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TIPOS DE MICROSCOPIOS

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1. El microscopio ptico 1.1. El microscopio ptico compuesto 1.2. El microscopio ptico de contraste de fases 1.3. El microscopio ptico de campo oscuro 1.4. El microscopio ptico de fluorescencia 2. El microscopio electrnico 2.1. El sombreado 2.2. La tincin negativa 2.3. Rplicas de carbono 2.4. Criocorrosin 2.5. El microscopio electrnico explorador

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AcuaNatura 1. TIPOS DE MICROSCOPIOS

1.1. El microscopio ptico El microscopio ptico es un instrumento que sirve para aumentar el tamao de un objeto a travs de un sistema de lentes. Puede conseguirse con este mtodo un aumento de hasta 2000 veces. Las partes de las que se compone un microscopio se pueden dividir en parte mecnica y en parte ptica (figura 1): Parte mecnica: Sistema de soporte: Pie: Sirve de apoyo y para darle estabilidad al microscopio. En l est integrada la fuente luminosa. Brazo: Es una columna que parte del pie sirve para sujetar el tubo. Puede ser recto o arqueado. Tubo: Es una cmara oscura que est unida al brazo. En su parte inferior est el revolver son los objetivos y en su parte superior los oculares. Platina: Es una plataforma horizontal sobre la que se engancha con dos pinzas el portaobjetos. Tiene en su zona central un orificio que permite el paso de la luz y un sistema de cremallera manejado por dos tornillos que permiten el movimiento de la muestra. Revolver: Sujeta los objetivos y gira para permitir el cambio de objetivo. Sistema de ajuste: Tornillo macromtrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de forma brusca y poco precisa. Tornillo micromtrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de forma lenta y muy precisa. Parte ptica: Fuente de iluminacin: Es una lmpara halgena que permite el encendido o el apagado con un interruptor y cuya intensidad puede ser graduada. Puede tener en su parte superior un anillo para permitir la colocacin de filtros que facilitan la visualizacin. Condensador: Es un sistema de lentes situado bajo la platina que permite concentrar la luz de la fuente de iluminacin hacia la preparacin. Diafragma iris: Est en el interior del condensador y sirve para limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la luz y ajusta la apertura numrica). Oculares: Estn colocados en la parte superior del tubo y su funcin es captar y ampliar la imagen obtenida por los objetivos. Actualmente se suelen usar los microscopios binoculares que tienen dos oculares unidos por un mecanismo que permite ajustar la separacin interpupilar. Son normalmente de x10 y x12. Objetivos: Estn colocados en la parte inferior del tubo insertados en el revolver y obtienen la imagen real aumentada e invertida. Sobre su superficie est indicado su aumento y su apertura numrica. Suelen llevar dibujado un anillo de color que indica su aumento y suelen ser de x4 (rojo), x10 (amarillo), x40 (azul) y x100 (blanco). Editado por: 3

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Figura 1: Esquema de un moderno microscopio ptico. 1.1.1. El microscopio ptico compuesto El microscopio compuesto ha sido de importancia crucial para la microbiologa como ciencia y es todava, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigacin microbiolgica rutinaria. Un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes, el objetivo, situado cerca del objeto que se observa, y el ocular, que est colocado cerca del ojo. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. Con un objetivo que aumenta x40 y un ocular que aumenta x10 el aumento total es de x400. El microscopio compuesto es pues capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Adems del aumento una propiedad del microscopio es su poder resolutivo. Esta es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos y, por tanto, cuanto mayor sea le poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como apertura numrica. Como la longitud de onda habitualmente est fijada, la resolucin de un objeto es funcin de la apertura numrica: cunto mayor sea la apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo. Hay una correspondencia aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura numrica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos habitualmente tendrn mayores aperturas numricas (el valor de la apertura numrica est marcado al lado de la lente). El poder resolutivo viene dado por la siguiente frmula:

