Universidad Nacional de Huancavelica

Laboratorio de Biotecnologa Molecular

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR CUALITATIVA)

NDICE

1.- OBJETO Describir un procedimiento para la realizacin de la tcnica de PCR (Polimerase Chain Reaction =Reaccin en cadena de la polimerasa) en DNA. 2.- ALCANCE

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Este mtodo es aplicable a DNA extrado por mtodos apropiados segn la metodologa previamente descrita en los correspondientes mtodos de ensayo (Identificacin de especies animales, vegetales etc.). 3.- REFERENCIAS [1] Sambrook et al (1989). Molecular Cloning, a Laboratory Manual. Second edition [2] Analytical Molecular Biology. Quality and Validation. Saunders and Parkes eds. Royal Society of Chemistry. Teddington. 1999. 4.- FUNDAMENTO La tcnica de PCR ordinaria de tipo cualitativo es una reaccin enzimtica que permite generar millones de copias de una secuencia gentica corta a partir de cantidades mnimas de DNA que sirve de molde. Adems del DNA inicial, en cada reaccin de PCR hay que aadir dos secuencias cortas flanqueantes al fragmento a copiar (oligonucletidos, cebadores o primers) que son los que determinan la especificidad de la reaccin. Tambin se debe proporcionar una concentracin salina en forma de MgCl2 apropiada y dependiente del primer y los componentes de las nuevas cadenas de DNA generadas en forma de deoxinucletidos: dATP, dGTP, dTTP y dCTP (en conjunto dNTPs). Finalmente la enzima encargado de copiar el fragmento, la Taq polimerasa lleva, generalmente asociado un tampn 10X para diluir. La reaccin se lleva a cabo sometiendo a los ingredientes a ciclos (30-45 normalmente) de tres temperaturas. A 94-95C se desnaturaliza el dsDNA, seguidamente y, a una temperatura inferior y dependiente de la secuencia del primer, se produce el alineamiento del mismo a la cadena sencilla de DNA. A 72 C se produce la elongacin de la nueva cadena de DNA a partir del primer alineado.

Cada ciclo dura tiempos variables en funcin de la secuencia a amplificar y la longitud de la misma. En conjunto, la sucesin de tiempos-temperaturas constituye el programa de PCR que se memoriza en el termociclador, aparato consistente en un bloque metlico en el que se pueden ajustar estas dos variables.

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5.- MATERIALES. Pipetas P1000, P200, P20 y P10. Puntas de pipeta. Vrtex, Tubos Eppendorf 1.5, 2 ml. Guantes sin empolvar. Gradillas. Gradillas y soporte para tubos de PCR. Termociclador PCR

6.- REACTIVOS Primer Cytb b Supermix platinium PCR Agua ultrapura estril.

Los reactivos de PCR comunes a todas las reacciones (Cl2Mg, dNTPs , Taq polimerasa y tampn 10X incluidas en el Supermix platinium PCR) se utilizan a la concentracin a la que se suministran, sin embargo, es conveniente tenerlos en alcuotas pequeas de un solo uso para evitar congelar y descongelar demasiadas veces.

7.- PROCEDIMIENTO OPERATIVO Preparar la cabina de PCR: soporte de tubos de PCR, pipetas, vrtex, microcentrfuga, puntas y todo el material plstico que se vaya a utilizar. Sacar del congelador todos los reactivos y ponerlos en hielo picado para que se vayan

descongelando. Mientras se descongelan los reactivos, se pueden calcular las cantidades totales segn los

cebadores, volumen final de la reaccin y nmero de muestras. Las cantidades de la mezcla

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de reactivos (mastermix) se harn con un 10 % de margen o aadiendo una muestra ms si hay 10 menos muestras. En las muestras de toda amplificacin se deben incluir los controles indicados en el mtodo de ensayo correspondiente, normalmente sern: control positivo, blanco de PCR. Mezclar los ingredientes de la reaccin de PCR en un microtubo. Agitar vigorosamente la mezcla en el vrtex y distribuirla en tantos tubos de PCR como corresponda. Los tubos de PCR deben estar bien sujetos al soporte durante la preparacin y manipulacin de los mismos. Ejemplo concreto de reaccin de PCR Deteccin de secuencia universal del citocromo b de vertebrados con los primers cyt b1 y cyt b2 para 9 muestras: Reactivo Platinium PCR super Mix Primer cyt b1 (5M) Primer cyt b2 (5M) ddH2O DNA* Total 20 l l/reaccin 14 2.5 2.5 (variable) variable) x 10 TOTAL MASTERMIX 140 25 25 (variable) (variable)

Una vez preparado el mastermix, se reparte en los tubos de PCR situados en su soporte y en hielo. A continuacin se aade el DNA a cada tubo. Los tubos se cierran y se colocan en el termociclador.

Verificar el perfecto cierre de los tubos y seleccionar el programa de amplificacin

correspondiente que de forma general tiene el nombre del primer o gen amplificado.

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Cuando acabe la amplificacin, se puede realizar

una electroforesis en gel de agarosa con una cantidad adecuada de la amplificacin (10-15 l en amplificaciones de 25 50 l) para verificar la presencia o ausencia del fragmento amplificado as como su tamao aproximado en pares de bases.