en 50l de buffer TE y aadir 1l de RNasa A. Guardar a -20C.

5. Resultados y discusin 1. SOLUCIN DE LISIS I Anote los cambios observados mientras adiciona la Solucin I en el tubo epperdorf DESCRIPCIN DE LO OBSERVADO EXPLICACIN DE LOS CAMBIOS OBSERVADOS

2.

SOLUCIN DE LISIS II Anote los cambios observados mientras adiciona la Solucin II en el tubo epperdorf DESCRIPCIN DE LO OBSERVADO EXPLICACIN DE LOS CAMBIOS OBSERVADOS

3. SOLUCIN DE LISIS III Anote los cambios observados mientras adiciona la Solucin III en el tubo epperdorf DESCRIPCIN DE LO OBSERVADO EXPLICACIN DE LOS CAMBIOS OBSERVADOS

El chequeo o visualizacin del DNA plasmdico luego de la extraccin se observara a travs de un gel de electroforesis al 1% en el cual se debe observar una o varias bandas de alto peso molecular dependiendo de la configuracin que tenga el plsmido Interpretacion del Gel Elabore un esquema del gel sembrado e interprete los resultados obtenidos

6. Conclusiones

7. Evaluacin/Autoevaluacin CUESTIONARIO 1. Qu finalidad tiene la neutralizacin en el mtodo de lisis alcalina? 2. Por qu la alcalinizacin en presencia de SDS afecta menos a los plsmidos que al DNA cromosmico? 3. Migra con idntica velocidad un plsmido con estructura nativa superenrollada que un plsmido con roturas? 4. Que diferencias existen entre un protocolo de extraccin de DNA plasmdico bacteriano y uno genmico bacteriano? 5. Cul es la importancia de los plsmidos en la Ingeniera gentica? 8. Observaciones

9. Bibliografa- Webibliografa rd Sambrook, J. and D. Russell. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 edition. Cold Spring Harbor, NY. Pp 5.8, 5.76. Current Protocols and Molecular Biology. John Wiley and Sons, inc. 1999. Suplemento 45. Brown, T. A. (2006). Gene cloning and DNA analysis : an introduction. Oxford, UK ; Malden, MA, Blackwell Pub.Impreso.