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siendo: d = poder resolutivo, = longitud de onda, N = ndice de refraccin del medio, = semiapertura del objetivo, N*sen = apertura numrica. Para conseguir un aumento total mximo e idneo este debe estar comprendido entre 500 y 1000 veces la apertura numrica. Si se busca una mayor ampliacin de la imagen lo que se consigue es un mayor aumento, pero una nitidez baja. Un factor que afecta a la apertura numrica adems de la construccin de la lente es el medio a travs del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo est separado del objeto por el aire, su apertura numrica nunca ser mayor de 10. Para conseguir aperturas numricas mayores que sta el objetivo debe estar inmerso en un lquido de mayor ndice de refraccin que el aire. Se utilizan aceites de varios tipos, y las lentes preparadas para usarse con aceite se denominan lentes de inmersin. La apertura numrica de un objetivo de inmersin de alta calidad esta entre 12 y 14. Aunque las lentes de inmersin en aceite tienen habitualmente mayores aumentos que las lentes para observacin en seco, esto no es siempre as. Una lente de inmersin utilizada en el aire da una imagen muy poco satisfactoria, por lo que nunca deber emplearse sin aceite. Aumento del objetivo x10 x40 x901 x100 x400 x900 025 076 130 20 045 027 70 13 05 15 035 017

Aumento con un ocular de x10 Apertura numrica Poder resolutivo, m Profundidad de campo aproximada, m rea de campo aprox. con un ocular de x10, mm 1 Lentes de inmersin

Tabla 1: Datos pticos para los objetivos utilizados comnmente. De acuerdo con la teora de la ptica, las mayores resoluciones posibles con un microscopio ptico compuesto permitirn la observacin de un objeto cuyo dimetro sea de unos 02 m (1 m = 10-6 m). Si un objeto de 02 m de dimetro se aumenta 1000 veces, aparecer a la vista como un objeto de 02 mm de dimetro que puede apreciarse fcilmente. Con el microscopio compuesto pueden obtenerse aumentos mayores de x1000 escogiendo los oculares adecuados, pero con ello no se da mayor resolucin del objeto (esto se denomina aumento ineficaz, puesto que no aade nada a la resolucin). La mayor parte de los microscopios usados en microbiologa tienen oculares de diez aumentos (x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento total x100), x40 (aumento total x400) y x90 o x100 (objetivos de inmersin, aumento total x900 x1000). Las lentes de menor aumento se utilizan para rastrear la preparacin buscando objetos de inters, el objetivo de 40 aumentos permite la observacin detallada de los microorganismos grandes tales como algas, protozoos y hongos, y los objetivos de 90 100 aumentos se emplean para ver las bacterias y los pequeos microorganismos eucariticos. El sistema de iluminacin de un microscopio es tambin de considerable importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza un sistema de lentes llamado condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de la luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El condensador tiene tambin un diafragma iris, que controla el dimetro del crculo de luz que pasa por el sistema. Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris Editado por: 2007 5

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es demasiado grande parte de la luz pasar no slo al objetivo sino tambin alrededor de l y no se utilizar. Si la luz es demasiado brillante no deber reducirse alterando la posicin del condensador o del diafragma iris, sino usando filtros de neutralizacin o disminuyendo el voltaje de la lmpara. Nunca se insistir lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopia, especialmente a los mayores aumentos. Otros dos factores relacionados con el sistema de lentes utilizado son la profundidad de campo y el rea de campo. Profundidad de campo significa el espesor de la preparacin enfocada en cualquier momento y es siempre mayor a pequeo que a gran aumento. Con inmersin en aceite la profundidad de campo es muy escasa, habitualmente menor de 1 m. El rea de campo se representa por el dimetro de la parte de la preparacin que se est viendo. El rea de campo es siempre mayor con pequeo que con gran aumento, y por esta razn las lentes de pequeo aumento son tiles para rastrear la preparacin.

Figura 2: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo claro. (b) Microfotografa de campo claro. 1.1.2. El microscopio ptico de contraste de fases El microscopio de contraste de fases hace posible ver fcilmente pequeas clulas, incluso sin teir. Las clulas tienen un ndice de refraccin distinto de su alrededor y esta diferencia puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste que la que puede obtenerse con el microscopio ptico normal. En este microscopio la fuente de luz es un cono hueco de luz que pasa a travs de un diafragma anular al condensador. En el objetivo un anillo de contraste de fases desplaza la fase de luz que lo atraviesa en un cuarto de longitud de onda. La luz que pasa retardada atraviesa el anillo y el ojo la ve como luz blanca normal. La luz que pasa a travs de una muestra con ndice de refraccin diferente del ndice del medio es retardada y tiene un recorrido ms largo, llegando al ocular fuera de fase. La interferencia entre la luz retardada y la no retardada produce una imagen de la Editado por: 6

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muestra. En la mayora de los microscopios de contraste de fases la imagen aparece clara sobre un fondo oscuro. Puesto que la imagen depende de las diferencias en el ndice de refraccin de la muestra y del medio circundante, la imagen desaparece si la muestra es sumergida en un lquido de igual ndice de refraccin. Para obtener mejores resultados con el microscopio de contraste de fases es esencial que el sistema ptico est cuidadosamente alineado y se emplea un dispositivo especial, el telescopio controlador, para ajustar el diafragma anular en relacin con el anillo de contraste de fases. La microscopia de contraste de fases hace posible observar clulas en estado vivo, ayudndonos as a evitar la creacin de artefactos tales como los introducidos por la tincin. En muchos laboratorios de bacteriologa el microscopio de contraste de fases ha reemplazado prcticamente al microscopio ptico comn como instrumento de investigacin. Pero hay que tener en cuenta que el objetivo de contraste de fases es menos apropiado que el normal para la observacin de material teido, por lo cual los objetivos de campo claro son todava necesarios y deberan emplearse siempre para observar muestras teidas.

Figura 3: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de contraste de fases. (b) Microfotografa de contraste de fases. 1.1.3. El microscopio ptico de campo oscuro El microscopio de campo oscuro es un microscopio ptico ordinario cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparacin desde los lados de tal modo que slo la luz difractada por la preparacin pasa al ocular y se hace visible. A causa de esta disposicin la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro. La microscopia de campo oscuro ha posible la observacin en estado vivo de partculas y clulas que de otra manera estaran por debajo de los lmites de resolucin del microscopio ptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeas clulas mviles tales como Treponema pallidum, la

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espiroqueta causante de la sfilis, que es invisible con la microscopia ptica ordinaria.

Figura 4: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo oscuro. (b) Microfotografa de campo oscuro. 1.1.4. El microscopio ptico de fluorescencia Se utiliza para poner de manifiesto muestras que tienen fluorescencia, bien a causa de la presencia en su interior de sustancias materiales fluorescentes o que han sido tratadas con colorantes fluorescentes. La fluorescencia es la propiedad que tienen muchas sustancias qumicas de emitir luz de un color despus de excitarlas con luz de otro color. En el microscopio de fluorescencia la luz de excitacin es eliminada con un filtro colocado entre el objetivo y el ocular, de modo que slo se ve la luz emitida.

Figura 5: Comparacin entre los mtodos microscpicos: (a) De campo claro. (b) De campo oscuro. (c) De contraste de fases. (d) De fluorescencia. Editado por: 8

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TIPOS DE MICROSCOPIOS 1.2. El microscopio electrnico

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Para estudiar la estructura interna de los microorganismos es esencial el uso del microscopio electrnico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Todo el sistema opera en el vaco. Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La resolucin obtenida con el microscopio electrnico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio ptico. Mientras que con estructuras ms pequeas que pueden observarse tienen unos 02 m, con el microscopio electrnico pueden verse fcilmente objetos de 0001 m (= 1 nm = 10-9 m). Con el microscopio electrnico es posible ver muchas sustancias incluso de tamao molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados. Si se est interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizndose habitualmente esto ltimo transfiriendo las clulas a un disolvente orgnico. Despus de la deshidratacin la muestra es incluida en plstico y en este plstico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrtomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola clula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas despus individualmente con el microscopio electrnico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrnica, tales como cido smico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales estn compuestos por tomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y, por tanto, se ven mejor.

Figura 6: Microscopio electrnico moderno.

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La fina seccin es montada sobre una rejilla metlica recubierta de colodin y es incorporada al instrumento, luego se aplica el alto vaco. Una vez es evacuada la cmara de la muestra, se enfoca el haz electrnico y la imagen se observa en una pequea pantalla. Se toman fotografas de las imgenes interesantes, ya que slo en la placa fotogrfica se obtiene la resolucin ltima del microscopio electrnico. El intenso haz electrnico causa el deterioro gradual de la muestra, de forma que no es posible una observacin a largo plazo. La fijacin, la inclusin y la tincin son tratamientos potencialmente perjudiciales y pueden alterar grandemente las estructuras celulares. Por esta razn debe tenerse gran cuidado en la interpretacin de las imgenes obtenidas con el microscopio electrnico. Los artefactos o creaciones artificiales son mucho ms comunes que en la microscopia ptica. Procedimientos que van bien con ciertos organismos pueden fallar con otros. En general, se utilizan mtodos diferentes para los organismos procariticos y para los eucariticos. La microscopia electrnica es un arte altamente desarrollado y con esta tcnica somos capaces de observar estructuras celulares que no pueden verse de ninguna otra manera. La resolucin mucho mayor que puede obtenerse justifica el cuidado, el tiempo y el gasto que representa la preparacin de micrografas electrnicas.

Figura 7: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrnico. (b) Microfotografa de msculo atrial aumentado x20000. 1.2.1. El sombreado Si slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas y sobre la rejilla metlica pueden montarse clulas enteras. Para aumentar el contraste de las clulas entras se recurre generalmente al sombreado. Esto implica el recubrimiento de la muestra con una fina capa de metal como, por ejemplo, paladio, cromo u oro. El metal se deposita sobre el objeto por un lado de forma que se crea una sombra. De esta manera el objeto aparece con grosor y

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forma. El sombreado se utiliza a menudo para observar apndices superficiales en las bacterias.

Figura 8: Micrografa electrnica de una clula sombreada mostrando los flagelos. 1.2.2. La tincin negativa Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrnico es la tincin negativa. Se aplica el mismo principio que en la tincin negativa del microscopio ptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas ms comnmente utilizadas en la microscopia electrnica se realiza con cido fosfovolfrmico (fosfotngstico).

Figura 9: Micrografa electrnica con tincin negativa. 1.2.3. Rplicas de carbono Para examinar las superficies celulares pueden prepararse rplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las clulas una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrnico.

Figura 10: Micrografa electrnica de una rplica de carbono de una aleacin de niquel. 1.2.4. Criocorrosin Otra tcnica de la microscopia electrnica recientemente desarrollada es la de criocorrosin (freeze-etching), que evita la formacin de artefactos al eliminar la fijacin qumica y la inclusin. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento qumico y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, Editado por: 11

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de tal modo que quedan expuestas porciones de las superficies de las clulas. Se hacen y se examinan entonces rplicas en carbono de esas superficies, pudindose observar estructuras superficiales o internas de las clulas. La mayora de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas qumicamente se ven tambin en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos.

Figura 11: Micrografa electrnica de una rplica celular por criocorrosin. 1.2.5. El microscopio electrnico explorador Otro instrumento reciente para examinar las estructuras superficiales es el microscopio electrnico explorador (scanning electron microscope). El material que se estudia es recubierto con una pelcula fina de un metal pesado tal como el oro. El rayo de electrones es dirigido sobre la preparacin y la va recorriendo y explorando por todas la superficie. Los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. Con el microscopio electrnico explorador pueden observarse incluso muestras muy grandes, siendo muy buena la profundidad de campo. El aumento que puede obtenerse oscila entre uno tan bajo como x15 y uno tan alto como x100000, pero slo puede observarse la superficie de un objeto.

Figura 12: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrnico explorador. (b) Microfotografa de la cabeza de una hormiga. Editado por: 12

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